FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES“ZARAGOZA”

MICROBIOLOGIA GENERAL I

SEMINARIO DE AISLAMIENTO YCUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓNDE MICROORGANISMOS

AISLAMIENTO

Consiste en separar los microorganismos de interés deuna comunidad microbiana ,el aislamiento esimportante por que se obtienen cultivos para estudiosdetallados y controlados de laboratorio y para suaplicación en biotecnología y en microbiologíaambiental e industrial.

¿COMO SE LOGRA?

El aislamiento se logra por medio de cultivo selectivopara el organismo que se desea aislar, e inhibir elcrecimiento de otros microorganismos no deseadospero sin afectar a la especie o grupo que se desea aislar.

MEDIO DE CULTIVO CLASIFICACION EJEMPLO DE M.O AISLADOS

EMB SELECTIVO YDIFERENCIAL

Escherichia coliKlebsiella pneumoniaeEnterococcus faecalis

SAL Y MANITOL SELECTIVO YDIFEENCIAL

Staphylococcus auerusEscheriachea coliKlebsiella pneumoniae

S-110 SELECTIVO Staphylococcus aureus

MAC CONKEY SELECTIVO YDIFERENCIAL

Shigella flexneriProteus mirabilisE. Coli

CHAPMAN SELECTIVO S . aureus

¿CÓMO LOGRO UN AISLAMIENTO?

Separando los microorganismos físicamente mediantediluciones o por agotamiento (estría).

Utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir losm.o no deseados.

CUANTIFICACION

Es un método muy utilizado en diferentes áreas comopor ejemplo:

Industria alimenticia (leches, jugos, néctares)Hospitalaria (procesos patológicos infecciosos)

MÉTODOS DE CUANTIFICACION

Existen métodos que permiten establecer el númerode microorganismos o en una muestra dada.Hay métodos que cuantifican el numero de células, yexisten otros que cuantifican la masa total de lapoblación.

RECUENTO EN PLACA POR FILTRODE MEMBRANAFundamento

Paso de la muestra através de una membranaporosa que retiene losmicroorganismos y queposteriormente se colocasobre una placa.

Ventajas Desventajas

Mide el no. De célulasviables

Requiere bastante tiempo(24 horas o más)

Las bacterias crecen enunidad, en cadenas o comogrumos

RECUENTO EN PLACA POR FILTRODE MEMBRANA

RECUENTO EN PLACAFundamento: Se basa en la suposición de que cada bacteria o

agrupación de colonia crece y se divide para formaruna sola colonia.

Dispersión de la muestra Formación de colonias

¿COMO SE CUENTAN LAS COLONIAS PORVACADO EN PLACA?

El método más usual para realizar el conteo de célulasviables se basa en contar el número de células de unamuestra que es capaz de formar colonias al sembrarloen un medio adecuado.

Método de extensión en placa. Método de vertido en placa (o diluciones).

Ventajas Desventajas

Mide el no. De célulasviables

Requiere bastante tiempo(24 horas o más)

Microorganismos sensiblesal calor pueden resultardañados por el agar fundido

Las bacterias crecen unidad,en cadenas o como grumos.

RECUENTO EN PLACA

Ventajas Desventajas

Mide el no. De célulasviables

Requiere bastante tiempo(24 horas o más)

Microorganismos sensiblesal calor pueden resultardañados por el agar fundido

Las bacterias crecen unidad,en cadenas o como grumos.

En medios diferenciales lascolonias que se formandebajo de la superficie noson adecuadas (solo las de lasuperficie)

SIEMBRA POR VERTIDO DE PLACA

FACTORES QUE AFECTAN ELVACIADO EN PLACA

• Tipo de muestra y microorganismos presentes en ella.

• Procesamiento de la muestra.

• Temperatura del medio de cultivo.

• Tipo de diluyentes.

• Es importante que haya un número determinado decolonias en la placa (30-300).

RECUENTO EN PLACA POREXTENSION SUPERFICIAL

FUNDAMENTO Se basa en la extensión de la muestra, agregada con un asa

calibrada sobre una placa seca.

Ventajas Desventajas

rápido Poco exacta

No diluciones Carencia de uniformidad enla extensión

Muy poca muestra tiempo

Evita el contacto de lascélulas con el agar fundido

RECUENTO EN PLACA POREXTENSION SUPERFICIAL

DILUCIONES SERIADAS

FUNDAMENTO:

VENTAJASEs fácil. DESVENTAJAS

Afecta el no hacer bien lasdiluciones.

No homogenizar bien lamuestra.

No contar correctamente. Cuenta los viables mesofilos. No cuenta anaerobios. Cuantifica muestras solidas y

trabajar mas. No cuantifica bacterias

exigentes nutricionalmente.

FUNDAMENTO:

VENTAJASSu rapidez.No ocupas material

de laboratorio.Se utiliza poca

muestra.No hay restricción

de unidadesformadoras decolonias.

DESVENTAJASEl tiempo.

MILES-MISRA

FUNDAMENTO:

Nùm. De bacterias (mL) = NxFV

DESVENTAJASNo es fácil.Hay restricción.El tiempo.

RECUENTO ELECTRONICO CONTADORES ELECTRONICOS

Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzada apasar desde un compartimiento al otro a través del pequeñoconducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando unmicroorganismo pasa al nuevo compartimiento, laresistencia de éste se incrementa debido a que laconductividad de la célula es menor que la del medio. Estoscambios en la resistencia son convertidos en pulsos ovoltaje y contados

RECUENTO ELECTRONICO

Es posible contar y medir varios miles de partículas porsegundo, independientemente de su forma, color ydensidad.

Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios enla resistencia que son comparables al "ruido" generadopor la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluidopor el orificio.

RECUENTO MICROSCOPICO

RECUENTO EN CAMARA DE PETROFF-HAUSER Unvolumen conocido de muestra es depositado en unportaobjetos especial para cuenta, esta consiste de unportaobjetos excavado y cuadriculados que facilitan elrecuento por unidad de superficie y de volumen.

RECUENTO MICROSCOPICO

Este tipo de recuento se utiliza para determinar lacantidad total de microorganismos de una muestra.Es un método que resulta ser bastante exacto debido aque tiene una dimensión que facilita el conteo de losmicroorganismos por cuadrante.

CUANTIFICACIONTipo decuadro

Area[cm2]

Volumen[ml]

Factor[1/Volumen

Cuadradototal

1.00 x 10-2

2.00 x 10-5 5.00 x 104

Cuadradogrande

4.00 x 10-4

8.00 x 10-7 1.25 x 106

Cuadradopequeño

2.50 x 10-5

5.00 x 10-8 2.00 x 107

CAMARA PETROFF HAUSER Ventajas:

Es un método que se realiza fácilmente. Su procedimiento es rápido. Si se realiza adecuadamente es muy exacto.

Desventajas: No es posible diferenciar microorganismos vivos de

microorganismos muertos

CUANTIFICACION 1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar

la cámara de recuento. Número de cuadrados contados: Cantidad de

cuadrados de la cámara que se utilizaron para contarun el número de bacterias.

Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadradode la cámara. Depende del tipo de cuadrado en dondese realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadradopequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml)

MÉTODO DE BREEDFUNDAMENTO: Es un método directo para cuantificar células totales en el cual

un volumen conocido de la muestra diluida se extiendeuniformemente sobre la superficie de un portaobjetos normal.

Observando al microscopio el campo de observación contandolos microorganismos en diversos campos microscópicos.

Se obtiene el valor medio de células por campo que se logramultiplicando el número de campos microscópicoscomprendidos en la preparación.

Ello da el número de microorganismos existentes en el volumenconocido que a su vez al multiplicarse por 100 indica el total demicroorganismos /ml o g de muestra original.

VENTAJAS

Es un método rápidoEs un método económico

DESVENTAJAS Es imposible diferenciar a las células vivas de las

muertas. Cuando se tienen muestras que contienen poblaciones

pequeñas, el margen de error es grande. El método no suele ser adecuado para suspensiones

con baja densidad celular. Las pequeñas células son difíciles de ver.

APLICACIÓN Utilizada para contar bacterias de la leche. Es usado para diagnóstico de mastitis bovina

(diagnóstico subclínico).

MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE(NMP)

FUNDAMENTO: Es un método estadístico que se fundamenta en la

teoría de la probabilidad. En él se preparan múltiples series de diluciones

decrecientes, con cada dilución se inoculan variostubos que contienen el medio de cultivo adecuado.

APLICACIONES Este método se utiliza para contar microorganismos

difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinarel número de células que pueden crecer en un mediolíquido determinado, como el análisis para determinarla contaminación del agua potable.

NEFELOMETRÍA(TURBIDEZ)FUNDAMENTO.

En una suspensión microbiana, la cantidad de m.o estádirectamente relacionada con la turbiedad o densidadóptica de la misma, e inversamente relacionada con lacantidad de luz que pasa por la misma. A mayorturbidez mayor número de bacterias.

ESCALA MCFARLANDEs una curva estándar construida con una suspensióntestigo de concentración celular conocida. Se basa enla mezcla de concentraciones crecientes de BaCl2 conconcentraciones decrecientes de ácido sulfúricoobteniéndose un precipitado de Sulfato de bario encantidades diferentes.

VENTAJASRápido

Poca muestra

Sensible

DESVENTAJAS

No debe tener materia orgánica ensuspensión.

No debe tener color.Es total.La curva no esta hecha a base de bacterias si

no de sales.

Bibliografía

Vullo. Microbiología en la práctica. Editorial atlante. Buenos Aires Argentina.2000. pág 61-73

Dauget. Técnicas en bacteriología. Editorial Jims. Barcelona España. 1977. pág.82-86.

Alejandro Camacho; Ruth Alvarez. Manual de microbiología