reacciones multisustrato
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Tema 17 Reacciones multisustrato Reacciones enzimáticas con dos sustratos
1. Introducción
2. Nomenclatura
3. Reacción enzimáticas con 2 sustratos y 2 productos.
4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción:
Ecuaciones con dos substratos
4.1. Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar.
4.2. Mecanismo Secuencial Bi Bi ordenado.
4.3.Mecanismo Bi BiPing-Pong
Hasta ahora hemos estudiado casos sencillos de transformación
enzimática de un sustrato en un único producto.
Sin embargo, en los sistemas biológicos, son casos excepcionales, restringidos a reacciones de isomerización.
Las reacciones enzimáticas que implican a más de un sustrato, transformándolos en varios productos son las más frecuentes.
1.Introducción
S + E <==> ES <==> EP <==> E + P
- Y, a modo de ejemplo, podríamos citar las siguientes enzimas:
- Por ejemplo:
A + B P + Q
Adenilato ciclasa
Citrato sintasa
Alcohol-DH
Malato-DH
Ribitol-DH
Lactato-DH
Coenzima-A transferasa
Glutamato-alanina transaminasa
Glucosa oxidasa etc. ....
Estudio cinético:
A) Velocidad inicial
B) Depender la velocidad de la reacción de uno solo de los
reactantes (Resto saturación).
Reacción orden cero con respecto todos los substratos menos uno
SK
SVv
``max
a) En cuanto al número de sustratos y productos:
Reacción Nombre
A -----> P Uni-Uni A + B -----> P Bi-Uni
A + B + C -----> P + Q Ter-Bi
A + B -----> P + Q Bi-Bi
b) En cuanto al orden en que entran los sustratos y salen los
productos:
* Reacciones secuenciales:
- al azar
- ordenadas
* Reacciones de desplazamiento: - Ping-Pong
2. Nomenclatura
De acuerdo con la simbología de Cleland, el progreso de la
reacción se simboliza por una línea horizontal.
El trabajar con reacciones multisustrato, puede llegar a ser
bastante complicado a la hora de representar los esquemas de
las reacciones
A lo largo de la Historia se han propuesto varios sistemas, pero el
que más éxito ha tenido ha sido el propuesto por Cleland.
La entrada de sustratos y la salida de productos se representan
por flechas verticales que indican la dirección de entrada o
salida de la reacción.
- Para afianzar estos conceptos, veamos algunos ejemplos
concretos de reacciones en las que intervienen 2 sustratos
y se forman 2 productos:
E E EA E
A P
EB
B Q
E E EA EAB
A B
EQ
P Q
EPQ
Desplazamiento: Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong
Secuencial: Bi-Bi ordenada
¿Se atreve a nombrar los siguientes mecanismos?
E E
A B P Q C a)
E E
A B C Q P b) R
E E
A B C Q P c) R
Reacciones bisustrato, del tipo Bi-Bi:
A + B --- P + Q
-Mecanismos secuenciales
- al azar
- ordenadas
- Mecanismo ping-pong o de doble desplazamiento
3. Reacciones enzimáticas de dos sustratos y dos productos
A) Mecanismos secuenciales,
Los dos sustratos se unen al centro activo antes de que se
libere cualquiera de los productos. Es decir el complejo ternario EAB o EBA debe formarse como requisito
indispensable antes de que se produzca la formación de
productos.
La formación del complejo ternario es independiente del orden de unión de los sustratos.
Este tipo de reacciónes se denominan
reacciones secuenciales al azar,
La formación del complejo ternario debe producirse en un orden determinado para que el complejo sea productivo
desde el punto de vista catalítico. Este tipo de reacción se denomina
reacciones secuenciales ordenadas).
Analicemos, desde el punto de vista esquemático, estos dos tipos
de reacciones secuenciales.
Hagámoslo primero de acuerdo con un esquema clásico:
E + A <=> EA
E + B <=> EB
EAB <=> EPQ
EQ <=> E + Q
EP <=> E + P
B
A
P
Q
Bi-Bi al azar
E + A <==> EA + B <==> EAB <=> EPQ <==> EQ + P <==> E + Q
Bi-Bi ordenado
Utilicemos ahora la simbología o nomenclatura de Cleland:
Bi-Bi al azar
E E
A B
EA
B A
EB
EAB
Q
Q P
P
EP
EQ
EBA
EPQ
EQP
Bi-Bi ordenada
E E EA EAB
A B
EQ
P Q
EPQ
E E EA
A B
EQ
P Q
- Un caso especial, es el siguiente:
- Este mecanismo se conoce como “Mecanismo de Theorell-Chance”, y en realidad es un mecanismo Bi-Bi ordenado, para el que no existe el complejo ternario EAB ni
EPQ
La alcohol deshidrogenasa es una metaloenzima tetrámeroque contiene zinc en el centro activo y que cataliza la oxidación de etanol) por el coenzima nicotinamina adenina dinuclótido (NAD+) produciendo NADH y acetaldehido
B) Mecanismo “ping-pong” o de doble desplazamiento
E + A <=> EA <=> E + P +B <=> EB <=>EQ <==> E + Q
- Este tipo de mecanismo es muy común en las reacciones en las
que un grupo químico se transfiere desde el sustrato A al B, es
decir en reacciones de transferencias.
En este tipo de mecanismo, tras la unión del primer sustrato se
libera uno de los productos, en una reacción parcial en la que se genera una forma modificada de la enzima.
(acil enzimas, fosforil enzimas)
Esta forma une al siguiente sustrato, catalizando la formación del
segundo producto con regeneración de la forma nativa de la
enzima.
* Utilizando la simbología de Cleland, en el caso de reacciones
Ping-Pong, tenemos:
E E EA E
A P
EB
B Q
Uni-Uni-Uni-Uni Ping-Pong, o tetra-Uni Ping Pong
¿De acuerdo con la nomenclatura de Cleland, cómo nombraría la
siguiente reacción?
E E
Suc
cini
l-C
oA
HSC
oA
Pi
Suc
cina
to
GD
P
GT
P
Succinil-E E-P
4. Cálculo de la ecuación de velocidad de reacción:
Ecuaciones con dos substratos
Las condiciones de partida para derivar la ecuación de velocidad con dos o más sustratos son las mismas que hemos utilizados para la derivación de la
ecuación de velocidad en un sistema sencillo: S --> P
a) Supondremos la formación de un equilibrio rápido:
entre la E y los S
b) La ec. de conservación nos dice que (Eo) = al sumatorio de
todas las especies químicas en las que pueda encontrarse la
enzima:
(Eo) = (EXi)
c) Supondremos la existencia de condiciones de estado estacionario
4.1 Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar.
B A
E + P+ Q
v = kcat [EAB=EBA]
EABEBEAEE
EBA
BEBK
EAB
BEAK
EB
BEK
EA
AEK
T
MM
BA
BAAB
AB
BA
M
M
B
A
K
K
K
K
A + B P +Q
E
A B
EA
EB
EAB kcat
KA
KB
KMAB
KMBA
EBA
KM es la concentración de Substrato en el cual v=1/2 Vmax cuando el otro substrato está saturante
E
A B
EA
EB
EAB
kcat KA
KB
KMAB
KMBA
EBA
A M B A T
T
A M
M
M
K K
B A E
K
B E
K
A E E E
EAB EB EA E E K K
B A E EAB
K
B EA EAB
EAB
B EA K
AB
AB
AB
AB
] [
] [
E + P+ Q
AB
MAKK
BAEkcatv
BAKBKAKK
BAEkcatv
BAABABMMMA
T
Ecuación de velocidad para un mecanismo secuencial al azar
v = kcat [EAB]
BAKBKAKK
BAEkcatv
BAABABMMMA
T
BAKBKAKK
BAVv
BAABABMMMA
max
Vmax = kcat [ET] Concentraciones saturante de A y B
ECUACIÓN DE VELOCIDAD PARA Mecanismo Secuencial Bi Bi al azar
BAKBKAKK
BAVv
BAABABMMMA
max
Constante [A]
AK
AKKK
AK
AVV
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max´max
Un substrato constante pero no saturante
Ver anexo 1
BK
BVv
´´max
Igual se hace para [B] constante pero no saturante
BAKBKAKK
BAVv
BAABABMMMA
max
AK
AVv
´´max
BK
BKKK
BK
BVV
AB
BA
AB
M
BM
M
´
max´max
Constante [B]
[A]
Vmax V`max
KMBA
AK
AVV
BAM
max´max
AK
AKKK
BA
AB
M
AM
´
K`
[A]
KB
KMAB
Representación gráfica: Obtención de las constantes cinéticas
[A] =0
[B]
Vmax V`max
KMAB
BK
BVV
ABM
max´max
K`
[B]
KA
KMBA
BK
BKBKK
AB
BA
M
M
´
AK
AVv
´´max
BK
BVv
´´max
[A] cte [B] cte
AK
AKKK
BK
BVV
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max´max
[B] se hace muy grande, --> , condición de saturación
Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten
Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante
BAKBKAKK
BAVv
BAABABMMMA
max
AK
AVv
ABM max
AB
AB
M
M
KA
AKK
VB
BVV
´
maxmax
´max[B] Muy grande
[A] se hace muy grande, --> , condición de saturación
Comportamiento queda reducido a las expresiones de Michalis-Menten
Análisis de la ecuación: Un substrato constante y saturante
BAKBKAKK
BAVv
BAABABMMMA
max
BK
BVv
BAM max
BA
BA
M
M
KB
BKK
VA
AVV
´
maxmax
´max[A] Muy grande
BK
BKKK
AK
AVV
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max´max
4.2. Mecanismo secuencial Bi-Bi ordenado
QPEEABBEAAE KA KmAB kcat
EABEAEE
EAB
BEAKm
EA
AEK
T
AB
A
v BAKAKK
BAEkcatv
ABABMMA
T
V=kcat[EAB]
BAKAKK
BAVv
ABABMMA
max
Constante B BAKAKK
BAVv
ABABMMA
max
BK
KKK
BK
BVV
AB
AB
AB
M
MA
M
`
max`max
Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B
[B]
Vmax
AK
AVv
``max
V`max Regresión No-linear
Vmax
KMAB
K`
[B]
KA
Constante A BAKAKK
BAVv
ABABMMA
max
BK
BVv
``max
AB
AB
M
MA
KA
KKK
VV
`
max`max
K` KM
AB
[A]
Pendiente es igual: KA KAB
ORDEN DE UNÓN DE SUBSTRATOS EN UN MECANISMO BIBI ORDENADO: Cálculo de la Velocidad máxima haciendo constante un substrato: Una relación de substrato concentración idependiente frente a valor de Vmax indica que es el primer substrato que se une a la enzima
4.3. Mecanismo Bi Bi Ping-Pong
No hay complejo ternario
k1 k2 k3 k4
E +A EA P + E* + B E*B E + Q k -1 k-3
O con la nomenclatura de Cleland:
E E EA E*
A P
E*B
B Q
- Consideraremos velocidades iniciales unidireccionales.
KMA KM
B
k1 k2 k3 k4
E +A EA P + E* + B E*B E + Q
k -1 k-3
KMA KM
B
La velocidad de reacción es la descomposición del complejo EB
v = k4 [E*B]
BEEEAEE
BE
BE
k
kkK
EA
AE
k
kkK
T
B
M
A
M
**
´
*
3
43
1
21
Las constantes de Michaelis y el balance de masas en el estado estacionario
4kkcat
2
4
2
41
max
k
kBAAKBK
k
k
BAVv
B
M
A
M
Despejando [E*B]de las ecuaciones anteriores
ECUACIÓN DE VELOCIDAD EN MECANISMO BI BI PING PONG
2
4
42
4
k
k
kk
kkcat
BAAKBK
BAVv
B
M
A
M max
Paso limitante
Constante B BAAKBK
BAVv
BAABMM
max
BK
BKK
BK
BVV
B
A
B
M
M
M
`
max`max
Determinar K`y V`max a diferentes concentraciones de B
[B]
Vmax
AK
AVv
``max
V`max Regresión No-linear
Vmax
KMB
K`
[B]
KMB
KMA
KMB
Constante A
AK
AVv
``max
AK
AKK
AK
AVV
A
B
A
M
M
M
`
max`max
BAAKBK
BAVv
BAABMM
max
[B]
Vmax V`max
K`
[B]
KMA
KMB
KMA
Regresión No-linear
Vmax
KMA
DIFERENCIACIÓN MECANISMOS
[B]
K` Ping-Pong
Ordenada
Al azar
K` Ping-Pong
Ordenada
Al azar
[A]
Mecanismo Enzima
Bi-Bi al azar Adenilato quinasa (EC 2.2.4.3)
Creatin quinasa (EC 2.7.3.2)
Citrato sintasa (EC 4.1.3.7)
Bi-Bi ordenado Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1)
Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37)
Ribitol deshidrogenasa (EC 1.1.1.56)
Lactato deshidrogenasa (EC1.1.1.27)
Bi-Bi Ping Pong Coenzima-A transferasa (EC 2.7.8.7)
Glutamato-alanina transaminasa (EC 2.6.1.2)
Glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)
Inhibición por productos
Diferentes tipos de inhibición por producto en las reacciones que transcurren con dos substratos y dos productos
Mecanismo Inhibidor Substrato
A
(B saturante)
Substrato
B
(A saturante)
Bi-Bi ordenado P Q
Acompetitiva Competitiva
No competiva ------------------
Ping Pong P Q
Competitiva -----------------
------------------ Competitiva
Bi-Bi al azar P Q
No competitiva No Competitiva
No competitiva No competitiva
A + B --- P + Q
RESUMEN
Los conceptos utilizados para la obtención de datos cinéticos en reacciones monosubstratos ,son útiles para el estudio de las reacciones más complejas, con más de un substrato y más de un producto de reacción, si se hace depender la reacción de un solo reactante y los demás permanecen a concentraciones saturantes, es decir, la reacción será de orden cero con respecto a todos los reactantes menos uno.
En el caso de reacciones bisustratos puede distinguirse si la reacción tiene lugar mediante un complejo ternario, o si el enzima queda modificado al reaccionar con el primer substrato (mecanismo Ping Pong). En el caso de formación de un complejo ternario puede obtnerse al azar (mecanismo BiBi al azar) o de manera ordenada (mecanismo Bi-Bi ordenado).
Se han deducido la s ecuaciones de velocidad y la forma de obtener las constantes cinéticas que describen el proceso enzimático.
La inhibición por los productos P y Q puede servir para discriminar mecanismos probables de reacción. En general la información cinética puede ayudarnos para comprender propiedades locales de las enzimas, necesarias parea entender el control de la actividad enzimática y el papel de una enzima en el proceso de metabolismo celular.
Anexo 1 BAKBKAKK
BAVv
BAABABMMMA
max
A constante
BAK
AKK
B
AK
Vv
BAK
KAKK
B
AK
Vv
AK
BAKKAKK
B
AK
Vv
AK
BAKBKAKK
B
AK
Vv
BAKBKAKK
BAVv
BA
ABBA
BA
ABABBA
BA
BAABABBA
BA
BAABABBA
BAABAB
M
AMM
M
MMAM
M
MMMAM
M
MMMAM
MMMA
)(max
max
)(max
max
max
AK
AKKK
AK
AVV
BA
AB
BA
M
AM
M
´
max´max
Se divide
BK
BVv
´´max
PROBLEMAS.
1. Una enzima cataliza la siguiente reacción de la forma AX +B Bx + A Fue investigada a temperatura, pH y concentración de enzima constante dejando constante la concentración de B, y variando la concentración de substrato AX. Los resultados obtenidos.
INICIAL [AX] [B]=2.0mM 4.0 mM 6.0 mM
2.0 250 286 300
2.5 278 323 341
3.3 313 371 395
5.0 357 435 469
10.0 417 526 577
¿Qué tipo de mecanismo cursa esta reacción bisustrato?