MÉTODOS DE ENSAYOS

TOXICOLOGICOS I

Msc.. LEON F. VILLEGAS V.

Dpto. Ciencias Celulares y Moleculares

Sección Ciencias Farmacéuticas

FACULTAD DE CIENCIAS-UPCH

TOXICIDAD AGUDA

• Administración de la sustancia a los animales en una ocasión.

• El objetivo es determinar la sintomatología consiguiente a la administración de la sustancia y su grado de letalidad.

• El procedimiento inicial consiste en investigar una serie de rangos de dosis del compuesto (Dosis maxima y minima). Seleccionar vía de administración y preparar la sustancia de una manera adecuada para su administración.

• Se usa la vía oral cuanto menos además de las otras con el objeto de comparar con otros compuestos relacionados y para ver estudios de toxicidad prolongada posteriormente.

• Independiente de las especies seleccionadas, los animales de xperimentación deben estar sanos y ser observados antes de los ensayos (ratones y ratas 1 semana y perros 3 a 4 semanas)

• Experimentación preliminar.Tiempo de observación minimo 24 hora. Determinación de la DL50.

• Vía inhalatoria CTL50 (50% de animales muertos para una exposición es de 4 horas)

• Observar efectos durante la determinación experimental de la toxicidad, los cuales pueden ayudar algunas conclusiones sobre el cnetro y psoible meanismo de acción.

EXAMEN FISICO Y OBSERVACION DE

ANIMALES EN ESTUDIO DE TOXICIDAD

• ACTIVIDAD: locomotora y de saltos

• REACCION EXTRAÑA: Movimientos acrobáticos,

vagabundeo sin proposito fijo, movimiento hacia atrás,

hociquear, lamer, mov. empujar con la nariz, fijar mirada

con ojos vidriosos, dar vueltas.

• FONACION: Normal, anormal

• SENSIBILIDAD AL DOLOR: Inc., Dis. O Analgesia.

• SENSIBILIDAD AL SONIDO: Inc., Dis. Reactividad

• SENSIBILIDAD AL TACTO:Sensibilidad, reflejo del pabellón de la oreja

• INTERACCION SOCIAL: Comportamiento exploratorio, frecuencia de erguimiento, altura de rguimiento.

• COLA ANORMAL: rigida, flácida

• COMPORTAMIENTO AGRESIVO: Especie contra especie, hacia los experimentadores

• ATAXIA (alteracion en la capacidad de coordinar movimientos)

• CONVULSIONES: tonicas, clonicas, mixtas

• TONO MUSCULAR: tronco, extremidades

• PARALISIS

• RESPUESTA SOMATICA: aseo,frotarse la nariz, rascarse, retorcimiento

• REFLEJOS POSTURALES: reflejo colocación, asinamiento, enderezamiento

• POSTRACION: perdida de conciencia

• TEMBLORES: En reposo y movimiento, solo en movimiento

• EXOLFTALMIA: Protrusión marcada de los globos oculares

• IRRITACION OCULAR: Opacidad, papadeo excesivo, iritis

• REFLEJO CORNEAL

• LACRIMACION

• NISTAGMO (Movimientos oculares involuntarios)

• REFLEJOS PUPILAR A LA LUZ (FOTOMOTOR)

• FOTOFOBIA

• TAMAÑO DE LA PUPILA

• DEFECACION: Diarrea, Depocisión sanguinolenta

• SALIVACION: salivación, sequeda de la boca

• MICCION: Hematuria

• APNEA (ausencia de rspiración espontanea)

• DISNEA(falta de aliento o difcultad para respirar)

• RESPIRACION: ritmo respuratorio, profundidad respuartoria, respiración irregular

• CORAZON: Ritmo cardiaco, pulso

• DESCARGA NASAL

• TEMPERATURA CORPORAL

• CIANOSIS (coloración azulada de la piel y de las mucosasproducidas por un incremento de hemoglobina desoxigenada en la sangre)

• DEFICIT MOTOR: en pista inclinada, barra rotatoria, en alambre horizontal

• PILOERECCION

• MUERTE

• AUSENCIA DE EFECTOS

• ENSAYOS FUNCIONALES ESPECIALES: Comportamiento frente al condicionamiento de evitación, respuesta de reflejos condicionados

TOXICIDAD PROLONGADA

• Objetivo evaluar de forma general y caracterizar

todos los efectos cuando una sustancia es

administrada reiteradamente.

• Tres a cuatro mesesaplicación de tecnicas

analiticas para determinar efectos sobre la

química de la sangre, orina, liquidos biologicos y

la función especifica de los órganos

• Incluyen la evaluación de todos los animales

patologicamente e histologicos.

PRUEBAS ANALITICAS Y FUNCIONALESHEMATOLOGIA SANGRE ORINA ESPECIALES

-Eritrocitos

-Leucocitos

-Diferencial de

leucocitos

-Hematocrito

-Hemoglobina

-Sodio y potasio

-Cloruros y

calcio

-Doxido de

carbono

-Transaminasa

sérica

(Glutamato-

piruvato* y

Glutamato-

oxalacetato+)

-Fosfatasa

alcalina sérica*

-Electroforesis

de proteínas

séricas

-pH

-Peso especifico

-Proteínas

totales

-Examén

microscopico del

sedimento

-Glucosa

-Cetonas

-Bilirrubina

-Creatinina

-Ac. Urico

-Retención de

bromosulfaleína*

-Turbidimetría

con timol*

* = Ensayos de funcionalismo hepatico

+ = Ensayo para células de tejidos lesionados

EXAMENES PATOLOGICOS E HISTOLOGICOS

PESOS EXAMENES HISTOLOGICOS

•Corporal

•Tiroides

•Corazón

•Hígado

•Bazo

•Riñones

•Capsulas suprarrenales

•Testículos con epidídimo

•Riñon y Capsulas

suprarrenales

•Carazon

•Higado

•Intestino grueso y delgado

•Bazo

•Ovario

•Nodulos linfaticos mesentericos

•Todas las lesiones tisulares

•Pituitaria

•Tiroides

•Estomago

•Pancreas

•Vejiga urinaria y testiculos

TOXICIDAD CRONICA

• Ensayos de un año o más son llevados para

demostrar ausencia de toxicidad cuando la

dosis implicadas representan un cierto nivel

practico y evaluación del potencial

carcinogenico

• Alimento 100 veces la dosis para el hombre

utilizada

• Evaluación patologica e histologica aintervalos

de 6 a 12 semanas o bien cuando los animales

enfermen debido a la sustancia.

ENSAYOS DE POTENCIACION

• Posibilidad de sumación de efectos biologicos cuando dos o mas agentes con acción similar se administran simultaneamente.

• Tambien puede darse la condición que surge cuando el efecto combinado de dos sustnacias quimicas es mayor que la suma de las toxicidades de las sustancias individuales.

• Se realiza haciendo un ensayo normal de toxicidad aguda o prolongada con una mezcla de 1:1 de los dos compuestos y luego se comparan con los efectos producidos individualmente.

ENSAYOS SOBRE PIEL Y OJOS

• Trata de evaluar los efectos locales producidos

por sustancias muchas veces irritantes sobre la

zona de contacto.

• Es el caso de jabones,detergentes,

emulsificantes, cosmeticos, disolventes y una

gran variedad de colorantes.

• Obtener información de efectos en el curso de

su uso habitual asi como el uso

inadecuado.medir el tipo y grado de efcto sobre

piel y ojo.

IRRITACION PRIMARIA -PIEL

• Utiliza el conejo albino, el cobayo albino y el ratón.

• Cuando se absorben por piel puede derminarse su DL50

• Se utilizan dos grupos de animales, el dorso desde la

cabeza hasta los cuartos traseros se afeitan y depilan.

• Se necesita un sistema de calificación:

• 0=ningun eritema, 1= eritema ligero, 2=eritema bien

definido, 3=eritema moderado, 4=eritema grave, lo

mismo se hace con respecto al edema.

• ENSAYOS DE SENSIBILIZACION

CUTANEA: Ensayos en piel de conejos.

• ENSAYOS DE FOTOTOXICIDAD Y

FOTOALERGIA: se utilizan cobayos,

evalua los efectos de la luz ultravioleta

sobre problemas de toxicidad o alergias

a nivel de piel.

• ENSAYOS EN OJO: Se utiliza conejos

albinos, se evalua los efectso sobre,

cornea, conjuntiva e iris (metodo de

Draize).

Metodos de ensayo toxicologico II:

Ensayos teratologicos,

reproducción y embriotoxicos

Msc.. LEON F. VILLEGAS V.

Dpto. Ciencias Celulares y Moleculares

Sección Ciencias Farmacéuticas

FACULTAD DE CIENCIAS-UPCH

• Teratologia es el estudio de las causas,

mecanismos y manifestaciones desarrollo

anomalo de naturaleza estructural y

funcional.

• Algunos productos son letales mientras que

otros son predominantemente capaces de

producir malformaciones en el feto, que se

llaman teras (o lesiones teráticas) y el agente

que la produce se designa como teratógeno

o agente teratogénico.

ENSAYOS

TERATOLOGICOS

• El efecto embriotoxico depende de la

dosis y en la fase de gestación en la

que el feto esta expuesto al compuesto

ensayado.

• Existen otros factores que pueden

generar anormalidad en el periodo de

gestacion: deficiencia en la

alimentacion, infecciones viricas,

hipertermia, desequilibrio hormonales y

stress.

• Los ensayos en una especie tienen un valor

limitado en cuanto a predecir los efectos

sobre otras especies. Por ejemplo la

cortisona es teratogenico en ratones pero

solo en algunas cepas de ratas.

• Cuando existen marcadas diferencias entre

especies en cuanto a su respuesta a una

sustancia dada, cabe pensar que hay

diferencias en la biotransformacion del

compuesto en dichas especies y que el

agente puede ser un metabolito del

compuesto original.

• Las ratas Hooded y Sprague-Dawley son resistentes a la TALIDOMIDA y sin embargo son suceptibles a los agentes alquilantes.

• Los efectos toxicos sobre el embrion se obtienen experimentalmente mediante administracion del agente a la madre. El embrion depende del organismo materno para su crecimiento y sustento.

• La placenta puede ser una barrera mas o menos eficiente.

• Los ratones, ratas y conejos son los animales

de experimentacion mas frecuentes

empleados en los ensayos de

teratogenicidad.

• Se utilizan por su disponibilidad en los

laboratorios de ensayo y porque con ellas se

pueden operar con un numero de animales

suficientes para satisfacer las exigencias

estadisticas. En numero de ratas minimo es

10 esto produce aprox. 100 fetos si los

resultados son dudosos se repite el

experimento con 20 hembras como minimo

en cada grupo.

• La secuencia de todos los ensayos teratologicos es: producir gestacion, confirmar la gestacion y administrar la sustancia a ensayar y establecer el efecto teratogenico.

• Las ratas y ratones deben ser seleccionados con ciclos estruales regulares mediante control diario de su frotis vaginal y el apariamiento se realizara en el proestro.

• Estro= periodo de celo o ardor sexual de los mamiferos hembras

• El ciclo estral se determina usando

como parametro la cantidad, o

ausencia, de tres tipos de celulas en un

frotis vaginal: leucocitos (neutrofilos),

celulas epiteliales y celulas

cornificadas.

• El ciclo estral presenta 4 fases.

• Proestro: predominio de celulas

epiteliales sobre celulas cornificadas.

Presencia de leucocitos residuales.

• Estro: cantidad maxima de celulas cornificadas y celulas epiteliales minimo. El animal esta listo para aparearse.

• Metaestro I: La cantidad de celulas cornificadas ha disminuido y hay pocas celulas epiteliales

• Metaestro II: Cantidad de leucocitos aumentado hay algunas celulas cornificadas y epiteliales.

• Diestro: mayor cantidad de leucocitos ocupan todo el campo de visualizacion microscopica y se observa un incremento de celulas epiteliales

• Se debe de observar el tapon vaginal, presencia de espermatozoides en el fluido vaginal y el desarrollo de un diestro permanente.

• Periodo de gestacion de ratones es de 21 dias, en las ratas 21 a 22 dias y en los conejos 30 a 35 dias.

• Los experimentos se llevan a cabo en dos especies y minimo con 3 dosis. Ademas del control negativo es importante un control positivo.

• Cuando se trabajan con ratas y ratones la dosificacion se lleva a cabo administrando diariamente, a partir del 7o hasta el 15o dia de gestacion.

• La gestacion es interrumpida por cesarea: 20 dias ratones, 21 rats y 31 conejos.

• Autopsia completa a la madre contabilizacion de fetos vivos y muertos y se inspeciona el utero para observar resorcion fetal.

• Los fetos son examinados

sistematicamente y se realiza estudios

de histopatologia.

• Si no se encuantran fetos puede

pensarse de posible aborto, por lo cual

el experimento debe ser repetido y

debe de observarse mejor.

• Los perros, los gatos y primates

plantean problemas de manejo con

respecto al seguimiento de su

gestacion.

ENSAYOS DE REPRODUCCON

• Un estudio bien diseñado y realizado de reproduccion constituye un unico protocolo los suficientemente amplio como para que se puedan manifestar practicamente todas las formas de toxicidad, salvo la acrcinogenica.

• Los ensayos de fectos sobre la reproduccion tienen como objetivo final una estimacion de los efectos sobre la fertilidad, la gestacion y la descendencia.

• Los efectos toxicologicos sobre la reproduccion presentan tres posibilidades.

• 1. Los efectos pueden manifestarse

sobre el progenitor macho o hembra o

en ambos, y pueden ser el resultado

directo de una alteracion en el

funcionalismo de las gonadas, en el

ciclo estro, en el comportamiento en el

apariamiento, el indice de concepcion o

en los primeros estadios de gestacion,

tales como efectos sobre la

implantacion del ovulo fertilizado.

• 2. Puede ser sobre el desarrollo del

feto, su grado de normalidad, icluyendo

efectos teratogenicos y mutagenicos y

la mortalidad intrauterina.

• 3. Puede ser efectos sobre la madre,

como efectso sobre la lactancia y

aceptacion de la progenie; y sobre

dicha progenie en lo referente al

crecimiento, desarrollo y maduracion

sexual.

• La evaluacion de la ausencia de un

efecto sobre la reproduccion requiere

una valoracion de la probabilidad y

aplicar el criterio cientifico en la

interpretacion de resultados obtenidos.

• El experimento debe de considerar un

numero adecuado de animales, tres

dosis de ensayo siendo la dosis mayor

proxima ala maxima tolerada.

Metodos de ensayo toxicologico

III:

Ensayos mutagenicos,

carcinogenicos

y sobre comportamiento

MsC. LEON F. VILLEGAS V.

Dpto. Ciencias Celulares y Moleculares

Sección Ciencias Farmacéuticas

FACULTAD DE CIENCIAS-UPCH

• Es la inducción de alteraciones en

la información (DNA) de un

organismo o de una célula, que no

son el producto de la

recombinación normal.

• En organismos superiores la lesion

genetica puede darse a nivel de

celulas germinales o somaticas.

• Las mutaciones somaticas en un

organismo en desarrollo puede

generar una diferenciacion anormal

de sus celulas.

MUTACIONES

• Las alteraciones en celulas

somaticas en division de

un adulto puede dar

cancer. Este efecto es

sobre el individuo y no

sobre su progenie.

• Las alteraciones en celulas

germinales pasan a

generaciones sucesivas.

• Las mutaciones germinales

pueden producir la muerte

hasta anormalidades en el

desarrollo de la

descendencia.

• Existen 2 tipos de alteraciones en el material genetico

espontaneamente o por induccion quimica: mutaciones

pun tuales y aberraciones cromosomicas.

• Una mutacion puntual es una alteracion en un unico par

de nucleotidos del DNA y da cambios en una funcion

bioquimica.

• Las mutaciones puntuales se detectan en los cambios del

fenotipo y puden ser localizados mediante el mapa

genetico.

• Las aberraciones cromosomicas

incluyen mutaciones

estructurales (ruturas y

reordenamiento de cromosomas)

y cambios en el numero de

cromosomas.

• Las alteraciones se detectan

mediante examen citologico de

los cromosomas.

• La hidroxilamina es un ejemplo

de mutageno que produce

alteraciones puntuales.

• Los mutagenos que producen

radicales libres, causan ruturas

cromosomicas con mayor

frecuencia que alteraciones

puntuales.

• Los sistemas para evaluar estos efectos incluyen el uso

de bacterias, plantas e insectos.

• Pero la desventaja es que carecen de una fisiologia y

de un metabolismo de los mamiferos.

• Se ha superado aumentando a los medios de cultivo

los sistemas metabolizadores propios de los

mamiferos.

• Deben realizarse ensayos in vivo como in vitro.

• Se ha recomendado tres ensayos in vivo: ensayo del

dominante letal, ensayo por medio de hospedador y

citogenetica in vivo.

• Es aquella que mata a un individuo heterocigote.

• La lesion genetica se da en forma de aberraciones cromosomicas estructurales y numericas.

• El procedimiento consiste en tratar ratones o ratas machos con una dosis subtoxica (1/5 DL50) de la ssustancia a ensayar.

• Los ratones copulan con ratones no inoculadas.

• Las hembras luego son sacrificadas a los 14 dias despues de la copula se disecan y se estudian: cuerpos luteos, muertes fetales prematuras, muertes fetales tardias y las implantaciones totales.

ENSAYO DEL DOMINANTE LETAL

• I.M. = [(m.f.p./imp.totales)] X100

• Da cuenta de las mutaciones

cromosomicas pero no las puntuales.

• Principalmente se evaluan agentes

alquilantes.

ENSAYO POR MEDIO DE HOSPEDADOR

• Emplea microorganismos como indicadores de lesion genetica en un sistema de ensayo mamifero.

• Hay sustancias que no son mutagenicas en microrganismos pero son covertidas en mutagenos activos en los mamiferos.

• Estos ensayos tienen en cuenta la metabolizacion del mutageno potencial por el animal hospedador.

• Se inyecta intraperitonealmente a un raton, rata o hamster un microorganismo indicador como Salmonella o Neurospora. Luego el animal es tratado con el mutageno potencial, que es administrado por otra via.

• Despues de un tiempo se extrae una muestra de la cavidad peritoneal del hospedador y se mide la frecuencia de mutaciones en los microorganismos. Simultaneamente se ensaya in vitro la accion mutagenica del compuesto y esta es comparada con el resultado del ensayo hecho en el hospedador.

CITOGENICA in vivo

• Existen metodos in vivo como in vitro para el examen microscopico de las aberraciones cromosomicas de celulas de mamiferos.

• Los ensayos in vitro permiten una regulacion mas precisa de la dosis y del tiempo de exposicion.

• Para detectar las anormalidades cromosomicas es el ensayo in vivo, permite el examen directo de celulas animales tratados o expuestos accidentalmente.

• Los tejidos son medula osea para ver efectos sobre mitosis, linfocitos para las lesiones que se dan antes de la sintesis de DNA, fibroblastos de piel para efectos de largo plazo, gametocitos meoisis, y cultivo de celulas de liquido amniotico para lesiones de la progenie.

CARCINOGENICIDAD

• El tumor es una masa anormal de tejido cuyo crecimiento excede el de los tejidos normales y no esta coordinando su ciclo celular.

• Tumores benignos y malignas

• Los tumores benignos tienen caracteristicas estructurales identicas a las del tejido normal que lo origino, su crecimiento es solo expansivo no invade tejidos aledaños.

• Tumor maligno no son tipicas e invaden tejidos proximos.

• El tumor maligno tiende a desarrollar

secundariamente al sitio de su origen.

Estos tumores son metastasicos.

• Los tumores malignos: carcinomas (cel.

Epiteliales) y sarcomas (tej. Sosten o

conectivos).

• Sustancia que producen cualquier

tumor: tumorigenos

• Sustancia que producen tumores

malignos: carcinogenicos (carcinoma o

sarcoma).

• Los ensayos se interpretan siempre en

funcion del efecto del compuesto sobre la

incidencia de aparicion de tumores en

animales de experimentacion en

comparacion con un control.

• Los estudios se hacen en ratones y en rata,

aunque se han empleado perros, conejos y

cobayos.

• Los estudios son evaluados durante toda la

vida del animal de experimentacion.

• Se ha desarrollado un metodo invitro, un

ensayo bacteriano simple para la deteccion

de mutagenos (Ames 1974).

• Se utiliza una cepa de Salmonella typhymurium (His-) que necesita histidina exogena para su desarrollo, en el medio de cultivo se agrega la sustancia a evaluar.

• En presencia de un mutageno la cepa mutante de Salmonella tiende a revertir (His+).

• Como muchos carcinogenos requieren de ac tivacion metabolica el ensayo in vitro que emplea la cepa mutante de Salmonella(His-), se incluye un sistema de biotransformacion (homogenizado de higado de rata la fraccion S9)

COMPORTAMIENTO

• Efectos a dosis sucesivas o exposiciones

repetidas.

• Ensayos de: rueda giratoria, campo abierto,

jaula normal y laberinto residencial.

• La rueda giratoria es el mas antiguo, se utiliza

para medir la actividad diurna de los animales, y

puede detectarse efectos estimulantes sobre el

sistema nervioso central inducido por

medicamentos (psicotropicos). Lesiones

cerebrales asociados a hiperactividad.

• La tecnica de campo abierto: cuantifica

la actividad exploratoria de los animales

en un ambiente que no les es familiar;

en genral ello implica normalmente

observacion del animal durante un corto

periodo de tiempo. Es una prueba

simple que se ha visto sirve para

demostrar la hiperactividad debida

alesion cerebral en roedores jovenes

tras la exposicion de sales inorganicas

de plomo.

• La jaula normal o domestica: jaula

donde el animal se cria y en donde su

actividad de comer, asearse o

interactuar socialmente es registrado.

• El laberinto residencial: se utiliza par

determinar hiperactividad nocturna en

ratas jovenes que han sido expuestas a

altas dosis de monoxido de carbono.

• Ensayos especificos de recompensa o

castigo.