purificación+de+proteínas

8/2/2019 Purificacin+de+protenas

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PURIFICACIN DE PROTENAS


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Las protenas se purifican para hacer (principalmente):1. cristalografa de rayos X2. cintica enzimtica3. estructura primaria, cuando no se conoce el gen

La purificacin de protenas es una tarea frecuente en loslaboratorios de bioqumica. Para purificar una protena esfundamental disponer de un ensayo especfico: enzimtico,fsico (geles), biolgico, inmunolgico, etc.


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La fuente puede ser un tejido animal o vegetal, o un microorganismo. En el primer caso serompe el tejido con una juguera o un Potter. Luego las clulas (bacterias tambin) se abrenpor sonicacin, lisis (lisozima), mortero, prensa, etc. Todos los pasos que siguen se hacen(casi siempre) a 4 C, con tampones, con o sin inhibidores de proteasas.

sonicador

Potter


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Centrifugacin diferencial para clulas eucariticas. Es opcional.

Rotores de ngulo fijo

Rotores swinging bucket para ultracentrfuga


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Si la protena es soluble se puede concentrar por insolubilizacin preferencial:a) con sales (AmSO4). Al principio, imperceptible en la figura, salting in, ya que losgrupos cargados de las protenas se estabilizan, pero a conc. mayores empieza elsalting out, donde los iones de la sal se solvatan y retiran agua disponible a la

protena, adems de interferir con las interacciones electrostticas de sta;


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b) Otra opcin es con solventes orgnicos como acetona y etanol, los que bajan la cte.dielctrica del solvente. Las protenas reaccionan de distinta forma, tal como ocurrecuando se agrega AmSO4;

d) Por ltimo, en lugar de precipitarla, la protena se puede concentrar por ultrafiltracin,con membranas de distinto tamao de poro, o por dilisis contra un polmero inerte que

mantenga la presin osmtica (polietilenglicol).

c) Tambin se puede precipitar a la

protena con pH: las protenas tienensu mnima solubilidad en el pI, seacual sea la concentracin de sal.


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En los casos en que la protena se haya precipitado (a, b y c anteriores), se centrifugay el pellet se solubiliza en buffer adecuado . Luego se dializa para eliminar la sal osolvente orgnico para poder llevar a cabo las cromatografas que convengan


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Cromatografa de intercambio inico: catinico si resina es negativa y aninico si es positiva.Se eluyen con gradientes salinas en preparadas en buffer.

Colector de fracciones


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Matriz puede ser:- dextrano (Sephadex)- poliacrilamida (Biogel)- agarosa (Sepharose)

Tpicamente, se monitoreala elucin por A280

Filtracin en gel (gel permeation)


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La columna se calibra con protenas de peso molecular conocido

El volumen de exclusin (V0) de determina con un polmero de alto PM que no penetra el gel


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Elucin puede ser porbatch o con gradiente

Cromatografa de afinidad


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Criterios de pureza:a) electroforesis en condiciones denaturantes (SDS-PAGE)b) isoelectroenfoque (IEF)

c) electroforesis bidimensional: IEF y luego SDS-PAGE.

Smil de la diferencia entre actividady actividad especfica


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SDS-PAGE de fracciones obtenidas durante un proceso de purificacin

Este detergente cubre al polipptidodesnaturndolo y confirindole unadensidad de carga uniforme en sulongitud. Las cargas propias de laprotena se vuelven despreciables.

Normalmente se hace un stacking gel al 4% PA

para concentrar las protenas antes que entren algel de resolucin (tpicamente 10 a 15% PA)

Tincin con Azul de Coomassie o con AgNO3


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En SDS-PAGE las molculas ms chicas migran ms rpido. En este caso, alrevs de lo que ocurre en filtracin en gel, todas las molculas estn obligadasa migrar dentro de la malla del gel.


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Como las cargas propias de la protena no influyen en su migracin,SDS-PAGE es la tcnica rutinaria para medir el PM de una protena.Para ello se utilizan estndares de PM conocidos.


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Geles de poliacrilamida en condicionesnativas (sin SDS y sin calentar la

muestra)

Se hacen en fro, tpicamente en geles cilndricos. Migracin depende del PM y de la carga.Un gel se puede teir con Coomassie para ver el nmero de bandas y un gel paralelo secorta en tajadas delgadas, las que se suspenden en buffer para medir actividad. Luego se vesi la actividad coincide con alguna banda, idealmente con la banda nica. Tambin se puedehacer un zimograma.


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Isoelectroenfoque: electroforesis en una gradiente de pH

Los anfolitos tienen la funcin de estabilizar la gradiente de pH, ya que cubrenun amplio espectro de pIs. Recordar lo rpido que migran los H+ en solucin.


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Electroforesis bidimensional

Comnmente se hacen anlisis comparativos.Por ej, para detectar protenas mutadas, paraestudiar expresin gnica, para ver el avancede una enfermedad, etc. Los geles se escaneany son posteriormente analizados mediantesoftwares


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Otro ejemplo: diferencias en la expresin de protenas en dos tejidos diferentes

Las marcadas artificialmente con rojo son comunes en ambos tejidos,aunque de todos modos se aprecian diferencias cuantitativas


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No es criterio de pureza, pero sirve para detectar protenas usando anticuerpos especficos.

o leche en polvo

Recordar Southern blotting y Northern blotting. El trmino blotting hacereferencia a la transferencia de macromolculas biolgicas desde un gelhasta una membrana y su posterior deteccin en la superficie de la misma.

Empleo de Western en nuestra actual investigacin.

Western blot


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Determinacin de la estructura primaria de una protena purificada.

Ahora se deducen muchas secuencias a partir del DNA, pero este mtodo no nos

dice nada sobre puentes S-S, RNA editing y modificaciones post-traduccionales.

Si se dispone de la protena, se siguen los siguientes pasos:

- Separacin de las cadenas si hay estructura cuaternaria, usando

cromatografas descritas

- Ruptura de puentes disulfuro:con mercaptoetanol (HS-CH2-CH2-OH) o conditiotreitol o DTT (HS-CH2- CHOH-CHOH-CH2-SH).

Los SH resultantes se pueden oxidar con iodoacetato para evitar reoxidacin:

R-SH + ICH2-COO- ------> R-S-CH2-COO- + HI


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Composicin aminoacdica: siempre es deseable tenerla antes desecuenciar. 6N HCl, 110 C, 10-100 horas, en tubo sellado.Precaucin, porque en estas condiciones se destruye el trp y algola ser, treo y tir, mientras que asn y glm se hidrolizan a asp y glu.

La hidrlisis alcalina es an ms destructiva y la enzimtica no esprctica dada la especificidad de las proteasas, aunque vendenmezclas (pronasa) que suelen usarse, con el inconveniente que supropia autodigestin contamina la muestra.

El anlisis de aa puede hacerse por HPLC, derivatizndolos aalgo fluorescente (por ej).


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Deteccin por HPLC de aa derivatizados fluorescentes(o-phtaldehido o cloruro de dansilo)

La HPLC (high performance (pressure) liquid chromatography) es rpida, eficientey sensible. Es reversa porque la fase estacionaria es apolar y se eluye aumentandola apolaridad de la fase mvil. Tpicamente, tienen un detector UV-visible y/o de

fluorescencia. Bien calibrada es tambin cuantitativa.


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FPLC o fast protein liquid chromatography es como un HPLC preparativo que se lleva acabo en columnas de intercambio inico, de filtracin, de afinidad, de interaccioneshidrofbicas, etc., todas ellas disponibles en el mercado. Se usa para separar protenas.

Normalmente se trabaja en fro


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Id tifi i d l N t i l h ti i t t i id d


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Identificacin del aa N-terminal: se hace rutinariamente, en parte por curiosidad ytambin para estar seguros de que aparece un solo aa. Reactivos: (reaccionan tambincon aa individuales)

Se hidroliza la protena y se identifica por cromatografa (papel, HPLC, etc).

Los compuestos son coloreados o fluorescentes.

U d l l d d il id tifi l N t i l


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Uso del cloruro de dansilo para identificar el aa N-terminal


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No confundir las reacciones anteriores con la de la ninhidrina, la que detectaaminas pero no permite identificar los aa.

P C i l h i i i l S l d b i id


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Molarequ

ivalentsof

aminoacidsreleased

Molarequivalentsof

aminoacidsreleased

timetime

Para C-terminal no hay criterio equivalente. Solo se pueden usar exo-carboxipeptidasas,aunque no atacan con la misma eficiencia todos los aa, por lo que puede dar datosequvocos, ya que al seguir metindose en la cadena pueden aparecer rpidamente otros aa.

Aqu est claro que tir es el C-term Aqu no sabemos cual es el C-term

P l j d t i l C t l hid i li i 90 C l


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Por eso, lo mejor para determinar el C-term es la hidrazinolisis a 90 C, la quedestruye todos los enlaces peptdicos derivatizando todos los aa, salvo el C-term.


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Ruptura de pptidos para secuenciar.

Puede ser con peptidasas


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El bromuro de ciangeno, ltimo agente en la tabla anterior, rompeespecficamente en el extremo C-term de una metionina interna

Separacin de los fragmentos:


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Separacin de los fragmentos:

por cromatografas ya vistas, incluyendo HPLC y papel (fig).

La fase mvil es agua y solvente orgnico. La primera humedece el papel porcapilaridad y el segundo acta como fase mvil, por lo que los aa menos polares se

mueven ms rpido.

Ejemplo: separacin de distintoscolorantes solos o en mezclas


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Secuenciacin: se usa reactivo deEdman o PITC, que tiene la graciade no requerir hidrlisis.

Funciona en tres etapas (OH-,trifluoracetato y H+), en ciclosautomatizados.

El aparato se llama sequenator y da

hasta 50 ciclos. Por eso es necesariofragmentar la protena. Se requierenentre 0.1 y 1.0 mg de protena.

C i d l i d Ed l 1 F 2 4 DNB


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Comparacin del reactivo de Edman con el 1-F-2,4-DNB


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Para obtener la secuencia completa, se repite con otra proteasa, etc., yse hacen las sobreposiciones

R it l i d l di i t i t


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Recapitulacin del procedimiento ya visto

L li i d t di lf i l h S t l t


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Localizacin de puentes disulfuro: si es que los hay. Se rompe protena completa conuna enzima, antes y despus de reducir los S-S y se hace cromatografa o porfingerprinting se ve cuales pptidos desaparecen. Este ltimo consiste en unacromatografa en papel en una dimensin y electroforesis en el mismo papel en otradimensin. Una idea de este procedimiento se tiene en la figura, en la que mediante

fingerprinting se detecta donde hay una mutacin puntual en la hemoglobina.


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Determinacin del PM de las protenas por espectrometra de masas

Cuando iones en fase gaseosa son introducidos en un campo elctrico o en un campomagntico, sus desplazamientos son proporcionales a las razones masa/carga (m/z). Este es

el principio que hace posible la tcnica llamada espectrometra de masas (MS).

La MS permite medir PM de molculas. La imposibilidad de pasar protenas a fase gaseosaimpidi por muchos aos la aplicacin de esta tcnica para medir sus PMs.

En 1987, Karas y Hillenkamp describieron el matrix assisted laser desorption/ionization

mass spectrometry, o MALDI MS

Sobre una placa metlica se mezcla la protenacon una molcula orgnica disuelta en unamezcla de agua y solvente orgnico (matriz). Alhacer incidir un rayo laser, la matriz se sublimaarrastrando a la protena. Esta queda libre en fasegaseosa, asociada a protones que le ha cedido lamatriz, la que se ioniza por efecto del laser.Luego las molculas de protena cargada entranal espectrmetro de masas para su anlisis.

Las protenas ionizadas entran a un campo magntico donde su desplazamiento (time of


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p p g p (flight) es dependiente de su relacin m/z. (MALDI-TOF)

Esquema simple

Esquema ms detallado


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Una variante de la tcnica anterior consiste en hacer pasar una solucin lquida dela protena a travs de una aguja sometida a un alto potencial elctrico. La solucinse dispersa en minsculas gotas cargadas, se evapora espontneamente el solvente

cedindole protones a la protena. La protena cargada con los protones queda enfase gaseosa: ESI MS (electrospray ionization mass spectrometry)


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En ambos casos se forma un espectro de especies con diferente m/z. El espectrmetroregistra peaks que tienen una diferencia de carga de 1 y tambin una diferencia demasa de 1 (un protn).

Basta el anlisis de dos peaks vecinos para tener el PM (en cada caso se conoce el m/zpero no la masa ni la carga de cada peak, por eso se hace un sistema de dos ecuacionescon dos incgnitas). Pero la integracin de todos los peaks da una masa de la protenano cargada mucho ms exacta (inserto).


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La aplicacin de MS en tandem (MS/MS) permite deducir la secuencia de una protena.Esta se digiere primero con una proteasa. Se somete la mezcla de pptidos a ESI y stosson separados en un primer espectrmetro. Luego, cada pptido ionizado, incluyendotodas sus subespecies que difieren en carga, entra a una cmara al vaco donde es

fragmentado por un gas noble sometido a alta energa. Tpicamente cada pptido sefragmenta una vez en el enlace peptdico, que como no adiciona agua genera un radicalcarboxilo. A continuacin, el segundo espectrmetro mide m/z de todos los nuevospptidos que tienen carga, dando un conjunto de peaks que difieren en un aminocido.La diferencia de masa entre dos peaks vecinos revela el aminocido que falta. Unintegrador da la secuencia.

Espectro de un decapptido


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Tpico protocolo de protemica actual

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