Resultados de purificación de Proteínas (LDH)

a) Geles de cada uno de los equipos

b) Curva estándar

c) Interpolar valor de peso molecular LDH

d) Identificar la banda de interés en el gel de su equipo

Excelente trabajo a todos!!!

Como podrán observar hicieron un excelente trabajo al realizar la purificación

1. Se ven que la mayoría de los geles tienen un cargado de proteínas similar, los promedios grupales nos ayudaron en general, excepto el equipo 6.

2. Los equipos que realizaron la cromatografía de afinidad, aunque engorrosa por los volúmenes usados de elución, resulto, tienen una banda preferencial o única de proteína

3. Los equipos que realizaron la cromatografía de intercambio iónico tuvieron excelentes resultados, aunque tienen más de una banda hay una más intensa en el peso molecular esperado. Excepto el equipo 7, que obtuvo muy poca proteína y que casi no se ve en el gel, pero aún así tienen la banda del peso molecular esperado.

Continúan instrucciones

Muy bien chicos la prueba de fuego será la determinación de actividad.

De su gel determinen la distancia a la cual esperan el monómero de la LDH y ven si coincide con la banda que se enriquece (instrucciones al final de los geles)

Mi computadora del lab se descompuso así que les tome fotos con una cámara en mi casa, así que está un poco deformada la imagen.

Les llevaré sus geles a clase para que los vean en vivo y a todo color.

Equipo 1.

Carril Fracción 1 X 2 Std 3 F1 4 F2 5 F3 6 F4 7 FP1 8 FP2 9 FP3?10 X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Intercambio iónicoResina Intercambiador catiónicopH unión 6.5Buffer elución pH 6.5 + 1M NaCl

Equipo 2

Carril Fracción 1 X 2 Std 3 F1 4 F2 5 F3 6 F4 7 FP1 8 FP2 9 FP310 FP4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cromatografía de afinidadBuffer pH unión 6.5Buffer elución pH 6.5 + 1 mM NAD+

Equipo 3

Carril Fracción 1 X 2 Std 3 F1 4 F2 5 F3 6 F4 7 FP1 8 FP2 9 FP310 X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Intercambio iónicoResina Intercambiador catiónicopH unión 6.5Buffer elución pH6.5 + NaCl

500 mM NaCl750 mM NaCl1000 mM NaCl

Equipo 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Carril Fracción 1 X 2 Std 3 F1 4 F2 5 F3 6 F4 7 FP1 8 FP2 9 FP310 X

Cromatografía de afinidadBuffer pH unión 6.5Buffer elución pH 6.5 + 1 mM NAD+

Equipo 5

Carril Fracción 1 F1 2 Std 3 F2 4 F3 5 F4 6 FP1 7 FP2 8 X 9 X10 X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Intercambio iónicoResina Intercambiador catiónicopH unión 6.5Buffer elución pH6.5 + 1M NaCl

Equipo 6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Carril Fracción 1 X 2 Std 3 F1 4 F2 5 F3 6 F4 7 FP1 8 FP2 9 FP310 X

Cromatografía de afinidadBuffer pH unión 6.5Buffer elución pH 6.5 + 1 mM NAD+

Equipo 7

Carril Fracción 1 X 2 Std 3 F1 4 F2 5 F3 6 F4 7 FP1 8 X 9 X10 X

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Intercambio iónicoResina Intercambiador aniónicopH unión 8.6Buffer elución pH 8.6 + 1M NaCl

Instrucciones

Hacer curva de calibración con los estándares de peso molecular que se proporcionan en la siguiente transparencia,

Calcular los Rfs,

Rf =distancia recorrida de la proteína de interés

distancia total recorrida por el colorante

Realizar el gráfico del log del peso molecular vs Rf

Stds usados en el gel del equipo 6 y el mío

Curva std de proteínas1. Para encontrar en

donde está la banda de interés se hace una curva estándar.

2. interpolar el log del peso molecular y conocer en que posición o Rf debe estar la proteína

d PM(cm) (kDa)1.0 250-1.5 150-1.9 100-2.3 75-

3.15 50-

3.9 37-

5.05 25-5.8 _