Métodos cromatográficos

Bioquímica experimental.

Gpo 1.

2020-2

Algunas características de las proteínas.

• Difieren en:

• Forma• Tamaño • Función• Carga

• Estructural

• Transporte

• Receptores

• Reguladoras

• Enzimas

Purificación de proteínas

• Definir los objetivos de la purificación.

• Seleccionar la muestra biológica de inicio.

• Desarrollar una técnica de análisis.

• Minimizar la manipulación de la muestra.

• Remover los posibles contaminantes al inicio del proceso.

• Reducir el uso de aditivos.

• Usar una técnica diferente en cada paso.

• Minimizar el número de pasos.

Protocolo de purificación de proteínas

• 1ª fase: Ruptura de las membranas celulares, centrifugacióndiferencial o centrifugación usando gradiente de densidad.

• 2ª fase: Puede incluir la precipitación selectiva de proteínas por laadición de sales o disolventes miscibles en agua.

• 3ª fase: Se remueven las proteínas contaminantes utilizando laseparación basada en la carga, tamaño y afinidad de la proteína.

Técnicas de separación de proteínas

• Cromatografía de filtación en gel

• Cromatografía de intercambio iónico

• Cromatografía de afinidad

Cromatografía de filtración en gel

• Es una clase de cromatografía solido-líquido, permite separarmoléculas en función de su TAMAÑO.

• La fase estacionaria es un gel, con partículas esféricas que tienenPOROS de un determinado tamaño.

• Las particulas de TAMAÑO PEQUEÑO difunden a través de los porosde las particulas del gel, por lo que son RETARDADAS en su paso de lacolumna.

• Las MOLÉCULAS GRANDES no entran en los poros de las partículasdel gel, por lo que eluyen en ORDEN DECRECIENCTE de su PESOMOLECULAR.

Materiales para la filtración en gel

• Son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas seentrecruzan hasta formar una Red tridimensional conentrecruzamiento molecular al azar.

• Estos geles suelen ser de tres tipos Dextrano, agarosa ypoliacrilamida.

• Dextrano: polímero ramificado de Glucosa, entrecruzado y formadode pequeñas bolitas.

Aplicaciones de la filtración en gel

• Separar sustancias según su peso molecular.

• Purificar proteínas.

• Determinar peso molecular de proteínas.

• Eliminar sales, detergentes.

• Cambiar el amortiguador.

Determinar el peso molecular

• Existe una relación lineal entre el volumen de elución y el logaritmodel peso molecular de las proteínas.

• Si medimos el volumen de elucion de una proteína desconocida,utilizando la ecuación resultante de una curva de calibración(preparada con proteínas puras de peso molecular conocido) sepuede deducir aproximadamente el peso molecular.

+ 3 mL (A o C)

Amortiguador A (Afinidad)

Amortiguador C (Iónico)

20 mM de Tris/HCl, 0.5 mM β-Mercaptoetanol y

1 mM PMSFpH = 8.6 pH = 6.5

Aplicar vacío

TÉCNICA DE DESALADO QUE USAREMOS EN LA PRÁCTICA

FILTRACIÓN EN GEL. LA SAL DE AMONIO SE QUEDARÁ ATRAPADA EN LA MALLA DEL GEL Y LAS PROTEÍNAS SALDRÁN PRIMERO

+ 800 𝝁L de Fracción 3

+ 2 mL Amortiguador equilibrio de columna

Volumen vacío.

+ 1 mL Amortiguador equilibrio de columna

Fracción 4.100 𝝁L 800 𝝁LConcentración de proteína

TÉCNICAS PARA DESALADO

•FILTRACIÓN EN GEL•DIÁLISIS•ULTRAFILTRACIÓN

Diálisis (TÉCNICA DE DESALADO)

• Difusión a través de una membrana semipermeable.

• Aplicaciones:

Eliminar sales.

Concentrar macromoléculas.

Ultrafiltración (TÉCNICA DE DESALADO, DE CONCENTRACIÓN Y/O CAMBIO DE AMORTIGUADOR DE LA MUESTRA)

Cromatografía de intercambio iónico

• Fraccionamiento de proteínas que se desplazan a lo largo de unamatriz solida porosa.

• Se basa en la carga electrica de las proteínas.

• La matriz tiene una carga opuesta a la proteína que se quierepurificar.

• Se debe tener un pH determinado.

• Las proteínas eluyen de menor a mayor fuerza de unión.

Las proteínas son moléculas con carga.

pH disolución > pI = proteína carga (-) por desportonaciónpH disolución < pI = proteína carga (+) por protonaciónpH disolución = pI = proteína carga (0) precipitado insoluble

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LDH

Factores que afectan la retención

• Fuerza iónica.

• pH

• Modificadores orgánicos

Intercambiador catiónico

• Matriz sólida tiene grupos cargados negativamente.

• Fase movil tiene grupos cargados positivamente

Intercambiador aniónico

• Matriz sólida tiene grupos cargados positivamente.

• Fase movil tiene grupos cargados negativamente

Factores para eluir

• Aumentar la concentración de NaCl u otra sal en el buffer eluyente

Usos

• Se utiliza principalmente para separar proteínas de contaminantes, siempre que las diferencias entre las cargas sean lo suficientemente grandes.

• Separa aminoácidos, péptidos, nucleótidos. (Compuestos iónicos)

• En lab. Clínicos se usa para separar hemoglobina, isoenzimas y esteroides.

¿Cómo se va a eluir?

Cromatografía de afinidad

• Es una de las técnicas de purificación de proteínas mas utilizadas.

• Una proteína es capaz de unirse a un ligando específico (no covalente)

• El ligando está unido de forma covalente a una matriz cromatográfica porosa e inerte.

Fundamentos

• Las proteínas tienen afinidad biológica específica a un ligando en particular.

• Ejemplo:Proteína-Ligando.Enzima-Sustrato.Receptor-HormonaAntígeno-Anticuerpo.

Matriz cromatográfica

• Gran numero de grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con los ligandos.

• El mas usado: Agarosa, también se usa polímeros de acrilamida y sílices.

Ligandos:• Unión covalente con gel de

agarosa.

• Alta capacidad para atrapar proteína de interés.

• Enzimas, anticuerpos, gpos químicos específicos.

Ventajas:• Evita pasos extra de purificación

con respecto a tecnicas clásicas.

• Altos rendimietos y alta actividad específica.

• Separa proteínas, enzimas, anticuerpos, membranas, vitaminas, etc.

Esquema de purificación.1. Unión covalente de ligando con matriz.

2. Las proteínas se hacen pasar por la matriz.

3. Unión de la proteína que reconoce al ligando (no covalente)

4. Las demás proteínas y el resto se eluye.

5. Desprendimiento de la proteína por adición de sal, pH, temperatura o ligando libre.

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Conclusiones

• Técnica muy específica.

• Permite alto rendimiento y eficiencia.

• Menor cantidad de pasos posibles para purificación.