Universidad de Antofagasta

Facultad de Medicina y Odontología

Unidad de Biología Molecular

PURIFICACION DE PROTEINAS RECOMBINANTES (GFP)

Integrantes:

- Nicolás Mora

Purificación de Proteínas

Recombinantes Procedimiento Cromatográfico de la GFP

La purificación de proteínas recombinantes consiste en la obtención

de las proteínas sintetizadas por la bacteria, que son codificadas por un

gen que se insertó en ella mediante la metodología de transformación

génica.

Como muchas de estas proteínas no son liberadas al medio externo

por las bacterias, es necesario romper la pared celular de estas para

extraerlas y separarlas de otras proteínas, para esto se utilizan enzimas

como lisozimas, métodos de centrifugación, sonicación, cromatografía,

etc.

La Cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en la

separación de los componentes de una mezcla, los que interaccionan en

distinta forma con una matriz, de este modo, los componentes se van

separando.

En esta ocasión utilizaremos la Cromatografía de interacción

hidrofóbica (HIC) la cual implica una interacción entre los grupos

hidrofóbicos expuestos de las proteínas y los grupos hidrofóbicos de la

matriz cromatográfica Esta interacción se produce por la asociación de

regiones apolares en medio acuoso.

A continuación se desarrollará y analizará el proceso de purificación

de proteínas recombinantes realizado en Laboratorio.

De acuerdo a protocolo entregado en laboratorio, se recibió un

tubo de bacterias centrifugadas.

Estas bacterias corresponden a E.coli cepa HB 101 a las cual se les ha

introducido mediante la metodología de Transformación Génica, el

plásmido pGLO, que contiene el gen que codifica para la síntesis de la

Proteína Fluorescente Verde (GFP)

El pellet de bacterias contenidas en un tubo de microcentrifuga,

fueron observadas bajo la luz ultravioleta, y debido a la presencia de

la proteína GFP, éstas emiten fluorescencia.

Luego se resuspendió el pellet de bacterias de la ultima

centrifugación en 250 L de buffer TE o de elusión [0M] el que se

utiliza para que la proteína se reestructure.

MUESTRA A:

Esta muestra contiene 20L del resuspendido de bacterias, la cual al

ponerla en el trans-iluminador fluórese debido a la presencia de las

bacterias junto con la proteína GFP.

Luego se añadieron 20 L de lisozima a la muestra original, la cual es

una enzima utilizada para romper la pared celular y facilitar la extracción

de la proteína.

Después de esperar 5 minutos para que la enzima actué, se

homogenizo la muestra en un sonicador por 5 segundos a poder #7, lo cual

permite romper las células para luego separar las proteínas de los restos de

membranas, pared celular y otros residuos.

Equilibrio de la columna.

A la columna entregada, se le aspiro la solución contenida sobre la

resina y se añadió 2ml de buffer de equilibrio, el cual se dreno hasta que el

menisco de la solución de buffer tocara la superficie de la resina.

El propósito de agregar buffer de equilibrio (NH4)2SO4 (sulfato de amonio)

[2M], es que la proteína GFP se vuelva hidrofóbica y se una al columna.

Una vez sonicada la

muestra, se lleva a centrifugar

las bacterias lisadas a 10.000g.

por 10 minutos, lo cual permite

que la muestra quede dividida

en un sobrenadante y un

precipitado el cual corresponde

a los contenidos bacterianos y

restos de pared celular.

MUESTRA B

Se toman 20 L de sobrenadante de la muestra centrifugada y se

guardan en un tubo de microcentrífuga, el cual al observarlo bajo la luz

UV, fluórese pues se obtuvo del sobrenadante de la muestra anterior.

Esta muestra contiene proteínas variadas, entre ellas la que se desea

separar que es la GFP.

MUESTRA EQUILIBRADA.

En un nuevo tubo de microcentrifuga se agregaron 250 L de

sobrenadante y 250 L de buffer de enlace.

El buffer de enlace [4M], sirve para separar las proteínas y así hacer

mas fácil la obtención de la proteína deseada.

MUESTRA C

Para obtener la muestra c se cargo en la columna 250 L de la

muestra equilibrada.

Una vez cargada la muestra se retiro el tapón y se transfirió la

columna al tubo de colección C, en el cual no se observo fluorescencia

debido a que la proteína GFP queda en la columna y solo pasan al tubo

otras proteínas que no se desean obtener.

Esto se pudo constatar observando la columna bajo la luz UV, en la

cual se observa una pequeña porción de proteína GFP en la parte superior

de la resina.

MUESTRA D

Para obtener la muestra D se carago la columna con 250 L de

buffer de lavado [1,3M], el cual se utilaza para excluir las proteínas que no

se requieren, una vez cargada la muestra se dreno la columna sobre el

tubo de colección D, hasta pasar toda la solución de lavado.

Al observar el tubo colección D bajo la luz UV no se observa

fluorescencia, pues en el tubo están las proteínas restantes de la columna,

sin incluir la GFP.

MUETRA E

Para obtener la muestra E se cargo la columna con 700 L de buffer

elusión [0M], el cual se utiliza para que la proteína se reestructure; por lo

que ahora ésta fue drenada completamente y traspasada al tubo E, en

donde de observa fluorescencia por contener la proteína GFP que fue

separada de las demás.

Al observar los tubos C, D, E en el trans-iluminador se observa lo siguiente:

C = no se ve fluorescencia

D = no se ve fluorescencia

E = se ve fluorescencia

El contenido de los tubos de microcentrifuga que fluorecen en el

transiluminador corresponden a muestras donde la proteína GFP se

encuentra presente, ya sea en la bacteria, junto a otras proteínas o pura.

Esta proteína fue purificada (separada del resto de contenido de la

bacteria) mediante la técnica de Cromatografía de interacción

hidrofóbica.