PURIFICACIN DE PROTENAS

Cunta protena tengo?

MtodosEspectrofotomtricosAbsorbancia de luz UVColorimetraBiuretLowryBradfordFluorescamina

MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICAPor desaparicin de sustrato (S)

Por aparicin del producto (P) S + E P

Siempre debe acordarse que:En el extracto crudo y despus de cada etapa en una purificacin, se debe medir la cantidad de protena y la actividad enzimtica para poder evaluar la purificacin realizada.

Etapa de la purificacinProtena total (mg)Actividad Totalx10-3 (U)Rendi-Miento (%)Purifica-Cin(veces)Extracto crudo133.55136.62100.01.0

Se proceder a aislar la enzima de las otras molculas del medio, utilizando diferentes mtodos:

- precipitacin fraccionada - cromatografa

Precipitacin fraccionada

Precipitacin por sales (sales empleadas)Solventes orgnicos (etanol absoluto)Punto isoelctrico Por calor

Fuerza inica

pH

*Cromatografa

Cromatografa Es un proceso en el cual se realiza la separacin de molculas basada en diferencias de su estructura y/o de su composicin.

Cromatografa Las molculas en la mezcla tendrn diferentes interacciones con el soporte estacionario y as las mol-culas que se comporten de manera semejante ante el soporte, se separa-rn del resto.

Cromatografa lquidaExclusin molecular o filtracin en gelIntercambio inicoAfinidadInteraccin hidrofbica

Cromatografa lquidaEste es el mtodo mediante el cual las protenas son separadas de acuerdo a sus propiedades fsicas tamao, forma, afinidad por el ligando, carga, etc.

Cromatografa lquidaSe lleva a cabo en columnas cilndricas que acomodan en su interior a la matriz la cual retarda el flujo de algunas molculas mientras deja pasar a las dems.

Cromatografa de exclusin molecular(Filtracin en gel)Separa en funcin al tamao.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

Cromatografa de intercambio inicoSepara molculas con diferentes cargas netas.La matriz en la columna retardael paso de las protenas que tienen carga opuesta.

La cromatografa de intercambio inico se fundamenta en las propiedades cido-base de las protenas:

Una protena, a pH menor de su pI (punto isoelctrico), tendr carga positiva y a pH mayor de su pI presentar carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unir a una matriz con carga negativa y en el segundo a una matriz con carga positiva.

Cromatografa de intercambio inicoEjemplos de matrices:DEAE celulosa(dietilaminoetil)CM celulosa(carboximetil)

Cromatografa de intercambio aninico:

Cromatografa de intercambio aninico:

P-P-P-P-P-P-++Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-

Cromatografa de intercambio catinico:

Cromatografa de intercambio catinico:

--Na+Na+Na+Na+Na+

Na+P+P+P+P+P+P+

Una vez unida la protena a las matrices, stas se pueden eluir de dos formas distintas:

1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI

2) mediante la adicin de iones aadiendo el contrain correspondiente (Na+ en el caso de intercambio catinico).

Cromatografa de interaccin hidroffica

La cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC) es una de las principales tcnicas utilizadas para la separacin y purificacin de protenas en procesos biotecnolgicos. En HIC, las protenas se unen reversiblemente a ligandos hidrofbicos que se encuentran inmovilizados en el soporte cromatogrfico, debido a la presencia de una elevada concentracin de sal. La elucin se logra disminuyendo la fuerza inica en la fase mvil, formando un gradiente decreciente. Grupo fenilo de Phenyl Sepharose CL-4BGrupo octilo de Octyl Sepharose CL-4B

Cromatografa de afinidad

Cromatografa de afinidadLa finalidad de la cromatografa de afinidad es separar todas las molculas con una especificidad determinada del resto de molculas de una mezcla como por ejemplo, el suero sanguneo. Los anticuerpos en una muestra de suero especficos para un determinante antignico dado, pueden ser aislados utilizando cromatografa de afinidad.

Cromatografade inmunoafinidad

GRUPOS IMIDIAZOL(HIS)MATRIZAFINIDAD POR IONES METLICOS

Comprobacin de la pureza de la enzima

Electroforesis PAGE-SDSIsoelectroenfoque + PAGE-SDS (electroforesis bidimensional)

Electroforesis

Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE):

La cadena se despliega y se pierden las estructuras cuaternaria, secundaria y terciaria.

La cadena se despliega y se rodea de muchas molculas de SDS (dodecil sulfato de sodio).

Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (PAGE):Las numerosas cargas negativas que transportan las muchas molculas de SDS unidas a la protena hacen que la carga que sta transporta sea insignificante.

La cadena polipeptdica se transforma entonces en un objeto alargado cuya carga y longitud son proporcionales a la longitud de la cadena.

Cromatografa Bidimensional

Presentacin de los resultados

Presentacin de los resultadosUnidad(U), la cantidad de enzima que libera 1mmol de p-nitroanilina por minuto

Etapa de la purificacinProtena total (mg)Actividad Totalx10-3 (U)Rendi-Miento (%)Purifica-Cin(veces)Extracto crudo133.55136.62100.01.0Precipitacin por sales18.9837.6227.541.9Intercambio inico9.7237.5527.483.6afinidad5.5035.5023.706.0

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