“prototipo de un fotobiorreactor”

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA EN INGENIERÍA Y TECNOLOGÍAS AVANZADAS

U P I I T A

México, D. F. a 05 de Junio de 2006.

“Prototipo de un Fotobiorreactor”

Trabajo Terminal

Que para obtener el título de

“Ingeniero en Biónica”

Presentan:

López Sánchez Fernando Daniel Morales Narvaez Eden

Asesores:

Dra. Roxana Olvera Ramírez M. en C. Ricardo R. Horta Olivares

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA EN INGENIERÍA Y TECNOLOGÍAS AVANZADAS

U P I I T A

México, D. F. a 05 de Junio de 2006.

“Prototipo de un Fotobiorreactor”

Trabajo Terminal

Que para obtener el título de

“Ingeniero en Biónica”

Presentan: López Sánchez Fernando Daniel

Morales Narvaez Eden

Asesores:

___________________________ _________________________ Dra. Roxana Olvera Ramírez M. en C. Ricardo R. Horta Olivares Presidente del Jurado: Secretario del Jurado

___________________________ _________________________ Dra. Zinaida Andreevna Lovtchikova Dra. Lilia Martínez Pérez

_______________________________________________________________________________

PROTOTIPO DE UN FOTOBIORREACTOR.

Índice. Objetivos generales. 2 Objetivos particulares. 2 Abstract. 3 Resumen. 3 Justificación. 4 1. Antecedentes 5 2. Marco teórico. 9 2.1. Materiales de construcción. 9 2.2. Iluminación. 9 2.3. Trayectoria de la luz. 10 2.4. Circulación del medio de cultivo. 11 2.5. Temperatura. 11 2.6. Las cianobacterias. 12 2.7. Fotosíntesis. 13 2.7.1. Fotosíntesis y energía. 14 2.8. La Fotosíntesis en un reactor. 16

2.9. Modelo matemático del crecimiento de la biomasa en un fotobiorreactor.

17

2.10. El medio de cultivo. 19

3. Desarrollo. 20

3.1. Introducción. 20 3.2. Esquema general del sistema. 21 3.3. Diseño del contenedor. 22

3.3.1. Descripción. 22 3.3.2. Evolución del diseño del fondo del contenedor (en

base a experimentación). 23

3.4. El sistema airlift. 25 3.4.1. Modelo matemático del sistema airlift. 25 3.4.2. Descripción. 28

3.4.3. Algoritmo de mezclado airlift. 29 3.4.4. Circuito neumático del sistema airlift. 30 3.4.5. Circuito electrónico del control del sistema airlift. 31

3.5. El control de temperatura. 32 3.5.1. Descripción. 32

3.6. Iluminación. 33 3.7. Material biológico. 34 3.8. Instrumentos utulizados. 34 3.9. El protocolo de pruebas. 34

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3.10. Protocolo para la extracción y cuantificación de ficobiliproteínas que sintetizan las cianobacterias.

35

4. Resultados. 37

4.1. Introducción. 37 4.2. Experimentos. 38 4.3. Tabla de resultados. 42 4.4. Calidad de la biomasa (cantidad de las ficobiliproteínas). 43

5. Discusión y Conclusiones 44 Literatura citada 46 Glosario 49

AGRADECIMIENTOS

A la sociedad mexicana: por el sustento que brinda a las instituciones de educación pública.

Al Instituto Politécnico Nacional a la Unidad Profesional Interdisciplinaria en Ingeniería y Tecnologías Avanzadas, a la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas y al Departamento de Bioelectrónica del Centro de Investigación y Tecnologías Avanzadas: por hacer posible nuestra formación profesional.

A nuestros profesores: por impulsar nuestro desarrollo ético,

cultural, tecnológico e intelectual. A la Dra. Roxana Olvera Ramírez y el M en C. Ricardo Horta

Olivares (nuestros asesores): por su tiempo, atención, conocimientos, comprensión y observaciones otorgados para la culminación exitosa de este Trabajo Terminal.

A nuestros compañeros y amigos: por su amistad, confianza,

convivencia y paciencia. A nuestras familias: por su afecto, educación, apoyo moral, y

sustento económico. A nuestros padres y ancestros: por la vida.

Somos lo que pensamos Todo lo que somos surge con nuestros pensamientos Con nuestros pensamientos construimos al mundo

(Buddha)

DEDICATORIA A mi familia (materna y paterna), a mis padres, a mi hermano a mis profesores más brillantes, a mis Maestros y amigos más cercanos: dedico todo el esfuerzo que implicó este trabajo. A la Dra. Roxana Olvera Ramírez: dedico los resultados de este trabajo.

Eden Morales Narváez.

A mis grandiosos padres Gilberto y Laura fuente de amor, sabiduría y fortaleza. A mis bellas hermanas Alejandra y Cecilia por el cariño, la felicidad y dichas brindadas con su vida. A mis familias maternas y paternas por su disposición, ayuda y confianza otorgadas para mi desarrollo exitoso. A mis amigos más cercanos por su fidelidad y alegrías que alientan. A mis maestros por compartir su experiencia y conocimientos. Mención especial a nuestros asesores Dra. Roxana Olvera Ramírez y M. en C. Ricardo Roberto Horta Olivares por su gran disposición y ayuda.

A todos dedico este trabajo, infinitas gracias.

Fernando Daniel López Sánchez

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PROTOTIPO DE UN FOTOBIORREACTOR

(Una Fábrica Biónica)

Alumnos:

Morales Narváez Eden López Sánchez Fernando Daniel.

Asesores:

Dra. Roxana Olvera Ramírez. M. en C. Ricardo Horta Olivares.

Derechos Reservados

México, D.F. 2006

1

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PROTOTIPO DE UN FOTOBIORREACTOR

Objetivos Generales

• Diseñar y construir el prototipo de un fotobiorreactor para cultivar

cianobacterias. • Demostrar la productividad del llamado algoritmo de ascensión por

aire. • Experimentar el desempeño del prototipo con 3 cepas (Spirulina

maxima, Nostoc sp., Pseudanabaena tenuis).

Objetivos Particulares

• Diseño de la geometría del fotobiorreactor (diseño del contenedor). • Implementar un sistema hidroneumático para la circulación del

medio de cultivo. • Diseñar e implementar un sistema de control de temperatura (25 –

27 ºC). • Optimizar las condiciones de iluminación artificial para el cultivo

mediante tubos fluorescentes. • Realización de al menos 10 experimentos con el sistema para

evaluar su desempeño.

2

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Abstract

A photobioreactor is defined like a closed system employed to produce phototrophic biomass. This work is focus on the design and construction of a photobioreactor (for cyanobacteria growing) improving: construction materials, Illumination, light trajectory, circulation of the culture medium and temperature. Also prove the productivity of a novel mix system and contains a study of the culture under different light intensities.

Resumen

Un fotobiorreactor se define como un sistema cerrado dedicado a

producir biomasa fotoautotrófica, donde la energía es administrada por luz artificial. En otras palabras un fotobiorreactor esta diseñado para cultivar biomasa microbiana fotosintética, como lo son las microalgas y las cianobacterias.

En este trabajo se ha diseñado e implementado el prototipo de un

fotobiorreactor (para el cultivo de cianobacterias), optimizando sus siguientes parámetros: materiales de construcción, iluminación, trayectoria de la luz, circulación del medio de cultivo y temperatura del sistema. Aunado a ello, se demuestra la productividad de un innovador sistema de mezclado y se estudia el cultivo bajo distintas intensidades luminosas.

3

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Justificación

Los fotobiorreactores son sistemas muy caros (de miles a decenas de miles de dólares) y desafortunadamente en México es escaso su desarrollo y empleo, que es bastante prometedor como se ilustra al señalar algunos de los productos que se pueden obtener:

• Combustibles alternativos, como el hidrógeno. • Compuestos químicos “finos”, como ácidos grasos, pigmentos, etc. • Compuestos de interés farmacológico aplicados a la terapéutica. • En biorremediación, para la depuración de aguas residuales. • Biofertilizantes, debido a que algunas especies son capaces de fijar

nitrógeno atmosférico. • Alimentos de consumo humano o animal, como Spirulina maxima.

Generalmente la disponibilidad de comercialización para un fotobiorreactor es limitada (por el costo y personalización), este punto representa un problema para los investigadores que han descubierto la aplicación de alguna especie fotoautotrófica y desean incrementar su productividad o hacer comercial dicho descubrimiento. También esto estanca el impacto social de tal descubrimiento, es decir, aunque se cuente con la innovación científica y tecnológica no se da cabida al beneficio social.

A partir de las cianobacterias se puede obtener una ficobiliproteína

denominada ficoeritrina que es un compuesto de interés: farmacológico, empleado en el tratamiento del cáncer (Olvera, 2005); en la industria alimenticia como colorante; en cosméticos (Dainippon Ink and Chemicals, 1985); en el diseño y caracterización de sensores de luz y biosensores (Aygari et al, 1995); en microscopía de fluorescencia (Glazer y Stryer, 1984).

Bajo estas premisas, es posible sostener que el prototipo de un

fotobiorreactor posee un importante potencial social, económico, biotecnológico e industrial para nuestro país.

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1Antecedentes

En los ramos industrial y científico, existe un gran interés por la conversión

de luz en otros tipos de energía y el desarrollo de sistemas fotobiológicos para producir combustibles, fertilizantes y otras biomoléculas (Becker, 1994). Los fotobiorreactores sirven precisamente para este fin.

Dado que los microorganismos son verdaderas “fábricas químicas” –haciendo referencia a microalgas o cianobacterias– cultivados masivamente tienen aplicaciones prometedoras, especialmente en la producción de compuestos químicos “finos” y combustibles, en el tratamiento de aguas residuales, como intercambiadores iónicos y biofertilizantes, para la obtención de compuestos terapéuticos o aplicados a la terapéutica, y como alimento de consumo humano o animal (Contreras et al, 2003).

Producción de biomasa en Microalgas y Cianobacterias: sus insumos y productos potenciales.

Cultivos de Microalgas /

Cianobacterias

Luz

Fijación del N2

atmosférico

Nutrientes

CO2

H2O

Producción de O2

Cosecha

Tratamiento de aguas residuales

Energía: metano, H2

Biofertilizantes

Extracción de Metabolitos

Productos químicos

Alimentos de consumo humano y animal

Acuacultura

Figura 1.1. Producción de biomasa en microalgas y cianobacterias: sus insumos y productos potenciales.

(Modificado de Hall et al, 1992)

5

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En el laboratorio de Fisiología Vegetal, de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional∗, se ha investigado en la última década a las cianobacterias (Imagen 1y 2). – Los microbios al “especializarse” en la elaboración de determinados productos se convierten en microgeneradores, en laboratorios, en fábricas “vivientes” (Litinetski, 1975) –.

Imagen 1. Cultivos de cianobacterias. Laboratorio de Fisiología Vegetal, ENCB, IPN. (Octubre de 2005)

Imagen 2. Laboratorio de Fisiología Vegetal, ENCB, IPN. (Octubre de 2005).

∗ De este laboratorio se obtienen las cianobacterias destinadas a este trabajo.

6

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Como corolario de ello se ha logrado obtener sustancias de interés farmacológico. Después de identificar una especie y producto de importancia, el siguiente paso es el desarrollo de un bioproceso que permita hacer una coyuntura entre el descubrimiento y la comercialización (Barbosa, 2003). Esa coyuntura la determina un fotobiorreactor.

A partir de los años 50’s se empiezan a construir los primeros biorreactores en países como Israel y Japón. Ya en los 80´s hasta la actualidad su desarrollo se da con mayor ahínco en naciones como Alemania, Estados Unidos, Francia, Gran Bretaña, Holanda, India e Italia (incluyendo nuevamente a los primeros países mencionados) (Becker, 1994).

Sus materiales de construcción van desde arena, arcilla, ladrillos, cemento

hasta PVC resistente a la radiación UV, vidrio, fibra de vidrio, poliuretano, bolsas de polietileno, acrílico y acero inoxidable (Becker, 1994).

Hay muchas configuraciones de fotobiorreactores que han sido diseñadas

y construidas (figura 1.2) desde sistemas tubulares y cilíndricos (Pirt et al, 1983; Radmer et al, 1984; Chaumont et al, 1987; Pohl et al, 1987; Richmond et al, 1993; Spektorova et al, 1997; Ericksen et al, 1998; Merchuck et al, 2000; Suh y Lee, 2001; Babock et al, 2002), sistemas cónicos (Watanabe y Hall, 1996; Morita et al, 2001), hasta contenedores de placas planas (Delente et al, 1992; Iqbal et al, 1993; Hu et al, 1998). Estos sistemas emplean varias fuentes de luz –como el sol, diodos emisores, fibra óptica, tubos fluorescentes– (Radmer, 1990; Takano et al, 1992; Lee y Palsson, 1994; An y Kim, 2000). Como tal, cada sistema es altamente personalizado [varían en función de la especie y el producto (Barbosa, 2003)] (Behrens, 2005).

Figura 1.2. Tipos básicos de fotobiorreactores. a) Tipo carrusel, vista superior, los bloques negros indican propelas. b) Tipo plano, vista horizontal. c) Con iluminación interna, los bloques blancos indican espacios de iluminación. d) Tipo serpentín. e) Tipo tubular horizontal con sistema airlift (Contreras et al, 2003).

Los parámetros que deben ser considerados en el diseño de un

fotobiorreactor son: materiales de construcción, iluminación, circulación (del medio de cultivo), el pH, la temperatura y cómo proveer CO2 y remover el O2 (Behrens, 2005).

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Distintos tipos de fotobiorreactores y sus usos. Tipo Pv Pa DC Aplicación Referencia Sistema carrusel 0,18 27 0,4 Producción de biomasa Richmond, 2000 Plano vertical UADC

9,2 67,8 22,5 Fijación de CO2 del aire Hu et al., 1998

Plano inclinado ADC

4,3 51,1 8,4 Estudio del efecto de la trayectoria de la luz.

Hu et al., 1996 b

Plano inclinado UADC.

n.d n.d. 35 Estudio de la fisiología de los organismos en UADC

Hu et al., 1996 a

Triangular n.d n.d. 0,275 Remoción de amonio, nitrato y fósforo.

Sylvestre et al., 1996

Tanque agitado iluminado

n.d. n.d. 1,2 Remoción de amonio a altas concentraciones

Prosperi, 2000

Tubular horizontal

0,55 n.d. n.d. Prototipo de reactores horizontales con mecanismo airlift

Richmond et al., 1993

Tubular inclinado 1,47 n.d. n.d. Con mezcladores estáticos internos

Ugwu et al., 2002

Tubular helicoidal cónico.

n.d. 33,2 n.d Prototipo agitado neumáticamente

Morita et al., 2002

Iluminado cuasi-internamente UADC

n.d. n.d. 2x109 cel/ml

Prototipo de UADC con ultrafiltración e iluminación con diodos

Lee y Palsson, 1994

Iluminado internamente

n.d. n.d. 30 Prototipo de reactores de UADC

Javanmardian y Palsson, 1991

Tubular horizontal ADC

1,6 27 4,8 Prototipo de producción de biomasa

Richmond, 2000

Plano vertical ADC 2,4 66 6 Prototipo de producción de biomasa

Richmond, 2000

Plano inclinado ADC

0,9 110 2,2 Prototipo de producción de biomasa

Richmond, 2000

Tubular horizontal ADC

n.d. 30 6,5 Producción de biomasa Gudin y Chaumont, 1991

Plano horizontal. n.d 30 2 Producción de biomasa Gudin y Chaumont, 1983 Plano vertical

1,93 n.d. n.d. Estudios de fotoinhibición en diferentes geometrías

Tredici y Zitteli, 1998

Serpentín vertical 1,64 n.d. n.d. Estudios de fotoinhibición en diferentes geometrías


Serpentín horizontal 0,9 n.d. n.d. Estudios de fotoinhibición en diferentes geometrías


Airlift

0,34 n.d. n.d. Estudio y caracterización de reactores airlift.

Sánchez et al., 2000

Tabla 1.1. Distintos tipos de fotobiorreactores y sus usos. Pv: productividad volumétrica (g/l·día), Pa: productividad por área (g/m2·día) salvo donde se indique, DC: densidad celular máxima alcanzada (g/l). ADC: alta densidad celular, UADC: ultra alta densidad celular. n.d.: no descrito. (Contreras et al, 2003).

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2 Marco Teórico

2.1. Materiales de Construcción. Por sus características mecánicas y su traslucidez, los materiales más recomendados para los fotobiorreactores son el vidrio y el acrílico (Behrens, 2005).

Propiedad Vidrio (borosilicato)*

Acrílico (metacrilato)**

Densidad 2.2 g/cm³ 1.19 g/cm³ Módulo de elasticidad 63 kN/mm² 3.3 kN/mm2

Coeficiente de Poisson 0.2 0.45 Índice de refracción 1.472 1.491

Tabla 2.1. Propiedades del vidrio y del acrílico

2.2. Iluminación. La iluminación es el más importante parámetro en el

diseño y construcción de un fotobiorreactor ya que el crecimiento de las cianobacterias se ve limitado por una escasez de luz y deteriorado por un exceso de luz (Behrens, 2005). El flujo de energía luminosa decrece exponencialmente en la medida que una célula se aleja de la fuente de irradiación, como se muestra en la figura 2.1.

Distancia a la fuente de luz

μmax μ

I

I

I

Figura 2.1 Iluminación y crecimiento local como función de la distancia a la fuente de luz (Ericsson y Lee, 1986)

* http://jimenezcristaleros.es/p163. html (1/11/2005)

** http://www.eis.uva.es/~macromol/pmma/documentacion/propiedades.htm (1/11/2005)

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De acuerdo a la experiencia con el diseño de fotobiorreactores, se deben

de tomar en cuenta los siguientes aspectos en su construcción, (Merchuk y Wu, 2002):

1. Un exceso en la intensidad luminosa puede mermar el índice de

crecimiento del cultivo (μ), a veces de manera drástica. Así es como ocurre la fotoinhibición, donde la energía administrada ya no se aprovecha.

2. Un exceso de iluminación provoca que el crecimiento de la biomasa se

detenga, hasta llegar a un punto en el que el fotobiorreactor es improductivo por completo.

3. El flujo luminoso que produce sensibilidad a la fotoinhibición depende

de la concentración de la biomasa [g l-1] en virtud del fenómeno de absorción y dispersión de las células.

4. En ausencia de luz, la biomasa (el producto del fotobiorreactor) de

hecho puede decrecer.

5. El mezclado o circulación (del medio de cultivo) tiene gran influencia en el índice de crecimiento del producto.

2.3. Trayectoria de la Luz. La trayectoria de la luz es la distancia transversal que debe recorrer un fotón para pasar a través de un fotobiorreactor (Richmond, 1996). En algunos cultivos se ha encontrado que la luz penetra sólo una pequeña fracción (10-30%) del volumen total del cultivo (Contreras, 2003). Al reducir la trayectoria de la luz se obtiene un aumento significativo de la densidad celular óptima y la velocidad específica de crecimiento del cultivo (Hu et al, 1996).

Figura 2.2. Trayectoria de la luz y ciclos luz /oscuridad (Contreras et al, 2003).

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2.4. Circulación del Medio de Cultivo. Este aspecto es muy importante para hacer más eficiente la iluminación de las cianobacterias (como se explica en el apartado 2.8), su adecuado intercambio gaseoso y el control de la temperatura del cultivo (Behrens, 2005). También evita la sedimentación de células y la concentración de nutrientes.

Los métodos de mezclado que se utilizan en los fotobiorreactores más

recientes son las columnas de burbujas y la ascensión por aire (airlift, en el idioma ingés). En las columnas de burbujas, como su nombre lo dice, se mezcla el cultivo a través de las burbujas que genera un gas que se inyecta de manera continua al medio de cultivo, por lo que siempre es ascendente y no existe una zona específica de retorno gravitacional. En un sistema de ascensión por aire (airlift) existen dos zonas divididas físicamente: una zona ascendente –provocada por burbujas–, y otra descendente –generalmente por descarga gravitacional–.

Figura 2.3. Tipos de mezclado. A: Columnas de burbujas. B: airlift ascendente en el centro. C: airlift ascendente en la periferia.

2.5. Temperatura. La temperatura apropiada para cultivar

cianobacterias es de 25 a 27º C (Olvera, 2005). Una técnica de enfriamiento es la convección. La convección es la

transmisión de calor debida al flujo de corrientes en el interior de una masa fluida; es decir, un líquido o un gas que circulan alrededor de la superficie de un cuerpo más caliente o más frío. Matemáticamente se define como se muestra a continuación.

TAQ Δ⋅⋅= λ [W].

Donde λ es el coeficiente de conductividad térmica [W/m2 ºC], A el área

de la superficie [m2] y ΔT = Tw – Tf [ºC] (Tw es la temperatura de la superficie y Tf la temperatura del gas).

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2.6. Las Cianobacterias.

Las cianobacterias son procariotes fotosintéticos que poseen la habilidad de sintetizar ficobiliproteínas (que son pigmentos fotosintéticos) y sintetizar la clorofila a (Whitton y Potts, 2000). Geólogos y geoquímicas concuerdan en que las cianobacterias poseen una larga historia evolutiva de al menos 3500 millones de años (Whitton y Potts, 2000).

A las cianobacterias podemos encontrarlas prácticamente en todos los

medios. Crecen en desiertos, regiones volcánicas, aguas termales, capas de hielo polar, mares, ríos y montañas. Ellas son responsables de alguna parte del ciclo del carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo e hidrógeno (Hall y Rao, 1994). Como consecuencia, las cianobacterias juegan un papel crucial en el mantenimiento de la estabilidad de la corteza terrestre y la fertilidad del suelo; inclusive son muy importantes en la formación de estratos ricos en petróleo (Whitton y Potts, 2000).

Figura 2.4. Estructura de los grupos cromóforos de las ficobiliproteínas (Glazer, 1988). En la membrana de las cianobacterias, conocida como tilacoide, se realiza el proceso fotosintético. Allí se encuentran las ficobiliproteínas que son verdaderas antenas cuánticas que transfieren energía a la clorofila. Las ficobiliproteínas se aglutinan en cuerpos llamados ficobilisomas (Figura 2.5), cada ficobilisoma consiste en un centro triangular rodeado por seis varillas en su periferia. El centro triangular, que está en contacto directo con la membrana tilacoide, contiene aloficocianina, mientras que las varillas contienen ficocianina y ficoeritrina. Los ficobilisomas están dispuestos en filas paralelas en la capa externa de la membrana tilacoide. La gran proximidad que existe a la membrana tilacoide es esencial para una máxima transferencia de energía por resonancia que acontece en la fase inicial de la fotosíntesis (Fay, 1983).

12Figura 2.5. Ficobilisoma

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2.7. Fotosíntesis. La fotosíntesis es un proceso metabólico complejo, donde la radiación luminosa que llega a la tierra en forma de fotones es captada por los organismos fototróficos –a través de pigmentos fotosintéticos (como las clorofilas, carotenoides y ficobiliproteínas)– y así trasforman el agua y CO2 en compuestos orgánicos (carbohidratos). Expresándose generalmente como:

( ) ↑+⎯→⎯+ 222 OCHOOHCO n

Luz Tipo de pigmento Absorción máxima [nm] Organismo fotosintético. CLOROFILAS Clorofila a 420, 660 Todos los organismos fotosintéticos Clorofila b 435, 643 Todas las plantas y algas verdes Clorofila c 445, 625 Diatomeas y algas cafés Clorofila d 450, 690 Algas rojas CAROTENOIDES β-caroteno 425, 450, 480 Plantas y la mayoría de algas α-caroteno 420, 440, 470 La mayoría de plantas y algunas

algas FICOBILIPROTEÍNAS Ficoeritrinas 490, 546, 576 Algas rojas y algunas

cianobacterias Ficocianinas 618 Cianobacterias y algunas algas

rojas

Tabla 2.2. Los pigmentos fotosintéticos (Hall y Rao, 1994)

Figura 2.6. Espectro de absorción de las

ficobiliproteínas (Hall y Rao, 1994).

13

_______________________________________________________________________________

2.7.1. Fotosíntesis y energía. De acuerdo a la ley de la equivalencia fotoquímica de Einstein, una

molécula simple reaccionará sólo después de haber absorbido la energía de un fotón (hν). Entonces un mol (gramos-molécula) de un compuesto debe absorber la energía de N fotones (N = 6.023 x 1023, el número de Avogadro), esto es Nhν, para comenzar una reacción. La energía total de los fotones absorbidos por 1 mol de un compuesto es conocido como un Einstein (un Einstein=6.023 x 1023

fotones) (Hall y Rao, 1994).

λν hcNNhE == Siendo c la constante de la velocidad de la luz (3 x 10 m s ) y h la 8 -1

constante de Plank, Jsh 34106261.6 −×=

Longitud de onda [nm]

Color Nivel energético [J mol-1]

[kcal mol-1]

[eV fotón-1]

700 Rojo 17.10 x 104 40.87 1.77650 Naranja-rojo 18.40 x 104 43.98 1.91600 Amarillo 19.95 x 104 47.68 2.07500 Azul 23.95 x 104 57.24 2.48400 Violeta 29.93 x 104 71.53 3.10

Tabla 2.3. Niveles energéticos de la luz visible (Hall y Rao, 1994)

Las longitudes de onda (λ=νΤ ) propicias para la fotosíntesis presentan altos

gradientes en el espectro del azul y del rojo, como se observa en la figura 2.7*.

Figura 2.7. Curva de la distribución espectral propicia para la fotosíntesis, Tubo fluorescente Fluora*.

* Tomado del catálogo de OSRAM. www.osram.com (17/10/05)

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Término Unidades Definición

Energía radiante J Energía en forma de radiación electromagnética

Flujo Radiante W = J s-1 Energía radiante emitida o absorbida por una superficie por unidad de tiempo.

Densidad de flujo radiante

W m-2 Flujo radiante (de una longitud de onda específica) incidente en una sección infinitesimal de una pequeña esfera.

Irradiancia W m-2 Flujo radiante incidente por unidad de área por tiempo

Densidad de flujo de fotones (PFD)

mol m-2 s-1 Flujo de fotones por unidad de área

Radiación fotosintéticamente activa (RFA)

Radiación solar en el ancho de banda de 400 a 700 nm.

Densidad de flujo de fotones en la fotosíntesis (PPFD)

mol m-2 s-1 Flujo de la radiación solar de 400 a 700 nm

Tabla 2.4. Terminología para la irradiación (Hall y Rao, 1994).

Fuente de luz Luz de día Halogenuro

metálico Sodio

(Alta presión) Mercurio Luz blanca

fluorescente Incandescente

Conversión Factor W m-2 (RFA) a μmol m-2 s-1

(RFA)

4.6

4.6

5.0

4.7

4.6

5.0

klux a μmol m-2 s-1

(RFA)

18

14

14

14

12

20

klux a W m-2 (RFA)

4.0 3.1 2.8 3.0 2.7 4.0

Tabla 2.5. Factores de conversión, aproximados, para varias fuentes de luz [RFA (Radiación fotosintéticamente activa), ancho de banda: 400-700 nm]. (McCree, 1981).

15

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2.8. La Fotosíntesis en un Biorreactor. En un fotobiorreactor, los microorganismos que están más cercanos a la

fuente de luz son expuestos a una alta densidad de flujo de fotones, lo cual incrementa el índice de crecimiento del cultivo (al menos que la iluminación en determinada posición sea tan grande como para causar fotoinhibición). Las células de la parte media (media radial, para este trabajo) y periferia del reactor reciben menos luz como resultado de la sombra causada mutuamente y se presentará un índice de crecimiento más pequeño (Bannister, 1979; Laws y Bannister, 1980; Rhee y Gotham, 1981; Molina Grima et al, 1993). Ha sido demostrado que el índice de crecimiento no solo es afectado por la intensidad luminosa sino también por los casos de iluminación que las células experimentan (Lee y Pirt, 1981). En virtud de todo esto se utiliza el mezclado, para incrementar la disponibilidad de luz y que las diferentes células inmersas tengan periodos de luz y sombra. Así se optimiza el trabajo de las celdas fotosintéticas, removiendo el medio de cultivo (con un fluido dinámico), cuya representación matemática descriptiva se presenta en la figura 2.8.

Sombra

Luz

(x1 x2) Captura de fotones

Recuperación (x3 x1)

Biomasa (x2 x1)

Ciclo de Luz/Sombra

(fluido dinámico)

Biomasa (x2 x1)

Desactivación de PSF (x2 x3)

Recuperación (x3 x1)

Figura 2.8. Representación esquemática de la interacción de la fotosíntesis cinética y el fluido dinámico en un biorreactor. El reactor se divide en 2 regiones una de sombra y otra iluminada. Los fotones son captados en la región de iluminación, donde ambas: fotosíntesis y desactivación de la PSF toman lugar. Las células son cíclicamente transportadas a la zona de sombra, donde la recuperación de la PSF se presenta (Merchuk y Wu, 2002).

16

_______________________________________________________________________________

2.9. Modelo Matemático del Crecimiento Cinético de la Biomasa en un Fotobiorreactor (Merchuk y Wu, 2002).

Nomenclatura.

I = Densidad de flujo de fotones, μE m s-2 -1

PSF = Fábrica fotosintética (Photosynthetic Factory), adimensional = Fracción de la PSF en estado abierto, adimensional x1

= Fracción de la PSF en estado cerrado, adimensional x2

= Fracción de la PSF en estado inhibido, adimensional x3

α = Constante del índice de fotones empleados para transferir x -11 ═> x2, (μE m )-2

β = Constante del índice de fotones empleados para transferir x -12 ═> x3, (μE m )-2

δ = Constante del índice de transferencia x3 ═> x1, s-1

γ = Constante del índice de transferencia x2 ═> x1, s-1

μ = Índice específico de crecimiento, h-1

Me = Mantenimiento, s-1

Existe un modelo cinético planteado por Eilers y Peeters (1988) que es de

gran utilidad para ilustrar la actividad en un fotobiorreactor. Su modelo describe los procesos fotosintéticos incluyendo la fotoinhibición y la recuperación de la fotoinhibición y esta basado en el concepto de una fábrica fotosintética (PSF, “photosynthetic factory”). Una PSF se define como la suma de luz atrapada en un sistema, la cual es activada por una cantidad conocida de energía luminosa para producir cierta cantidad de un producto fotosintético. Una importante premisa es suponer que la PSF posee tres estados:

x1. Estado abierto, indica que un fotón puede entrar a la PSF. -

x2. Estado activo, cerrado (ocupando la energía para la fotosíntesis). -

x3. Estado inhibido. - La PSF en estado abierto puede ser estimulada y transferida al estado

activo cuando captura un fotón. La PSF en estado activo tiene dos posibles caminos: recibir otro fotón para pasar al estado inhibido o bien procesar la energía, ya recibida, para comenzar a realizar la fotosíntesis y luego retornar al estado abierto. La PSF inhibida puede eventualmente recuperarse y retornar al estado abierto como se muestra en la figura 2.9.

Ι Ιγ

αΙ

δ βI

X1 X2

X3

Fotones FotonesFigura 2.9. Diagrama de estados del modelo: Los fotones son capturados por la PSF en el estado x1, el cual pasa al estado x2 con un índice que es proporcional a αI. La PSF en estado x2 puede regresar el estado x1 con un índice constante γ, o bien capturar otro fotón y pasar al estado inhibido x3. La PSF en el estado x3 regresa al estado x1 con un índice constante δ. La cadena de reacciones en sombra es iniciada por el pasaje directo x2═>x1 (Merchuk y Wu, 2002).

17

_______________________________________________________________________________

La estructura del modelo, que se muestra en la figura 2.8, es para el caso más sencillo de iluminación que pueda ocurrir: una situación donde sólo hay dos regiones en el biorreactor, una iluminada, con una intensidad de luz conocida, y la otra completamente sombreada. Bajo estas condiciones el crecimiento del cultivo puede ser visto como el resultado de cuatro eventos simultáneos.

1. Al capturarse un fotón comienza una cadena de reacciones bioquímicas que dirigen la síntesis de la biomasa. En términos de una PSF, se ilustra como x1═>x2.

2. La iniciación de la cadena de reacciones en sombra x2═>x1. 3. La pérdida reversible de la actividad de fotones atrapados causados por

la alta intensidad luminosa (fotoinhibición), que en términos de una PSF se representa como x2═>x3.

4. La recuperación después de atrapar un fotón, indicada como x ═>x3 1.

Mientras los procesos descritos en los eventos 1 y 3 ocurren sólo en los lapsos de luz, los eventos 2 y 4 no necesitan de luz. El índice de crecimiento observado resulta de la integración de todos estos procesos descritos entorno a la historia del cultivo, o en los simples términos del esquema de la figura 2.9, el tiempo empleado por una célula en la zona iluminada y en la zona sombreada.

La descripción matemática del modelo se muestra a continuación con ecuaciones diferenciales básicas.

( ) 1.......1 21211 axxxIx

dtdx

−−++−= δγα

2......................2212 aIxxIx

dtdx

βγα −−=

( ) 3...............1 2213 aIxxx

dtdx

βδ +−−−=

4.....................................2 aMexk −= γμ

La ecuación a.1 expresa el índice total de la generación de fábricas fotosintéticas en estado abierto. De manera similar, las ecuaciones a.2 y a.3 determinan el índice total de generación de fábricas fotosintéticas en los estados cerrado e inhibido, respectivamente. La ecuación a.4 calcula el índice total de la formación de biomasa, incluyendo su mantenimiento.

18

_______________________________________________________________________________

2.10. El Medio de Cultivo. Existen numerosas formulaciones de medios de cultivo para microalgas y

cianobacterias bajo condiciones de laboratorio. Varias de ellas son modificaciones de fórmulas publicadas, otras son el resultado de un análisis del agua del hábitat nativo de alguna especie y consideraciones ecológicas. Las principales consideraciones para el desarrollo de una fórmula de nutrientes son las siguientes (Hall et al, 1992):

a) La concentración total de sales, que depende del origen ecológico

del organismo. b) La composición y concentración de los miembros iónicos como el

potasio, magnesio, sodio calcio, sulfato y fosfato. c) Fuentes de nitrógeno: nitrato, amonio y urea son usados generalmente

como fuentes nitrogenadas. d) Fuente de carbono: el carbono inorgánico generalmente se

administra en forma de gas CO2 del 0.05 al 5% mezclado con aire. Otra fuente es el bicarbonato.

e) pH usualmente en tendencias ácidas para evitar la precipitación de calcio, magnesio y oligoelementos.

f) Oligoelementos, generalmente administrados en una mezcla en concentraciones del orden de los microgramos por litro.

Los siguientes medios son para Spirulina maxima (Zarrouk, 1966), Nostoc y Pseudanabena tenuis (BG-11, Rippka et al, 1979).

Medio Zarrouk Medio BG-11

Compuesto [g/L] Compuesto [mg/L] NaHCO3 16.00 NaNO 1500 3

K2HPO4 0.50 K HPO 3H O 40 2 4 2

NaNO3 2.50 MgSO 7H O 75 4 2

K2SO4 1.00 CaCl 2H O 36 2 2

NaCl 1.00 Ácido Cítrico 6 MgSO4 7H2O 0.20 6 Citrato férrico amónico CaCl2 0.04 Na -EDTA 1 2

FeSO4 7H2O 0.01 Na CO (H O) 20 2 3 2

EDTA 0.08 Sol. micronutrientes 1 ml. Sol. micronutrientes 1 ml. Tabla 2.6. Medio Zarrouk Tabla 2.7. Medio BG-11

Solución de micronutrientes.

Compuesto [g/L] H BO 2.8600 3 3

MnCl 4H O 1.8100 2 2

ZnSO 7H O 0.2220 4 2

Na MoO 2H O 0.3900 2 4 2

CuSO 5H O 0.0790 4 2

Ca(NO ) 6H O 0.0494 3 2 2

Tabla 2.8. Sol. de micronutrientes

19

_______________________________________________________________________________

3 Desarrollo

3.1. Introducción. Diseño del contenedor: Se utiliza, en este prototipo, vidrio con un espesor mayor o igual a 0.25 cm

debido a que el diseño en este material es apropiado para los esfuerzos del sistema, es traslúcido y se cuenta con la instrumentación para esterilizarlo (a vapor–presión).

La iluminación del prototipo es interna al contenedor para aprovechar al

máximo la luz radial de un tubo fluorescente. Dicho tubo puede ser intercambiado en cualquier instante sin alterar el medio de cultivo.

Mezclado: Se utiliza para mezclar el medio de cultivo columnas de burbujas y un

innovador algoritmo de ascensión por aire. Los reactores con el sistema de elevación por aire (airlift, en el idioma inglés) poseen un gran potencial para bioprocesos industriales, en virtud de su bajo costo y la distribución homogénea que brinda su mezclado hidrodinámico (Vunjak, 2005).

Temperatura: Por una parte, aprovechando el sistema de ascensión por aire (airlift, en el

idioma inglés), se enfría un poco el sistema; sin embargo no se enfría lo suficiente por lo que se emplea el método de enfriado por convección a través de un serpentín. Así se acota la temperatura adecuada (25 a 27ª C) para el óptimo desempeño del cultivo en el fotobiorreactor.

Iluminación: Se utiliza una ruta luminosa no mayor a los 10 cm. Pues la luz en trayectos

más amplios no es bien aprovechada (Hu et al, 1996). Se emplean tubos fluorescentes debido a la distribución espectral que

presentan estas lámparas (ver figuras 2.7 y 3.14). Se ha descubierto que un foto-periodo con 18 horas de luz por 6 de

oscuridad es benéfico para las cianobacterias a cultivar (Olvera, 2005), ya que influye en su reproducción. El control incluye dicho fotoperiodo.

20

_______________________________________________________________________________

3.2 Esquema general del sistema El diseño de este fotobiorreactor está inspirado en trabajos como los que

han presentado Pohl, Kohlhase y Martin (1986), Takano et al (1992), Suh y Lee (2001), Zitelli et al (2003); que son fotobiorreactores cilíndricos con iluminación interna. Sin embargo no fue considerado un algoritmo de ascensión por aire (ver detalles en 3.4.2) a través de conos distribuidores.

Figura 3.1. Esquema general del sistema.

21

_______________________________________________________________________________

3.3 Diseño del contenedor. 3.3.1. Descripción. Como puede observarse en la figura 3.2, se trata de dos

cilindros (de vidrio) concéntricos. Está calculado para contener 4 litros aproximadamente a sus 43 cm. de altura. El cilindro interno es para soportar el tubo fluorescente; así mismo, el espacio delimitado entre el cilindro interno y externo es para contener el medio de cultivo. La trayectoria de la luz será de 3 cm. En su tapa posee un escape. En el fondo: se sitúan los distribuidores neumáticos necesarios para el sistema de ascensión por aire (airlift, en el idioma inglés) y en su centro hay una entrada para conectar un polo del tubo fluorescente.

Figura 3.2. Dibujo del contenedor, acotación: cm.

22

_______________________________________________________________________________

3.3.2 Evolución del diseño del fondo del contenedor (en base a experimentación).

1a Etapa. Cuenta con cuatro entradas neumáticas [para adaptar el sistema de ascensión por aire (airlift, en el idioma inglés)].

Bajo esta disposición, sólo tenemos cuatro columnas de aire que no son

suficientes para mezclar homogéneamente el medio de cultivo.

Figura 3.3. Primera etapa del diseño del fondo del contenedor.

2ª Etapa. Para tener más columnas de aire, se le adapta un distribuidor por

cada entrada neumática. Así; cada entrada neumática distribuye su contenido por 5 vías más, generándose así 20 columnas de aire disponibles.

Aquí se obtienen filas de aire que aun no tocan todo el espacio del contenedor y el mezclado que resulta bajo estas condiciones no es el esperado.

Figura 3.4. Segunda etapa del diseño del fondo del contenedor.

23

_______________________________________________________________________________

3ª Etapa (final). Se diseñan unos conos distribuidores y se ordenan como se muestra en la figura 3.5 (los círculos menores representan a los conos). Son un total de 6 y a cada 2 de ellos le corresponde una línea neumática independiente entonces hay 3 líneas neumáticas (A, B y C).

Con este diseño, se genera un “árbol” de burbujas por cada distribuidor cónico. Así se obtiene mezclado homogéneo, muy superior al de las dos etapas anteriores.

Figura 3.5. Última etapa del diseño del fondo del contenedor.

24

_______________________________________________________________________________

3.4. El sistema de ascensión por aire (airlift, en el idioma inglés).

3.4.1. Modelo matemático del sistema de ascensión por aire. Nomenclatura.

h = Altura [m]. r = radio de una esfera de gas [m] t = Tiempo [s]

= Densidad del medio de cultivo [kg m ]. ρ -3mc

ρg = Densidad del gas [kg m ]. -3

Δρ = Gradiente de densidad [kg m ]. -3

= Presión del gas [kg m s ]. P -1 -2g

= Presión del medio de cultivo [kg m s ]. P -1 -2mc

ΔP = Gradiente de presión [kg m s ]. -1 -2

vg = Velocidad del gas [m s ]. -1

= Aceleración del gas [m s ]. a -2g

= Fuerza de una burbuja del gas [kg m s ] F -2g

g = Constante de la aceleración de la gravedad [m s ]. -2

Para obtener este modelo matemático se ha elaborado un análisis

dimensional utilizando el teorema Pi de Buckingham.

hmin

hmax

Figura 3.6. Fenómeno del sistema de ascensión por aire. Un gas, con densidad ρg, es inyectado en hmax a una presión Pg en la base de un recipiente que contiene un medio de cultivo con una densidad ρmc que ejerce una presión Pmc. Dicho gas se desplaza en forma de burbujas a una velocidad vg hasta agotar una distancia h en hmin. El objetivo del sistema es mezclar el medio de cultivo.

25

_______________________________________________________________________________

Sean:

mcg

mcg PPP

ρρρ −=Δ

−=Δ

Teniendo así 4 variables (h, ΔP, Δρ y v ), 3 dimensiones [v, ρ, h] y un grupo Πg 1

adimensional.

( )( )

002

03

,,,

,,,23

1

231

=+=−

=−+−

=

=+−−−+−

−−−−

dda

dcb

kgsmPhv

mskgmmkgsmPhvdbdadcba

g

dddcbbaag

ρ

ρΠ Π Haciendo las dimensiones unitarias:

a

−

b Sea b =1, por lo tanto: d = -1, a = 2 y c = 0.

( ) 1,,,2

10121 =

Δ

Δ=ΔΔ=Π∴ −

Pv

PhvPhv ggg

ρρρ

ρΔΔ

=⎯→⎯Pvg

1.........bPP

vmcg

mcgg ρρ −

−=

Para obtener la velocidad del gas a cualquier altura h procedemos bajo el mismo

teorema con el fin de encontrar la presión superficial que ejerce el medio de cultivo en cualquier altura h, entonces encontramos: 4 variables (ρ , h, g y Pmc mc), 3 dimensiones [ρ, h, g] y un grupo Π adimensional. 2

( )( )

0022

03

,,,

,,,223

2

2232

=+=−−

=−++−

=Π

=Π+−−−++−

−−−−

dadc

dcba

kgsmPgh

mskgsmmmkgPghdadcdcba

mcmc

dddccbaamcmc

ρ

ρ

Haciendo las dimensiones unitarias:

Sea a =1, por lo tanto: d = -1, c = 1 y b =1.

( ) ghhPP

ghPhgPgh mcmcmc

mcmcmcmc ρ

ρρρ =⎯→⎯===Π∴ − )(1,,, 1111

2

26

_______________________________________________________________________________

Ahora se puede obtener la velocidad del gas como función de la altura así:

2.........)( bghP

hvmcg

mcgg ρρ

ρ

−

−=

Se analizan ahora estas 3 variables: Δh = h2 – h , a y Δv = v1 g g g2-vg1 bajo estas dos

dimensiones: ag y Δh. con el fin de hallar una expresión matemática para la aceleración del gas.

( )( )

020

,,

,,2

3

23

=−−=++

=ΔΠ

=ΔΠ−−++

−−

cacba

smvha

smmsmvhacacba

g

ccbaag


Sea a = 1, así: c = -2 y b = 1

( ) ( )h

va

v

havhavha g

gg

gggg Δ

Δ→=

Δ

Δ=ΔΔ=ΔΠ∴ −

2

2211

3 1,,

( ) ( )

3.........12

212

2

bhh

vvh

va ggg

g −

−=

Δ

Δ=

Finalmente se considera el volumen de una esfera de gas (Veg=(3/4)π r2 [m3]) de

radio r, con densidad ρ y aceleración a a fin de que sea posible estimar la fuerza (Fg g g) con que será golpeado – por el gas – algún cuerpo inmerso en el medio de cultivo.

( )( )

022033

0

,,,

,,,2233

4

23324

=−−=+−+

=+

=Π

=Π−−+−++

−−−

dadcba

ca

smkgaVF

smmkgmsmkgaVFdadcbaca

ggegg

ddccbaaaggegg

ρ

ρ


Sea a = 1, así: d = -1, c =- 1 y b =- 1

( ) ggeggggeg

gggeggggegg aVF

aVF

aVFaVF ρρ

ρρ =→===Π∴ −−− 1,,, 11114

4.........43 3 barF ggg ρπ ⋅=

27

_______________________________________________________________________________

3.4.2. Descripción. El innovador sistema de ascensión por aire (airlift, en el idioma inglés)

diseñado consta de un conducto vertical abierto por sus dos extremos, por un extremo se inyecta un gas (aire en nuestro caso) para suspender y mezclar el medio de cultivo y el otro extremo funge como escape.

Componente Concentración aproximada (en volumen)

Figura 3.7. Sistema airlift.

1. Nitrógeno (N) 78.03% 2. Oxígeno (O) 20.99% 3. Dióxido de Carbono (CO ) 00.03% 2

4. Argón (Ar) 00.94% 5. Neón (Ne) 00.00123% 6. Helio (He) 00.0004% 7. Criptón (Kr) 00.00005% 8. Xenón (Xe) 00.000006% 9. Hidrógeno (H) 00.01% 10.Metano (CH ) 00.0002% 4

11.Óxido nitroso (N O) 00.00005% 2

12.Vapor de Agua (H O) Variable 2

13.Ozono (O ) Variable 3

Tabla 3 1 Composición del aire puro

Si las 3 entradas neumáticas (A, B y C) se activaran siempre al mismo

tiempo, se trataría de un mezclado por columnas de burbujas y gran porción del cultivo tendería a ascender en la mayor parte del proceso. Al tenor de este caso, se ha diseñado un algoritmo de activación de las líneas neumáticas –designado como “algoritmo de ascensión por aire” (AAA)– tal que en ciertos instantes el cultivo experimente un retorno gravitacional en determinadas partes del reactor y en otras ascender impulsado por “árboles” de burbujas.

28

_______________________________________________________________________________

3.4.3. Algoritmo de ascensión por aire (AAA).

Línea neumática ‘X’ activa → 1 Línea neumática ‘X’ inactiva → 0 ‘k’ = constante de retardo.

Línea A ← 0 Línea B ← 0 Línea C ← 0 Tiempo ← ‘k’ Línea A ← 1 Línea B ← 0

Figura 3.8. Algoritmo de ascensión por aire.

Línea C ← 0 Retardo(tiempo)

Línea A ← 0 Línea B ← 1 Línea C ← 0 Retardo(tiempo)

Línea A ← 0 Línea B ← 0 Línea C ← 1 Retardo(tiempo)

29

_______________________________________________________________________________

3.4.4. Circuito neumático del sistema de ascensión por aire.

Figura 3.9. Circuito neumático del sistema airlift. Las electroválvulas son activadas por una señal generada en un

microcontrolador. Cada línea, al activarse, se dispersa por 2 conos distribuidores.

A través de este circuito neumático y otro electrónico encabezado por un microcontrolador se lleva a la práctica el algoritmo de ascensión por aire (AAA).

30

_______________________________________________________________________________

3.4.5. Circuito electrónico para el control del algoritmo de ascensión por aire.

Figura 3.10.a. Circuito electrónico para implementar el algoritmo de ascensión por aire.

Este sistema de control se vale de relevadores de 5V para activar las electroválvulas y la fuente de luz (para controlar el fotoperíodo con ciclos de 16 horas de luz por 8 horas de sombra).

31

_______________________________________________________________________________

3.5. Control de Temperatura.

Imagen 3.1.Serpentín para el control de temperatura.

3.5.1. Descripción. El sistema de ascensión por aire por sí solo enfría al sistema, en virtud de la

diferencia de temperaturas que existe entre el aire y el medio de cultivo, y lo mantiene entre 28 y 30 ºC; sin embargo no es suficiente para la temperatura que se desea acotar (25 - 27 ºC) por lo que se apela al enfriamiento por convección; es decir, se utiliza un serpentín de poliuretano cuyo diámetro y longitud son de 8 mm. y 6 m. respectivamente. El serpentín abraza en su exterior al contenedor y se le inyecta aire a una temperatura promedio de 17.5 ºC. Experimentalmente, esto fue suficiente para acotar la temperatura entre los 25 y 27 ºC.

Otra opción para controlar la temperatura es suministrar aire frío

(aproximadamente a 4.5 ºC) con un sistema de aire forzado, por orden de un microcontrolador, al detectar una temperatura mayor a los 27 ºC, sin embargo un sistema como este es mucho más costoso (se cotiza arriba de $1,500).

Se utilizó para sensar la temperatura un termopar tipo J de acero

inoxidable con un cuerpo de 30 cm de longitud y diámetro de 0.8 cm. Cuya señal se acondiciona con el siguiente circuito:

Figura 3.10.b. Circuito electrónico para el acondicionamiento de la señal del termopar.

32

_______________________________________________________________________________

3.6. Iluminación. Para activar el tubo fluorescente se utilizó el circuito de la siguiente figura:

Figura 3.13. Balastro electrónico. En los experimentos del sistema se emplearon 3 tubos distintos:

• Un tubo de luz de día de 15 w que emana una densidad de flujo de fotones de aproximadamente de 200 μE m s-2 -1¥, su espectro posee el comportamiento de la figura 3.14 . *

• Un tubo fluorescente de 8 w que despide 36 μE m s-2 -1¥ y su espectro no es especificado por el fabricante.

• Un tubo Fluora de 15 w con una densidad de flujo de fotones de 123 μE m-2 s-1¥, cuyo espectro es el de la figura 2.7.

Figura 3.14. Espectro del tubo de luz de día.

¥ Medido con un luxómetro marca Tenma, modelo 72-6693, y convertido de acuerdo a la tabla 2.5. * Tomado del catálogo de Silvanya, www.sylvania.com (06-04-2006)

33

_______________________________________________________________________________

3.7. Material Biológico. Cepa Aislada de

Arrozal de Cocoyoc, Edo. de México. Nostoc sp. Sosa Texcoco, Edo. de México. Spirulina maxima Lago de Valle de Bravo, Edo. de México. Pseudanabaena tenuis

Tabla 3.2. Material biológico

3.8. Instrumentos Utilizados.

Balanza analítica Scientech SA120, precisión: una diezmilésima de g. Espectrofotómetro Perkin Elmer Junior Model 35, precisión: una milésima. Phmetro Conductronic pH120, precisión: una centésima. Oxímetro Dissolved Oxygen YS155, precisión: una décima de mg L . -1

Manómetro de esfigmomanómetro Waitch, precisión: 2 mm Hg. Luxómetro Tenma 7266-93, precisión: 1 lux.

3.9. El Protocolo de Experimentación. 1. Preparar el medio de cultivo (de acuerdo a las tablas 2.6-8.). 2. Esterilizar el medio de cultivo (a vapor-presión. 15 minutos a 15 psi). 3. Lavar y esterilizar el contenedor. 4. Colocar el serpentín alrededor del reactor. 5. Instalar el tubo fluorescente. 6. Conectar el circuito neumático. 7. Conectar el circuito electrónico (en caso de utilizar AAA). 8. Pesar la biomasa inicial (inóculo). 9. Mezclar homogéneamente el inóculo con el medio de cultivo. 10. Accionar el circuito neumático. 11. Accionar el circuito electrónico (en caso de utilizar AAA). 12. Vaciar el medio de cultivo inoculado al reactor. 13. Colocar la tapa del reactor. 14. Aguardar el tiempo definido para el experimento. 15. Cosechar. 16. Filtrar el medio de cultivo con papel Whatman # 1. 17. Pesar la biomasa final. 18. Calcular la productividad.

34

_______________________________________________________________________________

3.10. Protocolo para la Extracción y Cuantificación de

Ficobiliproteínas que Sintetizan las Cianobacterias. 1. Pesar 0.05 g de biomasa. 2. Agregar 10 ml de regulador de fosfatos (0.1 M, pH=7.0) en un tubo de

muestreo de 15 ml. 3. Incorporar 5 ml de regulador de fosfatos en un homogeneizador de tejidos. 4. Añadir la biomasa al homogeneizador. 5. Homogeneizar. 6. Complementar con los 5 ml restantes de regulador de fosfato a la solución

homogénea. 7. Homogeneizar. 8. Vaciar la solución del homogeneizador al tubo de muestreo de 15 ml. 9. Tapar el tubo de muestreo. 10. Congelar y descongelar la solución 5 veces. 11. Agregar sulfato de estreptomicina al 1 %.

Nota: todas estas operaciones se realizan para 5 tubos de muestreo.

12. Realizar una lectura de la absorbancia de cada muestra en un espectrofotómetro a las siguientes longitudes de onda: 650, 620 y 565 nm.

13. Calcular la cuantificación de las ficobiliproteínas por medio de las siguientes ecuaciones (Tandeau de Marsac y Houmard, 1988):

.c.APPCA

PE

.c.AA

AP

.c.AA

PC

nm

nmnm

nmnm

3 ....... 7.12

34.18.2

2 ....... 65.519.0

1 ....... 38.77.0

565

620650

650620

⋅−⋅−=

⋅−=

⋅−=

Donde:

]. PC = Ficocianina [mg ml-1]. AP = Aloficocianina [mg ml-1

]. PE = Ficoeritrina [mg m1-1

A = Absorbancia [adimensional]. 14. Promediar los resultados de las cinco muestras. 35

_______________________________________________________________________________

Imagen 3.1. Fotobiorreactor diseñado

36

_______________________________________________________________________________

4 Resultados

4.1. Introducción. En este apartado se reporta la productividad [g L d-1 -1] del fotobiorreactor

diseñado, queda en función de los siguientes parámetros: Cepa: Spirulina maxima. Nostoc. Tipo de mezclado: Continuo (con todas las líneas neumáticas activadas

simultánemante). Algoritmo de ascensión por aire (AAA). Flujo de aire [L min ]. -1

Densidad de Flujo de Fotones [μE m s ]. -2 -1

Tipo de lámpara: Luz de día (Figura 3.14.), Fluora (Figura 2.7.). Temperatura [ ºC]. Biomasa inicial [g o ml de inóculo]. Biomasa final [g]. Volumen del medio de cultivo [L].

Número de días (que duró el cultivo) [d]. Se realizaron un total de 11 experimentos o pruebas. Las primeras dos pruebas funcionaron para establecer el protocolo que se utiliza en los experimentos subsecuentes. Las pruebas 3 a la 6, demuestran la utilidad del algoritmo de ascensión por aire. La prueba 7 es de alta densidad celular; es útil para observar el comportamiento del sistema, en altas concentraciones de biomasa, en relación a sus niveles de oxígeno disuelto y pH. A partir de la prueba 8 se cambian los tubos fluorescentes, y así la densidad de flujo de fotones, para optimizar las condiciones de iluminación. El primer experimento se realiza con Nostoc sp. Del segundo al décimo experimento se utiliza Spirulina maxima y en el décimo primero se experimenta con Pseudanabaena tenuis.

37

_______________________________________________________________________________

4.2.1. Primer experimento (Exp. 1). Cepa: Nostoc. Tipo de mezclado: continuo.

. Flujo de aire: 1.5 L min-1

Densidad de flujo de fotones: 200 μE m s . -2 -1

Tipo de lámpara: Luz de día. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 400 ml de inóculo. Biomasa final: 21.65 g. Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 7 d. Productividad: 1.30 g L-1 d . -1

Observaciones: 4.2.2. Segundo experimento (Exp. 2). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA).



Tipo de lámpara: Luz de día. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 400 ml de inóculo. Biomasa final: 8.44 g. Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 4 d. Productividad: 0.95 g L-1 d . -1

Observaciones: 4.2.3. Tercer experimento (Exp. 3). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: continuo.



Tipo de lámpara: Luz de día. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 0.228 g Biomasa final: 6.32 g. Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 5 d. Productividad: 0.61 g L-1 d . -1

Observaciones: A partir de esta prueba se emplean válvulas antirretorno y reguladoras en serie para alimentar a los conos distribuidores. También ya se tiene un protocolo de pruebas. 38

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4.2.4. Cuarto experimento (Exp. 4). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA).



Tipo de lámpara: Luz de día. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 0.228 g. Biomasa final: 6.93 g. Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 5 d. Productividad: 0.67 g L-1 d . -1

Observaciones: 4.2.5. Quinto experimento (Exp. 5). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: continuo.



Tipo de lámpara: Luz de día. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 0.228 g Biomasa final: 4.93 g. Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 5 d. Productividad: 0.47 g L-1 d . -1

Observaciones: 4.2.6. Sexto experimento (Exp. 6). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA).




Observaciones:

39

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4.2.7. Séptimo experimento (Exp. 7). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: continuo.



Tipo de lámpara: Luz de día. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 3 g. Biomasa final: 15.60 g. Volumen del medio de cultivo: 3 L. Número de días: 5 d. Productividad: 0.84 g L-1 d . -1

Observaciones: Este es un cultivo de alta densidad celular (≥3 g L-1). Se midió el pH = 9.5, y la cantidad de oxígeno disuelto = 6.8 mg L . -1

4.2.8. Octavo experimento (Exp. 8). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA).



Tipo de lámpara: fluorescente (no especificado por el fabricante). Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 0.228 g. Biomasa final: 1.51 g. Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 5 d. Productividad: 0.12 g L-1 d . -1

Observaciones: 4.2.9. Noveno experimento (Exp. 9). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA).



Tipo de lámpara: Fluora. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 0.228 g. Biomasa final: 4.95 g. Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 5 d. Productividad: 0.47 g L-1 d . -1

Observaciones:

40

_______________________________________________________________________________

4.2.10. Décimo experimento (Exp. 10). Cepa: Spirulina maxima. Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA).




Observaciones: 4.2.11. Décimo primer experimento (Exp. 11). Cepa: Pseudanabaena tenuis. Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA).



Tipo de lámpara: Fluora. Temperatura: 25 – 27 ºC. Biomasa inicial: 100 ml. de inóculo. Biomasa final: no cuantificada Volumen del medio de cultivo: 2 L. Número de días: 5 d. Productividad: no calculada. Observaciones: El cultivo se colapsó por fotoinhibición.

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4.3. Tabla de resultados.

Exp. Cepa Tipo de

mezclado Flujo de

aire [L min-1]

DFF [μE m-2 s-1]

Lám_para

Vol. [L]

Bi [g]

Bf [g] Días Productividad [g L

-1 d-1]

1 N. Continuo 1.5 200 LD 2 21.65 7 1.24* 2 S. m. AAA 0.8 200 LD 2 8.44 4 0.84*

S. m. 3 Continuo 0.8 200 LD 2 0.228 6.32 5 0.61 S. m. 4 AAA 0.8 200 LD 2 0.228 6.93 5 0.67 S. m. 5 Continuo 0.8 200 LD 2 0.228 4.93 5 0.47 S .m. 6 AAA 0.8 200 LD 2 0.228 6.03 5 0.58

7 S .m. Continuo 5.57 200 LD 3 3.000 5 0.84 15.60 8 S.m. AAA 0.8 36 n.e. 2 0.228 1.51 5 0.12 9 S.m. AAA 0.8 123 F 2 0.228 4.95 5 0.47 10 S.m. AAA 0.8 200 LD 2 0.228 6.69 5 0.64

Tabla 4.1. Resultados. DFF: Densidad de flujo de fotones. LD: Luz de día. F: Fluora. Bi: Biomasa inicial. Bf: Biomasa final. N.: Nostoc sp. S.m.: Spirulina maxima. P.t.: Pseudanabaena tenuis. AAA: Algoritmo de ascensión por aire. *Productividad estimada con un factor de crecimiento de la biomasa inicial de 28.73.

Productividad [g/ L d]

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Exp. 1

Exp. 2

Exp. 3

Exp. 4

Exp. 5

Exp. 6

Exp. 7

Exp. 8

Exp. 9

Exp.10

Gráfica 4.1. Productividad del fotobiorreactor en distintos experimentos.

42

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4.4. La Calidad de la Biomasa (Cantidad de las Ficobiliproteínas). Se evalúa la calidad de la biomasa, en este trabajo, en función de la cantidad de ficobiliproteínas [ficocianina (PC), aloficocianina (AP) y ficoeritrina (PE)] que presentó la biomasa en los experimentos 8º al 10º, de acuerdo al apartado 3.9.; ya que en dichos experimentos se utilizaron diferentes espectros, y densidades de flujo de fotones. Las siguientes graficas ilustran los resultados:

Gráfica 4.2. Abundancia de ficobiliproteínas en la biomasa del octavo al décimo experimento. PC: ficocianina. AP: aloficocianina. PE: ficoeritrina.

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

PC AP PE

[mg

/ mL] Exp. 8

Exp. 9Exp. 10

Gráfica 4.3. Abundancia comparativa de ficobiliproteínas en la biomasa del octavo al décimo experimento. PC: ficocianina. AP: aloficocianina. PE: ficoeritrina.

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5 Discusión y Conclusiones

La introducción de los conos distribuidores en el fondo del reactor, posee una gran ventaja ante los diseños anteriores para este trabajo ya que se forma un árbol de burbujas, en lugar de una línea. El mezclado que estos distribuidores proporcionan no permite que la biomasa se adhiera en las paredes del contenedor.

El algoritmo propuesto para el mezclado del cultivo representa una

innovación en fotobiorreactores. Las máximas productividades del prototipo se lograron con la mayor

densidad de flujo de fotones utilizada, junto con el algoritmo de ascensión por aire (AAA).

En general la productividad del sistema diseñado es muy aceptable, de

hecho se halla en los rangos de las productividades de los fotobiorreactores descritos en la tabla 1.1. Específicamente el fotobiorreactor airlift descrito en dicha tabla tiene una productividad de 0.34 g L d .-1 -1 En este trabajo se logró una productividad promedio de 0.63 g L d-1 -1 (promediando las productividades de los experimentos 4, 6 y 10).

Se cuenta con un fotobiorreactor diseñado bajo los resultados de las

últimas investigaciones del ámbito y se aporta el llamado algoritmo de ascensión por aire que, como se demostró, incrementa la productividad del fotobiorreactor hasta en un 23% (Los experimentos 4º y 6º poseen mayor productividad que los experimentos 3º y 5º; así se demuestra la eficiencia del algoritmo de ascensión por aire).

En virtud del séptimo experimento, es posible asegurar que, cultivando

Spirulina maxima, el sistema mantiene los niveles apropiados de pH y oxígeno disuelto (Vonshak, 1997) hasta en una densidad celular de 5.2 g L-1, que es la densidad celular al final del experimento y el momento de las mediciones.

Gracias al sistema de mezclado, la geometría del prototipo y por tanto la

distribución de la luz; la calidad de la Spirulina maxima producida en el reactor queda estandarizada (Del octavo al décimo experimento; a pesar de utilizar distintas lámparas, y así diversas densidades de flujo de fotones, se obtuvo una calidad muy homogénea de la biomasa).

44

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En el fotobiorreactor diseñado: la cepa Nostoc sp. posee una mayor

productividad que Spirulina máxima. La cepa Pseudanabaena tenuis, dentro del reactor, cae en el estado de

fotoinhibición a una densidad de flujo de fotones de 123 μE m s-2 -1. Pro lo que se ha de cultivar a una densidad e flujo de fotones más baja.

Con este prototipo, se obtiene un cultivo de alta densidad celular bajo las

siguientes condiciones: Cepa: Spirulina maxima.

Tipo de mezclado: algoritmo de ascensión por aire (AAA). . Flujo de aire: 0.8 L min-1


Tipo de lámpara: Luz de día. Temperatura: 25 – 27 ºC.

. Densidad celular inicial: 0.114 g L-1

Número de días: 5 d.

El diseño de este fotobiorreactor permite utilizarlo con otras cepas de cianobacterias con el fin de obtener una mayor producción de biomasa y es el punto de partida para un proceso de comercialización. Además posee la capacidad de variar las condiciones de cultivo para obtener una síntesis mayor de metabolitos.

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Glosario

Airlift. Sistema que produce movimiento en un medio acuoso a través de burbujas. Biofertilizantes. Abonos biológicos están basados en microorganismos que promueven y benefician la nutrición y el crecimiento de las plantas. Se trata de microorganismos del suelo, generalmente hongos y bacterias, que se asocian de manera natural a las raíces de las plantas de una forma más o menos íntima. Biomasa. Peso total de todos los organismos (o de algún grupo de organismos) que viven en un hábitat o lugar determinado. Biomoléculas. Las biomoléculas son las moléculas constituyentes de los seres vivos formadas por sólo cuatro átomos que son el hidrógeno, oxígeno, carbono, y nitrógeno, representando el 99 % de los átomos de los seres vivos. Biorreactores. Se refiere a un dispositivo o contenedor cerrado, empleado para generar productos usando las reacciones bioquímicas de sistemas biológicos, como reacciones enzimáticas y fermentación. Biorremediación. Es el proceso en el que se emplean organismos biológicos para resolver problemas específicos medioambientales, como la contaminación. Cianobacteria. Una cianobacteria es una bacteria acuática poseedora de pigmentos fotosintéticos y que libera oxígeno como subproducto de su metabolismo. El prefijo (ciano-) hace referencia al color azulado que poseen. Son también conocidas como algas verdeazuladas (fueron nombradas así en principio debido a la mala clasificación). La palabra alga usada en este contexto se refiere solo a la apariencia y actividad fotosintética, no a una relación de especies (las verdaderas algas son eucariotas). Ficobiliproteína. Complejo químico utilizado como trazador fluorescente. Fotoautotrófico. Que genera su propio alimento a partir de la luz. Fotobiorreactor. Los FBR implican un cultivo intensivo de una única especie algal y en el cual se controlan casi todas las variables del cultivo (densidad, pH, nutrientes, agitación, etc.). Fotosíntesis. La conversión de energía luminosa a energía química que tiene lugar en los cloroplastos de las células eucarióticas (algas y plantas) o en los tilacoides y protoplasma de las células procarióticas. Implica tanto la recepción de la energía lumínica, su conversión a energía química (ATP y NADPH) así como la fijación del dióxido de carbono en compuestos orgánicos. Fotosintético. Producto resultado del proceso de fotosíntesis. Microalgas. Son organismos unicelulares o pluricelulares, cuyas células funcionan independientemente, realizando todas las funciones vitales. La alimentación, en general, es fotosintética.

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“prototipo de un fotobiorreactor”

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