producción microbiana de biosurfactantes y polisacáridos extracelulares

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Lima, 2013

INTRODUCCIÓN

La actividad comercial, industrial y militar, en el siglo XIX y XX, han considerado los

problemas de contaminación medioambiental que pueden amenazar la salud humana y el

funcionamiento del ecosistema. El grado al que tales contaminantes están disponibles a la

biota ha sido largamente investigado para ver todas las implicaciones reguladoras,

científicas y toxicológicas. La biorremediación, el uso de organismos (especialmente

Alumnos: Armas Díaz, Alexandra Benavides Saldaña, Alejandro Barboza Tena, Marco Chero Floreano, Yonatan E.

Profesor: Blga. Maribel Huatuco Curso: BiotecnologíaTrabajo: Producción Microbiana De Biosurfactantes Y Polisacáridos Extracelulares

Producción Microbiana De Biosurfactantes Y Polisacáridos Extracelulares

microorganismos o plantas) para eliminar estos problemas de polución tiene un inmenso

potencial para conocer las necesidades del control de la contaminación.

En general, los surfactantes están integrados a procesos que utilizan diversos tipos de

industrias en áreas agrícolas, alimenticias, de cosméticos y petroquímica. La demanda

industrial de estas moléculas es alta en la industria petrolera, donde pueden ser

empleadas en la emulsificación de bitú-menes. Ello, por una parte, permite una

manipulación más fácil de los petróleos pesados durante su extracción y transporte y, por

la otra, se pueden emplear para elaborar fórmulas de mezclas de carburantes y agua.

Los surfactantes de origen biológico también se pueden emplear para desarrollar

procesos que se han denominado biodesulfuración, biocraqueo y bioremediación que

requieren de medios de cultivo con fases acuosas continuas. La ventaja de estos

biosurfactantes sobre los de origen químico es que son degradables

Ahora bien La posibilidad de obtener compuestos químicos de manera biológica ha

llevado a los investigadores a experimentar nuevas alternativas para su producción y ha

sido entonces cuando los procesos biotecnológicos han empezado a ocupar un lugar de

privilegio en la industria mundial. Dentro de este grupo de compuestos se encuentran los

biopolímeros, una diversa y muy versátil clase de nuevos materiales con potenciales

aplicaciones en muchos de los sectores de la economía. Estos van desde polisacáridos

como Dextranos, Alginatos y Xantanos hasta poliésteres como los Poli-hidroxialcanoatos

(PHA´s). Los polisacáridos, definidos como polímeros de unidades de azúcar unidas por

enlaces glicosídicos, han adquirido una importancia cada vez mayor en el mercado debido

a las ya reconocidas aplicaciones en campos como la farmacéutica, medicina, alimentos y

la industria petroquímica.

La obtención de este tipo de biopolímeros vía fermentativa es un proceso que está

siendo ampliamente estudiado; el número de polisacáridos que se descubren cada

día va en aumento y con ello la cantidad de nuevas estructuras con propiedades

diversas que le abren las puertas a nuevas aplicaciones.

La bacteria Rhizobium leguminosarum que ha sido utilizada como biofertilizante en

la industria agrícola por su capacidad para fijar nitrógeno atmosférico en plantas

leguminosas, es además un microorganismo capaz de producir tres biopolímeros

diferentes, que hasta el momento no han sido muy estudiados; dos de ellos son

Biotecnología Página 1


polisacáridos extracelulares, que se encuentran en el medio de cultivo y un tercero

que está adherido a la pared celular como polisacárido capsular.

BIOSURFACTANTE

¿Qué es un biosurfactante?

Los surfactantes son compuestos antipáticos, es decir que estructuralmente sus

moléculas presentan dos partes diferentes, una hidrofóbica y otra hidrofilia. Los

surfactantes de origen biológico o biosurfactantes son un grupo estructuralmente diverso

de moléculas tensoactivas, que presentan en general menor toxicidad y mayor

biodegradabilidad que los surfactantes sintéticos. Entre las aplicaciones más estudiadas



de los biosurfactantes están aquellas relacionadas con la industria del petróleo y la

bioremediación de sitios o residuos contaminados con hidrocarburos.

Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería una molécula biológica

(orgánica) con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficies

vivas, mayormente superficies de células microbianas, o excretados al medio extracelular.

En los últimos años ha crecido el interés por evaluar la potencial utilidad de los

biosurfactantes en las disciplinas médicas y veterinarias, dado que existen estudios que

demuestran propiedades antibacterianas, antimicóticas, antivirales e incluso antitumorales

en estos compuestos. Además, los biosurfactantes también han mostrado contrarrestar la

adhesión y la formación de biofilms de microorganismos patógenos. Algunos de esos

biosurfactantes han sido aplicados con éxito en el tratamiento de residuos oleosos.

Los biosurfactantes presentan varias ventajas con respecto a los surfactantes químicos,

entre ellas su biodegradabilidad, baja toxicidad, incompatibilidad, especificidad y la amplia

variedad de estructuras químicas disponibles. Estas características han permitido, en los

últimos años, el desarrollo de técnicas de remediación y de recuperación asistida del

petróleo residual que incluyen el uso de biosurfactantes, tanto a escala de laboratorio

como a campo.

¿Cómo Se Clasifican Los Biosurfactantes?

Los surfactantes microbianos son moléculas complejas que cubren un amplio rango de

estructuras químicas incluyendo péptidos, ácidos grasos, fosfolípidos, glicolípidos,

antibióticos, lipopéptidos, etc… Los microorganismos también producen en algunos

casos, surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras químicas como los

surfactantes microbianos poliméricos. Muchos surfactantes microbianos han sido

purificados y sus estructuras químicas son conocidas. Mientras que los de alto peso



molecular son generalmente heteropolisacáridos polianiónicos que contienen tanto

polisacáridos como proteínas, los de bajo peso molecular suelen ser glicolípidos

Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo a tres criterios: naturaleza química,

peso molecular y carga iónica de la parte superficialmente activa de la molécula.

1. Naturaleza química

a) Lípidos

b) Hidratos de carbono

c) Aminoácidos

d) Glucolípidos

e) Lipopéptidos

2. Peso molecular

a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolípidos. El más estudiado es el

rhamnolípido, producido por diversas especies como Pseudomonas. La

función principal de estos biosurfactantes es reducir la tensión superficial

entre fases (agua-roca por ejemplo).

b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas,

lipopolisacáridos o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no

son tan eficaces en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre

fases, pero si son bueno emulsionantes. Además se ha demostrado que

son muy eficaces a bajas concentraciones y poseen una considerable

afinidad por el sustrato. Un ejemplo sería Alasan producido por

Acinetobacter radioresistens.

3. Carga iónica

a) Agentes aniónicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos polares

solubles-carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una

cadena hidrocarbonada hidrófoba. Si esa cadena es corta son muy

hidrosolubles y en el caso contrario tendrán baja hidrosolubilidad y

actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan

principalmente en la industria de jabones y detergentes.



b) Agentes catiónicos: Están compuestos por una molécula lipofílica y otra

hidrofílica, consistente de uno o varios grupos amonio terciario o

cuaternario. Son utilizados comúnmente en detergentes, agentes

limpiadores, líquido de lavaplatos, tratamiento de textiles, como sustancias

activas antimicrobianas y en cosmética.

c) Agentes no iónicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso.

Las propiedades hidrofílicas son provistas por hidratación de grupos

amido, amino, eter o hidroxilo.

d) Otros tipos de surfactantes: La combinación en la misma molécula de un

grupo con tendencia aniónica y de un grupo con tendencia catiónica

produce un surfactante anfotérico, como por ejemplo los aminoácidos, las

betainas o los fosfolípidos. Según el pH del medio una de las dos

disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usa sólo en casos

particulares debido a su alto costo.

Estudio De La Producción De Biosurfactantes



El estudio de la producción de biosurfactantes es un punto a tomar en cuenta.

Principalmente se usan tres métodos para estudiar la producción de estas sustancias por

diversos microorganismos.

Estos tres métodos son: drop collapse, oil spreading y blood agar lysis. El estudio

comparativo de dichos métodos se basó en la capacidad de los mismos de detectar la

actividad tensoactiva de las sustancias estudiadas y aplicabilidad. Estos 3 métodos se

usaron para testar la producción de biosurfactantes en 205 estirpes medio ambiéntales

con diferentes afiliaciones filogenéticas.

El 60% de las estirpes que dieron positivo con el método blood agar lysis, dieron negativo

con los otros dos métodos, para la producción de biosurfactantes. El 38% de las estirpes

que dieron negativo con el método del blood agar lysis resultaron positivas con los otros

dos métodos. Así pues se pudo observar que existía una correlación lineal negativa muy

pronunciada entre el diámetro de la zona clara obtenida con el método del oil spreading y

la tensión superficial (rs=-0.959) y una leve correlación entre el drop collapse y la tensión

superficial (rs=-0.82) debido a la gran cantidad de falsos positivos y negativos obtenidos

por la técnica blood agar lysis y su pobre correlación con la tensión superficial (rs=-0.15),

no se utiliza como método para detectar la producción de biosurfactantes..

Esto nos sugiere que el método del oil spreasing es más preciso y más fiable que el

drop collapse. Visto los resultados se opta por usar como método primario para la

detección de biosurfactantes el método drop collapse, seguido de una determinación de

las concentraciones de los mismos por medio del método oil spreasing. Esto constituye

un protocolo rápido y sencillo para escudriñar y cuantificar la producción de

biosurfactantes

Para Qué Sirven Los Biosurfactantes?

Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los hidrocarburos del petróleo, suelos y

aguas del medio ambiente requieren su solubilización antes de ser degradados por la

célula microbiana. La mineralización está gobernada por la desorción de los hidrocarburos

del suelo. Los surfactantes pueden aumentar el área de los materiales hidrofóbicos, como

pesticidas en suelos y agua del medio, aumentándose así su solubilidad en agua. Por



tanto, la presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradación microbiana de los

contaminantes.

Se le ha dado una atención considerable a la producción de moléculas tensoactivas de

origen biológico por sus aplicaciones en el procesado de alimentos, aromatización de

bebidas alcohólicas, reciclaje de papel, fabricación de pulpa de papel, en farmacología, y

la industria del aceite. En relación a esa última aplicación, los accidentes que llevan a

vertidos de aceite han llegado a ser numerosos y han causado catástrofes tanto sociales

como ecológicas.

La habilidad de los biosurfactantes para emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha

sido ampliamente divulgada. Estas propiedades emulsionantes también se ha demostrado

que favorecen la degradación de los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los

hacen muy útiles para el control de la contaminación por vertidos de aceites.

El procedimiento mostrado en la figura es la flotación por aire disuelto. En este

procedimiento se introduce por el fondo de la celda de flotación una solución acuosa

saturada de aire bajo presión. Al suceder la expansión se forman burbujas de aire

minúsculas, las cuales colectan las gotas de aceite. Con surfactantes apropiados este

método se puede utilizar para separar una gran variedad de coloides.



FIG.- Métodos de separación no convencional de pequeñas gotas de aceite en medio

acuoso

Desde el punto de vista de las cantidades producidas, la utilización principal de los

surfactantes es la formulación de jabones, detergentes y otros productos para el lavado y

la limpieza. La figura muestra el caso de la acción detergente sobre un sucio

sólido. Las moléculas de detergente deben poder adsorberse sobre el sucio y sobre el

sustrato, y en particular situarse entre ellos para poder separarlos.

FIG.- Fenómenos puestos en juego en la acción detergente



Las funciones que harían estos biosurfactantes a la hora de aumentar la

biodisponibilidad serían

Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto

Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Serían en

este caso sobre todo los de bajo peso molecular.

Poseen también funciones evolutivas para los propios microorganismos.

Pueden ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las

gotas de petróleo una vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que

utilizaba.

Una propiedad de los biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dicha actividad

se debe a su capacidad detergente. Así pues, existen diferentes tipos de desinfectantes

(Se suelen clasificar de acuerdo con su mecanismo de acción):

I. Agentes que dañan la membrana

1. Detergentes

a) Catiónicos

b) aniónicos

c) no iónicos

2. Compuestos fenólicos

a) Fenol

b) Cresoles

c) difenilos halogenados

d) alquilésteres del para-hidroxibenzoico

e) aceites esenciales de plantas



3. Alcoholes

a) Etanol

b) b) isopropanol

II. Agentes desnaturalizantes de proteínas

1) Ácidos y bases fuertes

2) Ácidos orgánicos no disociables

III. Agentes modificadores de grupos funcionales

1. Metales pesados

a) Mercuriales

b) compuestos de plata

c) compuestos de cobre

2. Agentes oxidantes

a) Halógenos

b) agua oxigenada

c) permanganato potásico

d) ácido peracético

3. Colorantes

a) derivados de la anilina

b) derivados de la acridina (flavinas)

4. Agentes alquilantes

a) Formaldehido

b) glutaraldehido c) óxido de etileno

c) ß-propionil-lactona



Surfactantes Microbianos

El interés por los surfactantes microbianos ha estado en aumento en los últimos años

debido a sus diversas características deseables tales como una efectiva selectividad,

respetuosos para la naturaleza, su estabilidad a elevadas temperaturas, a pH y

concentración de sales. Hay que añadir que los biosurfactantes han aumentado la

versatilidad en comparación a muchos surfactantes sintéticos y tienen la ventaja de poder

producirse por fermentación.

Hay células microbianas intactas con una superficie celular altamente hidrofóbica que son

ellas mismas surfactantes. En algunos casos, los propios surfactantes juegan un papel

natural en el crecimiento de las células microbianas sobre sustratos insolubles en agua.

Los surfactantes extracelulares están implicados en la adhesión celular, emulsión,

dispersión, floculación, agregación celular y fenómenos de desorción.

Aunque el tipo y cantidad de surfactante microbiana producido depende primeramente del

organismo productor, factores como el carbono y el nitrógeno, elementos traza,

temperatura, y aireación, también afectan a su producción por el organismo.

Varios biosurfactantes producidos por bacterias:

Microorganismo Biosurfactante

Arthrobacter RAG-1 hetropolisacáridos

Arthrobacter MIS38 lipopéptidos

Arthrobacter sp.trehalosa,sacarosa

y fructosa lípidos

Bacillus licheniformis JF-2 lipopéptidos

Bacillus licheniformis 86 lipopéptidos

Bacillus subtilis surfactina



Bacillus pumilus A1 surfactina

Bacillus sp. AB-2 ramnolípidos

Bacillus sp. C 14 hidrocarbono-lípido- proteina

Candida antarctica manosilertritol lípidos

Candida bombicola soforolípidos

Candida tropicalis Manan-ácido graso

Candida lipolytica Y-917 sophorolípidos

Clostridium pasteurianum Lípidos neutros

Corynebacterium hydrocarbolastus

proteina-lípido- c

Corynebacterium insidiosum

fosfolípidos

Corynebacterium lepus ácidos grasos

Strain MM1glucosa, lípidos y ácidos hidroxidecanoicos

Nocardia erythropolis Lípidos neutros

Ochrobactrum anthropii proteinas

Penicillium spiculisporum ácido espiculospórico

Pseudomonas aeruginosa ramnolípidos

Pseudomonas fluorescens lipopéptidos

Phaffia rhodozyma carbohidrato-lípido

Rhodococcus erythropolistrehalosa dicorinomicol

Rhodococcus sp. ST-5 glicolípidos

Rhodococcus sp. H13-A glicolípidos

Rhodococcus sp. 33 polisacáridos

Torulopsis bombicola soforolípidos

TABLA.- ejemplos de biosurfactantes y las bacterias que los producen.



Algunos Ejemplos De La Producción De Biosurfactantes:

1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran

capacidad de emulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace

que se considere esta estirpe como prometedora en el campo de la tecnología

medio ambiental.

2. Candida ishiwade (Tailandia) es una levadura termotolerante que

produce monoacilgliceroles y glicolípidos.

3. Pseudomonas sp. Pueden reducir la tensión superficial, estabilizar

emulsiones, y promover la formación de espumas y generalmente son no

tóxicos, no peligrosos y biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad

para el medio ambiente, posibilidad de producción a gran escala, selectividad,

efectividad bajo condiciones extremas en pequeñas cantidades, producción

sobre recursos renovables, y sus aplicaciones potenciales para la protección

del medio ambiente.

4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura

química, propiedades superficiales y actividad biológica en la producción de

biosurfactantes. La naturaleza química de los biosurfactantes producidos sería

en este caso ramnolípidica, cuya estructura de ramnosa contiene propiedades

biosurfactantes. En este caso se sintetizan diferentes homólogos que poseen

características similares con respecto a sus propiedades superficiales.

5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a

nivel industrial. En este caso se caracterizó dos lipopéptidos con

actividad biosurfactante: putisolvin I y putisolvin II; los cuales inhiben la

formación de biopelículas o provoca la destrucción de las mismas.

Conclusiones



- Los biosurfactantes potencian la emulsión de hidrocarburos y por eso tienen el

poder de solubilizar contaminantes hidrocarbonados y aumentar su disponibilidad

para la degradación microbiológica.

- Los microorganismos productores de biosurfactantes pueden jugar un importante

papel en la biorremediación acelerada de lugares contaminados con

hidrocarburos.

- Debido al alto costo de los procesos de remediación y otras aplicaciones

potenciales, la necesidad de aumentar la producción de biosurfactantes es

determinada por la genética del microorganismo.

Algunos tipos de producción de Biosurfactantes:

A) PRODUCCIÓN DE UN BIOSURFACTANTE MICROBIANO POR TORULOPSIS MAGNOLIAE EN CULTIVOS SUMERGIDOS POR CARGA.

Los biosurfactantes son moléculas tensoactivas de origen biológico obtenidas de células

animales, vegetales y microbianas. Se estudió la producción de biosurfactantes por varios

microorganismos mediante técnicas de fermentación sumergida. Se seleccionó a

Torulopsis magnoliae y las condiciones de producción óptima del surfactante por esta

levadura en un fermentador de 15 litros y en medio melaza - aceite, fueron: Agitación 500

rpm, aireación 0,6 vvm, temperatura 30°C y pH inicial 5,0. El surfactante, medido por

disminución de la tensión superficial, es excretado al medio durante el crecimiento de la

levadura y la producción se detiene al agotarse los azúcares de la melaza. Este es soluble

en agua aunque no lo es en éter dietílico a pH 9. No obstante, la extracción y purificación

parcial se realiza con este solvente después de acidificar hasta pH 2 el medio de cultivo.

La preparación de surfactante contiene azúcares, disminuye la tensión superficial del

agua hasta 40 dinas/cm, lisa glóbulos rojos y forma rápidamente emulsiones acuosas de

petróleo pesado (Tipo Cerro Negro 10° API).

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Microorganismos:



Se utilizaron cepas de las bacterias Pseudomonas sp Mez 2 y Pseudomonas spMez 3

aisladas y caracterizadas previamente. También se estudiaron las levaduras Torulopsis

petrophylum ATCC 20225, Torulopsis magnoliae ATCC 12573 y Saccharomycopsis

lipolitica ATCC 8662. Las bacterias fueron conservadas a 20°C en cuñas de agar nutritivo

y las levaduras en agar papa-dextrosa

2. Selección del microorganismo productor de biosurfactantes:

Los inóculos de cada uno de los diferentes microorganismos se hicieron en fiolas de 125

mL con 50 mL de medio de producción (MP) que contiene peptona 5 g/L ,extracto de

levadura 3 g/L y glicerol 10 g/L.

El pH inicial fue de 5,0 para las levaduras y de 7,0 para las bacterias. Este medio fue

esterilizado a 120°C y 15 psi durante 30 min: una vez inoculados, los cultivos se

incubaron en un agitador orbital TORMASAN a 160 rpm y 30°C y a las 48 horas se

centrifugaron a 5000 x g durante 10 min. A 40 mL de cada uno de los sobrenadantes se le

agregaron 5,0 g de crudo pesado tipo Cerro Negro (10°API). La mezcla se agitó

vigorosamente durante 30 segundos con un vortex y se observó a simple vista si se formó

o no una emulsión. En caso positivo se seleccionó el microorganismo como probable

productor Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences at La Universidad

del Zulia, Volume 9 Nº 3, July–September 2001 306 Producción de un biosurfactante

microbiano por Torulopsis magnoliae del biosurfactante. Se hicieron observaciones al

microscopio de luz de muestras década cultivo. El objetivo fue comprobar que la

morfología de los microorganismos fuera similar al inicio y al final del cultivo para eliminar

la posibilidad de contaminación. Como controles se dispusieron medios sin inocular y

cultivos inoculados con microorganismos que no producen surfactantes. Como será

discutido posteriormente, se decidió escoger a Torulopsis magnoliae y con esta levadura

se realizaron todas las experiencias que se indican en lo sucesivo.

3. Producción de biosurfactantes por fermentación sumergida en fermentadores de

2,5 y 15,0 litros



Cultivos de 200 mL de MP contenido en fiolas de 500 mL, se incubaron bajo las mismas

condiciones indicadas arriba. A las 24 ó48 horas estos cultivos sirvieron como inóculos

para 2 litros del mismo medio dispuestos en un fermentador TORMASAN de 2,5 litros(6,

9) e incubados durante 24 horas a30°C, 2,5 vvm y 500 rpm. Al final de las 24horas, 1,2

litros de este cultivo sirvieron, asu vez, como inóculo de 12 litros del mismo medio

contenidos en un fermentador L.K.BBromma Ultraferm modelo 1601 - 13 de 15litros. El

cultivo creció a 30°C, 1,5 vvm y 500rpm. En los casos donde se indica se cambió la

composición del medio de cultivo para lograr menores costos del proceso y para inducirla

producción del biosurfactante se añadió 10% de aceite de maíz marca COPOSA. Todas

las fermentaciones se hicieron por carga y los fermentadores no fueron esterilizados antes

de la adición del medio que se esterilizó bajo las condiciones antes señaladas. Cuando

fue necesario la espuma se controló con pequeñas cantidades (0,5 - 3mL) de aceite de

silicona.

A diferentes tiempos durante la fermentación se retiraron de los cultivos muestras de 6 mL

y se centrifugaron a 5000 x durante 15 minutos. El sedimento se resuspendió en agua

destilada y, con el fin de cuantificar el crecimiento celular, se determinó en él densidad

óptica (D.O Abs 410n.m), peso seco (estufa a 80°C) y número de células (cámara de

Neubauer) (6). En los sobrenadantes de esa centrifugación se midieron pH (sonda

combinada) y tensión superficial. Esta última mediante un tensiómetro de superficie

(marca Fisher, modelo 20). El procedimiento consistió en depositar 4mL década

sobrenadante en una cápsula de Petri e introducir el anillo del tensiómetro de manera que

estuviera en contacto con la superficie de la muestra. Accionando la manilla del aparato

se fue separando el anillo de la superficie. La fuerza requerida para lograr la separación

completa del anillo se registra como tensión superficial en un dial con una escala en

dinas/cm . Como controles se midieron las tensiones superficiales del agua pura y del

medio de cultivo antes de inocular.

4. Recuperación y Propiedades del biosurfactantes

Los cultivos de 2 y de 12 litros, obtenidos como se indicó anteriormente, se centrifugaron

a 5000 x g en una centrifuga Sharples de Flujo continuo, nº 77-T-1- 496. Los sedimentos

se utilizaron en algunos casos como inóculos para otras fermentaciones. Los

sobrenadantes se acidificaron hasta pH = 3 con ácido sulfúrico 98% y se mezclaron en un



embudo de decantación con éter dietílico en relación 2:1. Después de agitar, las mezclas

se dejaron en reposo durante 15 minutos. En cada caso el surfactante se extrajo

completamente por la fase orgánica. Esta se retiró y el éter dietílico se evaporó a 40°C,

bajo vacío, en un evaporador rotativo marca BÜCHI modelo RE/B. El residuo sólido, que

denominamos Biosurfactante Parcialmente Purificado (BPP) se resuspendió (10:1) en una

solución 0,1 M de bicarbonato de sodio y la solución se guardó a 20°C hasta su

utilización.

Para determinar la capacidad surfactante de los BPP, 0,1 mL de cada preparación se

añadieron en pozos abiertos en placas de agar sangre de conejo. Las placas Scientific

Journal from the Experimental Faculty of Sciences at La Universidad del Zulia, Volume 9

Nº 3, July–September 2001 J.M. Torres G. y J.A Sánchez C. / Ciencia Vol. 9, Nº 3 (2001)

305-312 307incubaron a 30°C y a las 24 horas se observó si había halos de bbb

hemólisis. Las capacidades de las diferentes muestras de BPP para disminuir la tensión

superficial del agua fueron medidas con el tensiómetro como se indicó anteriormente.

Cada experiencia consistió en mezclar 0,05mL de muestra con 10 mL de agua destilada.

Los valores obtenidos fueron comparados con el valor medido para el agua pura. La

diferencia entre este valor y los de las muestras, midió aquella capacidad. La

emulsificación de petróleo pesado Cerro Negro (10° API) por las muestras del BPP se

midió cualitativamente. Para ello se añadieron 10 mL del BPP en una fiola que contenía 5

g de petróleo pesado Cerro Negro (10° API) en 75 mL de agua, mantenida a30°C.

Después de agitar durante 20 seg, se observó si existía o no emulsificación del

petróleo .La presencia de azúcares en muestras de BPP se determinó por el método de

Antrona 10).

Resultados y Discusión

1. Selección del microorganismo productor

De acuerdo con sus capacidades de emulsionar petróleo pesado (Tabla 1), se

preseleccionaron dos cepas de Pseudomonassp. y una de Torulopsis magnoliae. Por el

aspecto de los filtrados de las emulsiones y por la capacidad observada de permitir o no la

adsorción del petróleo a las paredes de lasfiolas, se deduce que son diferentes los

biosurfactantes producidos por ambos tipos demicroorganismos, bacterias y levaduras. Se

siguieron tres criterios para escoger entrelas tres cepas preseleccionadas: El primero



tiene que ver con el mayor tamaño y densidad de la levadura. Este hecho puede

contribuirá una mayor facilidad para separarla de los cultivos que contienen surfactantes.

Por otra parte, el nicho ecológico de esta levadura está relacionado con las plantas de

Magnoliasp. de cuyas flores ha sido aislada . Su inocuidad para los humanos no ha sido

establecida pero es muy probable que como ocurre en otros casos similares de

microorganismos aislados de vegetales, esta levadura no sea parásito de animales El

tercer criterio se relaciona con Pseudomonas y es preventivo pues no pudimos precisar

con exactitud la especie a la que pertenecen las dos cepas de Pseudomonas Mez 2 y

Mez 3. En vista de su conocida capacidad para resistir los antibióticos (14) y de que no

pudimos descartar la posibilidad de que pudieran ser patógenas, decidimos no utilizarlas

en este trabajo, a pesar de ser buenas productoras de biosurfactantes. Así, en todas las

experiencias que siguen, se empleó aT. magnoliae como agente productor de

biosurfactantes.

2. Producción de biosurfactantes por fermentación sumergida

Resultados previos indican que las condiciones óptimas para el crecimiento de T.

magnoliae son 30°C y pH = 4 – 5 (11, 12,15). Nuestros resultados (no mostrados)

confirman estos valores óptimos (6). La levadura es facultativa y utiliza una amplia

variedad de fuentes de carbono (sacarosa, dextrosa, galactosa, xilosa y, glicerol) (6, 11,

12,15). Las experiencias que realizamos en fiolas con agitación en el MP, nos permitieron

comprobar cualitativamente que T. magnoliae produce un surfactante que emulsiona

petróleo y que el suministro de oxígeno es importante para la producción del surfactante.

En vista de que la agitación en fiolas no lo aporta en las cantidades requeridas por la

levadura, se decidió utilizar un fermentador TORMASAN de 2,5 litros provisto de un

sistema de aspersión de aire y un agitador de tres aspas. Varias pruebas realizadas con

este fermentador bajo similares condiciones que en las fiolas, pero modificando el medio

con adición de sacarosa como substrato complementario, nos permitieron seleccionar una

agitación de 500rpm y un aporte de aire de 2,5 vvm, como óptimos para producir el

surfactante a 30°C



B) BIOSURFACTANTES PRODUCIDOS POR BACTERIAS FIJADORAS DE

NITROGENO ATMOSFERICO CRECIDAS EN

HIDROCARBUROS

La biodisponibilidad de hidrocarburos para la degradación microbiana es muy baja debido

a su casi nula solubilidad y alta toxicidad. Por ello, la contaminación

ambiental por petróleo crudo es uno de los principales problemas con los que se enfrenta

la zona sur de México. En estudios previos para atacar este problema se encontró que

algunas bacterias de vida libre fijadoras de nitrógeno atmosférico (BFNA) procedentes de

suelos de Tabasco contaminadas con petróleo crudo, removían hidrocarburos del

queroseno con producción simultánea de exopolímeros tenso activos o surfactantes.

Dado que en varios estudios se ha encontrado que ese tipo de compuestos aumenta la

biodisponibilidad de hidrocarburos haciéndolos más accesibles a ciertos grupos

microbianos nativos del suelo sin incrementar los problemas de contaminación, en este

trabajo se seleccionaron varias de esas cepas BFNA para estudiar su producción de

exopolímeros y su potencial de uso en procesos de biorremediación. El objetivo fue

estudiar el perfil de crecimiento y producción de exopolímeros, tanto en cultivos en

agitación como bajo condiciones estáticas, determinando las características surfactantes

del exopolímero.

METODOLOGÍA

Las BFNA se cultivaron en medio de Rennie sin sacarosa pero con 5 g/L de queroseno o

fenantreno a 120 rpm, 28oC, por 15 días. Para el cultivo estático se conservaron las

mismas condiciones pero sin agitación. Se determinó la remoción de hidrocarburos por

CG, el crecimiento en base a peso seco y UFC, y la producción de surfactantes mediante

el índice de emulsificación (IE24) y tensión superficial.



RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Algunas de las BFNA aisladas, etiquetadas de acuerdo al color de sus colonias,

mostraron buen potencial para la producción de surfactantes (Cuadro 1).

Cuando los cultivos se aclimataron a crecer en queroseno, según el índice de

emulsificación1 (IE24), la mayoría mostró una curva de crecimiento típica tanto en

agitación como en cultivo estático (Figura 1). Sin embargo, solo 4 de 7 tuvieron

la capacidad de producir un exopolímero, siendo el cultivo crema quien a los cinco

días presentó el mayor poder emulsificante . Este fue seleccionado para estudiar la

producción usando fenantreno como única fuente de carbono.Los resultados revelaron

que, cuando se usó fenantreno como única fuente de carbono, la producción de

surfactante en los cultivos agitados se retardó a los 8 días y sólo se presenta si

los cultivos se crecen previamente en queroseno (Figura 1).

Cuadro 1. Índice de Emulsificación para cultivos agitados de BFNA

utilizando queroseno como única fuente de carbono

La

capacidad emulsificante fue mayor en los cultivos crecidosen fenantreno, quizá debido a

que este es un compuesto sólido muy insoluble, lo que puede demandar más

emulsificante para mantenerlo “soluble”. Esta hipótesis requiere de más

estudios pero es soportada por lo observado en los cultivos

estáticos, donde el crecimiento y acumulación de surfactante

fue aún tardío (12 días), quizá debido a que la solubilización

del fenantreno fue más difícil sin agitación. El exopolímero se



está caracterizando química y fisicoquímicamente.

Figura 1. Determinación del IE24 para la BFNA crema utilizando

fenantreno como fuente de carbono. ■ Agitación, ♦Estático.

Conclusiones.

Se aislaron cultivos de BFNA con capacidad de producir biosurfactantes cuando crecen

en queroseno o fenantreno como única fuente de carbono. Un cultivo color crema

presento remoción del 75% para queroseno, y 17 % para el fenantreno. Los resultados

sugieren que esta BFNA es buena alternativa para la producción biosurfactantes con

potencial para usarse en procesos de biorremediación.



C) PRODUCCIÓN DEL BIOSURFACTANTE

Se seleccionaron seis cepas bacterianas del grupo de cepas aisladas en el Laboratorio de

Microbiología Industrial del Centro de Investigación del Agua de la Universidad del Zulia

(MI3, MI5, MI7, MI9, MI10, y MI11). Cada una de ellas fue transferida con un asa de

platino a un medio fresco de caldo Tripticasa Soya y se incubó a 37ºC durante 24h en una

incubadora Memmert B-50 para su activación. Luego, 1ml de cada una de las cepas se

transfirió a 9ml de caldo Tripticasa Soya y se incubaron a 37ºC hasta alcanzar un

crecimiento superior a 1´108UFC/ml (Gerhardt et al., 1981; Kerr, 1981). Los cultivos se

centrifugaron a 2000xg en una centrifuga MSE Med Oil-58199 por 10min para separar las

células del medio de cultivo. Se descartó el sobrenadante y el centrifugado fue lavado y re

suspendido en solución salina estéril. La nueva suspensión fue centrifugada a 2000xg por

10min, se descartó el sobrenadante y el centrifugado se resuspendió en un medio mínimo

mineral, constituyendo así el inóculo (Duvnjak et al., 1982).

Se agregó cada inóculo (3% v/v) en fiolas que contenían un medio mínimo mineral (MMM)

(89% v/v) y gasoil (8% v/v) como única fuente de carbono para un volumen total de 1 litro.

El MMM usado para la biosíntesis del surfactante estuvo integrado por 1,2g NH4CL, 2,4g

KNO3, 0,0005g CaCl2.6H2O, 2,4g NaSO4, 1,2g MgSO4, 0,6g K2HPO4 y 0,002g FeSO47H2O

por litro de agua destilada. El MMM fue esterilizado a 121ºC y 15lb de presión durante

15min. El gasoil utilizado fue esterilizado por filtración. Seguidamente, la mezcla se colocó

en una incubadora Memmert B-50, por 144h a 37ºC. Luego de la incubación, la mezcla

fue centrifugada a 2000xg por 15min en una centrífuga MSE Med Oil-58199, para separar

las células del sobrenadante (biosurfactante). Se tomó el sobrenadante y se adicionó, en

diferentes concentraciones, a una mezcla de gasoil con agua para determinar la tensión

interfacial, utilizando el tensiómetro de Lecomte Du noüy (Duvnjak et al., 1982; Roberts et

al., 1991). Las cepas, cuyo sobrenadante obtenido a las 144h fue más eficiente en la

disminución de la tensión interfacial de la mezcla gasoil-agua (MI9, MI10 y un cultivo mixto

de ambas) fueron escogidas para la producción de surfactante en un período de

incubación de 192h, siguiendo la metodología descrita inicialmente.



Estudio de tratabilidad

A partir de las cepas MI5, MI7, MI9, MI10, MI11 activadas, se preparó el cultivo mixto para

realizar el montaje de los diversos tratamientos del estudio de tratabilidad, como se

muestra en la Tabla I. Cada tratamiento se preparó agregando el biosurfactante obtenido

de las cepas MI9 y MI10 (20% v/v), cultivo mixto (10% v/v) y el hidrocarburo liviano (1%

v/v) en fiolas que contenían agua del lago y fosfato de amonio para un volumen total de

100ml (Atlas, 1984). Los diferentes tratamientos fueron incubados en una incubadora con

agitación New Brunswick G25 durante 30, 60, y 90 días. Se realizaron análisis

fisicoquímicos y microbiológicos (Tabla II), según la metodología establecida en APHA

(1998).



Para el análisis estadístico de los resultados se aplicó análisis de varianza, utilizando un

diagrama de bloque al azar y mediante la aplicación de las pruebas de comparación entre

pares de medias por el método de Dunnett, que comparó todos los tratamientos con un

control (SAS, 2002).

Resultados y Discusión

Macro y micromorfología de las cepas bacterianas

Las características macro morfológicas y micro morfológicas de las colonias de cada una

de las cepas bacterianas utilizadas para la producción del biosurfactante y el estudio de

tratabilidad fueron registradas según el formato sugerido por Kerr (1981). Las cepas

resultaron cocos y bacilos, siendo la mayoría Gram negativas (Tabla III).



POLISACÁRIDOS EXTRACELULARES MICROBIANOS

En forma genérica se conoce como polisacáridos a los polímeros de origen biológico constituidos por unidades de carbohidratos unidas por enlaces glicosídicos. Estas macromoléculas se encuentran ampliamente distribuidas en plantas (terrestres y acuáticas), hongos, bacterias, moluscos y mamíferos, en donde se encuentran formando parte de la pared celular, espacio extracelular o de estructuras de reserva de energía.

Los microorganismos producen por lo menos tres tipos diferentes de polisacáridos: estructurales, (como los constituyentes de la pared celular); intracelulares de reserva (como el glicógeno) y los de naturaleza extracelular. Entre todos ellos, los polímeros extracelulares, como es el caso de la xantana, el alginato, el dextrano, etc., son los que hasta ahora se les ha dado mayor uso a nivel industrial.

Las bacterias del genero Rhizobium tienen la capacidad de producir tipos diferentes de polisacáridos, principalmente exopolisacáridos (extracelulares), compuestos por carbohidratos que son secretados al medio a través de la pared celular; estos a su vez pueden ser de carácter ácido o neutro. Dentro de los exopolisacáridos ácidos encontrados a partir de Rhizobium se destacan el succinoglicano, galactoglucano y glucoronan; el primero es un biopolímero producido por Shell Co. que ha sido utilizado como espesante y como estabilizante de emulsiones. En general se ha identificado que los polímeros de carácter ácido obtenidos están compuestos por unidades de D-glucosa, D-galactosa y ácido pirúvico.

Los exopolisacáridos de carácter neutro son polímeros capsulares constituidos por D-glucosa, D-galactosa y D-manosa en relaciones molares 1:3:2, formando unidades repetidas de hexasacáridos con características muy similares a las que se reportan para el curdlan [3], reconocido polímero, compuesto por fibras insolubles de bajo valor calórico, que no posee olor ni sabor, usado como aditivo para alimentos y que además tiene la propiedad de gelificar térmicamente y de forma irreversible. Este tipo de biopolímeros son también una alternativa en la microbiología por ser más elásticos y flexibles que el agar.

Características y propiedades de los polisacáridos microbianos

Los polisacáridos microbianos varían considerablemente en sus propiedades físicas, incluyendo sus características reológicas. Varios exopolisacáridos presentan un comportamiento pseudoplástico, lo que significa que la viscosidad aparente disminuye conforme se incrementa la deformación del fluido, esto es, las soluciones se “adelgazan” con la agitación. Este comportamiento es característico para el caso de la xantana y el alginato. Una de las propiedades más importantes de varios polisacáridos de interés industrial es su habilidad para formar geles y algunos de estos polímeros requieren la presencia de iones para ello. Los geles deben sus características a la formación de redes entrecruzadas de cadenas de polímeros. El curdlan, por ejemplo, no es soluble en agua a temperatura ambiente, pero cuando se calienta a 54ºC es perfectamente soluble. Un incremento mayor de la temperatura lleva a la gelificación de la molécula, la cual es altamente estable. Los alginatos forman geles en presencia de cationes divalentes, particularmente el calcio. La gelificación de alginatos inducida por iones divalentes se basa en su capacidad para atar iones específicamente, acompañada por cambios conformacionales. Los iones calcio se unen específicamente a los residuos de ácido gulurónico de la molécula debido a que éstos adoptan una conformación que favorece tal interacción.



La tabla 1 describe los principales polisacáridos microbianos reconocidos hasta ahora, enunciando los principales organismos que los producen, el monómero por el que están constituidos y la forma como se encuentra organizada la estructura del polímero.

Variables que afectan la producción de polisacáridos extracelulares.

- Concentraciones del Medio de cultivo.

Como ya se dijo las fuentes de carbono pueden ir desde mono y disacáridos como manitol, glucosa, fructuosa y sacarosa, hasta ácidos orgánicos como el succinato y el citrato entre otros.

Lancheros comparó glucosa, lactosa, manitol y sacarosa como fuentes de energía para la producción de polisacáridos por Rhizobium, determinando que la sacarosa en concentraciones de 10 g/l fue la que presento mayor rendimiento con respecto a la cantidad de producto obtenido. Sin embargo se sugiere que concentraciones mayores de la fuente de carbono favorecen la producción de polisacáridos . Peña y Galindo reportan la sacarosa en concentraciones de 20 g/l, como fuente de carbono en la producción de alginato. Como fuente de nitrógeno Lancheros determinó que utilizar una mezcla de nitrato de calcio y extracto de levadura en relación 0.2 : 0.2 g/l favorece la formación de producto.



- Temperatura y pH.

Según trabajos realizados en la producción de Alginatos, Dextranos y Xantanos [5] [6] [7] [8] a valores de la temperatura que estén entre 29 y 34 ºC se obtiene la mayor producción de polisacáridos. Así mismo cuando se utiliza Rhizobium como microorganismo, la temperatura no tiene un efecto significativo sobre la producción del biopolímero cuando se trabaja en rango entre 28 y 32 ºC. En las mismas referencias se reporta que un valor neutro de pH favorece la formación de polisacáridos, como es el caso de Lancheros [3] donde se mencionan valores entre 6.5 y 7.2 para fermentaciones industriales con cepas de Rhizobium.

- Aireación y mezclado:

Estos dos factores son determinantes en la producción de polisacáridos sobre todo a gran escala en donde surgen dificultades que no son apreciables a nivel laboratorio, debido a que al incrementar el tamaño del equipo, cambia la relación superficie volumen y la presión hidrostática. Si se considera un fermentador como un cilindro se tiene que el área, que determina la transferencia de calor y el nivel de aireación superficial, se incrementa al cuadrado con la escala; mientras que el volumen es función cúbica de la escala lo que hace que la relación área volumen se modifique con el solo aumento de tamaño del equipo. Lo que significa entonces que la transferencia de oxígeno que ocurre a través de la superficie del líquido sea muy importante en el fermentador pequeño y prácticamente despreciable en fermentadores de gran escala.

En cuanto a la presión hidrostática se tiene que en las fermentaciones industriales la presión en el fondo es muy alta mientras que en fermentadores de laboratorio la diferencia de presión entre la superficie y el fondo es prácticamente despreciable. Debido a esta situación, gases como el CO2, el cual es producto de la fermentación, incrementan su presión parcial en el fondo de los fermentadores donde la presión hidrostática es elevada, dando como consecuencia cambios importantes en el rendimiento del proceso y en las características moleculares del polímero producto.

Con respecto al mezclado uno de los aspectos más importantes en el escalamiento de fermentaciones de exopolisacáridos es la selección y empleo de impulsores adecuados. El impulsor óptimo debe ser formador de burbujas pequeñas y lograr el mayor nivel de homogeneidad posible. Para el caso de algunos cultivos donde se producen polisacáridos, el uso combinado de impulsores de tipo axial y de agitadores de tipo turbina Rushton, proveen una adecuada transferencia de oxígeno, además de un excelente mezclado.

Por qué producir polisacáridos. Aplicaciones reconocidas de estos polímeros microbianos

Desde un punto de vista tecnológico, los polisacáridos constituyen productos de alto valor agregado, cuyo rango de aplicaciones se extiende cada vez más. En los últimos años se ha intensificado el interés en el uso de polisacáridos microbianos, principalmente propiciado por las propiedades únicas de estas macromoléculas y la posibilidad de obtener un producto con una calidad constante y un precio relativamente estable.

Sin duda alguna la industria de los alimentos ha liderado el uso de polisacáridos de origen microbiano, con la aprobación para que productos como el dextrano, la goma xantana y el curdlan pudieran ser utilizados en alimentos; la comercialización de estos biopolímeros ha venido creciendo, abriéndole las puertas en nuevos mercados industriales.



La posibilidad de caracterizar estos productos y determinar sus propiedades físicas, permite comprender la relación entre su estructura, la función que estos pueden llegar a cumplir y su uso industrial. El caso específico de la goma xantana, que debido a sus excelentes propiedades reológicas es usado como aditivo para estabilizar emulsiones aceite agua, estabilizar la espuma formada en procesos de producción de cerveza y como inhibidor para la formación de cristales en alimentos, es una muestra clara de cómo estos productos se han establecido con un mercado a nivel industrial.

Otros polisacáridos como el glucano, usado para mejorar la textura de alimentos como pastas, el pullulan, polímero altamente soluble en agua que es usado para mantener el sabor y la apariencia de frescura en los alimentos, el gelano utilizado como agente gelificante en la industria de los elementos de aseo personal y como reemplazo del agar como medio de mantenimiento para cultivos celulares, son muestra de cómo productos diferentes a los polisacáridos microbianos tradicionales también han encontrado un espacio importante en el mercado industrial.

Más allá están las aplicaciones que estos productos pueden presentar en la medicina y biomedicina, caso concreto la celulosa de origen microbiano que puede actuar como sustituto de piel temporal en el ser humano gracias a sus altas propiedades mecánicas en estado húmedo [4] o el mismo glucano que puede ser usado como una droga biomédica contra algunas infecciones virales.

Nuevas y posibles aplicaciones para estos productos estarán supeditadas a las estructuras y propiedades físico químicas que puedan llegar a tener estos polisacáridos microbianos. Los nuevos polisacáridos tal vez encuentren aplicación en la industria de cosméticos y farmacéutica, sin embargo, estos productos microbianos siempre tendrán que competir contra los polímeros provenientes de plantas o polímeros sintéticos, que, a pesar de tener inferiores propiedades físicas y ecológicas, cuentan con procesos de producción mucho más económicos.

BIBLIOGRAFÍA

1. Flemming, H.C. and J. Wingender, Relevance of microbial extracellular polymericsubstances (EPSs) ‐ Part II: Technical aspcets. Water Science and Technology, 2001

2. Bitton, G., Wastewater Microbiology. Wiley Series in Ecological and AppliedMicrobiology, ed. R. Mitchell. 2005, New York: Wiley.

3. Laspidou, C.S. and B.E. Rittmann, A unified theory for extracellular polymericsubstances, soluble microbial products, and active and inert biomass. Water Research,2002.

4. de Silva, D.G.V. and B.E. Rittmann, Interpreting the Response to Loading Changes in aMixed‐Culture Completely Stirred Tank Reactor. Water Environment Research, 2000.

5. Barker, D.J. and D.C. Stuckey, A review of soluble microbial products (SMP) inwastewater treatment systems. Water Research, 1999. 33(14): p. 3063‐3082.

6. Arabi, S. and G. Nakhla, Impact of molecular weight distribution of soluble microbialproducts on fouling in membrane bioreactors. Separation and Purification Technology,2010. 73(3): p. 391‐396.


producción microbiana de biosurfactantes y polisacáridos extracelulares

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