producciÓn y purificaciÓn de enzimas celulolÍticas
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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICAS
MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLOGICAS Y BIOMEDICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES FARMACO BIOQUIMICAS (I.I.F.B.)
“PRODUCCION Y PURIFICACION DE ENZIMAS
CELULOLITICAS, LACASAS Y MANGANESO PEROXIDASAS
DE TRES CEPAS FUNGICAS NATIVAS (IB-105, GL-9B y CO-1)”
TESIS DE POSTGRADO PARA OPTAR AL TITULO DE MAGISTER SCIENTIARUM EN
CIENCIAS BIOLOGICAS Y BIOMEDICAS EN LA MENCION DE BIOTECNOLOGIA
MICROBIANA
ELABORADO POR : Gastón Pedro Torrez Monroy
TUTOR : Enrique Terrazas Siles Ph. D.
Alberto Gimenez Turba Ph. D.
La Paz – Bolivia
2015
.
i
DEDICATORIA
El mejor camino a seguir en la vida, no es aquel que uno escoge, sino aquel que
uno mismo traza, no es fácil llegar al final, se necesita ahínco, lucha y deseo, pero
sobre todo la fuerza para alcanzar la meta.
A Dios por haber
estado a mi lado todo el
momento
A mis padres, hermanas, Miesha y Adriana
ii
AGRADECIMIENTOS
A la Agencia Internacional de Cooperación Sueca ASDI / SAREC cuyo apoyo al
proyecto de Biodiversidad Microbiana del I.I.F.B. nos permite desarrollar trabajos
en el Área de Biotecnología
Al Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas por la gran acogida brindada y
haber permitido formar parte de su personal de investigadores
A mi asesor Ph. D. Enrique Terrazas Siles quien me brindo su poyo intelectual y
afectivo, por corregirme en algunas de mis muchas deficiencias no solo en el
desarrollo y conclusión de este proyecto siempre lo recordaré.
A mi Asesor Ph. D. Alberto Gimenez Turba por su constante estímulo y apoyo a
seguir adelante.
A mis padres Pedro y Elizabeth ya que sin su amor y su constante esfuerzo no
hubiera sido posible trazar mi propio camino que desde niño me han enseñado que el
principal limite lo pone uno mismo. Gracias papá por tu ejemplo y a ti madre por tu
amor.
A mis hermanas Daniela y Tanya, por todo el apoyo que me han brindado y por las
palabras de ánimo que día a día celebrando mis triunfos y fracasos apoyándome sin
condiciones.
A la persona que a pesar de cualquier circunstancia estuvo para apoyarme, Adriana
VIttes Lazaro gracias por hacer de mi loco mundo cada dia feliz, mi vida nunca será
lo mismo sin ti. Te amo.
iii
Tabla de contenido
I. INTRODUCCIÓN _________________________________________________ 1
II. ANTECEDENTES _______________________________________________ 4
III. OBJETIVOS ____________________________________________________ 6
a. Objetivo General ________________________________________________ 6
b. Objetivos Específicos _____________________________________________ 6
IV. JUSTIFICACIÓN _______________________________________________ 7
a. Justificación Teórica _____________________________________________ 7
b. Justificación Metodológica ________________________________________ 7
c. Justificación Práctica _____________________________________________ 8
V. MARCO TEÓRICO ____________________________________________ 11
1. REINO FUNGÍ _________________________________________________ 11
2. HONGOS DEGRADADORES DE LIGNINA _______________________ 14
2.1. HONGOS DE LA PODREDUMBRE MARRÓN _________________ 14
2.2. HONGOS DE LA PODREDUMBRE BLANCA __________________ 16
2.3. HONGOS DE LA PODREDUMBRE BLANDA __________________ 17
3. LIGNINA Y DEGRADACIÓN DE LA MADERA ___________________ 17
3.1. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA MADERA __________________ 19
4. ENZIMAS LIGNINOCELULÓLITICAS ___________________________ 21
4.1. ENZIMAS LACASAS _______________________________________ 21
4.1.1. MECANISMO CATALÍTICO ____________________________ 23
iv
4.1.2. SISTEMA LACASA-MEDIADOR _________________________ 26
4.2. ENZIMAS LIGNINO PEROXIDASAS _________________________ 28
4.3. ENZIMAS MANGANESO PEROXIDASAS ____________________ 29
4.4. ENZIMAS CELULASAS _____________________________________ 31
4.5. OTRAS ENZIMAS LIGNINOLITICAS ________________________ 33
5. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS __________________________ 35
5.1. APLICACIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS _______________ 35
5.1.1. INDUSTRIA TEXTIL ___________________________________ 36
5.1.1.1. COLORANTES DE TIPO AZO _________________________ 39
5.1.1.2. BIOBLANQUEO (“BIOBLEACHING”) __________________ 42
5.1.2. MODIFICACIÓN DE LAS FIBRAS _______________________ 43
5.1.3. INDUSTRIA PAPELERA ________________________________ 43
5.1.4. INDUSTRIA ALIMENTARIA ____________________________ 44
5.1.5. BIORREMEDIACIÓN ___________________________________ 46
5.1.6. NANOBIOTECNOLOGÍA _______________________________ 47
5.1.7. OTRAS APLICACIONES ________________________________ 48
5.2. APLICACIÓN DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS _______________ 49
VI. MATERIALES Y MÉTODOS ____________________________________ 51
6.1. MATERIAL BIOLÓGICO _____________________________________ 51
6.1.1. HONGOS DEGRADADORES DE MATERIAL
LIGNOCELULÓSICO ____________________________________________ 51
6.1.1.1. HONGO DEGRADADOR DE CELULOSA _________________ 51
6.1.1.2. HONGOS DEGRADADORES DE LIGNINA ________________ 51
6.1.1.2.1. COLECTA DE MUESTRAS ___________________________ 51
6.1.1.2.2. AISLAMIENTOS DE CEPAS __________________________ 52
6.1.1.2.2.1. SCREENING SIMPLE O DIRECTO _________________ 52
6.1.1.2.2.2. SCREENING DE RECUBRIMIENTO O INDIRECTO __ 52
v
6.1.1.3. IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA, MACROSCÓPICA Y
MICROSCÓPICA ______________________________________________ 52
6.1.1.4. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR ________________________ 53
6.1.1.4.1. AISLAMIENTO DE DNA GENÓMICO__________________ 53
6.1.1.4.2. AMPLIFICACIÓN POR PCR __________________________ 54
6.1.1.4.3. PURIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS PRODUCTOS
DE PCR ____________________________________________________ 55
6.1.1.4.4. ANÁLISIS DE SECUENCIA ___________________________ 55
6.1.1.5. CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA _____________________ 55
6.1.1.5.1. COMPOSICIÓN DEL MEDIO _________________________ 56
6.1.1.5.2. PREPARACIÓN DE LA GALERÍA. ____________________ 56
6.1.1.5.3. INOCULO. __________________________________________ 56
6.1.1.5.4. INOCULACIÓN DE LA GALERÍA. _____________________ 57
6.1.1.5.5. LECTURA DE LAS GALERÍAS. _______________________ 57
6.2. DETERMINACIONES ANALÍTICAS ___________________________ 57
6.2.1. MÉTODOS ENZIMÁTICOS _______________________________ 57
6.2.1.1. ENSAYOS CUALITATIVOS _____________________________ 57
6.2.1.1.1. ENSAYO CUALITATIVO PARA LACASAS _____________ 57
6.2.1.1.2. ENSAYO CUALITATIVO PARA PEROXIDASAS ________ 58
6.2.1.1.3. ENSAYO CUALITATIVO PARA CELULASAS __________ 58
6.2.1.2. ENSAYOS CUANTITATIVOS ____________________________ 59
6.2.1.2.1. ACTIVIDAD LACASA ________________________________ 59
6.2.1.2.2. ACTIVIDAD MANGANESO PEROXIDASA _____________ 59
6.2.1.2.3. ACTIVIDAD CELULASA _____________________________ 60
6.2.1.3. CUANTIFICACIÓN ENZIMÁTICA _______________________ 60
6.2.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE
PROTEÍNAS ____________________________________________________ 62
vi
6.3. METODOLOGÍA ____________________________________________ 62
6.3.1. CONDICIONES DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE
ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS _____________________________________ 62
6.3.2. CONDICIONES DE CRECIMIENTO POR EFECTO DE LA
TEMPERATURA ________________________________________________ 62
6.3.3. SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO BASAL PARA LA
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS ___________________ 63
6.3.4. OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO ________________ 64
6.3.4.1. OPTIMIZACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE LACASAS __ 64
6.3.4.2. OPTIMIZACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE MANGANESO
PEROXIDASAS ________________________________________________ 65
6.3.5. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
LIGNINOCELULOSICAS. ________________________________________ 66
6.3.5.1. PRODUCCIÓN Y EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA __________ 66
6.3.5.2. COMPARACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA _____ 66
6.3.5.2.1. CONCENTRACIÓN CON POLY ETHYLEN GLYCOL
(PEG) ____________________________________________________ 66
6.3.5.2.2. PRECIPITACIÓN CON PERSULFATO DE AMONIO _____ 67
6.3.6. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA __________________ 67
6.3.6.1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DEAE-SEPHAROSE ___ 67
6.3.6.2. FPLC _________________________________________________ 68
6.3.7. SDS PAGE _______________________________________________ 68
6.3.8. PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS ENZIMAS ________________ 68
6.3.8.1. DETERMINACIÓN DEL PH Y TEMPERATURA ÓPTIMOS _ 68
6.3.9. PROPIEDADES CINÉTICAS ENZIMÁTICAS ________________ 69
6.3.9.1. DETERMINACIÓN DEL Km _____________________________ 69
6.3.10, PROPIEDADES CATALÍTICAS ____________________________ 69
6.3.10,1. EFECTO DE IONES METÁLICOS ______________________ 69
vii
6.3.10,2. EFECTO DE COMPUESTOS ORGÁNICOS ______________ 69
6.3.11. DEGRADACIÓN DE COLORANTES _______________________ 70
6.3.11.1. DEGRADACION DE COLORANTES EN MEDIO SOLIDO _ 70
6.3.11.2. DEGRADACION DE COLORANTES EN MEDIO LIQUIDO 70
6.3.11.2.1. DEGRADACION CON LAS CEPAS FÚNGICAS _________ 70
6.3.11.3. APLICACIÓN DE DEGRADACION DE COLORANTES EN
MATERIAL TEXTIL ___________________________________________ 72
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ___________________________________ 73
7.1. MATERIAL BIOLÓGICO _____________________________________ 73
7.1.1. HONGOS DEGRADADORES DE MATERIAL
LIGNOCELULÓSICO ____________________________________________ 73
7.1.1.1. HONGO DEGRADADOR DE CELULOSA _________________ 73
7.1.1.2. HONGOS DEGRADADORES DE LIGNINA ________________ 73
7.1.1.2.1. COLECTA DE MUESTRAS ___________________________ 73
7.1.1.2.2. AISLAMIENTOS DE CEPAS __________________________ 74
7.1.1.2.3. SELECCIÓN DE CEPAS FÚNGICAS CON MAYOR
ACTIVIDAD LIGNINOLÍTICA ________________________________ 77
7.1.1.2.3.1. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ENZIMAS
CELULOLITICAS __________________________________________ 77
7.1.1.3. ENSAYO CUANTITATIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE
LACASAS Y MANGANESO PEROXIDASAS ______________________ 77
7.1.2. IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA MACROSCÓPICA Y
MICROSCÓPICA ________________________________________________ 86
7.1.2.1. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA GL9B ____________________ 86
7.1.2.2. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA CO-1 _____________________ 87
7.1.2.3. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA IB-105 __________________ 88
7.1.3. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR __________________________ 89
viii
7.1.4. CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA ______________________ 93
7.1.3.1 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA POR ASIMILACIÓN DE
AZUCARES ___________________________________________________ 93
7.2. CONDICIONES DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE
ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS _______________________________________ 94
7.2.1. CONDICIONES DE CRECIMIENTO POR EFECTO DE LA
TEMPERATURA ________________________________________________ 94
7.3. SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO BASAL PARA LA
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS _____________________ 96
7.4. OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO POR DISEÑO
FACTORIAL ______________________________________________________ 99
7.4.1. OPTIMIZACION DE PRODUCCION DE LACASAS __________ 99
7.4.2. OPTIMIZACION DE LA PRODUCCION DE MANGANESO
PEROXIDASAS _________________________________________________ 100
7.5. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
LIGNINOLÍTICAS ________________________________________________ 101
7.5.1. PURIFICACIÓN DE LACASA DE LA CEPA GL9B __________ 102
7.5.2. PURIFICACIÓN DE MANGANESO PEROXIDASA DE LA CEPA
CO-1 ________________________________________________________ 102
7.5.3. PURIFICACIÓN DE CELULASAS DE LA CEPA IB-105 ______ 103
7.6. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DEAE-
SEPHAROSE _____________________________________________________ 104
7.7. PURIFICACIÓN POR FPLC (FAST PROTEIN LIQUID
CROMATOGRAPHY) _____________________________________________ 104
7.8. SDS-PAGE _________________________________________________ 107
7.9. PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS ENZIMAS _________________ 110
ix
7.9.1. DETERMINACIÓN DEL PH Y TEMPERATURA ÓPTIMOS 110
7.9.2. PROPIEDADES CINÉTICAS ENZIMÁTICAS. ______________ 112
7.9.2.1. DETERMINACIÓN DEL Km ____________________________ 112
7.10, DEGRADACIÓN DE COLORANTES ________________________ 118
7.10,1. DEGRADACIÓN DE COLORANTES EN MEDIO SOLIDO ___ 118
7.10,2. DEGRADACION DE COLORANTES EN MEDIO LIQUIDO __ 120
7.10,2.1. DEGRADACION CON LAS CEPAS FÚNGICAS _________ 120
7.10,2.1.1. DEGRADACION DEL AZUL ÍNDIGO ________________ 120
7.10,2.1.2. DEGRADACIÓN DEL AZUL DE METILENO__________ 121
7.10,2.1.3. DEGRADACION DE POLY R-478 ____________________ 122
7.10,2.2. DEGRADACIÓN DE COLORANTES CON ENZIMAS ____ 123
7.10,2.2.1. DEGRADACIÓN DEL AZUL ÍNDIGO ________________ 123
7.10,2.2.2. DEGRADACIÓN DEL AZUL DE METILENO__________ 124
7.10,2.2.3. DEGRADACION DE POLY R-478 ____________________ 125
7.10,3. APLICACIÓN DE DEGRADACION DE COLORANTES EN
MATERIAL TEXTIL ____________________________________________ 127
VIII. CONCLUSIONES ___________________________________________ 129
IX BIBLIOGRAFÍA _________________________________________________ 137
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Variedad de macro hongos presentes en el medio ambiente ____________ 11
Figura 2. División del reino Fungí ________________________________________ 13
Figura 3. Pudrición Marrón en abeto. (Luley, 2006) __________________________ 15
Figura 4. Pudrición Blanca en árbol común (Luley, 2006). ____________________ 16
Figura 5. Pudrición Blanda en árbol urbano. (Luley, 2006) ____________________ 17
Figura 6. Estructura básica de la Lignina __________________________________ 18
Figura 7. Representación esquemática de la pared celular vegetal. ______________ 20
Figura 8. Oxidación de la Lignina. _______________________________________ 23
Figura 9. Ciclo catalítico de la oxidación por lacasas (Salomon et al., 2001) ______ 25
Figura 10, Sistema Lacasa Mediador ______________________________________ 27
Figura 11. Oxidación del ABTS en presencia de Lacasa _______________________ 28
Figura 12. Modelo de oxidación de la lignina por la lignino y manganeso peroxidasa 30
Figura 13. Mecanismo de acción de las celulasas ____________________________ 33
Figura 14. Cultivo de la cepa GL9B _______________________________________ 86
Figura 15. Cultivo de la Cepa CO-1_______________________________________ 87
Figura 16. Cultivo de la Cepa IB-105 _____________________________________ 88
Figura 17. Gel agarosa 1% amplificación de primers F63/LR3 región D1/D2 LSU. _ 91
Figura 18. Gel Agarosa 1% amplificación de primers ITS-1 / ITS-4 ______________ 91
Figura 19, Gel de Electroforesis ________________________________________ 108
Figura 20, Degradación del azul índigo suplementado en medio basal y agar con la
cepa GL9B _________________________________________________________ 118
Figura 21. Degradación del azul de metileno suplementado en medio basal y agar con
la cepa GL9B _______________________________________________________ 118
xi
Figura 22. Degradación del Poly R -478 suplementado en medio basal donde no hubo
cambio de color con la cepa GL9B _______________________________________ 119
Figura 23. Degradación del Poly R-478 suplementado en medio basal y agar con la
cepa CO-1 __________________________________________________________ 119
Figura 24. Degradación del azul índigo suplementado en medio basal donde no hubo
cambio de color con la cepa CO-1 _______________________________________ 120
xii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Cromoforos más comunes _______________________________________ 38
Tabla 2. Primers usados para la identificación molecular y las condiciones de PCR
para la reacción correspondiente. ________________________________________ 54
Tabla 3 Parámetros utilizados para el diseño factorial para Lacasas. ___________ 64
Tabla 4. Parámetros utilizados para el diseño factorial para MnP _______________ 65
Tabla 5. Códigos de hongos utilizados en la prueba cualitativa positiva para lacasas y
manganeso peroxidasa. _________________________________________________ 75
Tabla 6. Resultados de la extracción de ADN _______________________________ 89
Tabla 7. Resultados de la alineación por NCBI Blast el cual se reporta con la mayor
identidad ____________________________________________________________ 92
Tabla 8. Resultados de la asimilación de azucares de las cepas inoculados en las
galerías. ____________________________________________________________ 93
Tabla 9. Tabla de purificación de Lacasas de la cepa GL9B ___________________ 102
Tabla 10, Tabla de purificación de MnP de la cepa CO-1 _____________________ 102
Tabla 11. Tabla de purificación de Celulasas con Actividad CMCasa de la
cepa IB-105 _________________________________________________________ 103
xiii
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Actividad Lacasa en condiciones estáticas con suplementación de glucosa de
las seis cepas seleccionadas _____________________________________________ 79
Gráfico 2 Actividad Lacasa en condiciones estáticas sin suplementación de glucosa de
las seis cepas seleccionadas _____________________________________________ 79
Gráfico 3 Actividad Lacasa en condiciones de agitación con suplementación de
glucosa de las seis cepas seleccionadas ____________________________________ 80
Gráfico 4 Actividad Lacasa en condiciones de agitación sin suplementación de glucosa
de las seis cepas seleccionadas ___________________________________________ 81
Gráfico 5 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio estático con la suplementación de
Glucosa de las seis cepas seleccionadas ___________________________________ 82
Gráfico 6 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio estático sin la suplementación de
Glucosa de las seis cepas seleccionadas ___________________________________ 82
Gráfico 7 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio con agitación y la
suplementación de Glucosa de las seis cepas seleccionadas ____________________ 83
Gráfico 8 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio con agitación sin la
suplementación de Glucosa de las seis cepas seleccionadas ____________________ 84
Gráfico 9. Velocidad de crecimiento específico según el ensayo de crecimiento a
distintas temperaturas __________________________________________________ 95
Gráfico 10, Actividad Lacasa de la cepa GL9B en los tres medios de cultivo _______ 96
Gráfico 11. Actividad Manganeso peroxidasa de la cepa GL9B en los tres medios de
cultivo ______________________________________________________________ 97
Gráfico 12 Actividad Lacasa de la cepa CO-1 en los tres medios de cultivo________ 98
Gráfico 13. Actividad Manganeso peroxidasa de la cepa CO-1 en los tres medios de
cultivo ______________________________________________________________ 98
xiv
Gráfico 14 Análisis de Varianza expresados las tres variables y los tres niveles del
diseño factorial ______________________________________________________ 100
Gráfico 15 Análisis de Varianza expresados las tres variables y los tres niveles del
diseño factorial ______________________________________________________ 101
Gráfico 16. Cromatograma extracto del medio de cultivo de la cepa GL9B pH 4.5 _ 105
Gráfico 17 Cromatograma extracto del medio de cultivo de la cepa CO1 pH 5 ____ 106
Gráfico 18 . Cromatograma extracto del medio de cultivo de la cepa IB-105 pH 5.5 107
Gráfico 19. Determinación de la actividad enzimática vs pH (Manganeso Peroxidasa,
Lacasa y CMC) ______________________________________________________ 110
Gráfico 20, Determinación de la actividad enzimática vs pH (Manganeso Peroxidasa,
Lacasa y CMC) ______________________________________________________ 111
Gráfico 21. Porcentaje de actividad Lacasa frente a iones metálicos utilizados ___ 113
Gráfico 22. Porcentaje de actividad enzimática Manganeso Peroxidasa frente a iones
metálicos ___________________________________________________________ 114
Gráfico 23. Porcentaje de actividad enzimática CMCasa frente a iones metálicos _ 115
Gráfico 24. Porcentaje de actividad enzimática Lacasa frente a compuestos organicos y
surfactantes SDS y Tween 40 ___________________________________________ 116
Gráfico 25. Porcentaje de actividad enzimática Manganeso Peroxidasa frente a
compuestos organicos y surfactantes (SDS y Tween 40) ______________________ 117
Gráfico 26. Porcentaje de actividad enzimática CMCasa frente a compuestos organicos
y surfactantes (SDS y Tween 40) ________________________________________ 117
Gráfico 27. Degradación del Azul Índigo suplementado al medio de cultivo liquido con
las 2 cepas (GL9B y CO-1) _____________________________________________ 121
Gráfico 28. Degradación del Azul de metileno suplementado al medio de cultivo liquido
con las 2 cepas (GL9B y CO-1) _________________________________________ 122
Gráfico 29. Degradación del Poly R-478 suplementado al medio de cultivo liquido con
las 2 cepas (GL9B y CO-1) _____________________________________________ 123
xv
Gráfico 30, Degradación del azul Índigo con los extractos de los cultivos de las cepas
GL9B, CO-1 y las enzimas purificadas Lac y MnP __________________________ 124
Gráfico 31. Degradación del azul de metileno con los extractos de los cultivos de las
cepas GL9B, CO-1 y las enzimas purificadas Lac y MnP _____________________ 125
Gráfico 32. Degradación del azul Índigo con los extractos de los cultivos de las cepas
GL9B, CO-1 y las enzimas purificadas Lac y MnP __________________________ 126
Gráfico 33. Determinación de la luminiscencia en el material textil medidos en el
espectrofotómetro de superficie _________________________________________ 127
xvi
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1 AGAR PATATA DEXTROSA (PDA) _____________________________ 2
ANEXO 2. AGAR EXTRACTO DE MALTA 3% _____________________________ 2
ANEXO 3. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE DNA ______________________ 3
ANEXO 4. PROTOCOLO DE PURIFICACIÓN DE LOS AMPLICONES ________ 4
ANEXO 5. PROTOCOLO DE REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN _____________ 5
ANEXO 6. ANALIZADOR GENÉTICO AB3130 (APPLIED BIOSYSTEM). ______ 6
ANEXO 7. CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA PARA AZUCARES
REDUCTORES _______________________________________________________ 6
ANEXO 8. CURVA DE CALIBRACIÓN DE BSA PARA PROTEÍNAS TOTALES_ 7
ANEXO 9. PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE BRADFORD _______________ 7
ANEXO 10, DISEÑO EXPERIMENTAL PARA LA CEPA GL9B. ______________ 8
ANEXO 11. DISEÑO EXPERIMENTAL PARA LA CEPA CO-1 _______________ 9
ANEXO 12. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL AZUL ÍNDIGO _______________ 10
ANEXO 13. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL AZUL DE METILENO ________ 10
ANEXO 14. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL POLY R-478 _________________ 11
ANEXO 15. CULTIVO DE LA CEPA IB-105 EN AGAR PDA ________________ 11
ANEXO 16. CULTIVO DE LA CEPA IB-105 EN MEDIO LÍQUIDO __________ 12
ANEXO 17. CULTIVO DE MUESTRAS EN CAJAS PETRI __________________ 12
ANEXO 18. CEPAS FÚNGICAS AISLADAS EN MEDIO PDA _______________ 13
ANEXO 19. SCREENING CUALITATIVO PARA LACASAS _________________ 14
ANEXO 20, SCREENING CUALITATIVO PARA MANGANESO
PEROXIDASAS ______________________________________________________ 15
xvii
ANEXO 21. SCREENING CUALITATIVO DE CELULASAS POSITIVO PARA
CEPA IB 105 ________________________________________________________ 16
ANEXO 22. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA D1/D2 DE LA CEPA
GL9B _______________________________________________________________ 17
ANEXO 23. ALINEAMIENTO DE SECUENCIA D1/D2 CEPA GL9B _________ 18
ANEXO 24. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA D1/D2 DE LA CEPA
CO-1 _______________________________________________________________ 19
ANEXO 25. ALINEAMIENTO DE SECUENCIA D1/D2 CEPA CO1 ___________ 20
ANEXO 26. ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA D1/D2 DE LA CEPA _____ 21
ANEXO 27. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA ITS DE LA CEPA
GL9B _______________________________________________________________ 22
ANEXO 28. ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA ITS AMPLIFICADA DE LA
CEPA GL9B _________________________________________________________ 23
ANEXO 29. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA ITS DE LA CEPA _ 24
ANEXO 30, ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA ITS DE LA CEPA CO-1 ___ 25
ANEXO 31. ELECTROFEROGRAMA DE LAS SECUENCIA ITS DE LA CEPA
IB-105 ______________________________________________________________ 26
ANEXO 32. ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA ITS DE IB-105 __________ 27
ANEXO 33. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA POR ASIMILACIÓN DE
AZUCARES _________________________________________________________ 28
ANEXO 34. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 10 °C
EN MEDIO SOLIDO __________________________________________________ 29
ANEXO 35. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 25 °C
EN MEDIO SOLIDO __________________________________________________ 29
ANEXO 36. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 30 °C
EN MEDIO SOLIDO __________________________________________________ 30
ANEXO 37. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 40 °C
EN MEDIO SOLIDO __________________________________________________ 30
xviii
ANEXO 38. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD LACASA EN
EJE Y, CONCENTRACIÓN DE NH4NO3 EN EJE X Y LA CONCENTRACIÓN DE
GLUCOSA EN EJE Z _________________________________________________ 31
ANEXO 39. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD LACASA EN
EJE Y, CONCENTRACIÓN DE MNSO4 EN EJE X Y LA CONCENTRACIÓN DE
NH4NO3 EN EJE Z ___________________________________________________ 31
ANEXO 40, RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD LACASA EN
EJE Y, CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN EJE X Y LA CONCENTRACIÓN
DE MnSO4 EN EJE Z _________________________________________________ 32
ANEXO 41. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD MANGANESO
PEROXIDASA EJE Y, CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN EJE X Y LA
CONCENTRACIÓN DE TARTRATO DE AMONIO EN EJE Z _______________ 32
ANEXO 42. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD MANGANESO
PEROXIDASA EN EJE Y, CONCENTRACIÓN DE MnSO4 EN EJE X Y LA
CONCENTRACIÓN DE TARTRATO DE AMONIO EN EJE Z _______________ 33
ANEXO 43. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD MANGANESO
PEROXIDASA EN EJE Y, CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN EJE X Y LA
CONCENTRACIÓN DE MnSO4 EN EJE Z _______________________________ 33
ANEXO 44. CONCENTRACION CON PEG EN BOLSAS DE DIALISIS _______ 34
ANEXO 45. PROTEINA LIOFILIZADA DE LACASA Y MANGANESO
PEROXIDASA Y CELULASAS _________________________________________ 34
ANEXO 46. SISTEMA DE FPLC BIORAD BIOLOGIC DUOFLOW CON
SOPORTE DEL SISTEMA MAXIMIZER _________________________________ 35
ANEXO 47. GRAFICO DE LA CURVA DE MICHAELIS MENTEN PARA LA
LACASA AISLADA ___________________________________________________ 35
ANEXO 48. GRAFICO DE LINEWEAVER BURKE Y SU ECUACIÓN DE LA
LACASA AISLADA ___________________________________________________ 36
xix
ANEXO 49. GRAFICO DE LA CURVA DE MICHAELIS MENTEN PARA LA
MANGANESO PEROXIDASA AISLADA _________________________________ 36
ANEXO 50, GRAFICO DE LINEWEAVER BURKE Y SU ECUACION DE LA
MANGANESO PEROXIDASA AISLADA ________________________________ 37
ANEXO 51. GRAFICO DE LA CURVA DE MICHAELIS MENTEN PARA LA
CELULASA CON ACTIVIDAD CMCasa AISLADA ________________________ 37
ANEXO 52. GRAFICO DE LINEWEAVER BURKE Y SU ECUACION DE LA
CELULASA CON ACTIVIDAD CMCasa AISLADA ________________________ 38
ANEXO 53. CURVA DE CALIBRACION DEL AZUL INDIGO _______________ 38
ANEXO 54. CULTIVO DE A CEPA GL9B SUPLEMENTADO CON AZUL INDIGO
____________________________________________________________________ 39
ANEXO 55. CURVA DE CALIBRACION DEL AZUL DE METILENO ________ 40
ANEXO 56. CULTIVO DE LA CEPA GL9B EN MEDIO SUPLEMENTADO CON
AZUL DE METILENO ________________________________________________ 40
ANEXO 57. CURVA DE CALIBRACION DE POLY R-478 ___________________ 41
ANEXO 58. CULTIVO DE LA CEPA CO-1 EN MEDIO DE CULTIVO
SUPLEMENTADO CON POLY R-478 ___________________________________ 41
ANEXO 59. ESPECTROFOTOMETRO DE SUPERFICIE KONICA MINOLTA
CM-2600 ____________________________________________________________ 43
ANEXO 60, MEDICION ESPECTRAL DEL MIX DE EXTRACTOS DE LOS
CULTIVOS A LAS 72 HORAS __________________________________________ 43
ANEXO 61. TRATAMIENTO DEL MATERIAL TEXTIL ____________________ 44
xx
ABREVIATURAS
Abs Absorbancia
ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
ADN Acido Desoxirribonucleico
ANOVA Análisis de la Varianza
ARN Ácido Ribonucleico
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BSA Bovine serum albumin
CMCasa Carboximetil celulasa
Da Daltons
DEAE Diethyl aminomethane
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
FPU Filter Paper Unit
g g-force Aceleración gravitacional de la tierra
Km Constante de Michaelis Menten
Lac Lacasas
LiP Lignina Peroxidasa
MnP Manganeso Peroxidasa
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
PEG Polietileneglicol
SDS Sodium dodecyl sulfate
UI Unidad Internacional (enzimática)
Vmax Velocidad Máxima
xxi
RESUMEN
El uso de las enzimas en biotecnología ha permitido actuar como biocatalizadores
en distintos procesos químicos, por las propiedades de especificidad y
estereoselectividad de sustrato y producto; se ha reconocido que catalizan diversas
reacciones que químicamente son difíciles y costosas de efectuarse. Una alternativa
es la utilización de estas enzimas capaces de degradar compuestos recalcitrantes
entre aquellos los desechados por la industria textilera como los colorantes. En el
presente estudio se logró aislar 138 cepas fúngicas de 58 muestras ambientales. Por
ensayo cualitativo 28 cepas fúngicas mostraron actividad lacasa de las 138 cepas
aisladas y solo una con actividad manganeso peroxidasa. La cepa con mayor
actividad Lacasa fue GL9B con 12,05 ± 1,46 UI/L a los 6 días de incubación en el
medio Basal suplementado con glucosa y en agitación. La mayor actividad
Manganeso Peroxidasa fue la cepa CO-1 con 1,11 ± 0,06 UI/L a los 9 días de
incubación en medio basal en agitación y suplementado con glucosa.
Las cepa GL9B con los marcadores D1 y D2 presentó una máximo de identidad a
Pestalotiopsis sp. Con los marcadores ITS Pestalotipsis microspora. La cepa CO-1
con los marcadores D1 y D2 presento con un máximo de identidad a
Phanaerochaete sp. con los marcadores ITS Phanaerochaete sp. La cepa IB-105
productora de celulasas con los marcadores D1 y D2 presentó un máximo de
identidad para Aspergillus sp. y con los marcadores ITS Aspergillus terreus.
La optimización del medio para la producción de lacasas con la cepa GL9B se
obtuvo mayor actividad con la combinación de la concentración de NH4NO3 10
mg/L, Glucosa 1 g/L y 20 mg de MnSO4 por presentar una actividad Lacasa de
349,89 ± 0,89 UI/L. La optimización del medio de cultivo para la producción de
Manganeso peroxidasas se obtuvo mayor actividad en la combinación de glucosa
xxii
0,02 g/L, tartrato de amonio 0,25 g y Sulfato de manganeso 0,01 g que presentó una
actividad de 38,94 ± 1 UI/L. Se realizó la concentración de lacasa donde se obtuvo
una actividad 13111,25 UI/mg y un factor de purificación de 30,76, para manganeso
peroxidasa 1558,46 UI/mg y factor de purificación 27,82 y celulasas 935,71 UI/mg y
su factor de purificación de 25,48 utilizando el método con PEG. Por cromatografía
de intercambio iónico en FPLC los pH óptimos para su separación fueron para
lacasas pH 4,5 y se obtuvo dos fracciones 11 (1,8 UI/L) y 12 (5,8 UI/L). El pH
óptimo para la separación de manganeso peroxidasas fue a pH 5 y se obtuvo
actividad en la fracción 11 con 5,3 UI/L. El pH óptimo para la purificación de
celulasas es a pH 5,5 se obtuvieron 5 fracciones la fracción 53 y 57 con actividad
CMCasa de 2,1 UI/L y 3,8 UI/L la fracción 63 y 64 con actividad CMCasa 0,34
UI/L y 0,21 UI/L. La determinación del peso molecular de las actividades
enzimáticas para la enzima lacasa se obtuvo un peso molecular de 75 KDa, para la
enzima Manganeso peroxidasa se obtuvo dos bandas una con pesos moleculares de
50 KDa y 70 KDa y para la enzima celulasas se obtuvo cuatro bandas con pesos
moleculares aproximados de 75 KDa, 73 KDa, 35 KDa y 30 KDa.
La mayor actividad para lacasa purificada se obtuvo a pH de 2,5 con 12,0 UI/ L ±
0,32, para manganeso Peroxidasa la mayor actividad fue a pH 4.5 con 12,6 UI/L ±
0,25 y Celulasa pH 4,5 con 12,0 UI/L ± 0,45. La mayor actividad lacasa se obtuvo a
la temperatura de 30 °C con 14,5 UI/L ± 0,62. Con Manganeso peroxidasa la
temperatura óptima encontrada fue a 30 °C con 13,4 UI/L ± 0,38 y para celulasa con
actividad CMCasa a 30 °C con 13,6 UI/L ± 0,61.
Con la lacasa aislada de la cepa GL9B se obtuvo un Km de 0,309 mM y Vmax de
192 mM S-1
.Con la enzima manganeso peroxidasa aislada de la cepa CO-1, fue Km
0,006 mM y Vmax de 1428 mM S-1
. Con la enzima celulasa con actividad CMCasa
se obtuvo el Km de 0,31 mM y Vmax de 81,97 mM S-1
. La aplicación
biotecnológica se realizó sobre tres colorantes azul indigo, azul de metileno y Poly
xxiii
R-478. La degradación del colorante azul indigo se llevó a cabo a los 7 días de
incubación hasta un 59,3 % de color relativo suplementado con ABTS con la cepa
GL9B. La degradación del colorante azul de metileno se obtuvo un color relativo de
53 % con la cepa GL9B suplementado con ABTS a los 12 días de incubación. La
degradación del Poly R-478 con la cepa CO-1 se degradó hasta un 38 % de color
relativo. Con el extracto sin purificar de la Cepa GL9B se obtuvo una degradación
de 36 % suplementado con ABTS 0,2 mM con el azul índigo a las 72 horas de
incubación. Con el extracto de la cepa GL9B y ABTS tuvo una degradación hasta
64% de color relativo hasta las 72 horas de incubación. Con el extracto de la cepa
CO-1 para el Poly R-478 se obtuvo una mayor degradación con el extracto del
cultivo de la cepa CO-1 con 88 % de color relativo a las 64 horas de incubación. La
aplicación sobre el material textil (denim) se obtuvo mayor luminiscencia (L) con el
espectrofotómetro de superficie del textil con el mix enzimático (extracto de los
cultivos de GL9B, CO-1 e IB105) que contenían una actividad de 15 UI/L hasta un
60% de Luminiscencia a las 72 horas de incubación.
Palabras clave: Lacasas, Manganeso Peroxidasas, Celulasas, degradación
enzimática, caracterización bioquímica
xxiv
ABSTRACT
The approaches of enzyme in biotechnology allowed to make main chemicals
processes for its specificity, stereo selectivity on substrate and products, reducing
costs and condition to make chemical reaction.
Pollutants and recalcitrant during processes like textile industry can be removed by
the degradation with enzyme applications. The present study showed isolation of
fungal strains (138) from 58 environmental samples. Qualitative assay 28 strains
showed laccase activity and only one strain with manganese peroxidase.
GL9B strain showed laccase activity of 12.05 ± 1.46 UI/L at 6 days of incubation
with glucose as supplemented in a basal medium and with agitation culture.
Manganese Peroxidase of CO-1 strain of 1.11 ± 0,06 UI/L to 9 days with glucose
supplemented to a basal medium with agitation.
Molecular identification with D1/D2 primers, determined GL9B identity with
Pestalotiopsis sp. and with ITS primers Pestalotipsis microspora. CO-1 strain with
D1/D2 and ITS primers identity with Phanaerochaete sp. IB-105 strain cellulase
producers with D1/D2 primers an identity with Aspergillus sp. and ITS primers
Aspergillus terreus.
Optimization medium culture for laccase with GL9B highest activity 349.89 ± 0,89
UI/L were with NH4NO3 10 mg/L, Glucose 1 g/L and 20 mg de MnSO4 . Manganese
peroxidase highest activity 38.94 ± 1 UI/L with glucose 0,02 g/L, ammonium
tartrate 0,25 g y manganese sulfate 0,01 g. Laccase concentration method showed
xxv
activity 13111.25 UI/mg (fold 30,76), Manganese peroxidase with 1558.46 UI/mg
(fold 27.82) and cellulase (CMCasa) 935.71 UI/mg ( fold 25.48).
FPLC separation at different pH condition for laccase were pH 4.5 with 2 fractions
11 (1.8 UI/L) and 12 (5.8 UI/L), for Manganese Peroxidase pH 5 with fraction 11
5.3 UI/L, Cellulase to pH 5.5 settled 53 and 57 fraction with 2.1 UI/L y 3.8 UI/L
CMCasa activities Molecular weight of several fraction with SDS+PAGE was able
to determine laccase of 75 KDa, Manganese Peroxidase with two lines 50 KDa y 70
KDa and cellulases 75 KDa, 73 KDa, 35 KDa and 30 KDa.
Purified Laccase best activity of range pH of 2.5 with 12.0 UI/ L ± 0,32, for
manganese Peroxidase to pH 4.5 with 12.6 UI/L ± 0,25 and Cellulase pH 4.5 with
12.0 UI/L ± 0,45. Range temperatures also for Laccase with 14.5 UI/L ± 0,62,
manganese peroxidase 13.4 UI/L ± 0,38 and CMCasa with 13.6 UI/L ± 0,61, this
three enzyme work at 30 °C
Kinetics enzyme showed Km 0,309 mM and Vmax de 192 mM S-1
of Laccase
(GL9B), Km 0,006 mM y Vmax de 1428 mM S-1
Manganese Peroxidase (CO-1)
and Km de 0,31 mM y Vmax de 81.97 mM S-1
Cellulase (IB-105).
Biotechnology application on three dyes (indigo blue, methylene blue and Poly R-
478) showed a degradation in solid medium culture and 59.3% remaining color in 7
days of culture with ABTS and indigo blue (GL9B strain), With methylene blue and
supplemented with ABTS showed 53 % remaining color in 12 incubation days
(GL9B strain), Poly R-478 with a 38 % of remaining color in culture with CO-1
Strain. Using the extract of medium of GL9B without purification showed a
degradation of 36 % (ABTS 0,2 mM) of indigo blue in 72 hour of incubation, and 32
% with methylene blue. The medium extract of culture with CO-1 strain showed a
degradation of 22 % on Poly-R478 in 64 hour of incubation. Application on denim
xxvi
decolonization using a sample mixed of the three cultures of the three fungal strain
with a final activity of 15 UI/L with a measuring of Luminescence (L) was
determined of 60 % with 72 hours of incubation.
Key words: Laccase, Manganese Peroxidase, Cellulase, enzymatic degradation,
biochemical characterization.
1
I. INTRODUCCIÓN
En los últimos años la industria textil, papel, alimenticia, cosméticos, entre otras
generan una gran cantidad de desechos químicos, que provocan un gran impacto
ambiental adverso al ecosistema. Debido a la eliminación de aguas residuales
resultantes de varios procesos industriales que contienen principalmente colorantes y
compuestos fenólicos recalcitrantes (Birhanl et al, 2013) entre otras se encuentran
sales, almidón, peróxidos, EDTA, tenso activos y diferentes metales en forma de
iones, los mismos son desembocados a los cauces de ríos y lagos.
En particular los colorantes tienen una gran persistencia en el ambiente, y los
métodos de eliminación clásicos tardan mucho tiempo y no son útiles puesto que en
estos procesos incluyen reacciones de oxidación y reducción parciales, que generan
en su mayoría productos secundarios altamente tóxicos (Manzano et al., 2004).
Los hongos juegan un gran rol dentro la biotecnología ambiental en la
biodegradación de compuestos naturales y xenobióticos, por su habilidad de usarlos
como agentes de detoxificación contra desechos peligrosos. Entre los problemas más
frecuentes de contaminación industrial que se desechan a los efluentes son los
compuestos químicos aromáticos, por ejemplo los colorantes azo que tienen en su
estructura nitrógeno (−N=N−) (Amido Black, Reactive Black 5, etc.) y los
polifenoles presentes en los desechos de la industria de la celulosa y el papel. La
capacidad de estos hongos para degradar una amplia gama de sustratos nos permite
desarrollar métodos de biotratamiento lo más eficiente posibles (Gül Üd et al.,
2012).
Durante años se han realizado experimentos de degradación de contaminantes
utilizando el sistema ligninolítico de los hongos. Como el sistema de degradación de
la lignina de estos hongos no tiene sustratos específicos; son capaces de realizar
2
reacciones en las cuales transforman y algunas veces mineralizan completamente
una gran cantidad de contaminantes ambientales (Wilkolazka et al., 2002). La
biorremediación de efluentes mediada por hongos puede clasificarse de acuerdo con
su estado de vida; células vivas que biodegradan y adsorben los contaminantes y las
células muertas (Knapp et al., 1995).
El uso de las enzimas han permitido ser excelentes biocatalizadores en distintos
procesos químicos por las propiedades de especificidad y estereoselectividad de
sustrato y producto que además son producidas por hongos, plantas y otros
microorganismos su costo es generalmente bajo y se ha reconocido que catalizan
diversas reacciones que químicamente son difíciles y costosas de efectuarse.
Dentro de las enzimas usadas en procesos biotecnológicos están las enzimas
ligninolíticas, con potencial uso en procesos de biorremediación entre ellas las
lacasas. Estas enzimas catalizan la oxidación de sustratos fenólicos, así como la
polimerización, despolimerización y metilación y/o desmetilación de compuestos
fenólicos (Edens et al., 1999), reduciendo el oxígeno en agua. Se han reportado que
estas enzimas en los hongos están implicadas en la pigmentación, formación de
cuerpos fructíferos, además de jugar un papel importante en la patogenicidad en
plantas y degradación de lignina (Torrez, 2010; Miranda 2011).
Otras enzimas utilizadas en procesos biotecnológicos son las celulasas, un grupo de
enzimas en las que se incluyen celebiohidrolasas, glucosidasas y endoglucanasas y
en su gran variedad de isoenzimas; que juntas catalizan la hidrolisis de la celulosa en
azucares solubles que son utilizables para otros procesos como la biotransformación
del etanol, diésel, etc. (Torrez 2010). Entre sus potenciales aplicaciones están: la
producción de biocombustibles, industria de alimentos, cervecería, textil entre otros.
(Ramesh et al. 2011, Rajeev et. Al. 2005).
3
Dado que las enzimas juegan un rol biotecnológico importante en muchos procesos,
el presente trabajo tuvo la finalidad de estudiar la producción de enzimas
ligninocelulolíticas por hongos aislados mediantes un “screening”, a partir de
muestras ambientales recolectadas (trozos de madera, hojas, frutos, etc.). Se
optimizaron medios de cultivo con la finalidad de obtener un mayor rendimiento en
la producción de enzimas. Se purificaron las mismas por procesos de cromatografía
y electroforesis permitiendo de esta manera determinar algunas características de
estas proteínas con actividad lacasa, manganeso peroxidasa y celulasa. Se evaluó la
actividad decolorante de las enzimas producidas por los hongos estudiados en este
trabajo sobre tres colorantes (azul de metileno, azul índigo y Poly R-478) en medios
semisólidos, líquidos y sobre material textil.
4
II. ANTECEDENTES
El empleo de grandes volúmenes de agua en la industria textil, ha originado en el
tiempo un problema ambiental a nivel mundial, ya que el desecho de estas aguas
residuales son altamente contaminantes por contener un sin número de compuestos
químicos, recalcitrantes. Los contaminantes que se encuentran en mayor proporción
y de cuidado en el efluente residual de la industria textil son los colorantes y otros
subproductos generados a partir de la ruptura molecular, que originan otros
compuestos tóxicos y/o mutagénicos (Dos Santos et al., 2007).
En la industria textil se disponen más de cien mil colorantes de diversas industrias
sin incluir la gama de aplicaciones de acuerdo a su superficie de adsorción. Cada año
se producen alrededor de setecientas mil toneladas métricas de colorantes alrededor
del mundo y estos a su vez desechados en los efluentes (Supaka et al., 2004).
Existen diversos procesos químicos y físicos para la remoción de sustancias. Entre
estos procesos se incluye la ozonización, procesos oxidativos (oxidación por
hipoclorito de sodio, procesos fotoquímicos o electroquímicos, adsorción,
tratamiento con membranas de filtración, etc). Sin embargo estos procesos de
remoción presentan desventajas económicas por sus altos costos operacionales y la
inclusión de subproductos generados por dichos procesos (Robinson et al., 2001).
Actualmente para disminuir o controlar los efectos adversos sobre el medio
ambiente se está haciendo uso de herramientas biotecnológicas en las cuales se
encuentran distintos microorganismos capaces de realizar estos procesos complejos
siendo los hongos (basidiomicetos y ascomicetos) los que poseen un sistema
5
enzimático ligninocelulolítico no especifico, capaces de degradar compuestos
aromáticos contaminantes como: compuestos aromáticos policíclicos como el
fenantreno (Terrazas et al. 1, 2005), benzo (a) pireno (Terrazas et al. 2, 2005),
remoción de hormonas sintéticas (Soares et. al. 2005), Remoción de fibras de
materia textil generado por el proceso de “stonewashed” (Arja, 2004)
6
III. OBJETIVOS
a. Objetivo General
Evaluar la producción y purificación de las enzimas celulasas, lacasas y
manganeso peroxidasas de tres cepas fúngicas nativas (IB-105, GL-9B y
CO-1)
b. Objetivos Específicos
Aislar e identificar cepas fúngicas con actividades enzimáticas a partir de
muestras ambientales (Hojas, tallos, frutos, etc.) colectadas de la zona
Licoma Pampa y Cobija.
Establecer cultivos en medios basales para la producción de enzimas
celulolíticas y ligninoliticas con las cepas aisladas
Optimizar las condiciones químicas y físicas de cultivo para la
producción de enzimas celulolíticas y ligninoliticas por las cepas
fúngicas seleccionadas
Realizar la extracción y purificación de las enzimas celulolíticas y
ligninoliticas.
Evaluar la actividad decolorante de las enzimas producidas por los
hongos estudiados.
7
IV. JUSTIFICACIÓN
a. Justificación Teórica
Los microrganismos son importantes por muchas razones particularmente por
producir una gran variedad de productos resultantes del metabolismo microbiano en
sus distintas fases de su crecimiento (Demain, 1990). Estos productos pueden ser
proteínas, ácidos nucleicos, polímeros, incluso células o pequeñas moléculas de bajo
peso molecular que generalmente son divididos en metabolitos esenciales necesarios
para su crecimiento (metabolitos primarios) y otros no esenciales (metabolitos
secundarios) que son producto de las reacciones químicas biosintéticas.
Aunque estos microrganismos son muy útiles, la desventaja es que estos son
producidos en bajas proporciones en cultivos experimentales. Con la ayuda de la
biotecnología microbiana, orientada a utilizar estos microrganismos para procesos
industriales a partir de los estudios en la versatilidad metabólica fúngica,
incrementos de la producción de estos metabolitos entre otros para el beneficio
industrial y ambiental (Demain et al., 2000). Por tanto el presente trabajo pretende
aislar e identificar aquellos microorganismos del reino fúngico de las muestras
recolectadas capaces de producir enzimas que permitan realizar procesos químicos
de oxidación, reducción, o hidrolisis en medios de cultivo experimentales.
b. Justificación Metodológica
La biocatálisis enzimática a través de la historia ha permitido lograr procesos
biotecnológicos, como en la elaboración del vino, la cerveza o en procesos de mayor
complejidad como la biorremediación de compuestos recalcitrantes o en la
8
lixiviación de aguas contaminados con metales pesados (Bommarius et al., 2004)
que van asociados al uso de microorganismos por su alto sistema enzimático.
Las aplicaciones son diversas, una vez que se desarrollan métodos para distintos
procesos industriales que además puedan abaratar costos y permitan la producción
continua de un producto determinado. Es de gran importancia por medio de este
trabajo cuantificar la actividad enzimática que se identifica a partir de los cultivos
fúngicos para permitir su aplicación.
c. Justificación Práctica
En la industria textil la oxidación de los colorantes pueden realizarse con facilidad
usando hipoclorito de sodio o hidrosulfíto de sodio pero la reacción produce otro
tipo de subproductos como cloro-bencenos, que son cancerígenos y por tanto
contaminantes aun con mayor toxicidad y mutagenicidad que los compuestos
aromáticos originales (Agency for Toxic Substances and Disease Registry Division
of Toxicology and Environmental, 1990).
En los procesos de desgaste del “denim” se incluyen los procesos de “stonewashed”
en los que interviene el uso de reactivos químicos y otro tipo de agentes desgastantes
(piedras, reactivos, etc.) de los cuales provocan residuos tanto de desecho orgánico
como inorgánico.
Otra alternativa es usar el peróxido de hidrogeno como oxidante que no genera
contaminación tanto en los procesos de tratamientos de suelos con el método fenton
para la oxidación de metales (Romero et al. 2011) o en los procesos de reducción de
compuestos orgánicos como colorantes para los textiles, pero tiene un cierto costo
adicional pues se va como reactante no catalítico (Amorim et al., 2002).
9
Las primeras utilizan el oxígeno como aceptor de hidrógenos y genera peróxidos y
superóxidos de cobre; a su vez estos superóxidos pueden oxidar compuestos
orgánicos como los polifenoles o las peroxidasas que por la formación de radicales
inestables compuestos llamados mediadores, pueden elevar el potencial de óxido
reducción al incrementar la afinidad del sitio activo de la enzima (Thurston, 1994).
Las enzimas celulolíticas permiten la hidrolisis selectiva de los enlaces beta 1,4
glucosídico presente en las fibras de algodón permitiendo el desgaste de las fibras
(Arja, 2004; Torrez 2010).
En la actualidad el mundo encara un problema progresivo por falta de recursos
energéticos basados en combustible no renovables que generan enormes cantidades
de gases contaminantes liberados a la atmosfera como también son desechados las
aguas de desecho residuales como en empresas textileras, papeleras, etc., que van
contaminando progresivamente en el caso de la industria textil por procesos de
blanqueamiento y desgaste.
Con este tipo de enzimas se realiza la reducción de los colorantes azoicos que se
impregnan en las fibras que actualmente son realizados con químicos agresivos en
procesos de engomado o por procesos físicos como el “stonewashing”, así también
permiten la producción de otros biocombustibles como el bioetanol, biodiesel a
partir de materia orgánica ligninocelulósica como la madera, paja, etc. Es por este
motivo en el presente trabajo se busca una alternativa con la producción de estas
enzimas lacasas, manganeso peroxidasas y celulasas que además son producidas por
cepas nativas de Bolivia y permitan un uso posterior a nivel industrial la reducción
de la contaminación por la decoloración de los colorantes (azul de metileno, azul
índigo y Poly R-478).
10
El presente estudio de investigación se enfoca a la producción de enzimas
ligninocelulolíticas a partir cepas fúngicas que se aislaron de muestras recolectadas
de materia orgánica de distintas regiones de Bolivia, a su vez por métodos
cualitativos en inicio por tamizaje con Poly-R478 y ABTS, indicadores de
producción de enzimas redox en medios sólidos; se realizó los ensayos cuantitativos
y con un diseño factorial se evaluaron las condiciones de cultivo así como un medio
eficiente para la producción de enzimas, que además son evaluadas con ABTS,
Sulfato de manganeso, papel filtro (FPU) o Carboximetil celulosa (CMCasa) para las
actividades enzimáticas respectivas: Lacasas, Manganeso peroxidasas y celulasas,
mediante una reacción colorimétrica medidos en el espectrofotómetro a distintas
longitudes de onda, una vez conocida la actividad se procedió a la purificación de la
enzima y obteniendo fracciones resultantes del paso en cromatografía aniónica en
columna o por FPLC, se determinó por electroforesis SDS-PAGE el peso molecular
de las enzimas en estudio. Se evaluó la actividad decolorante en tres colorantes azul
de metileno, azul índigo y Poly R-478 en solución suplementando al medio de
cultivo o sobre el Azul índigo presente en un material textil.
11
V. MARCO TEÓRICO
1. REINO FUNGÍ
El reino fungí comprende a organismos eucarióticos que incluye microrganismos
como las levaduras, mohos y los más familiares que son los hongos. Esta
clasificación está separada de plantas, animales y bacterias. Una gran diferencia de
este grupo de eucariotas es la composición de su pared celular como la quitina, a
diferencia de las paredes celulares de las plantas que contienen celulosa o pared de
las bacterias conformado por N-acetil murámico (NAM) o N-acetil glucosamina
(NAG), el tipo de división celular (por fisión binaria o recombinación), por estas
características entre otras forma un simple grupo de microrganismos que se
encuentran en la naturaleza (Madigan et al., 2004).
Los hongos se distribuyen alrededor de todo el mundo y crecen en un amplio rango
de hábitats, incluyendo ambientes extremos como desiertos, áreas con elevadas
concentración de sal (Vaupotic et al., 2008), sedimentos de mar (Raghukumar et al.,
1998). Alrededor de 100,000 especies fúngicas han sido descritos por taxonomistas,
pero la biodiversidad global del reino fungí no está aun completamente definida
(Mueller y Gehring, 2006).
Figura 1. Variedad de macro hongos presentes en el medio ambiente Fuente: http://www.mykoweb.com/photography/galleryL.html
12
La clasificación basada en las características morfológicas como el tamaño y forma
de las esporas u otro tipo de estructuras, han sido una base taxonómica tradicional
pero también se puede distinguir diferencias entre especies por las características
bioquímicas y fisiológicas como la habilidad de metabolizar ciertos compuestos
químicos como los azucares (auxonograma) o reacciones químicas diferenciales que
se generan por el metabolismo de ciertos tipos de hongos (pruebas bioquímicas).
Las herramientas moleculares como la secuenciación del ADN y análisis
filogenético permiten estudiar la diversidad de especies con una enorme estimación
de la diversidad genética dentro de los grupos taxonómicos (Hibbett, 2007; Adl et
al., 2012).
La mayor parte de los hongos se han clasificado por sus características en sus
estructuras sexuales reproductivas sin embargo por el análisis de secuencias LSU,
SSU, rbp-1, rpb-2, mt-SSU entre otras; se describió la clasificación filogenética la
cual se muestra en la siguiente figura.
13
Figura 2. División del reino Fungí
Fuente: Hibbett et al., 2007
Dentro de los microorganismos existe una variedad de especies capaces de producir
enzimas ligninocelulolíticas entre ellas las lacasas, manganeso peroxidasas,
ligninoperoxidasas, glucosidasas, etc. Sin embargo en la división del reino Fungí los
basidiomicetos y ascomicetos son los que poseen el sistema enzimático degradador
de compuestos polifenólicos como es la lignina presente en la estructura de la
madera. Entre los basidiomicetos más estudiados se encuentran a la especie
Trametes versicolor, buen productor de enzimas ligninolíticas con habilidad
oxidorreductasa por la producción de lacasas, ligninoperoxidasas y manganeso
peroxidasa. Otras especies fúngicas también ampliamente estudiadas por la
diversidad de sus enzimas oxidorreductoras estan Phanerochaete chrysosporium
(Pozdnyakova et al., 2012) y Pleurotus ostreatus (Tomer et al., 2012) entre otros
menos estudiados. Entre la división de ascomicetos la especie más estudiada y
14
conocido como un modelo fúngico productor de estas enzimas ligninolíticas esta
Gaeumannomyces graminis (Khushal et al., 2010).
En cambio la cepa con mayor producción de enzimas celulolíticas en el cual se han
realizado varios modelos de producción y expresión génica promoviendo un sin
número de celulasas con aplicación industrial entre ellas se encuentra Trichoderma
reesei (Antonella et al., 2013).
2. HONGOS DEGRADADORES DE LIGNINA
Los hongos debido a su gran variedad y distribución en la naturaleza han
desarrollado un sistema enzimático único que funcionan en el medio extracelular
cuyo mecanismo está basado en la degradación de diferentes sustancias o
compuestos químicos que sean provechosos para su metabolismo, entre aquellos se
encuentran los hongos que causan la pudrición de la madera; producen un daño
progresivo sobre las paredes celulares disminuyendo el riego de la savia, reduciendo
su resistencia y provocando su desarrollo adaptativo con crecimiento infructífero
(Luley, 2005). Estos se dividen dependiendo de los cambios químicos y estructurales
que ocasionan a la lignina de la madera. Se han distinguido tres grupos de hongos
aquellos que producen la: Pudrición blanda, pudrición marrón y pudrición blanca
(Schawarze et al., 2000).
2.1. HONGOS DE LA PODREDUMBRE MARRÓN
Es producida por hongos basidiomicetos, éstos son los más abundantes en las
arboles y arbustos (coníferas), pero pueden ser encontrados en otros tipos de
ambientes tales como en distintos tipos de suelos. Estos hongos pueden atacar
madera sin tratar, es decir aquel tipo de madera que se encuentra en el ambiente sin
la intervención de algún proceso y madera preservada por procesos de recubrimiento
15
químico como se lo realiza en procesos de carpintería. Uno de los hechos
característicos del ataque de la pudrición marrón es la rápida despolimerización de la
celulosa, aún en las etapas más tempranas de la pudrición y así la pérdida general de
la resistencia (Singh y Kim, 1997).
Figura 3. Pudrición Marrón en abeto. (Luley, 2006)
Durante la pudrición los carbohidratos son extensivamente despolimerizados y
removidos por procesos de oxidación y reducción con la liberación del material
ligninocelulósicos. Además, la lignina también puede ser modificada, aunque
residuos de lignina permanecen intactos dependiendo del tipo de mineralización o
poder oxidorreductor del medio. Una de las características cuando se degrada la
madera es la coloración marrón que es producto de la lignina y por ese motivo
aquellos hongos se denominaron hongos de la podredumbre marrón (Singh y Kim,
1997).
16
2.2. HONGOS DE LA PODREDUMBRE BLANCA
Los hongos que producen este tipo de pudrición también pertenecen a los
basidiomicetos. Son particularmente activos en los ecosistemas forestales
produciendo una extensiva pudrición en los árboles caídos dentro del bosque. Las
especies latifoliadas son más susceptibles que las coníferas, al ataque de estos
hongos. Otro de grupo de hongos que pertenecen a los ascomycetos se encuentran al
orden Xylariales como la Rosellinia que provoca la pudrición blanca de las raizes de
los arboles (Sir et al., 2012)
Los hongos de pudrición blanca pueden degradar todos los componentes de la pared
celular, incluyendo la lignina y algunas especies están especializadas en la
degradación primaria de la lignina tal que no atacan a la celulosa. Además, pueden
originar posteriormente la oxidación de los azúcares formados o liberados. Estos
hongos causan "blanqueamiento de la madera". La formación de canales de erosión
dentro de la pared celular es el hecho morfológico característico de este tipo de
ataque (Singh y Kim, 1997).
Figura 4. Pudrición Blanca en árbol común (Luley, 2006).
17
2.3. HONGOS DE LA PODREDUMBRE BLANDA
A este grupo pertenecen ciertos miembros de los Ascomicetes y Deuteromicetes, los
cuales son particularmente activos bajo condiciones en las que las otras variedades
de hongos de la pudrición marrón y blanca no desarrollan (por la presencia de
humedad, temperatura, etc.).
El ataque en las coníferas resulta en la formación de cavidades en la pared
secundaria, la cual se observa al microscopio óptico como perforaciones en un corte
transversal a las fibras: en la sección longitudinal estas cavidades se observan
orientadas paralelas a las microfibrillas de la celulosa; en las latifoliadas se observa
como erosión de la pared celular quitándole la mayor resistencia estructural de la
madera (Singh y Kim, 1997).
Figura 5. Pudrición Blanda en árbol urbano. (Luley, 2006)
3. LIGNINA Y DEGRADACIÓN DE LA MADERA
El término lignina se deriva de la palabra latina “lignum” que significa madera. Fue
introducido por Anselme Payen en dos publicaciones en 1838 para representar las
18
incrustaciones de celulosa en la pared celular de plantas (Leonowicz et al., 1999). Es
un heteropolímero aromático complejo que se deriva del metabolismo de
fenilpropanoides. Representa el 30% de la madera y se considera que ha tenido un
papel crucial en la adaptación de las plantas en el hábitat terrestre (Ranocha et al.,
1999).
La lignina es el principal componente del tejido vascular de las plantas leñosas,
donde está entremezclada con la hemicelulosa y celulosa para formar la
ligninocelulosa. Tiene un elevado peso molecular, por su estructura confiere rigidez
a la planta y permite la unión entre sus células. La función principal de la lignina
consiste en proteger a los polisacáridos vegetales contra el ataque microbiano. En la
madera le confiere una protección física a la celulosa y hemicelulosa contra el
ataque enzimático, por tal motivo limita la utilización de la celulosa y hemicelulosa
en la degradación hidrolítica por parte de los microorganismos (Leonowicz et al.,
1999).
Figura 6. Estructura básica de la Lignina http://www.ugr.es/~quiored/qoamb/Lignina.gif
19
Por otra parte es responsable del almacenamiento de alrededor del 40% de la energía
solar captada por las plantas. Presenta grupos hidroxilos y un 15-20% de grupos
metilados (Eggert et al., 1996). Es recalcitrante y se mineraliza en un proceso
oxidativo aerobio. La degradación de la lignina no provee de una fuente primaria de
carbono y energía para el desarrollo del hongo, pero es un paso necesario
probablemente en la utilización de los polisacáridos de la pared celular de las plantas
(Griffin et al., 1994).
La presencia de la lignina representa un impedimento para la utilización de celulosa
y hemicelulosa en los procesos industriales y biotecnológicos, por lo que el estudio
de su biodegradación tiene gran importancia. Existen una gran cantidad de
organismos (bacterias y hongos) con las enzimas hidrolíticas necesarias para
degradar la celulosa y hemicelulosa, pero en lo referente al ataque y mineralización
de lignina el número de organismos es limitado. Los organismos descritos con la
capacidad de degradar y mineralizar a la lignina son un grupo de hongos
denominados de pudrición blanca (Dedeyan et al., 2000).
La lignina está compuesta de subunidades de fenilpropano interconectadas por
diferentes enlaces carbono-carbono y carbono-oxígeno-carbono (Pointing, 2001). El
principal enlace de la estructura de la lignina es el éter p-arilglicerol, enlace que
comprende la mitad de los enlaces de la estructura.
3.1. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA MADERA
La madera está compuesta de forma general por tres grupos de sustancias las que
conforman la pared celular, donde se encuentran las principales moléculas: Celulosa,
Poliosas (hemicelulosas) y lignina, que están presentes en todas las maderas, el otro
grupo conforman las sustancias de bajo peso molecular conocidos como sustancias
20
extraíbles que se encuentran en menor cantidad y las sustancias minerales. La
proporción y composición químicas de lignina y las poliosas difieren en los diversos
tipos de madera.
Figura 7. Representación esquemática de la pared celular vegetal.
a. Corte transversal de una fibra de madera mostrando la lámina media y la pared
celular primaria y secundaria. b. Sección transversal de una porción de la pared
secundaria con macrofibrillas. c. Un manojo de microfibrillas. d. Los filamentos
miceliares. e. Corte transversal de una micela, mostrando la composición ultra
estructural: la lignina, hemicelulosa y celulosa. El espacio entre las fibras vegetales
(lámina media), macrofibrillas, microfibrillas y los filamentos miceliares está
ocupado por lignina (Hüttermann, et al 2001)
21
Los hongos de pudrición blanca producen cambios en la lignina (polímero estereo
irregular) mediante mecanismos oxidativos. El sistema enzimático ligninolítico es
poco específico pero estéreo selectivo, ya que las peroxidasas y oxidasas actúan al
azar sobre la molécula de lignina, generando radicales libres que son inestables y
tienden a polimerizarse. Las principales enzimas que actúan directa o indirectamente
sobre la lignina son: lignina peroxidasas (LiP), manganeso peroxidasas (MnP) y
lacasas. Ciertos hongos de pudrición blanca producen las tres enzimas, algunos sólo
dos y pocos producen una (Kirk y Cullen 1998).
4. ENZIMAS LIGNINOCELULÓLITICAS
4.1. ENZIMAS LACASAS
Las enzimas lacasas (p-difenol: oxígeno oxido-reductasas E.C. 1.10,3.2) son
glicoproteínas (Heinzkill et al., 1998), su Punto Isoeléctrico (pl) y su pH óptimo son
ácidos (Kirk y Cullen, 1998). Se han clasificado dentro del grupo de enzimas
denominadas oxidasas de cobre azul. Estas enzimas requieren cobre y oxígeno para
oxidar fenoles, polifenoles, aminas aromáticas y diferentes sustratos no fenólicos
mediante la transferencia de un electrón resultando la formación de radicales libres
(Claus, 2003; Claus, 2004), lo que permite que se lleve a cabo la polimerización,
despolimerización, metilación y/o desmetilación de compuestos fenólicos (Edens et
al., 1999).
Las lacasas son de las pocas enzimas que han sido estudiadas desde el siglo XIX,
inicialmente se obtuvieron del exudado del árbol Japanese lacquer (Rhus vernicifera)
y descritas por Yoshida (1883). Posteriormente Bertrand (1896) y Laborde (1896)
describieron la actividad lacasa proveniente de estos exudados sin embargo después
de estos estudios se reportaron esta misma actividad a partir de cultivos de hongos
degradadores de madera (Thurston, 1994).
22
La función fisiológica de estas enzimas no se han comprendido totalmente en
estudios realizados en plantas pero se han descrito que las lacasas participan en la
lignificación de la madera y en hongos en la morfogénesis (formación de esporas, de
pigmentos de los cuerpos fructíferos), patogénesis, virulencia y degradación de
lignina o eliminación de fenoles tóxicos que surgen durante esta degradación
(Mansur et al., 1998; Levin et al., 2002), pero también se ha reportado actividad de
lacasas en algunos insectos y bacterias, de los cuales aún se han realizan estudios
para esclarecer su función en los mecanismos de defensa o en su metabolismo.
La estructura molecular de las lacasas se elucidó a partir de las enzimas aisladas de
hongos. Estas enzimas forman parte de las enzimas ligninolíticas que presentan los
hongos de pudrición blanca para degradar a la lignina y son secretadas en múltiples
isoformas dependiendo de la especie de hongo y de las condiciones de desarrollo
(Giardina et al., 2010).
Las lacasas fúngicas no tienen un sustrato específico, por lo que pueden transformar
y algunas veces mineralizar por completo una gran variedad de contaminantes
ambientales (Wilkolazka et al., 2002), así como degradar compuestos no fenólicos
en presencia de mediadores redox apropiados (Li et al., 2005).
Las lacasas tienen muchas aplicaciones como son: clarificación del vino (remoción
de compuestos fenólicos), análisis de drogas (distinguir morfina de codeína),
delignificación y procesos de biorremediación (decoloración de efluentes,
blanqueamiento y delignificación de la pulpa de papel, degradación de herbicidas y
xenobióticos, etc.), (Moreira et al., 2005).
23
Figura 8. Oxidación de la Lignina. (Elaboración propia)
4.1.1. MECANISMO CATALÍTICO
Las oxidasas multicobre se caracterizan por la presencia de varios átomos de cobre
en su estructura, en estado Cu2+
de oxidación. Estos átomos de cobre se agrupan en
tres tipos diferentes de centros de cobre: tipo 1, tipo 2 y tipo 3. Las lacasas son el
miembro más sencillo dentro de las oxidasas multicobre, presentando un único
centro de cobre de cada tipo (Solomon y Lowery, 1993). Estos centros de cobre se
caracterizan de la siguiente manera:
Tipo 1 (T1 o cobre azul): confiere el característico color azul de estas
enzimas (también llamadas oxidasas de cobre azul) debido a una unión
covalente del átomo de cobre con un residuo de cisteína del esqueleto
proteico (Claus, 2004).
Tipo 2 (T2): no confiere ningún color aunque si es detectable por
técnicas de EPR.
44
e4 e
44
e4 e
4ē 4ē
24
Tipo 3 (T3): se trata de un centro de cobre binuclear, es decir con
dos átomos de cobre asociados. Los centros de cobre T3 presentan
una ligera absorción a 330 nm y un carácter diamagnético debido al
acoplamiento antiferromagnético de los dos átomos de cobre,
mediado por un hidroxilo que actúa como puente, lo que provoca la
ausencia de señal en estudios de EPR (Palmer et al., 2001; Claus,
2004). En las lacasas y otras oxidasas de cobre azul los centros T2 y
T3 se asocian formando un centro de cobre trinuclear considerado
como un híbrido T2/T3 (McGuirl y Dooley, 1999).
En la Figura 9 se muestra el ciclo catalítico de oxidorreducción llevado a
cabo por las lacasas. En estas enzimas, los diferentes centros de cobre
actuarían conduciendo electrones desde un sustrato reductor hasta el
oxígeno molecular de una manera controlada, sin la formación de
intermediarios tóxicos (Palmer et al., 2001). Esta reacción tiene lugar a
través de cuatro oxidaciones monoelectrónicas del sustrato catalizadas en
el centro de cobre T1, el cual media la transferencia electrónica hasta el
centro T2/T3, donde tiene lugar la unión y reducción del oxígeno
molecular a agua (McGuirl y Dooley, 1999; Ducros, 2001). Este primer
paso de reducción del centro T1 por el sustrato constituye el paso limitante
en el ciclo global de oxidorreducción de las lacasas (Xu, 1996; Solomon et
al., 1996).
Con respecto a la reducción del O2, el centro trinuclear T2/T3, reducido
completamente (Figura 9A), reaccionaría con el oxígeno para dar lugar a
un intermediario tipo peróxido, en un paso de reducción con 2 electrones,
25
dónde el átomo de cobre de tipo 2 y uno de los átomos de cobre de tipo 3
estarían unidos mediante un enlace hidroperóxido (Figura 9 B) (Solomon et
al., 1996). Este intermediario se activaría para llevar a cabo una reducción
adicional, dando lugar a un intermediario tipo nativo (Figura 9 C) dónde
los dos átomos de cobre anteriores estarían unidos mediante un producto
tipo oxo o tipo hidroxilo. La formación del intermediario nativo implicaría
la ruptura del enlace O-O de la molécula de dioxígeno a través de la
transferencia de 2 electrones (Palmer et al., 2001). Así, la reducción del
oxígeno con 4 electrones tendría lugar a través de dos pasos de reducción
con 2 electrones cada uno. Por último, el intermediario nativo se relajaría
lentamente dando lugar a la enzima en estado de reposo (Figura 9D)
Figura 9. Ciclo catalítico de la oxidación por lacasas (Salomon et al., 2001)
26
4.1.2. SISTEMA LACASA-MEDIADOR
Las lacasas pueden oxidar además de varios compuestos aromáticos (fenoles,
aminofenoles, polifenoles, etc.), también compuestos inorgánicos como iones
ferrocianuro, iones ioduro, etc. (Claus, 2003). La oxidación de iones inorgánico
generalmente son reacciones donde existe una reducción simultanea del dioxígeno a
agua sin la producción de intermediarios como el peróxido de hidrogeno (Morozova
et al., 2007).
Debido al bajo potencia redox de las lacasas (0,5 – 0,8 V), solamente pueden oxidar
estructuras fenólicas de la lignina y no compuestos no-fenólicos que alcanza el 80 %
en la estructura de la lignina (Wong, 2009). Solo un pequeño grupo de peroxidasas
secretadas por los sistemas enzimáticos de los hongos como las ligninoperoxidasas
con un potencial redox de 1.15 – 1.25 V (Ward et al., 2003) que si puede oxidar
otros grupos aromáticos de la lignina. Sin embargo la presencia de compuestos
químicos de bajo peso molecular llamados mediadores pueden normalmente tener un
potencial redox más de 0,9 V por tanto el rango de las lacasas pueden expandirse e
incuso oxidar algunos compuestos aromáticos (Schmidt, 2007)
Un mediador es un compuesto químico que continuamente oxidado por las lacasas y
subsecuentemente reducido por el sustrato. Como el sustrato debido a su tamaño
muchas veces no puede ingresar al sitio activo de las lacasas el mediador actúa como
un transportador de electrones entre la enzima y el sustrato (Li et al., 1999). La
reactividad de las lacasas disminuye con el aumento del tamaño del sustrato, por
tanto es necesario seleccionar el tipo de mediador que pueda interactuar con el
sustrato.
Como el resultado de la oxidación del sustrato por los intermediarios el sistema no
puede reducirse si el mediador no tiene su forma inicial reducida (Call y Mucke,
27
1997). El mediador ideal no debe ser toxico, sin embargo eficiente y económico con
alta estabilidad oxidante y las formas reducidas no deben inhibir la reacción
enzimática (Morozova et al., 2007). En la figura 10 se observa el mecanismo de
acción del sistema lacasa mediador.
Figura 10. Sistema Lacasa Mediador
Elaboración propia
El ABTS (2,2‟-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonato)) inicialmente reportó
Bourmbonnais et al. (1995) como el mediador de T. versicolor y este compuesto puede
oxidar compuestos aromáticos no-fenólicos. El sistema Lacasa-ABTS puede también
desmetilar y deslignificar la pasta kraft formado en la fabricación del papel. (Bourbonnais et
al., 1995). ABTS es oxidado por radicales libres de varios peroxidasas y lacasas para formar
el radical ABTS+ y la concentración de color intenso azul-verde un catión que puede
correlacionar a la actividad enzimática. El catión radical puede ser oxidado a un dicatión
ABTS2+
En la Figura 11 se observa la modificación del ABTS durante su oxidación. El
potencial redox de la semioxidación y oxidación total del ABTS varía entre 0,68 y 1.09 V
respectivamente (Scott et al., 1993)
28
Figura 11. Oxidación del ABTS en presencia de Lacasa
Elaboración Propia
4.2. ENZIMAS LIGNINO PEROXIDASAS
La lignina peroxidasa (LiP) (EC 1.11.1.14) se ha aislado de varios hongos de
pudrición blanca. Esta enzima cataliza la oxidación de la lignina como sustrato, pero
en presencia de H2O2. El peso molecular de LiP de aproximadamente 40 kDa, es una
enzima glicosilada y su pl y pH óptimos son ácidos. La oxidación por parte de LiP a
compuestos fenólicos, inicia con la abstracción de un electrón del anillo aromático
del sustrato donador (lignina), resultando un catión radical aril que entonces
reacciona como radical y como catión, formando una amplia variedad de fragmentos
degradados (Kirk y Cullen 1998).
29
La LiP no entra por los poros de la pared celular por lo que actúa directamente sobre
el polímero de la lignina, sobre la porción expuesta de la superficie del lumen. A
este tipo de degradación se le denomina pudrición simultánea, pero este modelo no
se aplica a los degradadores selectivos de lignina. En el modelo selectivo los hongos
remueven la lignina del interior de la pared celular, pero antes ya la han degradado
lo suficiente para que las enzimas puedan penetrar. Se ha propuesto que LiP podría
actuar indirectamente por oxidación de sustratos de bajo peso molecular, que a su
vez penetra a la pared y oxida el polímero (Kirk y Cullen 1998).
4.3. ENZIMAS MANGANESO PEROXIDASAS
La manganeso peroxidasa (MnP) (EC 1.11.1. 13) cataliza la oxidación de la lignina
y provee de oxidantes de bajo peso molecular como mediadores de la reacción. Estas
enzimas tienen un peso molecular aproximado a 50-60 kDa, son glicosiladas, su pl y
pH óptimos son ácidos. Tienen un ciclo catalítico de peroxidasas convencional, pero
con Mn (II) como cofactor. La MnP no está presente en muchos hongos de pudrición
blanca, actúa sobre unidades fenólicas de lignina transformándolas a radicales
fenólicos y puede producir una despolimerización extensa. Los hongos de pudrición
blanca que no producen LiP, pero presentan a la MnP pueden degradar estructuras
no fenólicas de lignina.
Se ha mostrado que la producción de oxirradicales formados por MnP puede ocurrir
por otros mecanismos de la vía de quelatos de Mn (III). En la presencia de Mn (II),
la MnP promueve la peroxidación de lípidos insaturados, generando lipo-radicales
transitorios intermediarios: esto se ha mostrado en un modelo de oxidación de
compuestos no fenólicos de lignina. La MnP y el sistema de peroxidación de lípidos
(Figura 12) de polimeriza compuestos fenólicos y fenoles metilados en lignina
30
sintética, lo que indica que este sistema podría ser el que se presenta en la
despolimerización de lignina in vivo. (Kirk y Cullen, 1998).
Aún no es clara la relación entre la distribución de enzimas ligninolíticas y la
degradación de la lignina, puesto que los hongos de pudrición blanca con una de
estas enzimas tienen la capacidad de degradar lignina al igual que los hongos que
presentan una combinación de más de una variedad de enzimas ligninolíticas
(Dedeyan et al., 2000).
Figura 12. Modelo de oxidación de la lignina por la lignino y manganeso peroxidasa
(Elaboración Propia)
31
4.4. ENZIMAS CELULASAS
La hidrólisis enzimática es un proceso catalizado por un grupo de enzimas
denominadas genéricamente celulasas, que son en realidad, una mezcla de distintas
actividades enzimáticas cuya acción conjunta produce la degradación de la celulosa.
Las plantas superiores, algunos invertebrados y principalmente microorganismos
(hongos y bacterias) son productores de este tipo de enzimas. Las celulasas de origen
fúngico, principalmente de los géneros Trichoderma sp., Phanerochaete sp. y
Fusarium sp., han sido las más estudiadas por la capacidad de estos
microorganismos de producirlas en grandes cantidades y de forma extracelular,
facilitando su separación en los medios de cultivo (Oliva, 2003). El complejo
celulolítico de hongos está formado por distintos grupos de enzimas que actúan
sinérgicamente. En la degradación de la celulosa
Este sistema enzimático tiene tres tipos diferentes de actividad cuya denominación y
mecanismo de acción son los siguientes (Montenecourt y Eveleigh, 1979; Mathew et
al., 2008).
Endo-β-glucanasas
β- (1,4)-glucanglucanohidrolasa (EC 3.2.1.4.)
Exo-β-glucanasas.
β-(1,4)-glucancelobiohidrolasas (EC 3.2.1.91.)
Celobiohidrolasa (CBH)
β-(1,4)-glucanglucanohidrolasas (EC 3.2.1.74.)
Glucohidrolasa (GGH)
β- glucosidasa (EC 3.2.1.21.).
La endoglucanasa actúa al azar en el interior del polímero, hidrolizando enlaces β-
(1,4) y generando nuevos finales de cadena no reductores. Puede actuar sobre
32
celodextrinas y derivados sustituidos como carboximetilcelulosa (CMC) e
hidroximetilcelulosa (HMC), así como celulosa amorfa, pero no actúa ni sobre
celulosa cristalina ni sobre celobiosa. Supone, aproximadamente un 20% del total de
proteínas del complejo.
La celobiohidrolasa actúa sobre los extremos no reductores de la cadena generados
por la endoglucanasa, liberando moléculas de celobiosa. Este enzima tiene actividad
sobre celulosa cristalina y amorfa, y sobre celodextrinas, pero no actúa sobre
derivados sustituidos ni sobre celobiosa. Este enzima constituye del 50-80% del
complejo celulolítico.
La glucohidrolasa se encuentra en pequeña proporción y actúa sobre los extremos no
reductores liberando unidades de glucosa. Tiene actividad sobre celulosa amorfa,
celo-oligosacáridos y CMC.
La β-glucosidasa hidroliza celobiosa y oligosacáridos de pequeño tamaño, y es
absolutamente necesaria para evitar la fuerte inhibición que sobre las endo y
exoglucanasas produciría la celobiosa si se acumulara en el medio de reacción.
33
Figura 13. Mecanismo de acción de las celulasas
http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.html
4.5. OTRAS ENZIMAS LIGNINOLITICAS
La acción de este sistema es estrictamente extracelular y en el intervienen un grupo
de hemoproteinas extracelulares denominadas enzimas peroxidasas, conocidas como
lignino peroxidasa (LiP, EC1.11.1.14), manganeso peroxidasa (MnP, EC 1.11.1.13)
y versátil peroxidasa (VP, EC 1.11.1.16), junto a la recientemente descubierta
peroxidasa decolorante de tintes (DyP, EC 1.11.1.19), un grupo de enzimas
productoras de H2O2 (glioxal oxidasa, aril alcohol oxidasa, entre otras), un grupo de
34
oxidasas (lacasa) (EC 1.10,3.2), alcohol veratrílico, manganeso y ácidos orgánicos
como oxálico o malónico.
Las ligninasas son de particular relevancia dado que por su falta de especificidad y
alto potencial redox son capaces de actuar sobre una gran variedad de compuestos
aromáticos. Las MnPs ejercen su acción oxidativa indirectamente a través de la
formación de radicales Mn+3
a partir del Mn+2
. El Mn+3
se estabiliza formando
quelatos con ácidos carboxílicos (ej. oxálico, malónico, málico, artárico, láctico) que
actúan como mediadores difusibles de baja masa molecular eliminando electrones e
hidrógenos inespecíficamente a moléculas orgánicas (Hofrichter, 2002).
Las LiPs pueden ejercer por sí mismas la acción oxidativa o formar radicales libres a
partir de algunos compuestos orgánicos como el alcohol veratrílico o el
dimetoxibenceno de manera análoga a como ocurre con las MnP (Cameron et al.,
2000). Estos radicales libres, son sustancias altamente oxidantes que pueden difundir
y penetrar en matrices en las que las propias enzimas (MnP y LiP) no lo pueden
hacer y así aumentar la biodisponibilidad de sustratos y xenobióticos implicados en
este tipo de metabolismo microbiano.
La versátil peroxidasa, uno de los tipos de enzimas que junto a la LiP y MnP
conforman el grupo de las peroxidasas de clase II, es una enzima modificadora de la
lignina, de alto potencial redox, que se presenta como un híbrido estructural de la
MnP y LiP (Hofrichter et al., 2010). Esto es, la VP tiene propiedades de la MnP
debido a que puede oxidar los sustratos de esta enzima, pero también es responsable
de oxidaciones de aminas simples y monómeros fenólicos independientemente de
Mn2+
que la MnP no es capaz de oxidar (Martínez, 2002; Ruiz-Dueñas et al., 2009),
y por otra parte puede oxidar también los sustratos de la LiP pero es más estable en
la oxidación de compuestos fenólicos que la LiP (Ruiz-Dueñas et al., 2008).
35
En los últimos años han sido descriptas otras peroxidasas híbridas de clase II como
las conocidas bajo el nombre de VP-pequeñas. Estas contienen el sitio de unión al
Mn+2
pero les falta el residuo triptófano; en consecuencia no son capaces de oxidar
el veratril alcohol tal como lo hace la LiP, pero comparten con la VP la capacidad de
oxidar fenoles, independientemente de la presencia de Mn2+
, propiedad que
comparten con la MnP (Hofrichter et al., 2010). Las DyPs representan una nueva
familia de hemo peroxidasas identificadas en hongos. Estas enzimas oxidan varios
colorantes, en particular los xenobióticos derivados de antraquinonas, así como
también sustratos típicos de las peroxidasas tales como fenólicos y ABTS (Sugano,
2009; Sugano et al., 2009). Esta capacidad para oxidar colorantes sintéticos del tipo
antraquinona, de alto potencial redox que apenas pueden ser oxidados por otras
peroxidasas, es un rasgo característico de todas las peroxidasas de tipo DyP
estudiadas hasta ahora.
5. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS
5.1. APLICACIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS
Aunque aún es escaso el número de preparaciones comerciales de lacasas
disponibles para uso industrial, cada vez existe mayor interés por la búsqueda de
alternativas enzimáticas que reúnan los requisitos exigidos para su futuro desarrollo
industrial. Las lacasas se han propuesto para ser aplicadas en distintos procesos
industriales, entre los que cabe destacar, la fabricación de pastas de celulosa y papel,
la industria textil en la remoción de colorantes, la síntesis orgánica, la
descontaminación ambiental y farmacéutica, así como la nanobiotecnología.
La consideración de estas enzimas como “ahorradoras de energía” y biodegradables,
hace que los biocatalizadores basados en enzimas encajen bien con el desarrollo de
industrias altamente eficientes, sostenibles y amigables con el medio ambiente.
36
Hay que tener en cuenta que para algunas de sus aplicaciones, como es el caso de la
biorremediación, se requieren grandes cantidades de enzima, cuyo costo podría ser
reducido mediante la utilización de residuos agrícolas y/o alimentarios, o efluentes
industriales derivados de distintos tipos de industrias como sustrato generalmente
desarrollados a escala de laboratorio, con vistas a su implementación a nivel
industrial.
5.1.1. INDUSTRIA TEXTIL
El origen de la industria textil se remonta al año 1856 cuando Henry Perkin descubre
de manera accidental el primer colorante sintético comercialmente exitoso, la
mauveína (Wesenberg et al., 2003).
Hasta esa fecha, los colorantes usados como la hematita o el ocre, poseían un origen
natural. Gracias al descubrimiento en 1865 de la estructura molecular del benceno, la
producción de colorantes sintéticos se vio fuertemente utilizada y desde entonces
más de 100,000 colorantes han sido sintetizados en el mundo (Wong y Yu, 1999), lo
que supone una producción anual de 7 x 105 Toneladas. En el año 2000, países como
India, China o el este de Europa consumían unas seiscientas mil toneladas de
colorantes al año (Wesenberg et al., 2003).
La creciente demanda de los productos textiles ha ocasionado que esta industria haya
experimentado un fuerte desarrollo y por lo tanto, las aguas residuales procedentes
de la misma se han visto incrementados de manera notable, constituyendo uno de los
principales problemas de contaminación ambiental hoy en día. La liberación de estos
efluentes en los ecosistemas acuáticos es perjudicial, no sólo por su efecto visual o la
alteración que producen los tintes textiles sobre la solubilidad de los gases, sino
37
porque además muchos de estos colorantes pueden resultar tóxicos y/o mutagénicos
para los seres vivos (Dos Santos et al., 2007).
Más de un 90 % de los 4000 colorantes investigados por la ETAD (Ecological and
Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing Industry) presentaron
elevadas tasas de toxicidad (Robinson et al., 2001). Sin los tratamientos adecuados,
los colorantes se mantienen además estables, pudiendo permanecer en los
ecosistemas por largos períodos de tiempo, como es el caso del colorante Reactive
Blue 19, cuya vida media es de 46 años a un pH de 7 y una temperatura de 25 °C
(Hao et al., 2000).
Además del problema ambiental, hay que añadir las enormes cantidades de agua, en
muchas ocasiones potable, que consumen este tipo de industrias, como por ejemplo,
la industria textil FINESA, que consume 100 litros de agua por cada Kg de
materiales textiles producidos (Abadulla et al., 2000).
Las legislaciones de los gobiernos en países desarrollados son cada vez más estrictas
en lo que se refiere a la liberación de los colorantes textiles en los efluentes (Dos
Santos et al., 2007). Por todo ello, se hace indispensable la búsqueda de tratamientos
adecuados de las aguas residuales generadas por este tipo de industria, así como la
posible reutilización de las mismas.
Los colorantes poseen en su estructura molecular grupos de átomos responsables del
color o cromóforos, y grupos de átomos ionizables capaces de modificar la
intensidad del color del cromóforo denominados auxocromos. Entre los cromóforos
más habituales encontramos los grupos vinilo (-C=C-), ciano (-CH=N-), carbonilo
(-C=O-), azo (-N=N-), nitrito (-NO2) y estructuras de tipo quinona, mientras que
los auxocromos más importantes son los radicales amonio (-NH3), carboxilo (-
COOH), sulfonato (- SO3H) e hidroxilo (-OH) (Van der Zee, 2001). Los colorantes
38
textiles pueden ser clasificados atendiendo a su origen, propiedades químicas o
físicas, estructura química, etc. Si atendemos exclusivamente a la estructura química,
podemos diferenciar entre 20-30 tipos de colorantes y entre los más importantes
destacan los de tipo triarilmetano, indolicos, antraquinona y azo o azoicos.
Tabla 1. Cromoforos más comunes
FAMILIA GRUPO CROMOFORO GAMA DE COLORES
AZOICOS Amarillo - Azul
ANTRAQUINONAS Amarillo - Violeta
INDOLICOS Azul - Violeta
TRIARILMETANO Naranja - Violeta
Durante el proceso de coloración de las fibras, estos compuestos se unen
fuertemente a la fibra textil mediante enlaces covalentes junto a interacciones
electroestáticas. En condiciones alcalinas, los colorantes forman grupos reactivos
como el vinil sulfónico que establecen enlaces con las fibras. Sin embargo, en
39
presencia de agua estos grupos reactivos sufren hidrólisis, perdiendo la afinidad por
las fibras y siendo liberados en los efluentes industriales. De esta manera, entre el 10
y el 20 % de los colorantes se pierden durante este proceso y son vertidos a los
ecosistemas acuáticos (Soares et al., 2001), con el consiguiente impacto ambiental.
Asimismo, la gran diversidad estructural que presentan los colorantes textiles, hace
que el tratamiento de los efluentes derivados de estas industrias resulte complejo y a
menudo ineficaz. Otro agravante, es que están precisamente diseñados para ser
química y fotolíticamente estables, lo que les confiere una alta persistencia en el
medio ambiente.
5.1.1.1. COLORANTES DE TIPO AZO
Los colorantes de tipo azo representan el grupo más importante de los colorantes
producidos anualmente, lo que equivale a un 70 % del total (Hao et al., 2000; Dos
Santos et al., 2007).
Se caracterizan por presentar grupos reactivos que forman enlaces covalentes con los
radicales hidroxilo (-OH), amino (-NH3) o sulfidrilo (-SH) en las fibras textiles
(algodón, lana, seda y nylon) y se utilizan para teñir con los colores amarillo, naranja
y rojo. Debido a la escasa fijación de estos colorantes a las fibras textiles, su
concentración en las aguas residuales donde son vertidos se ha estimado que su
concentración varía entre 5 y 1500 ppm (Gottlieb et al., 2003).
La importancia de este grupo de colorantes como contaminante ambiental radica no
sólo en su color, sino también en su baja biodegradabilidad y en el hecho de que en
las condiciones anaerobias inherentes a los tratamientos de depuración convencional
de aguas, tiene lugar la reducción del enlace tipo azo lo que da lugar a la formación
de aminas aromáticas poco biodegradables y tóxicas. Muchas de estas aminas
aromáticas, como la o-toluidina y las de tipo aminofenilo, están prohibidas ya en
40
algunos países como Alemania, por tratarse de sustancias altamente tóxicas y
considerarse potenciales carcinogenogénicos (Tauber et al., 2005). Estas aminas, en
los ecosistemas acuáticos, pueden ser absorbidas por distintos organismos,
acumulándose en el tejido adiposo de los peces (bioacumulación), pudiendo llegar a
los seres humanos a través de la cadena alimentaria.
En los mamíferos, la activación metabólica de los colorantes de tipo azo equivale a
la reducción de los mismos y se debe principalmente a la actividad bacteriana
presente en las zonas anaerobias del tracto gastrointestinal. La carcinogenicidad que
presentan estas aminas aromáticas se debe a que generalmente son metabolizadas a
sus derivados aciloxiaminas que se unen al carbono 8 de la guanina alterando la
estructura del ADN (Takahashi y Hashimoto, 2001; Moya et al., 2010). Asimismo,
estas aciloxiaminas pueden ser convertidas a sus respectivos iones nitronio y/o
carbonio que también se pueden unir al ADN o ARN, induciendo mutaciones y
formación de tumores (Van der Zee, 2002).
Para evitar la formación de estas aminas aromáticas se hace imprescindible la
búsqueda de nuevos métodos de degradación de tipo oxidativo que resulten
eficientes para el tratamiento de los efluentes que contengan colorantes de tipo azo.
Este objetivo se puede alcanzar tanto a través de tecnologías físico-químicas
oxidativas o bien, por la utilización de microorganismos con alta capacidad
degradativa y/o de sus sistemas enzimáticos oxidativos. En este sentido, son diversos
los factores que determinan la conveniencia técnica y/o económica de escoger unas
técnicas u otras: tipo de colorante y composición del efluente, dosis y costo de los
reactivos requeridos, costos operacionales, así como el destino y costos de manejo
de los productos de desecho generados.
Las lacasas ofrecen una alternativa interesante para conseguir estos fines, pues su
baja especificidad de sustrato les permite actuar sobre colorantes de diversa
41
estructura, ya sea de manera directa o indirecta, a través de mediadores de oxidación.
Son numerosos los estudios de degradación de colorantes textiles que emplean
microorganismos (López et al., 2006; Harazono y Nakamura, 2005; Chen et al.,
2003; Abadulla et al., 2000) o sus enzimas oxidativas, como lacasas (Hao et al.,
2007; Chivukula y Renganathan, 1995; Rodríguez Couto, 2007; Abadulla et al.,
2000; Kandelbauer et al., 2004) o peroxidasas (Goszczynski et al., 1994) o que
aplican un tratamiento biológico combinado con distintas tecnologías físico-
químicas (Tauber et al., 2005; Brosillon et al., 2008).
Más recientemente, se ha demostrado la eficacia de los sistemas lacasa-mediador
para degradar colorantes de alto potencial redox. Los primeros estudios se basaron
en el empleo de mediadores sintéticos (Hu et al., 2009; Rodríguez Couto et al., 2005;
Soares et al., 2001; Campos et al., 2001), pero debido a los inconvenientes que
presentan éstos, cada vez es más frecuente la utilización de mediadores naturales en
este tipo de estudios (Camarero et al., 2005; Murugesan et al., 2009; Singh et al,
2007; Dubé et al., 2008; Lu et al., 2011).
Las lacasas han sido también utilizadas en la industria textil con otros fines, como la
síntesis de nuevos colorantes (Setti et al., 1999), la tinción in situ de tejidos de
algodón a partir de moléculas precursoras (Hadzhiyska et al., 2006), la modificación
de las fibras textiles o el blanqueo de algodón con el fin de eliminar pigmentos
naturales indeseables (Tzanov et al., 2003). Por otro lado, existen diversas patentes
acerca de la utilización de las lacasas para otros fines, tales como, la simulación del
efecto desgastado en tejidos vaqueros (DeniLite®, Novozymes). Por lo general, la
utilización de lacasas en estos procesos supone un ahorro no sólo energético sino
también de agua, a la vez que se minimiza el consumo de reactivos químicos, en
muchas ocasiones tóxicos (Rodríguez Couto y Toca-Herrera, 2006).
42
5.1.1.2. BIOBLANQUEO (“BIOBLEACHING”)
Una de las posibilidades más interesantes que aportan las lacasas a la industria
papelera, es su utilización como paso previo a la etapa de blanqueo convencional,
principalmente a través de los sistemas lacasa-mediador. Concretamente, se ha visto
que estos sistemas en comparación con otras enzimas empleadas en el blanqueo,
como las xilanasas (Beg et al., 2001; Bajpai et al., 2006), presentan una mayor
especificidad sobre las fracciones fenólicas y no fenólicas de la lignina,
disminuyendo así las pérdidas de rendimiento (Cadena, 2008).
La efectividad del sistema lacasa-mediador, de naturaleza sintética o natural, para
disminuir el número kappa (indicativo de la cantidad de lignina en una pasta de
papel), han sido demostrados en varios estudios (Moldes et al., 2008; Ibarra et al.,
2006; Sigoillot et al., 2005; Camarero et al., 2004; Fillat y Roncero, 2010). Aunque
la mayoría de estos estudios se han llevado a cabo con lacasas de origen fúngico,
también ha sido demostrada la utilidad de lacasas producidas por el género
Streptomyces sp., como es el caso de S. cyaneus (Arias et al., 2003) y S. ipomoea
(Molina et al., 2005; Hernández et al., 2011), para el bioblanqueo de pastas de papel
a través de sistemas lacasa- mediador.
Por último, cabe resaltar la importancia de llevar a cabo estos experimentos a mayor
escala, con objeto de comprobar la viabilidad de los mismos. En este sentido, ya
existen empresas que comercializan productos basados en un sistema lacasa-
mediador para la industria papelera, como es el caso del proceso denominado
Lignozym® (Call y Mücke, 1997).
43
5.1.2. MODIFICACIÓN DE LAS FIBRAS
La capacidad de las oxidorreductasas para formar grupos reactivos sobre la molécula
de la lignina, ha sido utilizada para modificar las fibras de la madera, con el fin de
mejorar sus propiedades. Por ejemplo, las lacasas se han utilizado para mejorar las
fibras de lignocelulosa mejorando sus propiedades físicas o químicas, en cuanto a
hidrofobicidad, carga o adhesión (Chandra y Ragauskas, 2002; Felby et al., 1997).
5.1.3. INDUSTRIA PAPELERA
En el proceso de fabricación del papel, el principal objetivo que se persigue es la
separación de las fibras de celulosa del resto de la matriz lignocelulósica y
principalmente, de la lignina. Los procesos encaminados a extraer la lignina del
material lignocelulósico se conocen como procesos de pasteo, que pueden ser de
carácter físico y/o químico. Dentro del pasteo químico (Kraft), que se lleva a cabo en
condiciones alcalinas y empleando sulfuro sódico e hidróxido sódico para la
extracción de la lignina, es el más utilizado en todo el mundo, representando las
pastas Kraft un 60 % aproximadamente del total de fibras de celulosa obtenidas a
partir de la materia vegetal virgen (Sixta, 2006).
Tras el proceso de pasteo, es necesario aplicar una serie de secuencias de blanqueo,
con el fin de eliminar la lignina residual, lo que se traduce en un aumento de la
blancura. Tradicionalmente, este blanqueo se ha llevado a cabo mediante la
utilización de cloro elemental o hipoclorito. Sin embargo, como consecuencia de la
reacción de estos compuestos con la lignina, se forman las llamadas cloroligninas,
compuestos altamente tóxicos y bioacumulables (Rintala y Puhakka, 1994).
44
La aplicación en los países desarrollados de normativas estrictas a este respecto, ha
ocasionado que desde los años 90 se utilicen otras alternativas de blanqueo
industrial, como son las secuencias totalmente libres de cloro o TCF (“Totally
Chlorine Free”), en las que se emplea oxígeno, ozono, peróxido de hidrógeno y/o
peroxiácidos; o las secuencias libres de cloro elemental o ECF (“Elementary
Chlorine Free”), que utilizan dióxido de cloro seguido de cualquiera de los reactivos
anteriormente citados (McDonough, 1995). Sin embargo, en las secuencias ECF, las
más empleadas a nivel mundial (Sixta, 2006), se puede generar una cierta cantidad
de cloro elemental que a su vez puede dar lugar a la formación de compuestos
tóxicos órgano-clorados (Reeve et al., 1995).
.
Teniendo en cuenta la complejidad de los procesos que tienen lugar en la industria
del papel y el uso en muchas ocasiones, de compuestos perjudiciales para el medio
ambiente, es lógico que este sector haya considerado la utilización de las enzimas
como una herramienta biotecnológica para la mejora de sus procesos.
5.1.4. INDUSTRIA ALIMENTARIA
Muchos de los sustratos de las enzimas como carbohidratos, ácidos grasos
insaturados, fenoles, o proteínas con grupos tiol, forman parte de los alimentos, y su
modificación por estas enzimas puede conducir a una nueva funcionalidad, mejora
de la calidad del alimento o reducción de costes (Minussi et al., 2002).
Quizás una de las aplicaciones más importantes de las oxidorreductasas en este
sector, está relacionada con la mejora o modificación del color en determinados
alimentos o bebidas, mediante el empleo de las lacasas y celulasas como aditivos.
Dentro de las bebidas, destaca la estabilización de vino o cerveza, o el procesado de
los zumos de frutas (Osma et al., 2010).
45
Los mostos y vinos están formados por una compleja mezcla de compuestos
químicos, habiéndose demostrado que la extracción selectiva de polifenoles puede
ayudar a mejorar las características organolépticas del vino y evitar así la aparición
de turbidez, intensificación del color o alteraciones del aroma y sabor (Servili et al.,
2000). En el caso de la cerveza, donde también es frecuente encontrarse con
fenómenos de enturbiamiento debido a la precipitación de proteínas, las lacasas han
sido utilizadas tanto para la oxidación de polifenoles (Giovanelli, 1989) como para
la eliminación del oxígeno residual al final del proceso de producción, alargando así
la vida media del producto.
En cuanto al tratamiento de los zumos de frutas, los resultados obtenidos no siempre
han sido tan beneficiosos como se esperaba, pues en algunos casos se puede perder
la estabilidad del producto. Lo que sí parece claro es que los mejores resultados se
obtienen combinando el tratamiento enzimático con un proceso de filtración
(Giovanelli y Ravasini, 1993).
En lo que se refiere a otro tipo de alimentos, la industria panadera podría incorporar
los tratamientos con lacasas en sus procesos, pues se ha comprobado que estas
enzimas son capaces de mejorar las propiedades de la masa de pan y del producto ya
horneado (Labat et al., 2000; Selinheimo et al., 2006) demostraron que las enzimas
de T. hirsuta mejoraba las características de diversos tipos de masas, principalmente
por la formación de biopolímeros de ácido ferúlico y arabinoxilano.
Las lacasas también pueden ser utilizadas para mejorar las propiedades sensoriales
de ciertos alimentos. Así, se han utilizado para mejorar el olor y el sabor del cacao y
productos derivados, para mejorar la calidad del sabor en aceites, principalmente de
origen vegetal, o para mejorar el color de productos que contienen té (Osma et al.,
2010).
46
También se ha descrito la posibilidad de utilizar a las enzimas para la formación de
geles a partir de pectinas en alimentos, debido a la prohibición existente en varios
países de añadir peróxido de hidrógeno a los alimentos para la obtención clásica de
geles alimenticios (Norsker et al., 2000; Littoz y McClements, 2008).
Por último, las oxidorreductasas y celulasas no sólo pueden participar en la mejora
de las propiedades sensoriales de un alimento a través de los tratamientos descritos
hasta ahora, sino que también pueden formar parte de un sistema de diagnóstico. En
este sentido, biosensores amperométricos basados en lacasas se han desarrollado con
el fin de medir, por ejemplo, la cantidad de polifenoles presentes en el té (Ghindilis
et al., 1992) o el vino (Montereali et al., 2010; Di Fusco et al., 2010).
5.1.5. BIORREMEDIACIÓN
Las lacasas como se han descrito hasta ahora, por su baja especificidad de sustrato y
la similitud estructural de muchos compuestos contaminantes con el polímero de la
lignina, pueden ser aplicadas en la degradación de numerosos compuestos generados
por la industria o presentes en los ecosistemas acuáticos o terrestres.
Como ya se ha mencionado, las lacasas pueden ser aplicados en el tratamiento de los
efluentes derivados de las industrias textil y papelera, pero también pueden ser
tratados de este modo los efluentes derivados de industrias relacionadas con el sector
alimentario, como las destilerías o las fábricas de aceite. Los efluentes derivados de
las destilerías en las que se fermenta caña de azúcar, contienen materia orgánica que
puede ser eliminada por tratamientos convencionales, pero sin embargo, el alto
contenido en compuestos cromogénicos que a veces poseen (Valdez y Obaya, 1985),
resulta difícilmente degradable, existiendo la alternativa de utilizar para su
eliminación microorganismos ligninolíticos y/o sus enzimas (Strong y Burgess,
2008).
47
Por otro lado, los efluentes derivados de las fábricas de aceite, representan hoy en
día un gran problema medioambiental en el área mediterránea, pues se llegan a
generar 2,5 litros de efluente por cada litro de aceite producido (Osma et al., 2010).
El tratamiento de este tipo de residuos, que contienen una compleja mezcla de
compuestos y que por lo general resultan tóxicos, se ha llevado a cabo con diversas
lacasas de origen fúngico (Martirani et al., 1996; d'Annibale et al., 2000; Berrio et al,
2007; Iamarino et al., 2009).
Por último, entre los compuestos xenobióticos que pueden encontrarse en los suelos
o en el agua y que pueden ser degradados por las lacasas de manera directa o
indirecta, destacan: hidrocarburos aromáticos policíclicos (Durán y Esposito, 2000;
Pointing, 2001; Cañas et al., 2010), pesticidas (Amitai et al, 1998; Kang et al., 2002;
Maruyama et al., 2007), disruptores endocrinos (Tanaka et al., 2001; Fukuda et al.,
2001; Sei et al., 2008), clorofenoles (Iimura et al., 1996; Leontievsky et al.,
2001; Zhang et al., 2008; Gaitan et al., 2011), residuos plásticos (Kunamneni et al.,
2008), contaminantes emergentes como el agente antibacteriano triclosan
(Murugesan et al., 2010) y medicamentos como el naproxeno entre otros (Marco-
Urrea et al., 2010).
5.1.6. NANOBIOTECNOLOGÍA
La nanotecnología está contribuyendo al desarrollo de prácticamente todos los
ámbitos de la actividad humana (medioambiente, economía, clínica, etc.). Un
ejemplo de esta tecnología en el que se ven involucradas las lacasas, es en el
desarrollo de biosensores y células de biocombustible. Un biosensor es una sonda
que contiene un componente biológico incorporado y que a través de un transductor
electrónico es capaz de convertir una señal bioquímica en una respuesta eléctrica
48
cuantificable, que además nos proporciona información acerca de un cambio
fisiológico o bioquímico (Kunamneni et al., 2008).
En el caso de los biosensores, la nanotecnología ha permitido que estos dispositivos
sean más eficientes gracias al control de la deposición y la adsorción de las
biomoléculas sobre diferentes tipos de sustratos. Teniendo en cuenta la capacidad de
las lacasas para catalizar reacciones de transferencia de electrones sin la necesidad
de cofactores, parece lógico que se hayan desarrollado biosensores basados en estas
enzimas para la detección de gran variedad de compuestos, tales como, compuestos
fenólicos (Kulys y Vidziunaite, 2003; Roy et al., 2005), oxígeno (Gardiol et al.,
1996), azida (Leech y Daigle, 1998), compuestos xenobióticos como herbicidas
(Sezgintürk et al., 2010) e incluso, morfina y codeína (Bauer et al., 1999),
flavonoides de plantas (Jarosz-Wilkolazka et al., 2005) o catecolaminas (Ferry y
Leech, 2005).
Las lacasas pueden ser también inmovilizadas en celdas bioeléctricas (Chen et al.,
2001; Calabrese et al., 2002; Beneyton et al., 2011), para proporcionar energía a
sistemas de transmisión de tamaño reducido, muy interesantes desde el punto de
vista medioambiental, puesto que proporcionan una fuente de energía limpia
(Rodríguez Couto y Toca Herrera, 2006). Las celdas de combustible basadas en
enzimas tienen una gran importancia en medicina, ya que podrían ser utilizadas en
numerosos dispositivos de la medicina moderna, para el suministro de
medicamentos o la monitorización de una función corporal (Ivanov, 2010).
5.1.7. OTRAS APLICACIONES
Se han descrito asimismo otras aplicaciones de las lacasas en la industria papelera
como por ejemplo para el control del pitch (producto constituido por extractos
lipofílicos generados por la explosión de la lignina) que incrementan el consumo de
49
energía y reducen la resistencia del papel, que pueden ser eliminados por estas
enzimas (Zhang et al., 2008; Gutierrez et al., 2007). También se ha descrito la
utilización de lacasas en procesos de decoloración, utilizadas para el reciclaje de
papel de periódico (Selvam et al., 2005) o en el tratamiento de efluentes de la
industria papelera (Widsten y Kandelbauer, 2008).
5.2. APLICACIÓN DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS
En la industria textil, las celulasas juegan un papel muy importante en el desteñido
de telas de jean ya que se usan para remover el color azul índigo y dar una
apariencia de desteñido. Tradicionalmente este desteñido se realizaba con piedra
pómez (“stonewash”). En la actualidad, una pequeña cantidad de enzima puede
sustituir varios kilos de piedras. Con la reducción de las piedras se producen menos
daño a las telas y menos desgaste de las lavadoras.
Las celulasas también son utilizadas en la industria de los detergentes. La enzima
degrada las microfibrillas que se separan parcialmente de las fibras principales,
restituyendo a las fibras una superficie suave y a la prenda su color original.
Dentro de la industria alimenticia, las celulasas se usan para favorecer la extracción
y filtración de jugos de frutas o verduras, filtración de mostos, extracción de aceites
comestibles, entre otras aplicaciones.
Existen diferentes pasos en el proceso del terminado del algodón como ser:
“desizing” (removedor de agentes que dan mayor dimensión), aclarado (remoción de
impurezas como pectinas y ceras) y blanqueado (incremento del brillo). Las enzimas
celulolíticas se han usado en el terminado de las prendas como un agente en el
proceso del tratamiento del algodón desde 1980 (Oslon y Stanley, 1990).
50
Las celulasas atacan primariamente la superficie de la fibra, pero deja el interior
intacto, de este modo la acción de las celulasas las hace convenientes para
reemplazar el proceso de “Stone-washing” de las telas de jean por reducir la
abrasión de la superficie de las fibras (Tyndall, 1990). Lavando las prendas con
piedras remueve parcialmente la superficie coloreada por la abrasión, en tanto el
tratamiento con celulasas resulta obteniendo un efecto similar, como las celulasas
hidrolizan parcialmente la superficie de la fibra incluyendo al colorante (Kochavi et
al., 1990).
En ambos casos la acción mecánica es necesaria para remover el colorante y por
tanto la utilización con las enzimas surge el proceso “biostonning”. Existen muchas
ventajas al usar celulasas en reemplazo de las piedras, debido a que previene el daño
de las lavadoras y las prendas, eliminando la necesidad de depósitos de residuos de
piedras que se van acumulando durante el proceso de “Stone-washing”, incrementa
la calidad del agua de desecho y elimina el proceso de remoción de polvo de las
prendas terminadas (Kochavi et al., 1990).
51
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. MATERIAL BIOLÓGICO
6.1.1. HONGOS DEGRADADORES DE MATERIAL
LIGNOCELULÓSICO
6.1.1.1. HONGO DEGRADADOR DE CELULOSA
Se utilizó para este estudio la cepa IB-105 que fue estudiada como degradadora de
celulosa en trabajos previos (Torrez, 2010). La cepa fue mantenida liofilizada a – 20
°C y luego cultivada en cajas Petri con Agar PDA (ANEXO 1) incubada a 25 °C
durante una semana.
6.1.1.2. HONGOS DEGRADADORES DE LIGNINA
6.1.1.2.1. COLECTA DE MUESTRAS
Las muestras ambientales, fueron recolectadas en la región de Tahuamanu (Cobija)
(11° 20' 00" S / 68° 30' 00" W) y la región de Licoma Pampa (67‟05‟ - 67°15‟ LO /
16°45‟ - 16° 50‟ LS) ubicado en el departamento de La Paz. Ambas regiones
presentan la característica de ser zonas sub-tropicales y templadas.
Las muestras consistían en hojas, trozos de madera, muestras de frutos (castaña,
almendras, coco, etc.), recolectados en envases de plástico y tubos de ensayo
estériles, que fueron transportados a temperatura ambiente hasta el laboratorio de
Biotecnología fúngica en el Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas para
su aislamiento.
52
6.1.1.2.2. AISLAMIENTOS DE CEPAS
6.1.1.2.2.1. SCREENING SIMPLE O DIRECTO
Las muestras ambientales fueron cortados en piezas de 1 cm2 aproximadamente o
realizando un raspado con asa bacteriológica estéril de aquellos frutos a los que no
se podía cortar y se inoculo en cajas Petri con agar - agar 1,5 % p/v, adicionado con
0,1 % (p/v) de cloranfenicol (agar-agua-cloranfenicol). Las cajas Petri son selladas
con parafilm e incubadas a temperatura ambiente, se realizó el control de
crecimiento de hongos esporulados y miceliales cada 24 horas, si existe crecimiento
fúngico se procede a aislarlas en cajas Petri con agar PDA (ANEXO 1), todas las
muestras son etiquetadas e incubadas a temperatura ambiente (~ 25 °C).
6.1.1.2.2.2. SCREENING DE RECUBRIMIENTO O
INDIRECTO
Las hojas y otro material orgánico fueron cortados en piezas de 1 cm2 bajo
condiciones estériles sumergidas en 0,1 % de hipoclorito de sodio y lavadas en agua
destilada estéril (Zack y Bryan 1963; Burdon 1993), se continuó lavando las piezas
de las muestras en solución fisiológica estéril. Las muestras fueron colocadas en
cajas Petri con agar – agar adicionadas con 0,1 % (p/v) de cloranfenicol. Las cajas
Petri fueron selladas con parafilm e incubadas a temperatura ambiente (~ 25 °C)
durante una semana, verificando el crecimiento de cepas fúngicas cada 48 h.
6.1.1.3. IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA MACROSCÓPICA
Y MICROSCÓPICA
La identificación morfológica macroscópica se realizó del cultivo de las cepas en
medios sólidos de agar Extracto de Malta 3 % (ANEXO 2) y agar PDA donde se
observó las fases teleomórficas como las propuestas por Domsch et al. (1993);
53
Humber (1998) y Guerrero et al. (1999) de esta forma se consideraron los criterios
morfológicos por Mier et al. (2002) donde se incluyen color de la colonia, aspecto,
consistencia, superficie, conidios esporas micelios, etc.
La caracterización microscópica se procedió a la observación al microscopio de un
porta objetos con cinta adhesiva el mismo tenia impregnado la cepa fúngica de
acuerdo al método descrito en Torrez et al. (2010) y por medio de sus estructuras
microscópicas se contrastaron por su morfología consultados en Kirk et al. (2008) y
Damm et. al. (2008).
6.1.1.4. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
Las tres cepas fúngicas (GL-9B, CO-1 e IB-105) previamente seleccionadas por
métodos cualitativos en la producción de enzimas ligninolíticas y la cepa IB-105 que
se había seleccionado como productora de enzimas celulolíticas por ensayo
cuantitativo cuya actividad FPU reportado fue de 3,038 UI (± 0,022) en medio de
agitación y con un inoculo de esporas 1 x 108
(Torrez, 2010). Se procedió a realizar
la caracterización molecular de las cepas mediante técnicas de biología molecular
desde la extracción del ADN hasta su secuenciación y comparación con las bases de
datos del ADNr (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
6.1.1.4.1. AISLAMIENTO DE DNA GENÓMICO
Aproximadamente 100 mg de biomasa fúngica o 1 ml de concentrado de esporas
(1x108 esporas/ml) se colecto en un tubo eppendorf, se adicionó solución fisiologíca
estéril a un volumen de 1000 µL y se procedió a extraer el ADN según el protocolo
modificado de Promega (Wizard® Genomic DNA Purification Kit Protocol)
(ANEXO 3).
54
La pureza del ADN fue calculado por el factor 260/280 nm. Este ADN fue utilizado
como plantilla para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Sambrook et al.,
2001).
6.1.1.4.2. AMPLIFICACIÓN POR PCR
Tabla 2. Primers usados para la identificación molecular y las condiciones de PCR
para la reacción correspondiente.
Ciclos
94 ° C 3' 1
94 ° C 30''
55 ° C 30''
72 ° C 2'
72 ° C 3 ' 1
94 ° C 3' 1
94 ° C 30''
55 ° C 30''
72 ° C 2'
72 ° C 3 ' 1
25 650TCCGTAGGTGAACCTGCGG
TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS-1
ITS-4a
ITS1 –
5.8S –
ITS2 del
ADNr
Producto
Perfil de PCR
Parametros
Region
D1/D2 de
28S ADNr
F63
LR3GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG
GGTCCGTGTTTCAAGACGG
Pares de
PrimersSecuencia ( 5' → 3' )
Tamaño
del
producto
25 675 pbs
Para la identificación por la región LSU (Large Subunit) por su alta conservación se
utilizaron los primers F63 y LR3 correspondientes a las regiones D1/D2 (Tabla 2).
La región ITS1 – 5.8S – ITS2 del ADNr del hongo (~650 pbs) fue amplificado
usando los primers ITS1 y ITS4a e ITS4, la reacción de PCR fue realizado para
ambos pares de primers utilizando ADN polimerasa Go Taq (promega) 0,03 U/µL
conteniendo Buffer de PCR 1X, mix de dNTPs 0,2 mM, 0,5 uM de cada “primer”
antes mencionado y 1mM de MgCl2 para un volumen de 20 µL con ADN ~ 25 ng.
Se utilizó como control negativo agua tridestilada sin ADN ni ARN. La reacción se
terminó enfriando el tubo a 4 °C conservándolo a esta misma temperatura.
55
Los productos de PCR (0,5 µL) fueron corridos por electroforesis en 1% de agarosa
en buffer TBE 1 X, en uno de los pozos se colocó el “ladder” que determina el peso
molecular de los fragmentos amplificados.
6.1.1.4.3. PURIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN DE LOS
PRODUCTOS DE PCR
Con 15 µL del producto de PCR amplificado se realizó la purificación según el
protocolo modificado de purificación del kit BigDye® Terminator (Applied
Biosystem) (ANEXO 4 y 5). Para la secuenciación se utilizó el Kit
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem) utilizando los
“primers” antes mencionados. La secuenciación se realizó en el Analizador Genético
AB3130 (Applied Biosystem) (ANEXO 6). Para el análisis de datos se utilizó el
programa Sequencyng analysis (Applied Biosystem ver 3.4).
6.1.1.4.4. ANÁLISIS DE SECUENCIA
Todas las secuencias obtenidas fueron editadas utilizando el programa Bioedit v.
7.1.3 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html). Los dos sets de secuencias
fueron obtenidos por los “primers” forward y reverse. Para el estudio comparativo
de las secuencias de ADN se realizó por BLAST con análisis de nucleótidos
(Altschul et al., 1990) disponible en el sitio www.ncbi.nlm.nih.gov . El análisis
filogenético se realizó utilizando el software MEGA v. 4 (Tamura et al., 2007).
6.1.1.5. CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA
Se realizó la identificación bioquímica utilizando el sistema 20C AUX (BioMerieux)
que consta de 19 cúpulas con los siguientes carbohidratos disponibles: Glucosa
56
(GLU), glicerol (GLY), 2-keto-D-gluconato (2KG), L-arabinosa (ARA), D-xilosa
(XYL), adonitol (ADO), xilitol (XLT), galactosa (GAL), inositol (INO), sorbitol
(SOR), o-metil-D-glucósido (MDG), N-acetil-D-glucosamina (NAG), celobiosa
(CEL), lactosa (LAC), maltosa (MAL), sacarosa (SAC), trehalosa (TRE), melezitosa
(MLZ), rafinosa (RAF). Las galerías y las ampollas de inoculación se conservaron a
2-8 °C según los datos recomendados en la ficha de bioseguridad.
6.1.1.5.1. COMPOSICIÓN DEL MEDIO
El medio de cultivo que se utilizó para la determinación del auxonograma consistió
en sulfato de amonio 5 g; fosfato monopotásico 0,31 g; fosfato dipotásico, 0,45 g;
cloruro sódico 0,1 g; cloruro cálcico 0,05 g; sulfato de magnesio, 0,2 g; histidina,
0,005 g; triptófano, 0,02 g; metionina, 0,02 g; agar 0,5 g; solución de vitaminas, 1
mg; solución de oligoelementos, 10 mg; agua destilada hasta 1000 ml. El pH final:
6,5-6,7. Aunque este medio se suplementó con agar, se pipetea como un medio
líquido. No se deben agitar para evitar la formación de burbujas.
6.1.1.5.2. PREPARACIÓN DE LA GALERÍA.
Se retiró la cámara de incubación de la caja y se repartió unos 5 ml de agua destilada
estéril en los alvéolos para crear una atmósfera húmeda. Se identificó la referencia
de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara.
6.1.1.5.3. INOCULO.
A partir del desarrollo de esporas o micelial de un cultivo en agar Sabouraud
glucosado de 48 h de crecimiento, se preparó una suspensión de la cepa fúngica con
una turbidez igual a 2 de la escala de McFarland (6x108 células/ml) en 2 ml de agua
57
destilada estéril, a continuación se transfirió 100 µL de dicha suspensión a una
ampolla de medio basal para auxonograma y se homogeneizaba sin formar burbujas.
6.1.1.5.4. INOCULACIÓN DE LA GALERÍA.
Posteriormente se abre la galería con los azúcares deshidratados y se llenan las
cúpulas con 150 µL de la suspensión contenida con el medio. Se cierra la cámara de
incubación y se deja en reposo en estufa a 30 °C durante 48 h o eventualmente 72 h.
6.1.1.5.5. LECTURA DE LAS GALERÍAS.
Transcurrido el tiempo se realizó la observación y verificación del crecimiento de
cada una de las cúpulas tomando como control la primera cúpula como el control
negativo.
6.2. DETERMINACIONES ANALÍTICAS
6.2.1. MÉTODOS ENZIMÁTICOS
6.2.1.1. ENSAYOS CUALITATIVOS
Los hongos aislados por los dos métodos de aislamiento fúngico se inoculó en las
medios de cultivo suplementados con ABTS, Poly-R 478 que se describen a
continuación.
6.2.1.1.1. ENSAYO CUALITATIVO PARA LACASAS
Los hongos aislados fueron inoculados en microplacas de 24 pozos conteniendo el
medio basal LME (Fungal Diversity 1999) suplementado con 0,1 % (p/v) de ABTS
(2,2'azino-bis(3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid) con 1,5 % (p/v) de agar, se
autoclavó y asépticamente se adicionó 1 ml de glucosa acuosa esterilizada 20 %
58
(p/v) por 100 ml de medio preparado. Asépticamente se transfirió a cada pozo 1,5 ml
del medio preparado, se incubó a temperatura ambiente en oscuridad por 10 días. La
producción de lacasas se reporta por la formación de color verde del medio por la
oxidación de las enzimas lacasas extracelulares (Thurston, 1994; Eggert et al.,
1996).
6.2.1.1.2. ENSAYO CUALITATIVO PARA PEROXIDASAS
Los hongos aislados fueron inoculados en microplacas de 24 pozos conteniendo el
medio basal (fungal diversity, 1999) suplementado con 0,02 % (p/v) de Poly-R 478
y 1,5 % (p/v) de agar, se autoclavó y asépticamente se adicionó 1 ml de glucosa
acuosa esterilizada 20 % (p/v) por 100 ml de medio preparado. Asépticamente se
transfirió a cada pozo 1,5 ml del medio preparado, se incubó a temperatura ambiente
en oscuridad por 10 días. La producción de peroxidasas, se consideró positivas por
el cambio en el color de rosado a amarillo por la reducción del Poly-R 478. Las
enzimas analizadas mediante este test incluyen a lignina peroxidasas y manganeso
dependiente de peroxidasa (Boominathan y Reddy, 1992; Pointing et al., 1999).
6.2.1.1.3. ENSAYO CUALITATIVO PARA CELULASAS
Para realizar el ensayo cualitativo se realizó una modificación al método descrito por
Martinez et al. (2002) y se preparó el medio basal Czapeck suplementado con 2%
de Carboximetilcelulosa CMC se autoclavó a 120 °C por 15 minutos. Se transfirió
asépticamente a las cajas Petri, se inoculó el hongo y se dejó incubar a 25 °C.
Aproximadamente a los 6 días de incubación se adicionó 2% de rojo Congo y se
dejó reposar durante 15 minutos. Se eliminó el sobrenadante del rojo Congo y se
lavó con agua destilada. Se adicionó 1 M de NaCl para decolorar durante 15
minutos. Se eliminó todo el sobrenadante en la caja Petri y se observó un halo
59
transparente o de un color mas claro después del lavado con NaCl lo que evidencia
la degradación de CMC (Ponnambalam et al., 2011).
6.2.1.2. ENSAYOS CUANTITATIVOS
Para la evaluación y selección de hongos se estudiaron aquellos hongos aislados que
dieron positivo en el ensayo cualitativo. Se cultivaron las cepas por triplicado en un
medio basal líquido (Calle N. et al., 2007) con KH2PO4 0,5 g/L; K2HPO4 0,6 g/L,
extracto de levadura 0,5 g/L suplementando por un lado: 1) ensayos con 1 g de
glucosa y 2) ensayos sin glucosa. Se realizó el cultivo en forma estática así como en
agitación en shaker orbital a 100 rpm en todos los casos la temperatura fue de 30 °C
en oscuridad durante 13 días. Se utilizo como blanco los medios basales preparados
para cada una de los ensayos enzimáticos.
6.2.1.2.1. ACTIVIDAD LACASA
En placas de 96 pozos se colocó 160 µL buffer acetato pH 3, 20 µL de muestra y 20
µL de ABTS se realizó la medición de la absorbancia a 415 nm durante 2 minutos.
6.2.1.2.2. ACTIVIDAD MANGANESO PEROXIDASA
En placas de 96 pozos se colocó 80 µL de buffer succinato pH 4.5, 20 µL de MTBH,
20 µL de DMAB, 20 µL de MnSO4, 40 µL de muestra. La reacción se inició con la
adición de 20 µL de H2O2 16,4 mM, la misma se mide a 600 nm en un
espectrofotómetro durante un periodo de 30 min.
60
6.2.1.2.3. ACTIVIDAD CELULASA
Para determinar la actividad celulolítica se utilizó el método del Ácido 3,5
Dinitrosalicílico o DNS. Sin embargo se realizó la modificación del método
propuesto por Ghose (1987) de tal manera se aplique el micro método elaborado por
Torrez (2010) utilizando la adaptación de 60 µL como se sugiere y se presenta en el
informe No 4 proyecto IDH que se describe a continuación:
Se utilizó papel filtro Whatman No. 1 y se utilizaron círculos de 5 mm
cortados con una perforadora de papel.
Se depositó en un eppendorf el círculo de papel filtro y se adicionaron 20 µL
de alícuota del extracto de enzima en 40 µL de Buffer acetato de sodio 50
mM. Después de la incubación a 50 °C durante 1 hora.
Se adicionaron 120 µL de DNS en cada tubo eppendorf y se incubaron a 95
°C por 5 minutos.
Se obtuvieron una alícuota de 36 µL de cada muestra y se transfirió a una
microplaca de 96 pozos de fondo plano conteniendo 160 µL de H2O
destilada y se lee en un espectrofotómetro a 540 nm previa homogenización
de la microplaca.
6.2.1.3. CUANTIFICACIÓN ENZIMÁTICA
La actividad Lacasa y Manganeso Peroxidasa se expresó como Unidades
enzimáticas por litro (UL-1
) o (μmol min-1
) L-1
, donde una unidad enzimática expresa
como la cantidad de µmol de producto formado por minuto.
[Concentración]= ΔAbsx1000 x VT x c= (U/L x min-1
) (1)
x Vm
Donde:
61
ΔAbs: Variación de la absorbancia en los dos minutos (min-1
).
VT: Volumen total de la solución (ml).
Vm: Volumen de la muestra.
: Coeficiente de extinción molar, donde:
420 =3600 M -1
cm-1
(de los cromógenos ABTS, para lacasa)
590 =53000 M -1
cm-1
(de los cromógenos DMAB y MTBH, para manganeso
peroxidasa, piranosa oxidasa)
310 =9300 M -1
cm-1
(de veratril alcohol, para ligninaperoxidasa)
1000: factor de conversión de moles a moles
c: Distancia de la cubeta por donde pasa el haz luminoso (1 cm)
Se consideraron los aspectos sugeridos por German et al. (2011) en el caso del
cálculo y la determinación enzimáticas en microplacas de 96 pozos.
Para a cuantificación enzimática de celulasas con actividad FPU se utilizó la curva
de calibración de glucosa (ANEXO 7). Se utilizó la siguiente ecuación para
determinar la actividad celulolítica en UI/ml.
62
6.2.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
La concentración de proteínas se determinó por el método de Bradford, utilizando
como estándar BSA (Bradford 1976) ANEXO 8. Se mezcló 30 µL de cada muestra
que contenía proteínas, estándar o muestras y se mezcló con el reactivo de Bradford
(ANEXO 9), se incubó a temperatura ambiente (~25 °C) por 30 minutos. Se midió la
absorbancia a la longitud de onda de 595 nm. Se utilizo como blanco los medios
preparados para cada parámetro ensayado
6.3. METODOLOGÍA
6.3.1. CONDICIONES DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE
ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS
Las cepas fúngicas seleccionadas se cultivaron cada 10 días en condiciones estériles,
el inoculo consistió en una circunferencia de agar de 0,5 cm de diámetro que se
depositaron en cajas Petri con 20 ml del medio basal suplementado con ABTS y
Poly-R 478 para el aislamiento de las cepas GL9B y CO-1 respectivamente. Las
cajas petris fueron incubados a 25 °C bajo condiciones de oscuridad. Para la Cepa
IB-105 se realizó el cultivo en medio Agar PDA a 25 °C durante 7 días con 12 horas
de luz y 12 horas de oscuridad.
6.3.2. CONDICIONES DE CRECIMIENTO POR EFECTO DE LA
TEMPERATURA
Se preparó un cultivo de 7 días en medio agar Sabouraud dextrosa de las tres cepas
fúngicas de estudio. Con un sacabocados de 60 mm de diámetro se inoculó en cajas
63
petris de 30 cm de diámetro conteniendo agar sabouraud dextrosa, se selló la caja
petri y se incubó por 60 días. Se cultivaron las cepas por triplicado para evitar la
contaminación de las cajas petri y se colocaron a distintas temperaturas (10°C, 25°C,
30°C y 40°C). Se midieron los diámetros de crecimiento cada 3 días y se realizó el
análisis del crecimiento respectivo.
6.3.3. SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO BASAL PARA LA
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS
Tres tipos de medio fueron empleados para el tamizaje de producción de enzimas
denominándolas: 1) Medio A con 0,5 g de KH2PO4, 0,6 g K2HPO4, 0,5 g MgSO4
7H2O, 0,5 g de Extracto de Levadura suplementado con 1g de Glucosa (Calle et al.,
2007). 2) Medio B con 40 mg de MnSO4, 10 mg de NH4NO3, 0,2 g de CaCl2, 0,7 g
KH2PO4, 0,1 g de Glucosa (Terrazas, 2005). 3) Medio C con KH2PO4 1g,
(NH4)3C4H4O6 (Tartrato de Amonio) 0,5g CuS04.5H2O 0,001, MgSO4·7H2O 0,5
Fe2(SO4)3 0,001, CaCl2·2H2O 0,01 MnSO4.H2O 0,001, suplementado con 20 % de
Glucosa (Fungal diversity 1999).
El trozo de agar (60 mm de diámetro) con micelio fue usado como inoculo en
frascos conteniendo 10 ml del medio que fue incubado a 30 °C en recipientes
cubiertos para proveer oscuridad a todos los frascos, el proceso de incubación fue en
agitación en shaker orbital a 100 rpm. La producción de lacasa y Manganeso
Peroxidasas fue determinado cada tres días después del día de su inoculación durante
15 días.
64
6.3.4. OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
6.3.4.1. OPTIMIZACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE LACASAS
Se preparó el medio basal y se utilizó los parámetros para la producción de lacasa
que se muestran en la tabla 3. El volumen utilizado para el experimento fue de 10 ml
en viales de 100 ml de capacidad, dicho volumen permite la mayor expresión de la
actividad enzimática de oxidorreductasas explicados en el informe IDH No. 4
(Noviembre). El diseño factorial con 3 parámetros y tres niveles (33), se observa en
el ANEXO 10,
Tabla 3 Parámetros utilizados para el diseño factorial para Lacasas.
Variables Niveles
Glucosa
0,01 g/L
0,1 g/L
1 g/L
NH4NO3
5 mg/L
10 mg/L
20 mg/L
MnSO4
20 mg/L
40 mg/L
60 mg/L
65
6.3.4.2. OPTIMIZACIÓN PARA LA PRODUCCIÓN DE
MANGANESO PEROXIDASAS
Según la selección del medio basal para la producción de enzimas manganeso
peroxidasa se utilizaron los parámetros que se observan en la tabla 4 para determinar
por un diseño factorial con tres parámetros y tres niveles (33), la selección del medio
óptimo para la cepa CO-1 (ANEXO 11). De la misma manera se utilizó 10 ml de
volumen para el diseño experimental.
Tabla 4. Parámetros utilizados para el diseño factorial para MnP
Variables Niveles
Glucosa
0,002 g/L
0,02 g/L
0,2 g/L
Tartrato
de amonio
0,25 g/L
0,5 g/L
1 g/L
MnSO4
0,001 g/L
0,01 g/L
0,1 g/L
66
6.3.5. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
LIGNINOCELULOSICAS.
6.3.5.1. PRODUCCIÓN Y EXTRACCIÓN DE LA ENZIMA
Al cabo de 12 días de incubación con las cepas GL9B y CO-1 y a los 15 días de
incubación para la cepa IB-105 se filtraron para separar el micelio y las esporas a
través de papel filtro Whatman No. 1 GF/C 0,45 µm y finalmente en un filtro
milipore 0,22 µm. El producto de la filtración se ha utilizado para los experimentos
para concentración y purificación enzimática. La biomasa fúngica se estimó la
biomasa por el secado del hongo en papel filtro al cual se dejó toda la noche a 60 °C
hasta un peso constante medidos en una balanza analítica (Reeslev y Kjoller 1994).
Durante el desarrollo de la cepas en medio liquido se observó la producción de
sustancias exopoliméricas (biofilms) detectadas según su estructura morfológica y su
medición a una absorbancia de 570 nm (Virginia, 2013) se procedió a su remoción
por la técnica de congelación (D‟Souza, 2006) en la que consiste en congelar a -20
°C y consiguientemente descongelar y centrifugar aproximadamente a 22000 g por
15 minutos a 4°C y se remueve el precipitado.
6.3.5.2. COMPARACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE ENZIMA
6.3.5.2.1. CONCENTRACIÓN CON POLY ETHYLEN GLYCOL
(PEG)
El cultivo filtrado se puso en pretratamiento con mezcla de PEG 20000 y buffer
fosfato (pH 7.0) ajustando una proporción de 1/10, Después de una mezcla se deja
reposar por 10 minutos y luego se centrifuga a 3000 rpm por 10 minutos, con bolsas
67
de diálisis (~ 12 KDa cut off) se cierra ambos lados de la bolsa y se deja reposar toda
la noche y se lavó con agua destilada en la superficie. El volumen de rehidratación
fue de 4 ml utilizando agua destilada.
6.3.5.2.2. PRECIPITACIÓN CON PERSULFATO DE AMONIO
Persulfato de Amonio a 80 % de saturación (140,25 g) se adicionó lentamente al
filtrado en mezcla continua a 4 °C. Después que se ha disuelto por completo el
persulfato de amonio se guardó en oscuridad y a baja temperatura para permitir la
precipitación de la proteína. La solución se centrifugó a ~22000g a 4°C por 30
minutos. La rehidratación del precipitado se llevó a 4 ml con agua destilada.
6.3.6. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA
6.3.6.1. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DEAE-SEPHAROSE
Un extracto del medio de cultivo obtenido por el cultivo en “batch” se realizó la
centrifugación a 14000 rpm durante 10 minutos, obteniendo un volumen de 2 ml del
sobrenadante, el mismo fue aplicado sobre una columna de intercambio iónico
DEAE-SEPHAROSE con un volumen de 10 ml, se colecto fracciones cada 3
minutos, bajo un gradiente linear de 0 a 1,5 M de NaCl en 25 mM de buffer acetato
pH 5,5. Se determinó las actividades de todas las fracciones.
68
6.3.6.2. FPLC
Se utilizó una columna de cromatografía de intercambio aniónico Q-sepharose, pre-
equilibrado con buffer Acetato a una concentración de 25 mM a un set de pH de 3,
3.5, 4, 4.5, 5, 5.5. La elución se realizó en gradiente con buffer acetato y NaCl 1 M;
a un flujo de 1 ml min-1. Se colecto las fracciones cada 0,5 ml para el extracto de
celulasas y 1 ml para lacasas y manganeso peroxidasas.
6.3.7. SDS PAGE
El peso molecular de la enzima fue determinada por la desnaturalización en gel de
electroforesis (SDS-PAGE) (Bio-rad, mini-protean) en 12% de poliacrilamida como
describe Laemmli (1970). Las bandas fueron teñidas con Azul de Commasie R-250
para su visualización.
6.3.8. PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS ENZIMAS
6.3.8.1. DETERMINACIÓN DEL PH Y TEMPERATURA
ÓPTIMOS
Para la determinación el pH y la temperatura óptimos la actividad se evaluó a
distintos buffers en las que se incluía el buffer Glicina HCl (pH 2,5 a 3) fosfato
citrato de sodio (pH 3 – 6) Tris HCl (pH 7 – 9) y NaOH glicina (pH 10 a 11); todos
los buffers fueron preparados a 0,2 M en estas mismas condiciones se evaluó a
diferentes temperaturas que van desde los 4 °C hasta los 90 °C y consecuentemente
se determinó la actividad enzimática según correspondían siendo lacasas, manganeso
peroxidasas o celulasas.
69
6.3.9. PROPIEDADES CINÉTICAS ENZIMÁTICAS
6.3.9.1. DETERMINACIÓN DEL Km
La Vmax y Km fue determinado por la gráfica de Lineweaver Burke para la enzima
Lacasa el sustrato utilizado fue ABTS variando la concentración entre 10 a 500 µM.
Para la enzima Manganeso Peroxidasa el sustrato usado fue MnSO4 con la variación
de la concentración entre 0,1 a 1 mM. Para celulasa se utilizó como sustrato CMC
con concentraciones desde 0,1 % a 2 %. Los datos obtenidos por triplicado se
analizaron con el programa GraphPad Prism v. 6.01, los datos de análisis de
Lineweaver Burke estimados se analizaron en Hyper32 v. 1.0 (Hyperbolic Regresion
Analysis of Enzyme kinetic Data).
6.3.10. PROPIEDADES CATALÍTICAS
6.3.10.1. EFECTO DE IONES METÁLICOS
La actividad enzimática se determinó para cada una de las enzimas (lacasas,
manganeso peroxidasas y celulasas) en presencia de diferentes iones metálicos (1
mM, concentración final). CdCl2, BaCl2, CaCl2, FeCl3, MnCl2, MgCl2, NaCl,
Pb(CH3COO-)2 y AgNO3
6.3.10.2. EFECTO DE COMPUESTOS ORGÁNICOS
Se determinó la influencia de los compuestos orgánicos por la adición a una
concentración final de 20 % p/p de metanol, etanol, acetona, mercaptoetanol, tween
40 y SDS, estos últimos a una concentración de 0,1 % p/v.
70
6.3.11. DEGRADACIÓN DE COLORANTES
Los colorantes utilizados para esta prueba fueron azul Índigo (colorante indolico),
azul de metileno (colorante azoico), Poly R-478 (colorante azoico). Inicialmente se
determinó los espectros de absorción utilizando el colorante a 10 ppm disueltos en
agua destilada utilizando como blanco agua destilada. Se realizó sus
correspondientes curvas estándar (ANEXO 12– 14).
6.3.11.1. DEGRADACION DE COLORANTES EN MEDIO SOLIDO
Con los colorantes analizados se suplementó al medio de cultivo optimizado tanto
para las cepas GL9B y CO1, se incluyó 1,5 % de agar-agar y 5 ppm de los
colorantes. Para la cepa GL9B además se añadió ABTS 0,2 mM, se autoclavaron los
medios a 120 °C por 15 minutos y se depositaron en cajas petris. Se inocularon 6
mm de diámetro de un cultivo de 6 días de crecimiento de las dos cepas fúngicas, se
sellaron con parafilm y se incubaron a temperatura ambiente en oscuridad
observando su crecimiento cada 24 horas.
6.3.11.2. DEGRADACION DE COLORANTES EN MEDIO
LIQUIDO
6.3.11.2.1. DEGRADACION CON LAS CEPAS FÚNGICAS
Con las dos cepas fúngicas (GL9B y CO-1) y con los colorantes Azul de metileno,
Azul Índigo y Poly R-478 se adicionaron a los medios de cultivo optimizados, a una
concentración final de 5 ppm, se autoclavaron en viales de 100 ml con 10 ml de
71
medio de cultivo, se incubaron a temperatura ambiente en oscuridad. Además para la
cepa GL9B se utilizaron otro set de viales con las mismas características anteriores a
los cuales se adiciono ABTS 0,2 mM. Se midieron las absorbancias de los colorantes
utilizando como blanco el medio de cultivo.
6.3.11.2.2. DEGRADACION CON ENZIMAS
Para el presente ensayo se utilizaron los extractos de los cultivos de cada cepa en
medio optimizado, enzima purificada, con una actividad Lacasa y Manganeso
Peroxidasa de 10 UI/L. Los colorantes (azul de metileno, azul Índigo y Poly R-478),
se diluyeron en buffer acetato (pH 2,5), buffer succinato (pH 4,5). A 0,5 ml del
extracto del cultivo y de enzimas purificadas con actividades finales de 10 UI/ml se
adicionó 2 ml de los colorantes (2 ppm) y para el caso de lacasas 100 µL de ABTS
0,2 mM. Se incubo las enzimas a temperatura ambiente (~ 25 °C) en shaker orbital a
100 rpm por 3 horas tomando 1 ml de volumen de cada reacción cada 30 minutos y
se determinó espectrofotométricamente las absorbancias.
El porcentaje de decoloración se calculó por la siguiente formula
% de decoloración =
Abs(i) = Absorbancia inicial
Abs(f) = Absorbancia final
72
6.3.11.3. APLICACIÓN DE DEGRADACION DE COLORANTES EN
MATERIAL TEXTIL
Se cortó 2 cm2 de tela jean “denim” con 100 % de algodón pigmentado con Azul Índigo
(Tela jean Covolan Brazilera), se depositaron en buffer acetato, buffer succinato y buffer
citrato de sodio a un volumen de 10 ml. Se añadió los extractos de los medios de cultivo
de las cepas GL9B, CO-1 e IB-105 con actividad final de 20 UI/L por separado y por
otro lado una mezcla de los tres medios de cultivo (Mix). Se dejó en incubación por 3
horas a temperatura ambiente en agitación (100 rpm), se retiraron las telas y se procedió
a secar en estufa a 60 °C. Se procedió a colocar los trozos de tela en una superficie lisa y
se realizó un barrido con el espectrofotómetro de superficie (KONICA MINOLTA CM-
2600d) el cual se midieron con las siguientes especificaciones:
AREA/ESPEC M/I+E
COND. UV UV 100%
ILUM.1 D65
ILUM.2 ---
OBSERVADOR 10º
ESP. COLOR L*a*b*,E*
DESV. EST. SCI---- SCE----
INTERVALO 0,0s
73
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. MATERIAL BIOLÓGICO
7.1.1. HONGOS DEGRADADORES DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO
7.1.1.1. HONGO DEGRADADOR DE CELULOSA
La cepa IB-105 productora de celulasas que previamente se reportó como un hongo
degradador de celulosa en paja brava (Torrez., 2010), fue cultivada en cajas Petri con
Agar PDA adicionando cloranfenicol 0,1 %, para evitar contaminantes de origen
bacteriano, a partir de esporas liofilizadas que fueron conservadas a -20 °C. Se realizó el
cultivo (ANEXO 15 y 16) hasta la tercera replica donde se observó crecimiento
característico de la cepa y se evaluó la actividad enzimática el cual llego a 4.03 UI/L
FPU previamente se reportó con una actividad de 3,01 UI/L FPU ambos en el medio
optimizado a los 15 días de incubación (Torrez 2010).
7.1.1.2. HONGOS DEGRADADORES DE LIGNINA
7.1.1.2.1. COLECTA DE MUESTRAS
El lugar de muestreo fue realizado en dos regiones de nuestro país; Tahuamanu y
Licoma Pampa ubicados en el departamento de Cobija y La Paz, ambas regiones se
caracterizan por tener temperatura alrededor de 30-37 °C y humedad relativa de 60 – 80
%. De los cuales se colectaron 79 muestras de diferente tipo de materia orgánica en
descomposición (hojas, tallos, frutos, semillas, etc.) ANEXO 17.
74
7.1.1.2.2. AISLAMIENTOS DE CEPAS
Los hongos aislados a partir de las muestras de hojas, y materia orgánica en
descomposición utilizando el método indirecto se obtuvieron 33 cepas fúngicas y por el
método directo se obtuvieron 105 cepas fúngicas (ANEXO 18); las cepas aisladas se
conservaron en agar PDA a 4 °C.
Aunque por revisión bibliográfica se recomienda el método de aislamiento indirecto
(Muñoz et al., 2013; Krugg et al., 2012), ninguna de las cepas aisladas presentaron
crecimiento en medio basal con ABTS ni Poly R-478 de tal manera se consideró
negativas a las pruebas cualitativa de lacasas y peroxidasas (Gnanasalomi V et al.,
2013).
En este caso es necesario tomar en cuenta que el factor del estrés por el medio ambiente
juega un papel importante al momento de realizar un aislamiento si bien es
recomendable el método indirecto fue necesario realizar un proceso adaptativo como se
realizó en el método directo para que las cepas fúngicas puedan esporular o permitan la
formación de pseudohifas, hifas o septos (Nikolaou et al., 2009).
Sin embargo de las 138 cepas fúngicas aisladas, 28 cepas mostraron actividad lacasa en
medio basal con ABTS (ANEXO 19) y únicamente una cepa mostro actividad
peroxidasa en medio basal con Poly R-478 (ANEXO 20). Para la depuración en la
búsqueda de un hongo que predictivamente posea una buena actividad lacasa/peroxidasa
se evaluaron los siguientes criterios descritos en la tabla 5.
75
Tabla 5. Códigos de hongos utilizados en la prueba cualitativa positiva para lacasas
y manganeso peroxidasa.
Nro. Cepa Oxidación
de ABTS
Intensidad
de
Oxidación
Oxidación
de Poly R-
478
1 GL1 - - -
2 GL2 + - -
3 GL3 + - -
4 GL4 - - -
5 GL5 + - -
6 GL7 + + -
7 GL8 + - -
8 GL9V - - -
9 GL9B + + -
10 GL10 - - -
11 GL11 - - -
12 GL12B + + -
13 GL15I + - -
14 GL15II - - -
15 GL16R - - -
16 GL16DG + - -
17 GL17 - - -
18 GL18 - - -
19 GL19 - - -
20 GL20V - - -
21 GL21 - - -
22 GL22 - - -
23 GL24 - - -
24 GL26B - - -
25 GP25 + + -
26 EA - - -
27 2I - - -
28 GM + + -
29 CO-1 - - +
Oxidación de ABTS. Prueba que demuestra el cambio de color del medio de incoloro a azul-
verdoso. Intensidad de Oxidación. Grado de coloración del medio tenue o intenso. Oxidación de
Poly R-478. Cambio de color del medio de rojo a amarillo
76
Aunque muchos autores han descrito que la presencia de enzimas oxidativas (lignina
peroxidasas, manganeso peroxidasas y lacasas), pueden atacar una gran variedad de
compuestos poliaromáticos incluyendo a los colorantes azo; una decoloración total o
parcial - reversible se debe a que cada compuestos presentan diferentes potenciales de
oxidorreducción, siendo necesarios distintas clases de mediadores (naturales o
sintéticos) para alcanzar dicho potencial (Ratanapongleka et al., 2014; Moya et al., 2010
Murugesan et al., 2009).
El cambio del estado de oxidación del Poly R-478 se ha usado para el “screening” de
varios tipos de cepas de la podredumbre que presenten actividad peroxidasa o fenol
oxidasa de forma cualitativa (Freitag y Morrel, 1992; Mielgo et al., 2003). Sin embargo
muchos autores indican que dicho método no es suficientemente o específico para
determinar la actividad peroxidasa porque algunas enzimas no pueden alcanzar el nivel
de óxidorreducción del Poly R-478 y ya que para una decoloración total por las
modificaciones de los compuestos aromáticos se deben al conjunto de al menos tres
enzimas importantes en este proceso MnP, LiP y Lacasas además de otras peroxidasas
(Swamy y Ramsay, 1999; Ollika et al., 1993; Vyas y Molitoris, 1995; Mielgo et al.,
2003).
Otros autores además indican que lacasas extracelulares provenientes de
microorganismos no tienen buena actividad sobre ciertos colorantes azo debido al
potencial de oxidación disminuido en el medio extracelular o inhibido por la presencia
de quelantes en el medio extracelular (An et al., 2002; Zouari-Mechichi et al., 2006;
Hernández-Luna et al., 2008; Kurt y Buyukalaca, 2010). Aunque las cepas aisladas
producen actividad cualitativa para lacasas con ABTS solo la cepa CO-1 en este estudio
logro decolorar el colorante Poly R-478.
77
7.1.1.2.3. SELECCIÓN DE CEPAS FÚNGICAS CON MAYOR ACTIVIDAD
LIGNINOLÍTICA
Para las pruebas cualitativas de enzimas ligninolíticas se seleccionaron las cepas que
presentaron dos cruces (++), entre ellas se encuentran las cepas GL9B, GP25, GL12B,
GL7 y GM sin embargo se utilizó a la cepa CO-1 porque fue la única que presentó
actividad peroxidasa en medio semisólido (ver tabla 5).
7.1.1.2.3.1. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ENZIMAS
CELULOLITICAS
Las 138 cepas resultantes de los aislamientos directo e indirecto se probaron en medio
Czapeck donde no se evidenció la formación de ninguna halo de hidrólisis del CMC
con rojo congo. De tal manera se excluyeron de los ensayos para la producción de
enzimas celuloliticas, utilizandose solo a la cepa IB-105 como productora de celulasas
puesto que se observó la formacion de un halo incoloro (ANEXO 21)
7.1.1.3. ENSAYO CUANTITATIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE LACASAS
Y MANGANESO PEROXIDASAS
En el presente ensayo se utilizaron las cepas positivas con (++) en el ensayo cualitativo
de las cuales se seleccionaron a las cepas 9B. GP-25, GL-12b, GL7, GM y CO-1 las
mismas se sometieron a las condiciones de suplementación con Glucosa y sin Glucosa y
en medio estático y en agitación. Se tomaron estos parámetros para evaluar la
producción con la mayor actividad enzimática de lacasas y manganeso peroxidasas
debido a que es importante conocer si existe una gran influencia en la cantidad de fuente
de carbono en forma de glucosa, puesto que la fuente de carbono influye enormemente
en el grado de glicosilación de las proteínas y su correspondiente actividad enzimática a
78
esto se suma el estrés que se somete la cepa en el caso de no tener fácilmente la fuente
de carbono para su asimilación (Baldrian P., 2006; Tinoco et al., 2010).
Se han observado ensayos, en los que ciertas cepas fúngicas producen mayor cantidad
de enzimas lacasas y manganeso peroxidasas en medios con ausencia de glucosa esto
debido a que en la madera tanto la celulosa y la lignina están entrelazados y una
oxidación e hidrolisis de los mismos ocurren al mismo tiempo dando ciertos productos
por su degradación, sin embargo la degradación solo de celulosa y solo de lignina
promueve la producción de otros subproductos, es por eso cuando los hongos son
cultivados en lignina con o sin la adición de glucosa los hongos excretan una variedad
de fenol oxidasas que causan la polimerización de sustancia fenólicas, la presencia de
algún tipo de azúcar se previene la polimerización de la lignina inhibiendo la excreción
de algunas oxidorreductasas (Wetermark et al., 1974; Ander et al., 1997; Shah et al.,
2002). Es por ese motivo que en el presente trabajo se trató de evidenciar si existe el
efecto de la producción de las Lacasas, MnP y LiP.
El estudio del cultivo en agitación o estático se utilizó para determinar si las condiciones
de aireación del medio (oxígeno disuelto en el medio) favorece la producción de
enzimas. Estudios previos indican que la óptima producción de enzimas ocurre en
medios con agitación o aireación debido a que la disponibilidad e intercambio de
O2/CO2 es más eficiente en el crecimiento de las cepas fúngicas (Rothschild et al., 1999;
Shin et al., 2010). Los resultados obtenidos se observan en los gráficos 1 al 8.
79
Gráfico 1 Actividad Lacasa en condiciones estáticas con suplementación de glucosa de
las seis cepas seleccionadas
La mayor actividad con 9,74 UI/L ± 1,12 se observó con la cepa GL9B en un medio
estático suplementado con glucosa a los 13 días de incubación, sin embargo las cepas
GL12b (3,14 UI/L±0,99), GP25 (2,04 UI/L ± 0,74) son las que presentaron mayor
actividad. En cambio las cepas CO-1 (0,014 ± 0,004), GL7 (0,023 ± 0,006) y GM (0,037
± 0,007 UI/L) no presentaron buena actividad en estas condiciones
Gráfico 2 Actividad Lacasa en condiciones estáticas sin suplementación de glucosa de
las seis cepas seleccionadas
80
La mayor actividad lacasa con las condiciones del medio estático sin la adición de
glucosa demostró que la cepa GL9B presentó una actividad de 0,16 ± 0,06 UI/L a los 13
días de incubación, en comparación con las otras cepas las actividades enzimáticas son
bajas.
Gráfico 3 Actividad Lacasa en condiciones de agitación con suplementación de
glucosa de las seis cepas seleccionadas
Con los parámetros del medio en agitación suplementado con glucosa la cepa GL9B
presento mayor actividad con 12,05 ± 1,46 UI/L a los 6 días de incubación, sin embargo
la cepa GL12b presento una actividad de 6,32 ± 1,52 UI/L a los 13 días de incubación,
sin embargo las cepas CO-1 (0,45 ± 0,07 UI/L) GP-25 (0,34 ± 0,09 UI/L), presentaron
su máxima actividad a los 13 días de incubación y las cepas GL7 (0,47 ± 0,015 UI/L) a
los 9 días de incubación y la cepa GM (0,3 ± 0,084 UI/L) a los 6 días de incubación.
81
Gráfico 4 Actividad Lacasa en condiciones de agitación sin suplementación de glucosa
de las seis cepas seleccionadas
El medio en agitación sin suplemento de glucosa donde se observó que la mayor
actividad presento la cepa GL9B con 0,12 ± 0,03 UI/L a los 3 días de incubación y las
cepas GL12b (0,025 ± 0,01 UI/L), CO-1 (0,012 ± 0,001), GP25 (0,012 ± 0,003 UI/L),
GL7 (0,003 UI/L) y GM (0,001 UI/L) a los 3 días de incubación presentaron su mayor
actividad.
La mayor actividad Lacasa se presentó en las condiciones de agitación con suplemento
de glucosa, de esta manera se demostró que se requiere el suplemento de glucosa en el
medio como fuente de carbono en este estudio la ausencia de glucosa no promueve el
estrés fúngico para la producción activa de las enzimas oxidorreductasas efecto
mencionado por Shah et al. (2002). La cepa con mayor actividad fue GL9B y además se
selecciona esta cepa por que la actividad en estas condiciones se presenta a los 6 días de
incubación (12,05 UI/L) sin embargo en medio estático se alcanzó la actividad de 9,74
UI/L a los 13 días de incubación.
82
Gráfico 5 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio estático con la suplementación de
Glucosa de las seis cepas seleccionadas
La mayor actividad manganeso peroxidasa presento la cepa GM con 0,34 ± 0,09 UI/L a
los 9 días de incubación sin embargo se observó que las cepas GP25 (0,15 UI/L a los 3
días de incubación), CO-1 (0,13 ± 0,04), GL12 (0,09 ±0,03 UI/L) y GL7 (0,11 ± 0,01
UI/L) a los 13 días de incubación.
Gráfico 6 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio estático sin la suplementación de
Glucosa de las seis cepas seleccionadas
83
En medio estático sin el suplemento de glucosa la cepa con mayor actividad fue GM con
0,32 ± 0,02 UI/L a los 6 días de incubación sin embargo las cepas GL9B (0,02 ± 0,01
UI/L), GP25 (0,02 ± 0,01 UI/L), CO1 (0,016 ± 0,005 UI/L), GL12B (0,007± 0,001
UI/L) y GL7 (0,025 ± 0,011 UI/L) presentaron su mayor actividad a los 3 días de
incubación.
Gráfico 7 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio con agitación y la
suplementación de Glucosa de las seis cepas seleccionadas
La mayor actividad en las condiciones del medio en agitación con glucosa, presentó la
cepa CO-1 con 1,11 ± 0,06 UI/L a los 9 días de incubación.
84
Gráfico 8 Actividad Manganeso Peroxidasa en medio con agitación sin la
suplementación de Glucosa de las seis cepas seleccionadas
La mayor actividad en condiciones de medio en agitación sin suplemento de glucosa fue
la cepa GL9B con 0,01 UI/L, a los tres días de incubación las cepas GM (0,004 UI/L),
GL7 (0,003 UI/L), GL12b (0,003 UI/L), CO-1 (0,003 UI/L) y GP25 (0,004 UI/L)
también produjeron su mayor actividad a los 3 días de incubación.
Se seleccionó la cepa CO-1 como el hongo productor de enzimas manganeso
peroxidasas debido a que la mayor actividad en condiciones de agitación y
suplementado con glucosa a los 9 días de incubación la actividad fue de 1,11 UI/L en
condiciones de cultivo estático su actividad fue 0,13 a los 13 días de incubación, aunque
la cepa GM tuvo la mayor actividad en cultivo estático se observa lo contrario en
85
cultivos en agitación. Algunos autores sugieren que el oxígeno en el medio de cultivo
inhibe la producción enzimática como se presentó en el caso de la Cepa GM en medio
líquido inhibiendo la producción de enzimas independiente de peroxidasa (Gold y Allic,
1993; Kirk y Farell, 1987; Kuwahara, 1984; Tien & Kirk 1983).
Otra característica importante fue que la Cepa CO-1 fue la única que degradó Poly R-
478 en el “screening” cualitativo, también se observó que esta cepa tuvo actividad lacasa
de 0,45 UI/L siendo considerablemente menor que la cepa GL9B posiblemente la cepa
GM con actividad lacasa de 0,3 ± 0,084 UI/L no actúa de forma sinérgica con la
Manganeso peroxidasa que la excreta inhibiendo la decoloración in vitro (Koroleva et
al., 2002; Lorenzo et al., 2006).
En los experimentos se logró observar que la suplementación de glucosa en el medio de
cultivo influye en la actividad enzimática, como característica fundamental es que existe
una gran relación con la glicosilación de estas enzimas (Xiao, 2003) y su rol en la
formación de metabolitos primarios que le permiten la formación de su biomasa en la
obtención de nutrientes (Hatzimanikatis, 2004).
86
7.1.2. IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA MACROSCÓPICA Y
MICROSCÓPICA
7.1.2.1. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA GL9B
A. B.
6
7
8
9
10
C.
Figura 14. Cultivo de la cepa GL9B
A. Crecimiento macroscópico de la cepa GL9B en agar Extracto de Malta 3%. B.
Crecimiento macroscópico de la cepa GL9B en medio basal suplementado con
ABTS a los 3 días de incubación C. Imagen microscópica de la cepa GL9B a 100X
En la identificación macroscópica la cepa GL9B, presento ser hongo asporógeno
filamentoso con micelios e hifas blanquecinas de espesor regular con bordes regulares
en crecimiento radial de tipo anamórfico.
Microscópicamente esta cepa presenta hifas con septos de tipo plecténquimas pseudo
tabicados anamórfico asporágeno. A su vez también se observan ascomas unitunicados
87
sin la formación evidente de un ostiolo se presume que su reproducción es asexuada
representada por pelos conidióforos conidios multiseptados con células centrales
pequeñas oscuras y extremidades hialinas con pequeñas setulas, son ramificados con
estroma eustromático. Estas características específicas nos demuestran que esta cepa
pertenece a la familia Ascomycota,
7.1.2.2. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA CO-1
A. B.
C. D.
Figura 15. Cultivo de la Cepa CO-1
A. Crecimiento macroscópico de la cepa CO-1 en agar Extracto de Malta 3%. B.
Crecimiento macroscópico de la cepa CO-1 en medio basal suplementado con ABTS a
los 3 días de incubación C. Crecimiento en medio basal suplementado con Poly R-478 a
los 5 días de incubación D. Imagen microscópica de la cepa CO-1 a 100X
88
Macroscópicamente la cepa CO-1, es un hongo asporógeno filamentoso con micelios e
hifas blanquecinas de espesor regular con bordes regulares en crecimiento radial de tipo
rizomórfico.
Microscópicamente esta cepa presenta hifas dicarioticas septadas con la formación de un
metabasidio, se observa basidiosporas con núcleos oscuros y pequeños con extremos
largos hialinos traslucidos con escasas royas y carbones longitudinales, y algunas hifas
receptivas. Por estas características se determinó que el hongo se agrupa dentro de los
basidiomicetos
7.1.2.3. IDENTIFICACIÓN DE LA CEPA IB-105
Agar PDA Microscopica
A. B.
Figura 16. Cultivo de la Cepa IB-105
A. Crecimiento macroscópico de la cepa IB-105 en agar Extracto de Malta 3%. B.
Imagen microscópica de la cepa GL9B a 100X
Macroscópicamente la cepa es granular con coloración marrón con la presencia de
esporas visibles, de espesor delgado, la colonia presenta bordes irregulares.
89
Microscópicamente se observa hifas con cabezas conidiales en forma perpendicular al
micelio la que presenta ligera pigmentación marrón, con escasas equinulaciones. La
presencia de una vesícula distal en forma elíptica ligeramente pigmentada. Fialides
secundarias con fialosporas pigmentadas. En forma de saco elíptico que contiene
esporas. Por estas características este hongo se clasificó dentro del género Aspergillus.
7.1.3. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
Para la identificación molecular se siguió los pasos para la extracción de ADN y se
determinó la pureza utilizando la medición en el espectrofotómetro UV que se resumen
en la tabla 6.
Tabla 6. Resultados de la extracción de ADN
Muestra Abs 260 Abs
260/Abs280 [ADN] ng/uL
GL9B 0,098 1,611 940
CO-1 0,101 1,714 1101
IB-105 0,105 1,569 1120
El rango de pureza en la cuantificación del ADN se relación con la degradación del
mismo y la medición de nucleótidos libre, por tanto el índice de pureza nos permite
detectar si existe una contaminación por proteínas las cuales interfieren en la
amplificación y la secuenciación (Bergallo et al., 2006). Un valor cercano a 2 indica que
no hay contaminación por proteínas, en el estudio se obtuvo valores cercanos a 1,8 por
lo que se sospechó una ligera contaminación por proteínas y de acuerdo al análisis se ha
visto que las células de origen fúngico son aquellas que difícilmente alcanzan un
elevado índice de pureza quedando varios restos de proteínas entre otros que conforman
90
las estructuras celulares como la pared celular del hongo (Ning et al., 2009), sin
embargo se realizó la corrida electroforética para comprobar si el ADN estaba intacto o
degradado y en el presente trabajo no se evidencio la fragmentación o degradación del
ADN genómico.
Para realizar la identificación molecular se realizó la amplificación por PCR utilizando
los primers F63 y LR3 que amplifica la subunidad 18S o también llamada SSU (Small
Subunit) ADNr para una comparación filogenética se observa la regiones variables D1
y D2 puesto se extiende para heterobacidiomicetos y algunos Ascomycetos (Masclaux et
al.,1995; Peterson y Kurtzman, 1991; Demain, 1998) demostrando que la región D2 es
una región suficientemente variable para el reconocimiento biológico de especies de
levaduras y hongos (Fell et al., 2000; Carrigg et al., 2007).
Aunque algunas veces la amplificación variable de los dominios del 18 S han mostrado
ser insuficientes al momento de proporcionar información de una especie por tanto se
utilizó los primers ITS1 e ITS4A que amplifican regiones ITS que tienen mayor
variabilidad y generalmente se usan para la diferenciación de especies con patrones de
micro evolución (Gräser et al., 1999; Schoch et al., 2012).
91
Figura 17. Gel agarosa 1% amplificación de primers F63/LR3 región D1/D2 LSU.
Figura 18. Gel Agarosa 1% amplificación de primers ITS-1 / ITS-4A
92
Las secuencias obtenidas por el secuenciador AB3130 (ANEXO 22-32) se subieron a la
base de datos NCBI Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) los cuales se muestran en la tabla
con su mayor identidad tanto para los primers D1/D2 e ITS.
Tabla 7. Resultados de la alineación por NCBI Blast el cual se reporta con la mayor
identidad
Marcador Codigo Cepa Identidad
D1/D2
CO-1 Phanaerochaete sp. 94%
IB-105 Aspergillus sp. 98%
GL9B Pestalotiopsis sp. 94%
ITS
CO-1 Phanaerochaete sp. 89%
IB-105 Aspergillus terreus 88%
GL9B Pestalotiopsis microspora 93%
Por la secuenciación y por la alineación en la base de datos del NCBI utilizando los
primers tanto D1/D2, ITS-1 e ITS-4A, la mayor identidad para la cepa IB-105 fue
Aspergillus terreus (88 %), GL9B con identidad para Pestalotiopsis microspora (93%) y
CO-1 con identidad para Phanaerochaete sp. (94 %). Los valores de identidad nos
refieren al grado de similitud con una especie o bien la distancia genética entre familias,
subfamilias especies y subespecies (Taylor et al., 2000; Voigt y Kirk 2011), sin embargo
para identificar totalmente las cepas analizadas e indicar la distancia de evolución
intraespecie, es necesario realizar otras pruebas de biología molecular como el contenido
de G/C, o análisis de mutaciones intraespecie (DGGE), para poder denominar las cepas
estudiadas como otras cepas dentro de sus especies de origen nativo wild type (Nilsson
et al., 2008; Bellemain et al., 2010).
Por tanto se denominó que la cepa IB-105 es perteneciente al genero Aspergillus sp.,
GL9B Pestalotiopsis sp. y CO-1 Phanaerochaete sp.
93
7.1.4. CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA
7.1.3.1 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA POR ASIMILACIÓN DE
AZUCARES
Las tres cepas fúngicas se sometieron a distintos azucares como fuente de carbono los
mismos se detallan en la siguiente tabla (ANEXO 33).
Tabla 8. Resultados de la asimilación de azucares de las cepas inoculados en las
galerías.
AZUCAR CEPAS FUNGICAS
IB-105 GL-9B CO-1
GLUCOSA + + +
GLICEROL + - -
2-KETO-D-GLUCONATO - + -
L-ARABINOSA + + +
D-XILOSA + - -
ADONITOL + - -
XILITOL + - -
GALACTOSA + - -
INOSITOL + + +
SORBITOL + - -
O-METIL GLUCOSIDO + - -
N-ACETIL-D-GLUCOSAMINA + - -
CELOBIOSA + - -
LACTOSA - + +
MALTOSA + + +
SACAROSA + + +
TREHALOSA - - -
MELEZITOSA - + -
RAFINOSA - + +
94
Uno de los criterios taxonómicos importantes como característica fisiología es la
capacidad de asimilación de azucares, los resultados obtenidos para las tres cepas en
estudio se detallan en la anterior tabla. Si bien este método de clasificación es
insuficiente ya que solo aportan el tipo de metabolismo de carbohidratos que presentan
dichos hongos (Mendoza 2006), el método más eficiente en la actualidad va siendo los
métodos por biología molecular como el PCR de regiones conservadas y variables; sin
embargo son necesarios en este estudio para determinar los carbohidratos que pueden
asimilar las cepas fúngicas, cabe señalar que la única cepa capaz de asimilar la celobiosa
fue la cepa IB-105, asumiendo que es la única cepa productora de celulasas así mismo la
única que dio positiva mediante el experimento cualitativo de enzimas celulolíticas con
rojo congo.
7.2. CONDICIONES DE CULTIVO PARA LA PRODUCCIÓN DE ENZIMAS
LIGNINOLÍTICAS
7.2.1. CONDICIONES DE CRECIMIENTO POR EFECTO DE LA
TEMPERATURA
Por el modelo matemático de Monod y con los resultados obtenidos según el
crecimiento fúngico a distintas temperaturas (ANEXOS 34 – 37) se determinó la
velocidad de crecimiento para cada cepa fúngica según la ecuación matemática
propuesta por Dantigny (2006) tomando en cuenta el crecimiento radial.
r = μ (t - λ)
Donde:
r es el crecimiento micelial (cm)
μ es la velocidad de crecimiento (cm dias-1)
t el tiempo de cultivo (días)
λ representa el tiempo correspondiente a la fase de latencia del tamaño de la caja petri .
95
La velocidad de crecimiento, se calculó mediante regresión lineal de la fase de
crecimiento del cultivo correspondiente a cada temperatura de crecimiento.
Para la cepa IB-105 la temperatura que promueve el mejor crecimiento con respecto a su
velocidad de crecimiento es a los 25°C con una µ de 0,0965 cm dia-1
; para la cepa
GL9B la µ de 0,767 cm dia-1
a 30 °C y para la cepa CO-1 a 25 °C µ de 0,093 cm dia-1
.
Por tanto estas cepas se clasificaron como mesofílicas.
Gráfico 9. Velocidad de crecimiento específico según el ensayo de crecimiento a
distintas temperaturas
96
7.3. SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO BASAL PARA LA
PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS
Experimentalmente fue necesario conocer si la suplementación de tres componentes
variables en los medios de cultivo como ser fuente de nitrógeno, fuente de carbono y
micronutrientes como inductores afectan en la producción de las enzimas
oxidorreductoras (Sivakami et al., 2012; Gregg et al., 2012). La producción enzimática
en cepas fúngicas varían por el grado de glicosilación, o el tipo de inducción en el
metabolismo fúngico (Vite-Vallejo et al., 2009),
Para el caso de la cepa GL9B se puede indicar que la fuente de nitrógeno adicional
como el NH4NO3 permite una mayor actividad, correlaciona con estudios realizados en
los que muestran que el medio suplementado con una fuente de nitrógeno inorgánica
permite la inducción de lacasas aunque el rango de suplementación de fuente de carbono
y nitrógeno es directamente dependiente para la producción de enzimas ligninolíticas
(Buswell et al., 1995, Heinzkill et al., 1998).
Gráfico 10. Actividad Lacasa de la cepa GL9B en los tres medios de cultivo
97
La actividad lacasa después del ensayo con diferentes medios se incrementó a los 9 días
en el medio B con una actividad de 249,65 ± 18,66 UI/L (p 0,0000) con respecto a la
actividad con el medio basal de 121,59 ± 1,84 UI/L (p 0,0002) de tal manera que el
medio B permite la elevación de la actividad con respecto al medio A (medio basal) en
contraste solo se obtuvo una actividad de 21,5 ± 0,62 UI/L.
Gráfico 11. Actividad Manganeso peroxidasa de la cepa GL9B en los tres medios de
cultivo
La actividad manganeso peroxidasa producida por la cepa GL9B fue de 0,88 ± 0,32
UI/L a los 3 días (p 0,0044) y 0,96 ± 0,39 UI/L para el cultivo en el medio C (p 0,000).
98
Gráfico 12 Actividad Lacasa de la cepa CO-1 en los tres medios de cultivo
Sin embargo la actividad lacasas producidas por la cepa CO-1 fue de 1,45 ± 0,34 UI/L
(p 0,0028) siendo la mayor actividad con el medio C con respecto a los otros medio
utilizados para para la producción enzimática pero 100 veces menor obtenida con la
cepa GL9B.
Gráfico 13. Actividad Manganeso peroxidasa de la cepa CO-1 en los tres medios de
cultivo
99
La mayor actividad manganeso peroxidasa con la cepa CO-1 fue de 3,53 ± 0,41 UI/L (p
0,000) a los 9 días de incubación y de la misma manera en el medio C, para el medio A
con 1,34 ± 0,11 UI/L y 0,13 ± 0,051 UI/L en el medio B
7.4. OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO POR DISEÑO
FACTORIAL
Varios factores influencian la producción de enzimas ligninolíticas entre aquellos
mencionados la complejidad de la fuente de nitrógeno (orgánico e inorgánico), la fuente
de carbono (azucares simples, complejos) y la concentración de micronutrientes o
inductores (Wesenberg et al., 2003, Xavier et al., 2001). Por este motivo se realizó la
optimización del medio de cultivo para las cepas GL9B y CO-1 contando los parámetros
citados para obtener una mayor actividad enzimática (Lacasas y MnP).
7.4.1. OPTIMIZACION DE PRODUCCION DE LACASAS
Se utilizó tres variables; concentración de glucosa (0,01g, 0,1g y 1g), NH4NO3 (1 mg,
10 mg y 100 mg) y MnSO4 (20 mg, 40 mg y 60 mg) se realizó 27 experimentos según el
diseño factorial por triplicado cada experimento obteniéndose 81 viales. Por análisis de
varianza (Software Statistica ver 8.0) (ANEXO 38 – 40) se obtuvo los resultados que se
observa en la gráfico 14.
100
Gráfico 14 Análisis de Varianza expresados las tres variables y los tres niveles del
diseño factorial
La combinación de las tres variables por diseño factorial y que expresa una mayor
actividad enzimática fue NH4NO3 10 mg/L, Glucosa 1 g/L y 20 mg de MnSO4 por
presentar una actividad Lacasa de 349,89 ± 0,89 UI/L con la cepa GL9B, en las gráficas
se observa la tendencia de las variables expuestas en el presente trabajo.
7.4.2. OPTIMIZACION DE LA PRODUCCION DE MANGANESO
PEROXIDASAS
Para la optimización del medio de cultivo con la cepa CO-1 por los resultados previos se
optimizo el medio C utilizando tres variables con tres niveles concentración de glucosa
(0,002 g/L), tartrato de amonio (0,25 g, 0,5 g y 1 g) y Sulfato de manganeso (0,001 g,
0,01 g y 0,1 g). El resultado de los 27 experimentos por diseño factorial y por muestras
triplicadas se obtiene en el gráfico 15 los efectos de los parámetros estudiados por el
análisis de varianza (ANEXO 41 – 43).
101
Gráfico 15 Análisis de Varianza expresados las tres variables y los tres niveles del
diseño factorial
La mejor actividad producida por el diseño factorial fue la concentración Tartrato de
Amonio 0,25 g/L, glucosa 0,02 g/L y MnSO4 0,01 g/L permiten producir en el medio de
cultivo una actividad manganeso peroxidasa de 38,94 ± 1,85 UI/L.
7.5. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS
Después de un cultivo en medio líquido con cada cepa fúngica en condiciones del
medio optimizado se procedió a recolectar los sobrenadantes de los cultivos llegando a
un volumen aproximado de 1000 ml y se procedió a realizar las técnicas de
concentración (ANEXO 44 y 45) y se obtuvieron:
102
7.5.1. PURIFICACIÓN DE LACASA DE LA CEPA GL9B
Tabla 9. Tabla de purificación de Lacasas de la cepa GL9B
Técnica de Concentración
Actividad Lacasa (UI L-1)
Concentración de Proteína (mg L-1)
Actividad Especifica (U mg-1)
Fold
Cultivo Filtrado 341 1,3 262,3 1
Concentración con PEG
10489 1,8 13111,25 30,76
Precipitación con (NH4)2SO4
6815 1,5 4543,33 19,98
El método de concentración que tenía mayor actividad enzimática fue con PEG (10489
UI/L), con el precipitado con (NH4)2SO4 se obtuvo un 6815 UI/L y el cultivo filtrado
con 341 UI/L
7.5.2. PURIFICACIÓN DE MANGANESO PEROXIDASA DE LA CEPA CO-1
Tabla 10. Tabla de purificación de MnP de la cepa CO-1
Técnica de Concentración
Actividad MnP (UI L-1)
Concentración de Proteína mg L-1
Actividad Especifica (U
mg-1) Fold
Cultivo Filtrado 36,41 1,09 33,40 1
Concentración con PEG
1013 0,65 1558,46 27,82
Precipitación con (NH4)2SO4
635 0,52 1221,15 17,44
103
El método con mayor concentración para manganeso peroxidasas de 1013 UI/L fue de la
misma manera con PEG. Los beneficios que se vio en el estudio es que permite
fácilmente y con mayor rapidez la concentración de las proteínas además que mantiene
la estructura molecular y previene la desnaturalización de la estructura cuaternaria, esto
reflejado en la actividad enzimática comparado con los otros métodos.
7.5.3. PURIFICACIÓN DE CELULASAS DE LA CEPA IB-105
Tabla 11. Tabla de purificación de Celulasas con Actividad CMCasa de la cepa IB-
105
Técnica de Concentración
Actividad CMCasa (UI L-1)
Concentración de Proteína mg L-1
Actividad Especifica (U
mg-1) Fold
Cultivo Filtrado 51,42 2,81 18,29 1
Concentración con PEG
1310 1,4 935,71 25,48
Precipitación con (NH4)2SO4
961 1,3 739,23 18,69
Se ha realizado los pasos de concentración de enzima en las 3 cepas fúngicas de las
cuales la concentración con PEG resulta más eficiente observando el factor de
purificación es de aproximadamente de 25 a 30 en los tres casos y la actividad específica
se obtiene con mejor rendimiento también utilizando el mismo método, sin embargo se
obtuvo mayor concentración de proteínas en el caso de filtración del cultivo ya que este
método arrastra otro tipo de moléculas de bajo peso molecular como aminoácidos o
péptidos los mismo actúan con el reactivo de Bradford dando una elevada concentración
de proteínas (Harrison et al.,1993), sin embargo como es el caso de PEG permite
desechar moléculas por debajo de 20 KDa (péptidos entre otros) además que entre los
104
pesos moleculares de 40 y 80 KDa permite alargar el tiempo de vida media de las
proteínas (Nakoaka., 1997).
7.6. PURIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA DEAE-
SEPHAROSE
Para la preparación de la cromatografía se inició con una actividad de 10 UI/L de
actividad enzimática tanto para verificar el porcentaje de rendimiento después de la
cromatografía.
Inicialmente se realizó cromatografía por intercambio iónico en una columna con
DEAE-SEPHAROSE en los tres casos de purificación para lacasas, manganeso
peroxidasas y celulasas se obtuvieron 30 fracciones con aproximadamente 1 ml de
volumen en cada vial de recolección para lacasas las fracciones 10, 11 y 12 se presentó
una actividad de 4,8 UI/L, 5,1 UI/L y 3,9 UI/ L respectivamente, para manganeso
peroxidasas las fracciones 14 y 15 presento actividades de 3,1 UI/L y 2,8 UI/L
respectivamente; para el extracto con celulasas se obtuvieron actividad FPU en las
fracciones 9 y 10 (1,5 y 2,5 UI/L) y CMCasa en las fracciones 11, 12 y 13 (3,1 UI/L,
1,1 UI/L y 0,89 UI/L)
7.7. PURIFICACIÓN POR FPLC (FAST PROTEIN LIQUID
CROMATOGRAPHY)
De la misma manera se realizó la cromatografía por FPLC para las tres enzimas sin
embargo se logró realizar un gradiente de pH con el equipo Biologic Duo Flow
(BIORAD) utilizando el adjunto MAXIMIZER (BIORAD) (ANEXO 46)en el cual se
inició con pH 2,5 hasta pH 8,0 para las enzimas lacasas se obtuvo el cromatograma que
se observa en el gráfico 29 a pH 4,5 donde se obtuvieron las fracciones 11 y 12
actividades de 1,8 UI/L y 5,8 UI/L en otros cromatogramas se observa picos no tan
105
definidos por lo cual se seleccionó que el pH óptimo de separación para enzimas lacasas
fue a pH 4,5, por encima de este pH.
Gráfico 16. Cromatograma extracto del medio de cultivo de la cepa GL9B pH 4.5
Para la purificación de enzimas manganeso peroxidasa el mejor gradiente de pH
encontrado fue a pH 5 (gráfico 17). En el cual se obtuvo en la fracción 11 actividad de
5,3 UI/L
106
Gráfico 17 Cromatograma extracto del medio de cultivo de la cepa CO1 pH 5
En la purificación de enzimas celulasas el mejor gradiente de pH fue a pH 5,5 en el cual
se obtuvieron las fracciones 53 al 57 con actividades FPU de 1,2 UI/L, 1,5 UI/L,
CMCasa 2,1 UI/L y 3,8 UI/L y las fracciones 63 y 64 con actividad CMCasa de 0,34
UI/L y 0,21 UI/L (gráfico 18)
107
Gráfico 18 . Cromatograma extracto del medio de cultivo de la cepa IB-105 pH 5.5
7.8. SDS-PAGE
Una vez obtenidas las fracciones se realizó electroforesis SDS-PAGE de las fracciones a
las cuales se tenía mayor actividad enzimática y procedió a hacer la corrida
electroforética en el carril 1 se observa las 10 bandas del marcador de peso molecular
utilizado (Precision Plus Protein All Standards Biorad) en el carril 2 se observa una
banda de la fracción 12 (actividad lacasa 5,8 UI/L); el carril 3 se eligio la fracción 11
con (actividad manganeso peroxidasa de 5,1 UI/L) y las bandas 3 y 4 fracciones 57 y 63
con actividad FPU 3,8 UI/L y CMCasa 0,34 UI/L respectivamente
108
Figura 19, Gel de Electroforesis
1 Ladder de peso Molecular desde 250 KDa. 2 Fracción 12 con mayor actividad lacasa.
3 fracción 11 con mayor actividad MnP. 4 Fraccion 57 con mayor actividad FPU. 5
Fracción 63 con mayor actividad CMCasa
El peso molecular de la fracción 12 del carril numero 2 es aproximadamente de 75 KDa
para la enzima con actividad lacasa, el carril 3 con la fracción 11 se observó una banda
aproximadamente de 50 KDa y otra aproximadamente a 70 KDa. Para la fracción 57 del
carril numero 4 con actividad FPU se observó 4 bandas la primera aproximadamente a
75 KDa, 73 KDa, 35 KDa y 30 KDa aproximadamente y de la fracción 63 con Actividad
CMCasa dos fracciones a 35 KDa y 30 KDa aproximadamente. (Giardina et al., 2010;
More et al., 2011).
Para el peso molecular de las lacasas se han encontrado enzimas e isoenzimas con pesos
moleculares entre el rango de 55 KDa hasta 80 KDa (Ruijssenaars et al., 2004;
250
KDa 150
KDa 100
KDa 75
KDa 50
KDa 37
KDa 25
KDa 20
KDa 15
KDa 10
KDa
109
Mohammadian et al., 2010; Reiss et al., 2011), en el presente estudio la fracción con
actividad Lacasa posiblemente sea una isoenzima de la cepa fúngica estudiada.
Para el peso molecular de manganeso peroxidasas se encontraron dos bandas en estudios
al respecto se ha encontrado que las manganeso peroxidasas generalmente se encuentran
en un rango de peso molecular entre los 30 a 55 KDa (Praveen et al., 2012) siendo una
de ellas correspondiente a una de las isoformas de las manganeso peroxidasa la otra
banda a 70 KDa, posiblemente se trate de alguna isoenzima del tipo lacasa o lignino
peroxidasa debido a la actividad enzimática actúe de forma sinérgica para la actividad
catalítica de la enzima (Shin et al., 2005; Oliveira et al., 2009; Ryu, 2014).
Los carriles 4 y 5 con actividades FPU y CMCasa respectivamente presentan fracciones
con pesos moleculares aproximadamente de 30 KDa cuyo análisis en otros estudios
podría corresponder a una isoenzima de las celebiohidrolasas llamada CBH II del
complejo celulasa (Schmoll y Kubicek 2003; Xin et al., 2010). Las bandas con pesos
moleculares aproximadamente a 75 KDa y 73 KDa podrían corresponder a las
subunidades Cel I del complejo celulasa (Karlsson et al., 2001). Puesto que estas son las
isoenzimas iniciadoras para la acción celulolitica ambas bandas no se encuentran
presentes en el carril 5 del cual solo tienen actividad CMCasa (Qi et al., 2013; Kupsky et
al., 2014).
110
7.9. PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS ENZIMAS
7.9.1. DETERMINACIÓN DEL PH Y TEMPERATURA ÓPTIMOS
Para la determinación del pH óptimo se colocó en distintas condiciones de pH a las
enzimas purificadas los mismos se expresan en la siguiente gráfico.
Gráfico 19. Determinación de la actividad enzimática vs pH (Manganeso
Peroxidasa, Lacasa y CMC)
La mayor actividad para lacasa purificada se obtuvo al pH de 2,5 con 12,0 UI/ L ±
0,32, para manganeso Peroxidasa la mayor actividad fue a pH 4,5 con 12,6 UI/L ±
0,25 y Celulasa pH 4,5 con 12,0 UI/L ± 0,45. En varios estudios se reportaron dentro
del rango de pH de 2 a 7 como aquellas lacasas de compuestos aromáticos
encontrándose la enzima purificada dentro del rango que indican los autores con
mayor actividad (Wu et al., 2010; Mishra et al., 2009; Schroeder et al., 2006). El
rango de pH óptimo reportado varia de 2 a 5 (Ruttimann-Johnson et al., 1994;
Martinez et al., 1996, Erdem et al., 2009). El rango de pH óptimo que se reportó para
la fracción activa con CMC está entre 4 a 9 (Kamagata et al., 1986, Gomes et al.,
2000; Lucas et al., 2001)
111
Gráfico 20. Determinación de la actividad enzimática vs pH (Manganeso
Peroxidasa, Lacasa y CMC)
La mayor actividad lacasa se obtuvo a la temperatura de 30 °C con 14,5 UI/L ± 0,62,
los rangos óptimos de temperatura en cepas fúngicas son de 22 a 40 °C además se
indica que el rango de mayor actividad enzimática de lacasas esta dentro de los 10
°C por encima de la temperatura de cultivo (Autore et al., 2009; Lorenzo et al.,
2005; Wong et al., 2010). Con Manganeso peroxidasa la temperatura optima
encontrada fue a 30 °C con 13,4 UI/L ± 0,38 varios estudios demostraron que la
temperatura optima esta entre 25 y 30 °C ya que la estructura cuaternaria es
fácilmente desnaturalizable por encima de 35 °C (Wariishi et al., 1992; Giardina et
al., 2000 Rodriguez et al., 2006) y celulasa a 30 °C con 13,6 UI/L ± 0,61 para el
grupo de enzimas celulasas en las que se incluyen las celebiohidrolasas con
actividad CMCasa el rango de temperatura optimo dentro de los hongos mesófilos
están entre 25 y 50 °C (Singh et al., 1990; Hou et al., 2007, Lahjouji et al., 2007) sin
112
embargo en otros microorganismos se detectaron celulasas con temperaturas optimas
hasta los 105 °C (Ruttersmith et al., 1991)
7.9.2. PROPIEDADES CINÉTICAS ENZIMÁTICAS.
7.9.2.1. DETERMINACIÓN DEL Km
Se determinaron los valores de Km y Vmax de las enzimas purificadas donde para la
lacasa aislada de la cepa GL9B se obtuvo un Km de 0,309 mM y Vmax de 192 mM
S-1
(ANEXO 47 Y 48). Los Datos reportados por lacasa de Trametes versicolor
tuvieron un Km de 0,37 mM S-1
(Pakhadnia et.al. 2009) teniendo un valor cercano al
Km de este hongo capaz de alcanzar al sustrato para llevar a la velocidad media de la
enzima y teniendo un valor superior a la lacasa de Rhus Vernificira Km de 0,13
mM S-1
(Frasconi, et al. 2010).
Los Valores de Km y Vmax para la enzima manganeso peroxidasa aislada fue Km
0,006 mM y Vmax de 1428 mM S-1
(ANEXO 49 y 50), por estudios realizados el
valor de Km para esta enzima no supera los 0,1 mM siendo para Phanerochaete
chrysosporium Km de 0,004 mM (Pease et al., 1992) o Bjerkanderia sp. Km 0,2 mM
(Wang et al., 2003)
Para la enzima celulasa con actividad CMCasa se obtuvo el Km de 0,31 mM y
Vmax de 81,97 mM S-1
(ANEXO 51 y 52). Para Trametes versicolor se reportó un
Km de 0,58 mM (Lahiouji et al., 2007), Trichoderma reseei Km 0,68 mM (Hafiz et
al., 2011)
.
113
7.9.3. PROPIEDADES CATALÍTICAS
7.9.3.1. EFECTO DE IONES METÁLICOS
Se observó el efecto de iones metálicos sobre la actividad enzimática donde se
observo que el AgNO3 reduce la actividad enzimática en un 52 % (Gráfico 21) la
acción inhibitoria del manganeso fue solo de un 14 % donde se habían reportado que
la actividad enzimática frente a iones Mn+2
reduce la actividad en más de 25 %
(Sadhasivam et al. 2008; Nagai et al. 2002) también se observó que un inhibidor
fuerte (Stajic et al. 2006) de las lacasas es el ion Fe+3
en el presente estudio se
inhibió a un 36 %. La actividad relativa observada de los demás iones fueron 93 %
Cd+2
, 84 % Ba+2
, 91% Ca+2
, 79 % Mg+2
, 94 % Na+1
, 73 % Pb+2
.
Gráfico 21. Porcentaje de actividad Lacasa frente a iones metálicos utilizados
En el caso de las enzimas Manganeso Peroxidasas se observó que los iones Ba+2
(114 %), Ca+2
(126 %), Fe+3
(135 %) Mn+2
(101 %) y Mg+2
(104 %) actúan como
activadores o estimulantes de la enzima purificada esto puede deberse a que estos
iones mantienen la estructura globular por la estabilización de los puentes disulfuro
114
dentro del sitio activo de la enzima (Martinez, 2002), sin embargo se observó que los
iones Cd+2
(81% ) Na+1
(98%), Pb+2
(88%) y Ag+1
reducen la actividad desde un 20
% hasta un 60% de la actividad enzimática por medio de la inhibición competitiva
del sitio activo de la enzima (Asgher, 2013)
Gráfico 22. Porcentaje de actividad enzimática Manganeso Peroxidasa frente a
iones metálicos
De acuerdo al presente estudio se observó que existe una estimulación en presencia
de iones Ba+2
(115 %) y Mn+2
(103 %) en otros estudios también se observo que
estos iones estimulan la actividad de celulasas (CMCasa) sin embargo no se
reportaron que otros iones afecten la actividad enzimática por encima del 20 %
(Lucas et al., 2001; Shin et al., 2010). Se obtuvo la actividad relativa con Cd+2
81%,
Ca+2
95%, Fe+3
99%, Mg+2
84%, Na+1
91% y Pb+2
95 %. Sin embargo como en las
anteriores enzimas la inhibición con el ion Ag+1
alcanzo hasta obtener una actividad
relativa de 26 %, lo que podría indicar para las tres enzimas (Lac, MnP y celulasas)
que un grupo tiol esta involucrado en el sitio activo catalítico de la enzima esto por
la inhibición de la oxidación del sulfidrilo, por otro lado como metales divalentes
115
(Mn+2
, Ba+2
, Ca+2
, etc) estimulan la actividad por la unión de grupos tioles cuando
estos se encuentran en el sitio activo y además mantienen la estructura
tridimensional de las proteínas. (Riou et al., 1998; Rutter y Daniel, 1993).
Gráfico 23. Porcentaje de actividad enzimática CMCasa frente a iones metálicos
7.9.3.2. EFECTO DE COMPUESTOS ORGÁNICOS
El efecto de compuestos orgánicos en la actividad enzimática se observaron dos efectos
en la actividad lacasa, la inhibición por SDS (0% actividad relativa) y etanol ( 0%),
disminución en la actividad por Metanol (41%), Acetona (16%) y Mercaptoetanol (12%)
y por otro lado el aumento en la actividad a 111% con Tween 40 este efecto se ha visto
por que es un surfactante y estabiliza las soluciones y estabiliza las cargas de los iones
en solución (Sonica et al., 2014; Ahmad et al., 2014)
116
Gráfico 24. Porcentaje de actividad enzimática Lacasa frente a compuestos
orgánicos y surfactantes SDS y Tween 40
Por otro lado se observó que el metanol (59 %), SDS (0 %), el mercaptoetanol (39 %),
etanol (74 %) y Acetona (84 %) disminuyeron la actividad Manganeso Peroxidasa en
cambio el tween 40 incremento la actividad a 138 % con respecto al control, Si bien no
se obtienen datos específicos del efecto de estos compuestos sobre esta enzima se puede
deducir que afectan en la estructura de la proteína y de la modificación del sitio activo.
117
Gráfico 25. Porcentaje de actividad enzimática Manganeso Peroxidasa frente a
compuestos orgánicos y surfactantes (SDS y Tween 40)
Para la celulasa con actividad CMCasa se observó que inhiben la actividad
enzimática el metanol (49 %), etanol (0%), Acetona (21%), mercaptoetanol (24%) y
SDS (0%), en cambio el Tween incremento la actividad en 20 %.
Gráfico 26. Porcentaje de actividad enzimática CMCasa frente a compuestos
orgánicos y surfactantes (SDS y Tween 40)
118
7.10. DEGRADACIÓN DE COLORANTES
7.10.1. DEGRADACIÓN DE COLORANTES EN MEDIO SÓLIDO
En medio solido se incubaron las cepas fúngicas GL9B y CO1 donde se observó
cualitativamente la degradación del azul de metileno y azul índigo en el medio de
cultivo suplementado con estos colorantes, con la formación de un halo de menor
intensidad de color alrededor de la colonia.
Figura 20. Degradación del azul índigo suplementado en medio basal y agar con la
cepa GL9B
Figura 21. Degradación del azul de metileno suplementado en medio basal y agar
con la cepa GL9B
119
En el medio suplementado con Poly R-478 la cepa GL9B presento crecimiento micelial
en el medio de cultivo pero no provocó el cambio de color del medio de cultivo, sin
embargo con la cepa CO-1 se observó el cambio de color de rosado a amarillo
Figura 22. Degradación del Poly R -478 suplementado en medio basal donde no
hubo cambio de color con la cepa GL9B
Figura 23. Degradación del Poly R-478 suplementado en medio basal y agar con la
cepa CO-1
120
Las cepa GL9B en medio de cultivo solido se observó que existe una disminución del
color formando un halo de menor intensidad en los que se suplementaron con azul de
metileno y azul índigo. Sin embargo no presento la decoloración del medio con Poly R-
478. La cepa CO-1 se observó que permite la degradación del Poly R-478, en los medios
suplementados con azul de metileno y azul índigo, se observó un desarrollo mínimo y
no se observó un cambio o degradación del color.
Figura 24. Degradación del azul índigo suplementado en medio basal donde no
hubo cambio de color con la cepa CO-1
7.10.2. DEGRADACION DE COLORANTES EN MEDIO LIQUIDO
7.10.2.1. DEGRADACION CON LAS CEPAS FÚNGICAS
7.10.2.1.1. DEGRADACION DEL AZUL ÍNDIGO
La mayor absorción del azul índigo utilizado en el experimento se obtuvo a la máxima
absorción a 621 nm el mismo se obtuvo la curva de calibración (ANEXO 53). Para el
tratamiento del colorante suplementado al medio de cultivo donde se incubo junto a la
121
cepa fúngica se observa en el gráfico 27, donde el hongo degrada el colorante a un 59,3
% a los 7 días de incubación cabe señalar que para este ensayo se suplementó con ABTS
0,2 mM, en cambio con las cepa GL9B (84% y 8 días de incubación) y CO-1 (82% a los
10 días) (ANEXO 54).
Gráfico 27. Degradación del Azul Índigo suplementado al medio de cultivo liquido con
las 2 cepas (GL9B y CO-1)
7.10.2.1.2. DEGRADACIÓN DEL AZUL DE METILENO
La máxima absorción del azul de metileno usado en el trabajo se obtuvo 658 nm de
absorbancia al mismo se realizó la curva de calibración (ANEXO 55). La mayor cepa
degradadora fue GL9B hasta 53% de color relativo a los 12 dias de incubación (ANEXO
56), sin embargo también suplementado con ABTS como mediador del potencial redox.
Con la cepa GL9B sin ABTS se logró un color relativo de 81 % a los 12 días de
incubación y con la cepa CO-1 se observó hasta un 78 % de color relativo.
122
Gráfico 28. Degradación del Azul de metileno suplementado al medio de cultivo liquido
con las 2 cepas (GL9B y CO-1)
7.10.2.1.3. DEGRADACIÓN DE POLY R-478
Experimentalmente se determinó que la longitud de onda de maxima absorción donde se
encontró para Poly R-478; 524 nm, utilizando esta absorbancia para realizar la curva de
calibración (ANEXO 57). El color relativo observado con las cepas fúngicas donde la
cepa CO-1 obtuvo una degradación de 62% hasta los 12 dias de incubación sin embargo
la cepa GL9B con ABTS solo se obtuvo una degradación de 17 % hasta los 12 días y
solo la cepa GL9B 4 % de degradación (ANEXO 58).
123
Gráfico 29. Degradación del Poly R-478 suplementado al medio de cultivo liquido con
las 2 cepas (GL9B y CO-1)
7.10.2.2. DEGRADACIÓN DE COLORANTES CON ENZIMAS
7.10.2.2.1. DEGRADACIÓN DEL AZUL ÍNDIGO
Para este ensayo se utilizaron los extractos enzimáticos producto del cultivo de las cepas
fúngicas y las enzimas purificadas donde para Manganeso Peroxidasas se obtuvo una
decoloración de 2 % hasta las 72 horas de incubación. Como se observó que para los
ensayos es necesario el mediador ABTS se conjugó con la lacasa purificada sin embargo
se obtuvo una degradación de 4 %. Con el extracto de la cepa Fúngica sin purificar se
obtuvo una degradación 13 % a las 72 horas de incubación. Con el extracto sin purificar
de la Cepa GL9B se obtuvo una degradación de 36 % suplementado con ABTS 0,2
mM. Se puede observar que los extractos de las cepas producen una mayor acción
decolorante, esto posiblemente se vea influenciado por la bioadsorción de color por
parte del hongo durante la incubación del cultivo. Sin embargo también se observa una
gran diferencia entre las enzimas purificadas y las que no están purificadas (extractos de
124
cultivo). Este efecto puede estar dado por que en el extracto se encuentren otros factores
que permitan la degradación, como ser intermediarios que actúan como mediadores y el
potencial oxidorreducción (Kandelbauer, 2004)
Gráfico 30. Degradación del azul Índigo con los extractos de los cultivos de las cepas
GL9B, CO-1 y las enzimas purificadas Lac y MnP
7.10.2.2.2. DEGRADACIÓN DEL AZUL DE METILENO
El tratamiento enzimático del azul de metileno el extracto de la cepa GL9B y ABTS
tuvo una degradación hasta 68% de color relativo hasta las 72 horas de incubación, en
cambio con Lacasa purificada más ABTS alcanzo a 82%, extracto de la cepa CO-1 81%
y enzima purificada Manganeso peroxidasa 98 % al cabo de las 72 horas de incubación
en todos los casos
125
Gráfico 31. Degradación del azul de metileno con los extractos de los cultivos de las
cepas GL9B, CO-1 y las enzimas purificadas Lac y MnP
7.10.2.2.3. DEGRADACION DE POLY R-478
El tratamiento del Poly R-478 se obtuvo una mayor degradación con el extracto del
cultivo de la Cepa CO-1 con 88 % a las 64 horas de incubación. Con la enzima pura
de Manganeso peroxidasa se obtuvo 96 % de color a las 64 horas de incubación, con
Lacasa purificada y ABTS, se obtuvo 97 % de color a las 38 horas de incubación y
el extracto del cultivo con la cepa GL9B y ABTS un 95 % de color a las 72 horas de
incubación (Gráfico 32).
126
Gráfico 32. Degradación del azul Índigo con los extractos de los cultivos de las cepas
GL9B, CO-1 y las enzimas purificadas Lac y MnP
La mayor degradación de los colorantes se observó, que en el medio con azul indigo
y la cepa GL9B degradó el color a 40,7 % (59.3 % color relativo) y con el extracto
del cultivo a un 36 % (64 % color relativo), para el azul de metileno se obtuvo una
degradación del 47 % (53 % color relativo) con el cultivo con la cepa GL9B y solo
con el extracto del medio de cultivo un 32 % (68 % color relativo), en ambos casos
se utilizó el ABTS como mediador. En la degradación del Poly R-478 con la cepa
CO-1 se logró degradar 62 % (38 % color relativo) en cambio con el extracto del
cultivo un 22 % (88 % de color relativo), la diferencia que existe en los porcentajes
de degradación se pueden deber al fenómeno de Bioadsorción del hongo en el medio
de cultivo durante el crecimiento de las cepas, la cepa fúngica durante el crecimiento
micelial queda impregnado con el colorante por tal motivo disminuye la
concentración del mismo en el medio (Russo et al., 2010); por otro lado para el caso
del colorante Poly R-478 se observó el cambio de color drástico en el medio y no se
observa la adsorción del colorante lo que se puede inferir que durante el crecimiento
fúngico además se liberan otro tipo de enzimas que promueven la disminución del
potencial redox del colorante para que las enzimas manganeso peroxidasas puedan
127
actuar cuando estas se liberan al medio extracelular como las VP y Dyps. (Prachi et
al., 2009; Asha et al., 2010).
7.10.3. APLICACIÓN DE DEGRADACION DE COLORANTES EN MATERIAL
TEXTIL
El valor de luminiscencia que se midió con el espectrofotómetro Konica Minolta CM-
2600 (ANEXO 59) de superficie (L) es la característica de una disminución del color y
el aumento del blanco en la superficie (Arja, 2004). Los valores recogidos se observan
en el gráfico donde la mayor luminiscencia con el mix (extracto de los cultivos de
GL9B, CO-1 e IB105) que contenían una actividad de 15 UI/L hasta un 60% de
Luminiscencia a las 72 horas de incubación (ANEXO 60), en el textil se observó con el
extracto del cultivo de la cepa GL9B y ABTS hasta un 32,5 %, el valor subsecuente fue
con el extracto de la cepa IB-105 que alcanzó un valor de 20,8 %, El extracto del
cultivo de CO-1 con 9,2 % y solo 5 % con la celulasa purificada (Gráfico 33).
Gráfico 33. Determinación de la luminiscencia en el material textil medidos en el
espectrofotómetro de superficie
128
La degradación del color presente en la materia textil depende del colorante utilizado
en el paso de impregnación y del tipo (% algodón) de materia prima utilizada. En los
estudios preliminares se vio que existe una buena decoloración del azul índigo por
tanto se utilizó materia textil impregnado con ese tipo de colorante y utilizando un
mix de las enzimas tanto lacasas, manganeso peroxidasas y celulasas alcanzó un
valor de L de 60,34 *a -10,4 *b -2,34 en estudios similares se alcanzó a L= 29,99 *a
= -2,25 *b= -9,36 a las 72 h de incubación (Torrez, 2010) solo con la enzima del
extracto de IB-105 L 4.2 *b3,05 con celulasas de Trichoderma reseei a incubación
de 2 horas (Arja, 2004). Esta reducción de color está dada por el ataque la unión de
la impregnación del material textil que ataca al colorante, por eso se evidencia un
desgaste en la materia textil (biostoning) cuando se trata con celulasas. En el estudio
según Solis-Oba (2008) realizaron el estudio de la lacasa comercial en el que
probaron la actividad frente al denim donde el valor de L el mismo llegó
aproximadamente a 40 incluyendo ABTS como mediador. Existen pocos estudios de
las lacasas como adyuvante en el bio-blanqueamiento directo sobre el denim, sin
embargo viene a ser una gran alternativa en los bio-productos resultantes en los que
no se producen compuestos halogenados (como resulta del proceso fisicoquímico de
tratamiento de estas aguas residuales), de este proceso en la industria textil y el
tratamiento de aguas residuales debido a que ya son fácilmente biodegradables por
sistemas aeróbicos o anaeróbicos (Montazer y Maryan, 2008)
En algunos procesos se trataron de incluir una mezcla de enzimas Lacasas y
Celulasas para el tratamiento enzimático en detergentes pero se observó que hay
mucha incompatibilidad con la mezcla enzimática (Rodriguez Couto, 2012), pero en
el presente trabajo que la mezcla de las actividades enzimáticas tanto de lacasas,
manganeso peroxidasas y celulasas presentes en los extractos de los cultivos de las 3
cepas producen una acción sinérgica aumentando el grado de luminiscencia y el
aumento en la decoloración directamente sobre el textil.
129
VIII. CONCLUSIONES
Hongos degradadores de lignina
En el presente trabajo se logró aislar 33 cepas fúngicas por método indirecto
de 58 muestras ambientales y 105 cepas fúngicas por el método directo de las
mismas muestras.
Cualitativamente 28 cepas fúngicas mostraron actividad lacasa de las 138
cepas aisladas y solo una con actividad manganeso peroxidasa.
Selección de cepas fúngicas
Por criterios cualitativos de oxidación del ABTS y Poly R-478, Intensidad de
Oxidación y Tiempo de oxidación se seleccionaron 6 cepas fúngicas (GL9B,
GP25, GL12B, GL7, GM y CO-1).
La única cepa que cualitativamente dio positiva para el ensayo de celulasas
fue la cepa IB-105 previamente aislada y conocida como hongo degradador
de celulasa
Determinación cuantitativa de enzimas ligninolíticas
Después del tamizaje de las seis cepas fúngicas y utilizando los parámetros
de cultivo en agitación, estático, suplementación de glucosa o sin adición del
mismo, se obtuvo que la cepa con mayor actividad Lacasa fue la GL9B con
12,05 ± 1,46 UI/L a los 6 dias de incubación en el medio Basal suplementado
con Glucosa y en agitacion.
La mayor actividad Manganeso Peroxidasa fue la cepa CO-1 con 1,11 ± 0,06
UI/L a los 9 días de incubación en medio basal en agitación y suplementado
con glucosa. De tal manera que se seleccionaron las cepas GL9B y CO-1 por
130
producir mayor cantidad de enzimas lacasa y manganeso peroxidasas
respectivamente.
Identificación morfológica macroscópica y microscópica
La cepa GL9B se clasificó como Ascomiceto por ser asporogeno filamentoso
con micelios e hifas blanquecinas de espesor regular con bordes regulares en
crecimiento radial de tipo anamórfico. Microscópicamente esta cepa
presenta hifas con septos de tipo plecténquima pseudo tabicados anamórfico
asporageno, a su vez también se observan ascomas unitunicados sin la
formación evidente de un ostiolo se presume que su reproducción es
asexuada representada por pelos conidioforos conidios multiseptados con
células centrales pequeñas oscuras y extremidades hialinas con pequeñas
setulas, son ramificados con estroma eustromatico.
La cepa CO-1 se clasificó como Basidiomiceto por ser hongo asporogeno
filamentoso con micelios e hifas blanquecinas de espesor regular con bordes
regulares en crecimiento radial de tipo rizomórfico. Microscópicamente esta
cepa presenta hifas dicarioticas septadas con la formación de un metabasidio,
se observa basidiosporas con nucleos oscuros y pequeños con extremos
largos hialinos traslucidos con escasas royas y carbones longitudinales, y
algunas hifas receptivas.
La Cepa IB-105 se clasificó en el género Aspergillus por presentar
macroscópicamente una textura granular con coloración marrón con la
presencia de esporas visibles, con espesor delgado, la colonia presenta
bordes irregulares. Microscópicamente se observa hifas con cabezas
conidiales en forma perpendicular al micelio la que presenta ligera
pigmentación marrón, con escasas equinulaciones. La presencia de una
131
vesicula distal en forma elíptica ligeramente pigmentada. Fialides
secundarias con fialosporas pigmentadas. En forma de saco elíptico que
contiene esporas.
Identificación molecular
La cepa GL9B con los marcadores D1 y D2 (94 %) presento una máximo de
identidad a Pestalotiopsis sp. Con los marcadores ITS (93%) se obtuvo un
máximo de identidad para Pestalotipsis microspora
La cepa CO-1 con los marcadores D1 y D2 (94 %) presento con un máximo
de identidad a Phanaerochaete sp. Sin embargo con los marcadores ITS (89
%) solo se observó que el máximo de identidad fue para Phanaerochaete sp.
La cepa IB-105 con los marcadores D1 y D2 (98 %) presento un máximo de
identidad para Aspergillus sp. Y con los marcadores ITS (88 %) se obtuvo
un máximo de identidad para Aspergillus terreus
Efecto de la temperatura en el crecimiento fúngico
La cepa IB-105 tiene a 25°C una velocidad de crecimiento (µ) de 0,0965.
La cepa GL9B tiene a 30°C una velocidad de crecimiento (µ) de 0,767.
La cepa CO-1 tiene a 25°C una velocidad de crecimiento (µ) de 0,093.
Selección del medio basal
La actividad lacasa con la cepa GL9B después del ensayo con diferentes
medios se incrementó a los 9 días con una actividad de 249,65 ± 18,66 UI/L
con el Medio B que contenía como fuente de nitrógeno NH4NO3, de una
concentración de 121,59 ± 18,66 UI/L con el medio basal.
132
La mayor actividad manganeso peroxidasa con la cepa CO-1 fue de 3,53 ±
0,41 UI/L a los 9 días de incubación con el medio C que contenía como
fuente de nitrógeno Tartrato de amonio en comparación con el medio basal.
Optimización del medio de cultivo
La optimización del medio para la producción de lacasas con la cepa GL9B
se obtuvo mayor actividad con la combinación de la concentración de
NH4NO3 10 mg/L, Glucosa 1 g/L y 20 mg de MnSO4 por presentar una
actividad Lacasa de 349,89 ± 0,89 UI/L, partiendo del medio B que presentó
una actividad de 249,65.
La optimización del medio de cultivo para la producción de Manganeso
peroxidasas se obtuvo mayor actividad en la combinación de glucosa 0,02
g/L, tartrato de amonio 0,25 g y Sulfato de manganeso 0,01 g que presento
una actividad de 38,94 ± 1 UI/L sin embargo en el medio C se obtuvo una
actividad manganeso peroxidasa de 3,53 UI/L
Extracción y concentración de enzimas
El mejor rendimiento para la concentración de enzimas Lacasa, Manganeso
peroxidasa y celulasas fue la concentración con PEG obteniendo actividad
especifica (lacasa) 13111,25 UI/mg y un factor de purificación de 30,76;
(manganeso peroxidasa) 1558,46 UI/mg y factor de purificación 27,82;
(celulasas) 935,71 U/mg y su factor de purificación de 25,48
133
Cromatografía de intercambio iónico
El pH óptimo para la separación de lacasas por FPLC es pH 4,5 y se obtuvo
dos fracciones 11 (1,8 UI/L) y 12 (5,8 UI/L)
El pH óptimo para la separación de manganeso peroxidasas es a pH 5 y se
obtuvo actividad en la fracción 11 con 5,3 UI/L
El pH óptimo para la purificación de celulasas es a pH 5,5 se obtuvieron las
fracciones la fracción 53 y 57 con actividad FPU de 1,2 UI/L, 1,5 UI/L,
CMCasa 2,1 UI/L y 3,8 UI/L y las fracciones 63 y 64 con actividad CMCasa
de 0,34 UI/L y 0,21 UI/L
SDS-PAGE
Para la enzima lacasa se obtuvo un peso molecular de 75 KDa
Para la enzima Manganeso peroxidasa se obtuvo dos bandas una con pesos
moleculares aproximados de 50 KDa y 70 KDa.
Para la enzima celulasas se obtuvo cuatro bandas con pesos moleculares
aproximados de 75 KDa, 73 KDa, 35 KDa y 30 KDa.
Determinación del pH y Temperatura óptimos
La mayor actividad para lacasa purificada se obtuvo al pH de 2,5 con 12,0
UI/ L ± 0,32; para manganeso Peroxidasa la mayor actividad fue a pH 4,5
con 12,6 UI/L ± 0,25 y Celulasa pH 4,5 con 12,0 UI/L ± 0,45.
La mayor actividad lacasa se obtuvo a la temperatura de 30 °C con 14,5 UI/L
± 0,62. Con Manganeso peroxidasa la temperatura optima encontrada fue a
30 °C con 13,4 UI/L ± 0,38. Con celulasa a 30 °C con 13,6 UI/L ± 0,61.
134
Propiedades cinéticas enzimáticas
Con la lacasa aislada de la cepa GL9B se obtuvo un Km de 0,309 mM y
Vmax de 192 mM S-1
Con la enzima manganeso peroxidasa aislada de la cepa CO-1, fue Km 0,006
mM y Vmax de 1428 mM S-1
Con la enzima celulasa con actividad CMCasa se obtuvo el Km de 0,31 mM
y Vmax de 81,97 mM S-1
Propiedades catalíticas por el efecto de iones metálicos
El efecto de iones metálicos sobre la actividad lacasa disminuyo con AgNO3
en un 52%, Fe+3
36 %. La actividad relativa observada de los demás iones
fueron 93 % Cd+2
, 84 % Ba+2
, 91% Ca+2
, 79 % Mg+2
, 94 % Na+1
, 73 % Pb+2.
El efecto de compuestos orgánicos en la actividad lacasa se observó dos
efectos inhibición por SDS 0% y etanol 0%, disminución en la actividad por
Metanol (41%), Acetona (16%) y Mercaptoetanol (12%) y por otro lado el
aumento en la actividad a 111% con Tween 40,
En el caso de las enzimas Manganeso Peroxidasas se observó que los iones
Ba+2 (114 %), Ca+2
(126 %), Fe+3
(135 %) Mn+2
(101 %) y Mg+2
(104 %)
actúan como activadores o estimulantes de la enzima purificada y como
inhibidores o que reducen la actividad los iones Cd+2
(81%) Na+1
(98%), Pb+2
(88%) y Ag+1
reducen la actividad desde un 20 % hasta un 60%.
Con los compuestos orgánicos sobre la actividad Manganeso Peroxidasas se
observó que el metanol (59 %), SDS (0 %), el mercaptoetanol (39 %), etanol
135
(74 %) y Acetona (84 %) disminuyeron la actividad, en cambio el tween 40
(138 %).
En la celulasa aislada los iones Ba+2
(115 %) y Mn+2
(103 %) estimulan la
actividad CMCasa y con los iones una leve inhibición Cd+2
81%, Ca+2
95%,
Fe+3
99%, Mg+2
84%, Na+1
91% y Pb+2
95 %. Ag+1
26 %.
Para la celulasa aislada con actividad CMCasa se observó que inhiben la
actividad enzimática el metanol (49 %), etanol (0%), acetona (21%),
mercaptoetanol (24%) y SDS (0%), y un aumento en la actividad de 120%
con Tween 40,
Degradación de colorantes en medio solido
La cepa GL9B, se observó la degradación del azul de metileno, azul indigo y
Poly R-478 solamente degradado con la cepa CO-1
Degradación de colorantes con las cepas fúngicas
La degradación del colorante azul indigo se llevó a cabo a los 7 días de
incubación hasta un 59,3 % suplementado con ABTS con la cepa GL9B.
La degradación del colorante azul de metileno se obtuvo un color relativo de 53
% con la cepa GL9B suplementado con ABTS a los 12 días de incubación.
La degradación del Poly R-478 con la cepa CO-1 se degrado hasta un 38 % de
color relativo.
136
Degradación de colorantes con enzimas
Con el extracto sin purificar de la Cepa GL9B se obtuvo una degradación de 36
% suplementado con ABTS 0,2 mM con el azul indigo a las 72 horas de
incubación
Con el extracto de la cepa GL9B y ABTS tuvo una degradación hasta 68% de
color relativo hasta las 72 horas de incubación.
Con el extracto de la cepa CO-1 para el Poly R-478 se obtuvo una mayor
degradación con el extracto del cultivo de la con 88 % de color relativo a las 64
horas de incubación.
Aplicación de la degradación del colorante en el material textil
La mayor luminiscencia del textil fue con el mix (extracto de los cultivos de
GL9B, CO-1 e IB105) que contenían una actividad de 15 UI/L hasta un 60% de
Luminiscencia a las 72 horas de incubación, con el extracto del cultivo de la
cepa GL9B y ABTS hasta un 32,5 %, el valor subsecuente fue con el extracto de
la cepa IB-105 que alcanzó un valor de 20,8 %; el extracto del cultivo de CO-1
con 9,2 % y solo 5 % con la celulasa purificada
137
IX BIBLIOGRAFÍA
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ANEXO 1 AGAR PATATA DEXTROSA (PDA)
Papa 250 g/L
Glucosa 10 g/L
Agar-agar 15 g/L
Agua Destilada c.s.p. 1000ml
ANEXO 2. AGAR EXTRACTO DE MALTA 3%
Extracto de Malta en Polvo 30 g/L
Agar – Agar 15 g/L
Agua destilada c.s.p. 1000 ml
ANEXO 3. PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN
1 Tubo Eppendorf100 mg Masa fungica o 500 µL de
108 esporas/mL1 ml de Solucion Fisiologica
esteril
Centrifugar a 13000 g / 3 min
Precipitado Descartar Sobrenadante
300 µL EDTA 50 mM + 400 µL Tris-HCl 100 mM + SDS 1.25 % por 1 hora a 65 °C en
agitacion
Transferir Sobrenadante en otro tubo
Adicionar 400 uL de solucion “Nuclei Lysis” Incubar a 37 °C 30 minutos
Adicionar 400 uL Acetato de Potasio 5 M e incubar en hielo por 30 min en agitacion
Centrifugar 13000 g / 3 minutos
Adicionar 200 µL de “Protein Precipitation Solution”
Centrifugar 13000 g / 3 minutos
Transferir sobrenadante en tubo nuevo con 600 uL de Isopropanol
Decantar sobrenadante y adicionar etanol 70 %Centrifugar 13000 g / 2
minutos
Centrifugar 13000 g / 2 minutos
Aspirar el etanol y secar el pellet y adicionar “DNA rehydration Solution” 100 µL
Dejar reposar a 4 °C toda la noche
ANEXO 4. PROTOCOLO DE PURIFICACIÓN DE LOS AMPLICONES
AMPLICON(Producto del PCR)
10 µL del amplificado
1.5 µL Acetato de Sodio
30 µL Etanol Absoluto
Mezclar e incubar -20 °C por 1 hora
Centrifugar a 13000 rpm por 20 min
Precipitado
Descartar sobrenadante
Adicionar 50 µL de etanol 70 %
Secar a 55 °C 15 minAdicionar 10 µL de Agua Mili Q (agua
ultra pura)
Calentar a 55 °C por 15 minutos
Conservar a -20 °C
ANEXO 5. PROTOCOLO DE REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN
Amplicon Purificado
Adicionar 90 µL de Isopropanol
Reaccion de Secuenciacion
Remover el sobrenadante con una pipeta
Centrifugar a 6500 rpm por 20 min
Adicionar 200 µL de etanol 70 %
Secar a 90 °C / 1 min.
Adicionar 10 µL de Formamida
3 min / 95 °C
3 min / -20 °C
Electroforesis en AB1 Prism 3031
ANEXO 6. ANALIZADOR GENÉTICO AB3130 (APPLIED BIOSYSTEM).
ANEXO 7. CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA PARA AZUCARES
REDUCTORES
ANEXO 8. CURVA DE CALIBRACIÓN DE BSA PARA PROTEÍNAS TOTALES
ANEXO 9. PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE BRADFORD
Composición del reactivo de Bradford
Azul de Coomasie
G-250 5 mg
Etanol 2,5 ml
Acido Fosfórico 5 ml
Agua destilada
c.s.p. 50
ml
Se conserva a temperatura ambiente hasta el momento del experimento se realiza
una dilución 1:4 con agua destilada
ANEXO 10. DISEÑO EXPERIMENTAL PARA LA CEPA GL9B.
ExperimentosGlucosa
[g/L]
NH4NO3
[mg/L]
MnSO4
[mg/L]
1 0.01 5 20
2 0.01 5 40
3 0.01 5 60
4 0.01 10 20
5 0.01 10 40
6 0.01 10 60
7 0.01 20 20
8 0.01 20 40
9 0.01 20 60
10 0.1 5 20
11 0.1 5 40
12 0.1 5 60
13 0.1 10 20
14 0.1 10 40
15 0.1 10 60
16 0.1 20 20
17 0.1 20 40
18 0.1 20 60
19 1 5 20
20 1 5 40
21 1 5 60
22 1 10 20
23 1 10 40
24 1 10 60
25 1 20 20
26 1 20 40
27 1 20 60
ANEXO 11. DISEÑO EXPERIMENTAL PARA LA CEPA CO-1
Experimentos
Glucosa
[g/L]
Tartrato
de Amonio
[mg/L]
MnSO4
[mg/L]
1 0.002 0.25 0.001
2 0.002 0.25 0.01
3 0.002 0.25 0.1
4 0.002 0.5 0.001
5 0.002 0.5 0.01
6 0.002 0.5 0.1
7 0.002 1 0.001
8 0.002 1 0.01
9 0.002 1 0.1
10 0.02 0.25 0.001
11 0.02 0.25 0.01
12 0.02 0.25 0.1
13 0.02 0.5 0.001
14 0.02 0.5 0.01
15 0.02 0.5 0.1
16 0.02 1 0.001
17 0.02 1 0.01
18 0.02 1 0.1
19 0.2 0.25 0.001
20 0.2 0.25 0.01
21 0.2 0.25 0.1
22 0.2 0.5 0.001
23 0.2 0.5 0.01
24 0.2 0.5 0.1
25 0.2 1 0.001
26 0.2 1 0.01
27 0.2 1 0.1
ANEXO 12. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL AZUL ÍNDIGO
ANEXO 13. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL AZUL DE METILENO
ANEXO 14. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL POLY R-478
ANEXO 15. CULTIVO DE LA CEPA IB-105 EN AGAR PDA
ANEXO 16. CULTIVO DE LA CEPA IB-105 EN MEDIO LÍQUIDO
ANEXO 17. CULTIVO DE MUESTRAS EN CAJAS PETRI
ANEXO 18. CEPAS FÚNGICAS AISLADAS EN MEDIO PDA
ANEXO 19. SCREENING CUALITATIVO PARA LACASAS
ANEXO 20. SCREENING CUALITATIVO PARA MANGANESO PEROXIDASAS
ANEXO 21. SCREENING CUALITATIVO DE CELULASAS POSITIVO PARA
CEPA IB 105
ANEXO 22. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA D1/D2 DE LA
CEPA GL9B
ANEXO 23. ALINEAMIENTO DE SECUENCIA D1/D2 CEPA GL9B
ANEXO 24. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA D1/D2 DE LA CEPA
CO-1
ANEXO 25. ALINEAMIENTO DE SECUENCIA D1/D2 CEPA CO-1
ANEXO 26. ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA D1/D2 DE LA CEPA
IB-105
ANEXO 27. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA ITS DE LA CEPA
GL9B
ANEXO 28. ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA ITS AMPLIFICADA DE
LA CEPA GL9B
ANEXO 29. ELECTROFEROGRAMA DE LA SECUENCIA ITS DE LA CEPA
CO-1
ANEXO 30. ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA ITS DE LA CEPA CO-1
ANEXO 31. ELECTROFEROGRAMA DE LAS SECUENCIA ITS DE LA CEPA
IB-105
ANEXO 32. ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA ITS DE IB-105
ANEXO 33. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA POR ASIMILACIÓN DE
AZUCARES
ANEXO 34. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 10 °C
EN MEDIO SOLIDO
ANEXO 35. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 25 °C
EN MEDIO SOLIDO
ANEXO 36. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 30 °C
EN MEDIO SOLIDO
ANEXO 37. CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LAS CEPAS FÚNGICAS A 40 °C
EN MEDIO SOLIDO
ANEXO 38. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD LACASA EN EJE
Y, CONCENTRACIÓN DE NH4NO3 EN EJE X Y LA CONCENTRACIÓN DE
GLUCOSA EN EJE Z
ANEXO 39. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD LACASA EN EJE
Y, CONCENTRACIÓN DE MNSO4 EN EJE X Y LA CONCENTRACIÓN DE
NH4NO3 EN EJE Z
ANEXO 40. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD LACASA EN EJE
Y, CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN EJE X Y LA CONCENTRACIÓN DE
MnSO4 EN EJE Z
ANEXO 41. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD MANGANESO
PEROXIDASA EJE Y, CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN EJE X Y LA
CONCENTRACIÓN DE TARTRATO DE AMONIO EN EJE Z
ANEXO 42. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD
MANGANESO PEROXIDASA EN EJE Y, CONCENTRACIÓN DE MnSO4 EN
EJE X Y LA CONCENTRACIÓN DE TARTRATO DE AMONIO EN EJE Z
ANEXO 43. RESPUESTA DE SUPERFICIE DE LA ACTIVIDAD
MANGANESO PEROXIDASA EN EJE Y, CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA
EN EJE X Y LA CONCENTRACIÓN DE MnSO4 EN EJE Z
ANEXO 44. CONCENTRACIÓN CON PEG EN BOLSAS DE DIÁLISIS
ANEXO 45. PROTEINA LIOFILIZADA DE LACASA Y MANGANESO
PEROXIDASA Y CELULASAS
ANEXO 46. SISTEMA DE FPLC BIORAD BIOLOGIC DUOFLOW CON
SOPORTE DEL SISTEMA MAXIMIZER
ANEXO 47. GRÁFICO DE LA CURVA DE MICHAELIS MENTEN PARA LA
LACASA AISLADA
M ic h a e lis -M e n te n
[S u b s tra te ] u M
0 2 0 0 4 0 0 6 0 0
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
ANEXO 48. GRÁFICO DE LINEWEAVER BURKE Y SU ECUACIÓN DE LA
LACASA AISLADA
ANEXO 49. GRÁFICO DE LA CURVA DE MICHAELIS MENTEN PARA LA
MANGANESO PEROXIDASA AISLADA
M ic h a e lis -M e n te n
[S u b s tra te ] m M
0 .0 0 .5 1 .0 1 .5
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
ANEXO 50. GRÁFICO DE LINEWEAVER BURKE Y SU ECUACIÓN DE LA
MANGANESO PEROXIDASA AISLADA
ANEXO 51. GRÁFICO DE LA CURVA DE MICHAELIS MENTEN PARA LA
CELULASA CON ACTIVIDAD CMCasa AISLADA
M ic h a e lis -M e n te n
[S u b s tra te ] m M
0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5
0
2 0
4 0
6 0
8 0
ANEXO 52. GRAFICO DE LINEWEAVER BURKE Y SU ECUACIÓN DE LA
CELULASA CON ACTIVIDAD CMCasa AISLADA
ANEXO 53. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL AZUL INDIGO
ANEXO 54. CULTIVO DE A CEPA GL9B SUPLEMENTADO CON AZUL
INDIGO
ANEXO 55. CURVA DE CALIBRACIÓN DEL AZUL DE METILENO
ANEXO 56. CULTIVO DE LA CEPA GL9B EN MEDIO SUPLEMENTADO CON
AZUL DE METILENO
ANEXO 57. CURVA DE CALIBRACIÓN DE POLY R-478
ANEXO 58. CULTIVO DE LA CEPA CO-1 EN MEDIO DE CULTIVO
SUPLEMENTADO CON POLY R-478
ANEXO 59. ESPECTROFOTÓMETRO DE SUPERFICIE KONICA MINOLTA
CM-2600
ANEXO 60. MEDICIÓN ESPECTRAL DEL MIX DE EXTRACTOS DE LOS
CULTIVOS A LAS 72 HORAS
ANEXO 61. TRATAMIENTO DEL MATERIAL TEXTIL
TIEMPO (HORAS)EXTRACTO DE GL9B
+ ABTSEXTRACTO DE CO-1
EXTRACTO DE IB-
105CELULASA MIX
0
12
24
36
48
60
72