Procedimientos Generales de Laboratorio, Uso de Equipo, y Consideraciones de Seguridad 

Arturo Duarte Ortuño

I. Procedimientos de Seguridad

 A. Químicos

Un número no definido de químicos usados en cualquier laboratorio de biología molecular son peligrosos. Todos los fabricantes de materiales peligrosos son requeridos por ley de surtir al usuario con información pertinente de cualquier peligro asociado con sus químicos. Ésta información es surtida en forma de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales o MSDS. Ésta información contiene el nombre químico, CAS#, datos de peligro a la salud, incluyendo tratamientos de primeros auxilios, datos físicos, datos de fuego y peligro de explosión, datos de reactividad, procedimientos para derrame o fuga, y cualquier precaución especial necesaria cuando se manipule este químico. Un archivo conteniendo información de MSDS de las sustancias peligrosos debe mantenerse en el laboratorio. Además, la información de MSDS puede ser consultada en el internet. Es extremadamente necesario de hacer uso de esta información previamente al uso de un nuevo químico y sin duda en el caso de cualquier exposición accidental o derrame. El instructor/encargado de laboratorio debe ser notificado inmediatamente en el caso de un accidente que envuelva cualquier reactivo potencialmente peligroso.

Los siguientes productos químicos son particularmente notables:

• Fenol - puede causar quemaduras graves• La acrilamida - neurotoxina potencial• El bromuro de etidio – Cancerígeno

Estas sustancias no son dañinas si se utilizan adecuadamente: use siempre guantes cuando se utilizan productos químicos potencialmente peligrosos y nunca pipeteé con la boca alguno de ellos. Si accidentalmente derrama cualquiera de estos productos químicos en la piel, inmediatamente enjuague el área completamente con agua e informe al instructor. Desechar los residuos en contenedores adecuados.

B. Luz Ultravioleta

La exposición a la luz ultravioleta puede causar irritación ocular aguda. Dado que la retina no puede detectar la luz ultravioleta, puede tener lesiones oculares graves y no se dan cuenta hasta 30 minutos a 24 horas después de la exposición. Por lo tanto, use siempre protección ocular adecuada cuando se utilizan lámparas de rayos ultravioleta.

C. Electricidad

Las tensiones para la electroforesis son suficientes para causar electrocución. Cubrir los embalses de amortiguación durante la electroforesis. Siempre apague la fuente de alimentación y desenchufe los cables antes de quitar un gel.

D. Limpieza general

Todas las áreas comunes deben estar libres de desorden y de utensilios sucios, equipo de electroforesis, etc. deben ser tratados adecuadamente. Dado que usted tiene sólo una cantidad limitada de espacio para llamarla propia, es a su ventaja de mantener su propia área limpia. Dado que va a utilizar las instalaciones comunes, todas las soluciones y todo lo almacenado en una incubadora, nevera, etc deben estar etiquetados. A fin de limitar la confusión, cada persona debe utilizar sus iniciales o de la denominación única para el etiquetado de otros platos, etc material sin etiqueta en los refrigeradores, incubadoras, o congeladores que pueden ser destruidos. Siempre se marca la parte posterior de las placas con sus iniciales, la fecha y los datos experimentales relevantes, por ejemplo, los números de cepa.

II. Preparación de Soluciones

A. Cálculo de Molar, % y Soluciones "X".

 1. Una solución molar es una en la cual 1 litro de solución contiene el número de gramos igual a su peso molecular. Ej. Para preparar 100 ml de una solución 5M NaCl = 58.456 (peso molecular del NaCl) g/mol x 5 moles/litro x 0.1 litros = 29.29 g en 100 ml de solución.

2. Soluciones %. Porcentaje (peso/volumen) = peso (g) en 100 ml de solución; Porcentaje (volumen/volumen) = volumen (ml) en 100 ml de solución. Ej. Para preparar una solución 0.7% de agarosa en buffer TBE, pesar 0.7 de agarosa y llevarla a un volumen de 100 ml con el buffer TBE.

3. Soluciones "X". Muchos buffers de enzimas son preparados como soluciones concentradas, por ejemplo 5X o 10X (cinco o diez veces la concentración de la solución a emplear) y son entonces diluidas de tal manera que la concentración final del buffer en la reacción es 1X. Ej. Para configurar una digestión restrictiva en 25 μ l, uno debería añadir 2.5 μ l de un buffer 10X, los componentes de la reacción, y agua para un volumen final de 25 μ l.

B. Preparación de Soluciones de Trabajo de Soluciones Concentradas Existentes .

Muchos buffers en biología molecular requieren los mismos componentes pero con frecuencia varían en las concentraciones. Para evitar la necesidad de preparar cada buffer desde cero, es útil preparar varias soluciones concentradas base y diluirlas como sea necesario. Ej. Para preparar 100 ml de buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), combine 1 ml de una solución 1 M de Tris y 0.2 ml de EDTA 0.5 M y 98.8 ml de agua estéril. Lo siguiente es útil para calcular cantidades de solución existente necesarias: C i x V i = C f x V f , donde C i = concetración inicial, o concentración de la solución existente; V i = volumen inicial, o cantidad de solución existente necesaria; C f = concentración final, o concentración de la solución deseada; V f = volumen final, o volumen de la solución deseada.

C. Pasos para la Preparación de Soluciones:

1. Apoyarse en manual de laboratorio de referencia por cualquier instrucción específica en la preparación de una solución en particular y en la etiqueta del envase por cualquier precaución específica en el manejo del químico. Pesar la cantidad deseada de químico(s). Use una balanza analítica si la cantidad es menor a 0.1 g. Coloque el/los químico(s) en un recipiente de tamaño apropiado con una varilla de agitación. Añada menos de la cantidad requerida de agua. Prepare todas las soluciones con agua doble destilada. Cuando los químicos se haya disuelto, transfiera a un cilindro

graduado y añada la cantidad de agua destilada requerida para completar el volume final. Una excepción ocurre cuando se preparan soluciones que contengan agar o agarosa. Pese el agar o agarosa directamente en el recipiente final. Si la solución necesita estar a un pH específico, cheque el pHmetro con soluciones buffer frescas y siga las instrucciones para el uso del pHmetro. Autoclave, de ser posible, a 121° C por 20 min. Algunas soluciones no pueden ser autoclavadas, por ejemplo, SDS. Ésas deben ser filtradas a través de un filtro estéril de 0.22 μ m o 0.45 μ m. El medio para cultivos de bacterias debe ser autoclavado el mismo día que sea preparado, preferiblemente entre una o dos horas. Guardar a temperatura de almacenamiento y checar si hay contaminación previo al uso tomando el recipient a la altura del ojo y agitandolo suavemente. Los medios sólidos para places bacterianas pueden ser preparados de antemano, autoclavados, y almacenados en un recipiente. Cuando sean necesitados, el agar puede ser derretido en un microondas, cualquier componente adicional, por ejemplo antibióticos, puede ser añadido y las placas pueden entonces ser colocadas.

2. Concentrated solutions, e.g. 1M Tris-HCl pH=8.0, 5M NaCl, can be used to make working stocks by adding autoclaved double-distilled water in a sterile vessel to the appropriate amount of the concentrated solution.

D. Material de Vidrio y Plástico.

El material de vidrio y plastic usado para biología molecular debe estar escrupulosamente limpio. Tubos de ensayo sucios, contaminación bacteriana y trazas de detergente pueden inhibir reacciones o degradar ácido nucleico.

El material de vidrio debe enjuagarse con agua destilada y autoclavado o secado a 150| C por 1 hora. Para experimentos con RNA, el material de vidrio y las soluciones son tratados con dietilpirocabonato para inhibir RNasas las cuales pueden ser resistentes al autoclavavado. El material de plastic tales como pipetas y tubos de cultivo son surtidos con frecuencia estériles. Tubos hechos de polipropileno son turbios y resistentes a varios químicos, como el fenol y el cloroformo; los tubos de policarbonato o poliestireno son claros y no son resistentes a muchos químicos. Asegúrese que los tubos que esté usando sean resistentes a los químicos usados en su experimento. Las puntas de micropipetas y tubos de microfuga deben ser autoclavados antes de su uso.

III. Métodos para aislamiento de DNA

A. Aislamiento a gran escala de DNA de doble cadena

El método usado para el aislamiento a gran escala de DNA cósmido y plásmido es una modificación no publicada (16) de un procedimiento de alcalinólisis (17,18) seguido por una ultracentrifugación en equilibrio de gradientes de cloruro de cesio-bromuro de etidio (1). Brevemente, las células que contienen el deseado plásmido o cósmido son cosechadas por centrifugación, incubadas en un buffer de lisozima, y tratadas con

detergente alcalino. Las proteínas solubilizadas en el detergente y las membranas son precipitadas con acetate de sodio, y el lisado es clarificado primero por filtración del precipitado a través de estopilla y después por centrifugación. El el supernadante que contiene el DNA es transferido a un nuevo tubo, y el DNA plásmido o cósmido es precipitado por la adición de polietilenglicol y recolectado por centrifugación. El DNA es resuspendido en un buffer conteniendo cloruro de cesio y bromuro de etidio, el cual es cargado en tubos de polialómero y sujetos a ultracentrifugación de la noche a la mañana. El bromuro de etidio mancha las bandas de DNA plásmido o cósmido, equilibradas por el gradient de densidad del cloruro de cesio después la ultracentrifugación, son visualizados bajo la luz UV de longitud de onda larga y la banda inferior es removida con una jeringa de 5cc. El bromuro de etidio intercalado es separado del DNA cargando la solución en una columna de intercambio de iones en equilibrio. El A260 conteniendo fracciones es combinado, diluido y precipitado con etanol, y la bola final de DNA es resuspendida en buffer y ensayada por digestión restrictiva como detectado en electroforesis en gel de agarosa.

Durante el curso de éste trabajo se realizaron varias modificaciones al protocol anterior. Por ejemplo, inicialmente los tiempos de crecimiento de las células incluyeron tres incubaciones sucesivas por la noche, empezando con la inoculación inicial de 3 ml de antibiótico contenido en el medio con el plásmido o cósmido contenido en la colonia bacteriana, y el incremento del volumen del cultivo de 50 ml, y después a 4 l. Sin embargo, se observó que el DNA cósmido recombinante aislado del cultivo celular creció bajo estas condiciones, en contraste el DNA plásmido recombinado, se contaminó con moléculas de DNA cósmido suprimidas. Sin embargo, éstas supresiones son evadidas por la aplicación de cada una de las tres incubaciones sucesivas por ocho horas en lugar de por la noche, aunque hay una ligera pérdida de rendimiento acompañado de tiempos reducidos de crecimiento.

Recientemente, un método basado en tierras diatomeas (19-22) fue usado para aislar DNA plásmido o cósmido de un lisado celular. El crecimiento celular, lisis, y clarificado del lisado son pasos son pasos efectuados como se describe arriba, pero siguiendo la precipitación delDNA por polietilenglicol, el DNA es resuspendido en buffer RNasa y tratado con RNasa A y T1. El tratamiento de la nucleasa es necesario para remover el RNA por digestion ya que el RNA compite con el DNA para el vínculo con la tierra diatomea. Después del tratamiento con RNasa, el DNA conteniendo supernadadnte es vinculado a la tierra ditomea en un buffer caotrópico de hidrocloruro de guanidina por incubación a temperatura del cuarto. El DNA asociado a la tierra diatomea es entonces recolectado por centrifugación, lavado varias veces con buffer de etanol y acetona, secado, y después resuspendido en buffer. El DNA es eluído durante incubación a 65° C y el DNA conteniendo supernadante es recolectado después de centrifugación y separación de las partículas de tierra diatomea. El DNA recuperado es medido mediante la toma de lecturas de absorbancia a 260 nanómetros. Después de la concentración por precipitación con etanol, el DNA es ensayado por digestión restrictiva.

Protocolo

1. Tome una colonia bacteriana que albergue el DNA plásmido o cósmido de interés y colóquela en un tubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 2 ml de medio LB suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e

incube a 37° C por 8-10 horas con agitación a 250 rpm. Transfiera el cultivo a un matraz Ehrlenmeyer flask conteniendo 50 ml de un medio similar, e incube por otras 8-10 horas. Transfiera 12.5 ml del cultivo a cada uno de los 4 litros de mdio similar, e incube por unas 8-10 horas adicionales.

2. Albergue las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500 ml en el RC5-B usando el rotor GS3. Resuspenda las placas de células en medio Viejo y transfiera a dos frascos, centrifuge como antes, y decante el medio. Las placas de células pueden ser congeladas a -70°C en este punto.

3. Resuspenda las placas de células en un total de 70 ml de solución GET/Lisozima (35 ml por cada frasco) removiendo gentilmente la placa con una espátula e incubando por 10 minutod a temperatura de almacenamiento. (Nota: No arremoline el lisado en ningún momento porque esto puede cizallar el DNA cromosomal).

4. Agregue un total de 140 ml de solución lisis alcalina (70 ml por cada frasco), y mezcle cuidadosamente, e incube por 5min en un baño de hielo-agua.

5. Añada 105 ml de 3M NaOAc, pH 4.8 (52.5 ml por cada frasco), tape bien, mezcle gentilmente invirtiendo el frasco algunas veces, e incube en un baño de hielo-agua por 30-60 minutos.

6. Clarifique el lisado de SDS precipitado, proteinas, membranas, y DNA cromosomal colando a travez de una doble capa de estopilla. Transfiera el lisado a un frasco de centrifugación de 250 ml, centrifuge a 10,000 rpm por 30 minutos a 4° C en el RC5-B usando el rotor GSA.

Para la purificación del gradiente de cloruro de cesio:

7a. Junte los supernadantes clarificados en un recipiente limpio, añada un cuarto en volumen de NaCl 50% PEG/0.5 M, agite y mezcle, e incube en un baño de hielo-agua por 1-2 horas.

8a. Colecte el DNA precipitado por el PEG por centrifugación en frascos de 250 ml a 7000 rpm por 20 minutos a 4°C en el RC5-B usando el rotor GSA.

9a. Disuelva las placas en un combinado total de 32 ml de buffer TE 100:10, 5 ml de bromuro de etidio 5 mg/ml, y 37 g de cloruro de cesio (Var Lac Oid Chemical Co., Inc.) (la concentración final del cloruro de cesio debe ser 1 g/ml).

10a. Transfiera la muestra a tubos de polialómero para centrífuga de 35 ml, remueva las burbujas de aire, selle con tapones de goma y asegure adecuadamente.

11a. Centrifuge a 60,000 rpm de 16-20 horas a 15-20°C en el Sorvall OTD-75B ultracentrifuge (DuPont) usando el rotor T-865.

12a. Visualice el DNA teñido por el bromuro de etidio bajo luz UV de longitud de onda larga, y remueva la banda inferior de DNA usando una jeringa de 5cc y una aguja calibre 25. (Sería conveniente primero remover y descartar la banda superior).

13a. Para remover el bromuro de etidio, cargue la muestra de DNA en una columna equilibrada Dowex 1.5 ml, y colecte fracciones de 0.5 ml. Equilibre la resina Dowex AG (BioRad) por centrifugación sucesiva, resuspensión, y decantando con 1M NaOH, agua, y después HCL-Tris 1M, pH 7.6 hasta que la solución Dowex tenga un pH de 7.6.

14a. Reúna fracciones con un A260 de 1.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35 ml, añada un volumen de ddH2O, y precipite con etanol por adición de 2.5 volumenes de etanol frío al 95%. Incube al menos 2 hours a -20°C, centrifuge a 10,000 rpm por 45 minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34. Decante con cuidado el supernadante, añada 80% de etanol, centrifugue como antes, decante, y seque la placa de DNA en un horno a vacío.

15a. Resuspenda el DNA en buffer TE 10:0.1.

Para purificación basada en tierra diatomea:

7b. Reúna los supernadantes del paso 6 en frascos de 500 ml y agregue RNasa A libre de DNasa y RNasa T1 de tal forma que la concentración final de RNasa A sea 40 ug/ml y de RNase T1 sea 40 U/ml. Incube en un baño de agua a 37°C por 30 minutos.

8b. Añada un volumen igual de isopropanol y precipite a temperatura de cuarto por 5 minutos. Centrifugue a 9,000 rpm por 30 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. Decante el supernadadnte y drene la placa de DNA.

9b. Resuspenda cada placa de DNA en 20 ml de buffer TE 10:1, y añada 40 ml de tierra diatomea definida en HCl-guanidina (100 mg/ml) por cada frasco. Permita que el DNA esté a temperature ambiente por 5 minutos con mezclado ocasional. Centrifugue a 9,000 por 10 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3.

10b. Decante el supernadante, resuspenda cada placa en 40 ml de buffer de lavado de tierra diatomea, y centrifugue como anteriormente.

11b. Decante el supernadante, resuspenda cada placa en 40 ml de acetona, y centrifugue como antes.

12b. Decante el supernadante y seque la placa en un horno a vacío.

13b. Resuspenda la placa en 20 ml de buffer TE 10:1 TE, y eluir el DNA envolvente por incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente.

14b. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 9,000 rpm por 10 minutos en el RC5-B usando el rotor GS3. Repita si es necesario.

15b. Combine los supernadantes que contienen DNA y precipite el DNA en tubos de vridrio Corex de 35 ml agragando 2.5 volumenes de 95% de etanol frío/acetona.

16b. Resuspenda la placa seca de DNA en 2 ml de buffer TE 10:0.1 y ensaye por concentración para lecturas de absorbancia a 260 nm o por electroforesis de gel de agarosa.

B. Aislamiento Midiprep de DNA de doble cadena

Una midi-prep de asilamiento de DNA de doble cadena ha sido creada para generar una cantidad suficiente de DNA platilla para varias reacciones catalizadas de terminador fluorescente Sequenase[TM]. Aqui, una colonia bacteriana la cual alberga el plásmido de interés es tomada en 3 ml de medio líquido conteniendo ampicilina e incubado en un agitador a 37°C por 8-10 horas. En este tiempo, el cultivo es transferido a 50 ml de medio que contiene ampicilina e incubado por otras 10-12 horas. Después del albergado de células por centrifugación, se efectúa un método de purificación de tierra diatomea basado en lisis alcalina (19-22), similar al discutido anteriormente en el aislamiento de DNa a gran escala. El DNA purificado es ensayado crudamente por concentración y pureza mediante electrophoresis de gel de agarosa contra estándares conocidos. El producto aproximado de DNA de doble cadena usando éste método es 1 ug de DNA por ml de cultivo celular. Para 50 ml de cultivo celular, alrederor de 50 ug de DNA son recuperados, y 5 ug son usados comúmente en una reacción de terminación Sequenase[TM].

Nota: Éste procedimiento es el método de selección para aislar platillas basadas en plásmido de doble cadena para Reacciones de Rotulado con Tinte de Secuencia Terminadora Sequenase.

Protocolo

1. Tome una colonia de bacteria que albergue el DNA plásmido de interés y colóquela en un rubo Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 3 ml de medio 2xTY suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 8-10 horas con agitación a 250 rpm. Transfiera el cultivo a un matraz Ehrlenmeyer conteniendo 50 ml de un medio similar, e incube por otras 11-14 horas.

2. Junte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en tubos cónicos de 50 ml en la centrífuga de mesa Beckman GPR y decante el supernadante. Las plascas de células pueden congelarse a -70°C en este punto.

3. Resuspenda las placas de células en 2 ml de solución de GET/Lisozima, añada 04 ml de solución lisis alcalina, mezcle suavemente, e incube por 5 minutos en un baño de hielo-agua.

4. Añada 4 ml de 3M NaOAc, pH 4.8, mezcle suavemente por agitación, e incube en un baño de hielo-agua por 30-60 minutos.

5. Clarifique el lisado de SDS precipitado, proteínas, membranas, y DNA cromosomal vertiendo a través de una doble capa de estopilla en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Centrifugue a 3,000 rpm por 20 minutos a 4°C en la centrífuga de mesa Beckman GPR.

6. Decante el supernadante a un tubo de polipropileno para centrífuga de 50 ml, añada 20 ul de RNasa libre de DNasa a 20 mg/ml e incube en un baño de agua a 37°C por 30 minutos.

7. Añada 7 ml (igual volumen) de tierra diatomea HCl-guanidina (20 mg/ml) y permita que el DNA esté en contacto con la temperatura ambiente por 5 minutos con mezclado ocasional. Centrifugue a 3,000 por 5 minutos en la centrífuga de mesa Beckman GPR.

8. Decante el supernadante, resuspenda en 7 ml de buffer de lavado de tierra diatomea, y centrifugue como anteriormente lo hizo.

9. Decante el supernadante, resuspenda en 7 ml de acetona, y centrifugue como antes.

10. Decante el supernadante y seque en un horno a vacío.

11. Resuspenda la placa en 0.6 ml de buffer TE 10:1, y eluír DNA aprisionado por incubación a 65°C por 10 minutos con mezclado intermitente.

12. Remueva la tierra diatomea por centrifugación a 3,000 rpm por 5 minutos en la centrífuga de mesa Beckman GPR.

13. Transfiera el supernadante a un tubo de microcentrifugación de 1.5 ml y centrifugue a 12,000 rpm por 5 minutos en una microcentrífuga a temperatura del cuarto. Transfiera el supernadante a un Nuevo tubo de microcentrifugación de 1.5 ml y precipite con etanol.

14. Resuspenda la placa de DNA secada en 40 ul de buffer TE 10:0.1 y ensaye para concentración por electroforesis de gel de agarosa.

C. Aislamiento Miniprep de DNA de doble cadena

El método estándar para el aislamiento miniprep de DNA plásmido incluye la misma estrategia general que el aislamiento a gran escala. Sin embargo, alícuotas más pequeñas de antibiótico conteniendo medio líquido inoculado con colonias celulares que contienen plásmido son incubadas en un agitador a 37°C por 12-16 horas. Después colectando el plásmido contenido en las células por centrifugación, la placa cellular es resuspendida en un buffer hipotónico de sucrosa. Las células son sucesivamente incubadas con un buffer RNasa-lisis, detergente alcalino, y acetate de sodio. El lisado es clarificado de proteínas precipitadas y membranas por centrifugación, y el DNA plásmido es recuperado del supernadante por precipitación con isopropanol. El DNA es checado crudamente para concentración y pureza usando electrofóresis de del de agarosa contra estándares conocidos. Un rendimiento típico para éste método de aislamiento de DNA es 10-15 ug de DNA plásmido de 6 ml de cultivo inicial.

Como el DNA superenrrollado es deseado para el secuenciado de DNA de doble cadena, una modificación de éste método empleando tierra diatomea (19-22) algunas veces es usado para el aislamiento de plantillas de doble cadena para DNA secuencial con cebadores fluorescentes. Después de remover las proteínas precipitadas y las membranas, el plásmido conteniendo supernadante es incubado con tierra diatomea e hidrocloruro de guanidina y esta mezcla es añadida a uno de los 24 pozos en el BioRad Gene Prep Manifold. El supernadante es removido por filtración a vacío sobre un filtro de nitrocelulosa. El DNA asociado a la tierra diatomea es lavado para remover el hidrocloruro de guanidina con un buffer de etanol, y después secado por filtración. El buffer de elución es añadido a los pozos, y el DNA conteniendo solución es separado de

las partículas de tierra diatomea por filtración en un tubo colector. El DNA recolectado es concentrado por precipitación con etanol y ensayado en crudo para concentración y pureza por electroforesis de gel de agarosa contra estándares conocidos. El producto aproximado de DNA de doble cadena es 3-5 ug de DNA por 6 ml de cultivo inicial.

Nota: Esta es una típica mini-prep hasta el paso 7, donde en el paso 7a se debe precipitar la muestra y usarla para el ciclo secuenciado de Taq con los tapaporos rotulados, o en el paso 7b proceder con la purificación de la tierra diatomea para reacciones de ciclo secuenciado para Taq con terminador rotulado. Para reacciones de de secuenciado para Sequenase terminador rotulado use el procedimiento Midi-prep detallado anteriormente.

Protocolo

1. Tome una colonia que albergue el DNA plásmido de interés y colóquelo en un tubo Falcon de 17 X 100 mm conteniendo 6 ml de metió TB suplementado con el antibiótico apropiado (comúnmente ampicilina a 100 ug/ml) e incube a 37° C de 16-18 horas con agitación a 250 rpm.

2. Colecte las células por centrifugación a 3000 rpm por 5 minutos en un centrífuga de mesa Beckman GPR y decante el supernadante. Las placas celulares pueden ser congeladas a -70°C en este punto.

3. Resuspenda las placas celulares en 0.2 ml de solución TE-RNasa (50:10 buffer TE conteniendo 40 ug/ml de RNasa A; también puede añadirse RNasa T1 para una concentración final de 10 U/ul) por agitación suave, añada 0.2 ml de solución lisis alcalina, mezcle con cuidado, e incube por 15 minutos a la temperatura del cuarto.

4. Añada 0.2 ml de 3M NaOAc, pH 4.8, mezcle suavemente por agitación, transfiera a tubos de microcentrifugación de 1.5 ml, e incube en un baño de hielo-agua por 15 minutos.

5. Clarifique el lisado de SDS precipitado, proteínas, membranas, y DNA cromosomal por centrifugación a 12,000 rpm por 15 minutos en una microcentrífuga a 4° C.

6. Transfiera el supernadante a un tubo de microcentrifugación de 1.5 ml, incube en un baño de hielo-agua por 15 minutos, centrifugue como antes por otros 15 minutos y transfiera el supernadante a un tubo limpio de 1.5 ml.

Para purificación de lisis alcalina estándar:

7a. Precipite el DNA por adición de 1 ml de etanol 95%, y resuspenda la placa de DNA seca en 100-200 ul de buffer TE 10:0.1. Electroforise una alícuota de la muestra de DNA en un gel de agasora al 0.7% para determinar en crudo la concentración y pureza.

Para purificación de base de tierra diatomea:

7b. Añada 1 ml de tierra diatomea en hidrocloruro de guanidina (20 mg/ml) y permita que el DNA esté en contacto con la temperatura del cuarto por 5 minutos con mezclado ocasional. Mientras tanto, empape la membrana de nitrocelulosa Prep-A-Gene en

isopropanol por al menos 3 minutos, y coloque el colector Prep-A-Gene como se describe en el manual.

8b. Encienda la bomba de vacío y ajuste el nivel de vacío a 8 in. Hg, deje secar la membrana por 1 minuto, y entonces cese el vacío.

9b. Derrame las muestras bien mezcladas dentro de los pozos del colector Prep-A-Gene y filtre a 8 in. Hg hasta que el líquido haya pasado a través del filtro.

10b. Lave las muestras cuatro veces con 250 ul de buffer de lavado de tierra diatomea, usando una pipeta de repetición, permitiendo que todo el el líquido sea filtrado entre los lavados.

11b. Reduzca el vacío a 5 in. Hg antes de cesar el vacío en la llave de paso. Sin desmontar las abrazaderas negras, retire las abrazaderas blancas y coloque el estante de recolección con tubos de rosca de 1.5 ml en el colector. Sujete el colector con las abrazaderas blancas, y aplique 300 ul de buffer TE 10:1 calentado a 65°C y jale el DNA eluido a 5 in. Hg. Después de que el líquido ha sido filtrado, aumente el vacío a 10-12 in. Hg, y deje la membrana secarse por 1 minuto.

12b. Cese el vacío en la llave de paso y remueva el estante de recolección que contiene los tubos. Precipite el DNa con etanol y resuspenda la placa de DNA secado en 30 ul de buffer TE 10:0.1.

D. Aislamiento a gran escala de M13RF (9)

La doble cadena M13RF es aislada para usarse en el corte M13 SmaI, la preparación del vector defosforilado, se describe a continuación. Las condiciones de cremientos de células infectadas con la bacteria M13 (ver figura 1) aparece convoluída, pero resulta en una máxima cantidad de moléculas de M13 RF por célula. Después el M13RF conteniendo células bacterianas es colectado por centrifugación, las moléculas de doble cadena son aisladas usando el método del cloruro de cesio para un aislamiento de plásmido a gran escala, como se describió anteriormente. Esto brevemente implica lisis alcalina celular, precipitación con acetato de sodio de proteínas solubilizadas en detergente y membranas, precipitación de DNA con polietilenglicol, y extracción de DNA teñido con bromuro de etidio del gradiente de cloruro de cesio después de la ultracentrifugación. Después de remover el bromuro de etidio en una columna de intercambio de iones, el DNA conteniendo fracciones es detectado por la medición de A260 y colectado, y el DNA es concentrado por precipitación con etanol y analizado por digestión enzimática restrictiva y electroforesis de gel de agarosa.

Protocolo

1. Prepare un cultivo en fase inicial de JM101 inoculando un matraz Ehrlenmeyer conteniendo 50 ml de 2xTY con glicerol provisto de JM101 y pre-incubado por 1 hora en unbaño de agua a 37°C, sin agitación. Tome una placa que represente el M13 clone en cuatro alícuotas de 1.5 ml de fase inicial de JM101, e incube de acuerdo al procedimiento mostrado en la figura 1 para resultar en 4 litros de bacteria infectada con M13.

2. Colecte las células por centrifugación a 7000 rpm por 20 minutos en frascos de 500 ml en el RC5-B usando el rotor GS3. Resuspenda las places celulares en medio fresco 2xTY para remover fago extracelular contaminante y transfiera a dos frascos, centrifugue como antes, y decante el medio. Las placas celulares pueden se congeladas a -70°C en este punto.

3. Resuspenda las placas celulares en un total de 120 ml (30 ml por cada frasco) de buffer STB 1X removiendo suavemente la placa con una espátula. Añada un total de 24 ml solución de lisozima (6 ml por cada frasco), mezcle con cuidado, e incube por 5 minutos en un baño de hielo-agua.

4. Añada 48 ml de buffer TTE 50:2:10 (12 ml por por cada frasco) y 2 ml de RNasa A (10 mg/ml) (0.5 ml por por cada frasco), mezcle gentilmente, e incube en un baño de hielo-agua por 5 minutos.

5. Clarifique el lisado de SDS precipitado, proteínas, membranas, y DNa cromosomal por vertido a través de una capa doble de estopilla. Transfiera el lisado a un frasco de centrifugación de 250 ml, centrifugue a 10,000 rpm por 30 minutos a 4° C en el RC5-B usando el rotor GSA.

6. Añada 6 ml de bromuro de etidio 5 mg/ml, y cloruro de cesio de manera que la concentración final de cloruro de cesio sea 1 g/ml.

7. Transfiera la muestra a tubos de polialómero de 35 ml y llene con una solución 1:1 de buffer TE 100:10 TE y bromuro de cesio, remueva las burbujas de aire, selle con empaques de goma y cierre adecuadamente.

8. Centrifugue a 60,000 rpm de 16-20 horas a 15-20°C en el Sorvall OTD-75B ultracentrifugue usando el rotor T-865.

9. Visualice el DNA teñido con el bromuro de etidio bajo luz UV de longitud de onda larga, remueva la banda inferior de DNA usando una jeringa de 5cc y una aguja de calibre 25. (Sería adecuado remover y descartar la banda superior primero).

10. Para remover el bromuro de etidio, cargue la muestra de DNA en una columna de 1.5 ml Dowex AG (BioRad), equilibrada como antes, y colecte fracciones de 0.5 ml.

11. Junte las fracciones con un A260 de 1.00 o mayor en tubos de vidrio Corex de 35 ml, añada un volumen de ddH2O, y precipite con etanol agregando volúmenes de 2.5 de etanol frío al 95%. Incube por lo menos 2 horas a -20°C, centrifugue a 10,000 rpm por 45 minutos en el RC5-B usando el rotor SS-34. Decante con cuidado el supernadante, añada etanol al 80%, centrifugue, decante, y seque la placa de DNA en un horno a vacío.

12. Resuspenda el DNA en buffer TE 10:0.1.

E. Aislamiento de DNA de cadena simple M13 usando fenol

Este procedimiento de aislamiento (23) es el método de preferencia para la preparación de plantillas basadas en M13 usadas en reacciones catalizadas de terminador teñido de Sequenase[TM]. Se prepara un cultivo preincubado de fase inicial de JM101 por transfiriendo glicerol descongelado base a 50 ml de medio líquido e incubado por 1 hora a 37°C sin agitarse. Placas de M13 son tomadas con un mondadientes estéril y colocadas en alicuotas de 1.5 ml de cultivo en fase inicial de JM101, los cuales son incubados en un agitador a 37° C por 4-6 horas. Después de la incubación, las células bacterianas son emplacadas por centrifugación y el contenido viral supernadante es transferido a un tubo limpio. Las partículas de fago son precipitadas con PEG, recolectadas por centrifugación, y el emplacada es resuspendido en buffer. La cubierta proteínica del fago es desnaturalizada y extraída por una o incluso dos extracciones con fenol. Después de la precipitación con etanol, la placa de DNA seca es resuspendida en buffer, y la concentración y pureza son analizadas por electroforesis de gel de agarosa contra estándares conocidos.

Protocolo

1. Prepare un cultivo en fase inicial de JM101, como anteriormente, y tome placas basadas en M13 con mondadientes estériles y colóquelas en tubos Falcon de 12 X 75

mm conteniendo alícuotas de 1.5 ml de las células. Incube por 4-6 horas a 37°C con agitación a 250 rpm.

2. Transfiera el cultivo a tubos de microcentrifugación de 1.5 ml centrifugue por 15 minutos a 12,000 rpm a 4°C.

3. Pipeteé 1 ml de la parte superior del supernadante y colóquelo en un tubo de microcentrifugación de 1.5 ml conteniendo 0.2 ml de 20% PEG/2.5 M NaCl para precipitar las partículas del fago. Mezcle invirtiendo varias veces e incube por 15-30 minutos a temperatura de la habitación.

4. Centrifugue por 15 minutos a 12,000 rpm a 4°C para recolectar el fago precipitado. Decante el supernadante y remueva el PEG residual supernadante por succión dos veces.

5. Resuspenda el emplacado en 100 ul de HCl-Tris 10 mM, pH 7.6 por arremolinamiento, y agregue 50 ul de fenol saturado con TE.

6. Extraer el DNA con fenol y dos veces con éter, como se discutió anteriormente, y después precipite con etanol.

7. Resuspenda el DNA secado en 6 ul de TE 10:0.1 para usarse en reacciones catalizadas de secuenciado de tinte terminador de cadena simple Sequenase[TM].

F. Procedimiento de aislamiento automatizado Biomek Eperon modificado para DNA de cadena simple M13

Éste método semiautomatizado es una modificación del procedimiento reportado previamente (24,25), y permite el aislamiento simultáneo de 48 DNAs de cadena simple por estación de trabajo Biomek 1000 en un lapso de 3 horas (26). Basicamente, placas de M13 son tomadas con mondadientes estériles y colocadas en alicuotas de fase inicial de JM101, preparadas como se discutió antes. Los cultivos infectados con fago son incubados con agitación a 37°C por 4-6 horas, transferidos a tubos de microcentrifugación, centrifugados para separar las células bacterianas del viral supernadante, y entonces colocado cuidadosamente en la tableta Biomek. Por cada muestra, dos alicuotas de 250 ul son distribuidas roboticamente dentro de dos pozos de una placa de 96 pozos de microtitulación, y éste proceso es repetido para cada una de las 48 muestras hasta que los 96 pozos enteros sean llenados. Una solución de polietilenglicol (PEG) después es añadida a cada pozo y mezclada. La placa de microtitulación es cubierta con una placa de acetate sellador, incubada a temperature de la habitación para precipitar las partículas de fago, y después centrifugada. El supernadante entonces es removido invirtiendo la placa y drenando con cuidado en una toalla de papel, sin desmontar la placa. Después de colocar la placa de microtitulación de regreso en el Biomek, una solución diluida más de PEG es añadida robóticamente a cada pozo. La placa entonces es cubierta con otro sellador y centrifugada nuevamente. Este paso de enjuague ayuda en la remoción de proteínas contaminantes y RNA. Después de remover el supernadante, como antes, y colocar la placa de microtitulación en el Biomek, una solución de detergente Triton X-100 es agregada robóticamente a cada pozo. La placa es agitada suavemente y la muestra de cada par de pozos es

roboticamente transferida a tubos de microcentrifugación, los cuales son tapados y colocados en un baño de agua a 80° C por 10 minutos para ayudar a la solubilización de la capa de fago de proteínas en el detergente. Después de una breve centrifugación para colectar el condensado, el DNA de cadena simple es precipitado con etanol, secado y resuspendido. Una alícuota de cada muestra de DNA es sujeta a electroforesis de gel de agarosa para analizar crudamente concentración y pureza. El producto de la plantilla de cadena simple es aproximadamente 2-3 ug por muestra.

Protocolo

El procedimiento requerirá 9 filas de puntas P250 (contando del centro de la tablet de Biomek hacia la izquierda) para aislar 48 plantillas (48ISOL). El modulo reactive debe contener PEG-2000, Triton-Tris-EDTA, y etanol-acetato, respectivamente.

1. Prepare un cultivo en fase inicial JM101 en 50 ml de 2xTY, como anteriormente se hizo.

2. Usando mondadientes estériles, transfiera placas individuales de M13 a tubos Falcon de 12 X 75 mm conteniendo 1 ml de cultivo celular en fase prematura, e incube por 4-6 horas a 37°C con agitación a 250 rpm. (Crecimiento por más de 6 horas resulta en lisis celular y contaminación del DNA fago por proteínas celulares y ácidos nucleicos).

3. Separe las células bacterianas del supernadante conteniendo viral por centrifugación a 12,000 rpm por 15 minutos a 4°C. Abra cuidadosamente los tubos y coloque en la tableta Biomek.

4. El Biomek distribuirá dos alícuotas de 250 ul de viral supernadante por muestra en los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos de fondo plano (Dynatech). El Biomek después añadirá 50 ul de solución 20% PEG/2.5 M NaCl a cada pozo, y mezclara por pipeteo de arriba a abajo.

5. Cubra la placa con una placa de acetato sellador e incube a temperatura de la habitación por 15 minutos.

6. EMplaque el fago precipitado centrifugando la placa a 2400 rpm por 20 minutos en una centrífuga de mesa Beckman GPR. Remueva la placa selladora y drene el PEG de la placa drenando cuidadosamente de arriba abajo en un Kimwipe.

7. Regrese a la placa a la tableta, y el Biomek robóticamente añadirá 200 ul de solución de enjuague PEG:TE a cada pozo. Cubra la placa con sellador, centrifugue y drene como antes.

8. Regrese la placa a la tableta, y el Biomek añadirá 70 ul de solución TTE a cada pozo. Remueva y agite suavemente para resuspender.

9. El Biomek entonces juntará robóticamente el contenido de cada par de pozos en tubos de microcentrifugación de 1.5 ml.

10. Incube los tubos a 80°C por 10 minutos para desnaturalizar la cubierta de proteína viral y después centrifugue brevemente para recoger la condensación.

11. Precipite con etanol el DNA agregando 500 ul etanol/acetato a cada tubo, como se describió anteriormente.

12. Resuspenda las plantillas de DNA en 20 ul de buffer TE 10:0.1.

G. Aislamiento en 96 pozos de plantillas de doble cadena

Un manual como un procedimiento automatizado es dado a continuación. El método automatizado es una modificación de un procedimiento previamente reportado (4) el cual permite el aislamiento de 96 DNAs por estación de trabajo de laboratorio automatizada Biomek 1000 cada dos horas. Basicamente colonias que contienen plásmidos de doble cadena sin tomados con mondadientes estériles y colocados en medio e incubados a 37°C por 24 horas con agitación a 350 rpm. Estas células son colectadas por centrifugación y las placas son manual o roboticamente resispendidas por la adición de solución TE-RNasa. Una solución lisis alcalina es usada para lisar las células y el lisado es precipitado con KOAc. El lisado es clarificado por filtración y posteriormente concentrado por precipitación con etanol. Una alícuota de cada muestra de DNA es sujeta a electroforesis de gel de agarosa para analizar crudamente concentración y pureza. El producto de la platilla de doble cadena es aproxmadamente 3 mg por muestra.

Protocolo

Manual del método de aislamiento de doble cadena

Lo siguiente es un manual del procedimiento para el aislamiento secuencial de plantillas en 96 pozos de doble cadena que ha sido desarrollado en nuestro laboratorio. Un procedimiento similar que ha sido automatizado en el Biomek es presentado en otro espacio aquí.

1. Tome clones individuales de cada placa on un mondadientes estéril y deposite cada uno por separado en el bloque de 96 pozos conteniendo 1.75 ml de medio TB por pozo. Mantenga el mondadientes en el medio por alrededor de 5 minutos para permitir que las células se difundan en el medio, remueva los mondadientes, cobra el bloque de 96 pozos con la tapa suelta, y permita que las células crezcan por 24 horas en el agitador/incubador a 37° C a 350 rpm.

2. Remueva el bloque del agitador/incubador y colecte las células por centrifugación a 2500 rpm por 7 minutos. Las células pueden se guardadas congeladas a -20°C en el bloque en este punto.

3. Después de descongelar las células, añada 100ul de solución TE-RNAsa-A conteniendo RNAsa T1, mezcle por pipeteo arriba y abajo 4-5 veces para resuspender la placa celular y después incube en el incubador/agitador a 37°C por 5 minutos a 350 rpm para mezclar más a fondo.

4. Remueva el bloque del incubador/agitador y entonces añada 100ul de solución lisis alcalina. Agite el bloque a mano para mezclar los reactivos y después incube a la temperature del cuarto por 1 hora con arremolinado intermitente.

5. Después añada 100ul de acetato de sodio o de potasio 3M, pH 5, y coloque el bloque en un agitador/incubador a 37°C por 5 minutos a 350 rpm para mezclar a fondo y cizallar el DNa genómico para reducir la viscosidad de la solución. Coloque el bloque a -20degC por 30 minutos.

6. Centrifugue el bloque en la centrífuga GPR a 3000 rpm a 4°C por 30 minutos.

7. Remueva con cuidado 200 ul del supernadante de cada pozo en el bloque de 96 pozos con la pipeta de 12 canales y transfiéralos a una placa de microtitulación de fondo en V, siendo cuidadoso de no transferir ninguna célula de desecho.

8. Transfiera 10 ul del supernadante a los respectivos tubos de reacción de ciclo secuenciado, y precipite con 150 ul de etanol al 95% (sin acetato añadido). Después guarde a -20°C por 30 minutos, el emplacado es colectado por centrifugación, lavado tres veces con etanol al 70%, y secado directamente en los tubos de reacción de ciclo secuenciado.

9. Antes de agregar el terminador fluorescente a la mezcla de reacción de ciclo secuenciado, las plantillas secadas deben ser almacenadas a -20°C. Un adicional de 75 ul del supernadante es transferido a un tubo de reacción Robbins PCR (en formato de tubo de 96 pozos) y precipitado con 200 ul de etanol al 95%, lavado tres veces con etanol al 70%, y almacenado seco at -20°C para su uso posterior.

El siguiente es un procedimiento para el aislamiento automatizado de plantillas de 96 pozos de doble cadena que se ha desarrollado en nuestro laboratorio.

1. Tome colonias usando un mondadientes y colocándolas en 1.8 ml de TB con sales de TB conteniendo el antibiótico apropiado y agite por 22-24 horas a 350 rpm en un bloque de 96 pozos con cubierta.

2. Colecte las células por centrifugación a 1800 rpm por 7 min. Drene el supernadante y permita que las placas se drenen invertidas. Las placas celulares pueden ser congeladas en este punto si es necesario.

3. Encienda el Biomek, arranque el programa DSISOL2 y configure el Biomek como se indica en la pantalla de configuración. Específicamente, debe poner la solución TE-RNasa en el primer módulo, la solución lisis alcalina en el segundo módulo de reactivo y el 3 M KOAc, pH 4.8 en el tercer módulo.

4. Coloque el bloque de 96 pozos conteniendo las células en la tableta de Biomek en la posición etiquetada “Minitubos de 1.0 ml". Coloque el filtro miniporo en la posición etiquetada "placa de titulación de fondo plano de 96 pozos".

5. Presione ENTER para continuar con el programa.

6. Primero el Biomek añadirá 100 ml de solución TE-RNasa a las placas celulares y mezclará para resuspender parcialmente.

7. Siguiente, el Biomek añadirá 100 ml de solución lisis alcalina a los pozos con la placa de filtro.

8. El Biomek después mezclará la suspensión celular otra vez, transferirá el volumen entero a la placa filtro conteniendo la solución lisis alcalina y mezclará otra vez. Ajuste la filtración del aparato con un bloque de 96 pozos limpio para recolectar el filtrado (lave y reuse el bloque usado para el crecimiento).

9. El Biomek añadirá 100 ml 3M KOAc, pH 4.8 a los pozos de la placa filtro y mezclará al los lados de los pozos. Algunos escogen colocar la placa filtro a -20°C por 5 minutos en este punto. Transfiera la placa filtro al QiaVac Vacuum Manifold 96 y filter usando agua de vacío solamente (no force la filtración ya que las placas son frágiles y podrían perder su sello). Esto comúnmente toma menos de 20 minutos.

10. El supernadante recolectado en el bloque de 96 pozos es el DNA crudo y debe ser precipitado con etanol antes de su uso mediante la adición de 1ml de etanol al 100% e incubando a -20°C por al menos 30 minutos.

11. Centrifugue por 25 minutos a 3000 rpm en una centrífuga enfriada Beckman GPR.

12. Decante y lave con 500 ml de etanol al 80% y centrifugue por 5 minutos adicionales a 3000 rpm.

13. Decante el supernadante, drene invertido en una toalla de papel. Seque a vacío.

14. Resuspenda en 50 ml de TE 10:0.1 para usar una química secuencial de colorante iniciador o colorante terminador.

H. Aislamiento de DNA genómico desde sangre

El aislamiento de DNA genómico es desarrollado de acuerdo al protocol del FBI (27). Después de que las muestras de sangre son descongeladas (almacenadas a -70°C en tubos a vacío de EDTA), se agrega buffer de citrato estándar, se mezcla y los tubos son centrifugados. La porción superior de supernadante es descartada y se añade buffer adicional, se mezcla y el tubo es centrifugado nuevamente. Después de que el supernadante es descartado, el emplacado es resuspendido en una solución de detergente SDS y proteinasa Km y la mezcla es incubada a 55° C por una hora. A la muestra entonces se le extrae el fenol una vez con una solución fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, y después de una centrifugación la capa acuosa es removida a un tubo de microcentrifugación fresco. El DNA es precipitado con etanol, resuspendido en buffer, y después precipitado con etanol una segunda vez. Una vez que el emplacado este seco, se le añade buffer y el DNA es resuspendido para incubarlo a 55°C por la noche, la solución de DNA genómico es analizada por la cadena de reacción de polimerasa.

Protocolo (actualizado 10/30/98)

1. Muestras de sangre son comúnmente obtenidas como 1 ml de sangre entera almacenada en tubos de EDTA a -70° C.

2. Enjuague las muestras congeladas, y a cada muestra de 1 ml, añada 0.8 ml de buffer 1X SSC, y mezcle. Centrifugue por 1 minuto a 12,000 rpm en una microcentrífuga.

3. Remueva 1 ml del supernadante y descarte en desinfectante.

4. Añada 1 ml de buffer 1X SSC, vortice, centrifugue como antes por 1 minuto, y remueva todo el supernadante.

5. Añada 375 ul de 0.2M NaOAc a cada emplacado y vortice brevemente. Después añada 25 ul de SDS al 10% y 5 ul de proteinasa K (20 mg/ml H2O) (Sigma P-0390), vortice brevemente e incube por 1 hora a 55°C.

6. Añada 120 ul de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y agite por 30 segundos. Centrifugue la muestra por 2 minutos a 12,000 rpm en un tubo de microcentrifugación.

7. Remueva cuidadosamente la capa acuosa y colóquela en un nuevo tubo de microcentrifugación de 1.5 ml, agregue 1 ml de etanol frio al 100%, mezcle, e incube por 15 minutos a -20° C.

8. Centrifugue por 2 minutos a 12,000 rpm en una microcentrífuga. Decante el supernadante y drene.

9. Añada 180 ul de buffer TE 10:1, agite, e incube a 55°C por 10 minutos.

10. Añada 20 ul de acetato de sodio 2 M y mezcle. Agregue 500 ul de etanol frío al 100%, mezcle, y centrifugue por 1 minuto a 12,000 rpm en una microcentrífuga.

11. Decante el supernadante y enjuague el emplacado con 1 ml de etanol al 80%. Centrifugue por 1 minuto a 12,000 rpm en una microcentrífuga.

12. Decante el supernadante, y seque el emplacado en una Speedy-Vac por 10 minutos (o hasta que esté seco).

13. Resuspenda el emplacado adicionando 200 ul de buffer TE 10:1 TE. Incube por la noche a 55°C, agitando periódicamente para disolver el DNA genómico. Almacene las muestras a -20°C.

Bruce A. Roe, Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Oklahoma, Norman, Oklahoma 73019 broe@ou.edu

Extracción de DNA

Ésta es una modificación de un procedimiento de salado como es descrito por Miller et al., (1988), evaluado en el Laboratorio de DNA, Escuela Médica, Malta. Cuando se analizó por espectrofotmetría >95% del DNA genómico extraído dió un promedio de pureza de DNA a proteínas en un rango de 1.7 - 1.9 y una concentración de 100ng/ml.

En el siguiente protocolo el DNA fue extraído de leucocitos de sangre periférica usando 3ml de sangre entera. Se observó que en almacenamiento prolongado de sangre entera a -20 y -80ºC , el producto de DNA disminuyó considerablemente probablemente debido a la degeneración de los glóbulos blancos. Los volúmenes de buffers y reactivos usados deben ser ajustados de acuerdo al volumen de sangre entera a usarse.

PROCEDIMIENTO:

1. Sangre entera es recolectada en contenedores de EDTA disodio y almacenada a -20ºC y un numero de muestras también son almacenadas a -80ºC. para facilimtar la hemólisis de RBCs se recomienda almacenar la muestra fresca por unas cuantas horas en un enfriador ya que el frío destruye las células rojas.

2. Después de descongelar, 3ml de sangre entera son transferidos a un tubo cónico de centrifugación (15ml de volumen) al cual 9ml de buffer de lisado de eritrocito 1X (0.155M NH4Cl; 10mM KHCO3; 0.1mM Na2 EDTA; pH 7.4) debe ser añadido.

3. La solución es dejada por 10 minutos a RT con mezclado occasional por inversión seguido de una centrifugación por 5 minutos a 4000 rpm.

4. Después de la centrifugación el supernadante es descartado y una placa blanca será visible al fondo del tubo. Este emplacado debe ser lavado por al menos 3 veces por adición de 3ml de buffer de lisado de eritrocito y repitiendo los pasos 3 y 4. Es importante desglosar el emplacado y enjuagarlo bien con buffer de lisado de eritrocito con el fin de limpiar las células blancas de la sangre del hemo remanente.

5. 1.5mls de buffer SE (75mM NaCl; 25mM Na2 EDTA; pH 8.0) conteniendo 100g/ml de proteinasa K y 1% de dodecilsulfato de sodio (SDS w/v), son añadidos al emplacado. Los tubos después son incubados a una temperature de 37 - 55ºC (temperature óptima para la actividad de la proteinasa K) por la noche en un baño de agua o en un incubador. Durante este paso las membranas de las células blancas de la sangre son desnaturalizadas y el DNA sale en solución.

6. Después de la incubación, 1.5mls de buffer SE junto con 750l NaCl 6M (saturado) son agregados en cada tubo, seguido de la adición de 3.75mls de cloroformo.

7. Los tubos son mezclados vigorosamente (en un vórtice) por alrededor de 20 seg con mezclado ocasional por al menos 30min. Alternativamente pueden dejarse los tubos en un rotor por 1 hora.

8. La emulsion sera centrifugada por 10 minutos a 2000 rpm con minima fuerza de rompimiento. Después de la centrifugación se observan 2 fases y debe ternerse cuidado de no crear un disturbio en la interfase. Durante este paso el DNA es extraído en el supernadante y las proteínas son separadas en la fase inferior.

9. La fase acuosa superior (conteniendo el DNA) es transferida a un tubo de centrifugación cónico estéril limpio usando una pipeta Pasteur, seguido de la adición de un volumen igual de isopropanol.

10. El DNA sera precipitado con rotación suave del tubo y se observa un hilo como hebra.

11. Usando una espátula estéril o un bucle se transfiere la hebra de DNA a un tubo estéril de microcentrifugación conteniendo 1ml de etanol al 75%.

12. El DNA es entonces lavado por inversión para limpiarlo de cualquier sal remanente y el tubo es centrifugado a 11000g por 4 minutos. El supernadante es descartado teniendo cuidado de no descartar el emplacado. Repita este paso una vez más.

13. Después de descartar el supernadante el emplacado es secado del exceso de etanol usando centrifugación a vacío o dejando los tubos abiertos e invertidos e un horno a alrededor de 50 - 65ºC por una hora.

14. El emplacado seco es resuspendido en buffer TE (1M Tris-HCl; 0.5M EDTA; pH 8.0) y dejado por la noche en un rotador.

15. La concentración de DNA es determinada por electrophoresis de gel de agarosa o por espectrofotometría y ajustando a la concentración deseada adicionando más buffer TE. Es importante notar que antes de ajustar y leer la concentración de DNa uno debe obtener una muestra homogénea de DNA lo cual no es muy fácil de conseguir ya que el DNA es muy viscoso. Para ajustar una concentración menor uno debe usar otros métodos cuantitativos tales como Picogreen (Molecular Probes) usando espectrofluorometría ya que la espectrofotometría no es precisa y sensitiva a muy bajas concentraciones.

Preparación de DNA desde sangreSección Genómica de Cáncer, Rama Genética, NCIInstituto Nacional de SaludReactivosCloruro de amonio (NH4Cl)CloroformoMallinckrodt, Cat. 4440Etanol, absolutoHClAlcohol IsoamílicoSigma, Cat. I-3643Isopropanol (2-Propanol)FenolCarbonato de potasio (KHCO3)

Proteinasa KEM Science, Gibbstown, WV, Cat. 24568-2 (100 mg)Acetato de sodioCloruro de sodioEDTA de sodio (Na2EDTA)Dodecilsulfato de sodio (SDS 10%)Digene Diagnostics, Inc, Cat. 3400-1016Buffer Tris EDTA, pH 8.0PreparaciónBuffer lisisNH4Cl 8.29 g f.c. [155 mM]KHCO3 1 g f.c. [10 mM]Na2EDTA 0.034 g or 200 l EDTA 0.5 M f.c. [0.1mM]Llenar a 1000 ml con agua destilada

Ajustar pH 7.4 con 1 M HCl o NaOH por cada usoCloroformo/Alcohol isoamílico 24:1Cloroformo 24 mlAlcohol isoamílico 1 mlBuffer SENaCl 4.39 g f.c. [75 mM]Na2EDTA 8.41 g o 50 ml EDTA 0.5 M f.c. [25 mM]Llenar a 1000 ml con agua destiladaAjustar pH 8.0 con 1 M NaOH por cada usoAcetato de sodio3 M acetato de sodio 246 g/LAjustar pH 5.2 con CH3COOHProteinasa K (10mg/ml)Disolver 100 mg de Proteinasa K en 10 ml de TE por 30 min a la temperatura del cuartoAlicuote y almacene a –20°CProcedimiento1. A 10 ml de sangre entera (EDTA, heparina, citrato) añada 30 ml de buffer lisis, agite suavemente, incube por 30 min en hielo, y centrifugue a 1200 rpm por 10 min a 4° C.2. Remueva el supernadante (sangre de desecho), añada 10 ml de buffer lisis, resuspenda el emplacado, y centrifugue por 10 min a 4°C (1200 rpm).3. Remueva el supernadante (sangre de desecho), añada ml de buffer SE, resuspenda el emplacado, y centrifugue por 10 min a 4°C (1200 rpm).4. Remueva el supernadante (sangre de desecho).(Es posible almacenar el emplacado a -80°C. Para hacerlo, añada 1 ml de buffer SE y resuspenda el emplacado. Use un criotubo y centrifugue a 1200 rpm por 10 min a 4°C. Remueva el supernadante y congele el emplacado.)Añada 5 ml de buffer SE y resuspenda el emplacado, añada 40l proteinasa K (10 mg/ml) y 250 l 20% SDS, agite suavemente, e incube por la noche a 37°C en un baño de agua.5. Añada 5 ml de buffer SE y 10 ml de fenol, agite a mano por 10 min, y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C.6. Transfiera el supernadante a un nuevo tubo, añada 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), agite a mano por 10 min, y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C.7. De nuevo transfiera el supernadante a un tubo nuevo, añada 10 ml de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), agite a mano por 10 min, y centrifugue a 3000 rpm por 5 min a 10°C.8. Transfiera el supernadante a un tuboe nuevo, añada 300 μl de acetato de sodio 3 M (pH5.2) y 10 ml de isopropanol, agite suavemente hasta que el DNA sea precipitado, use una pipeta de vidrio, haga un gancho sobre un mechero bunsen y capture el DNA.9. Lave el DNA en etanol al 70% y disuelva el DNA en 0.5-1 ml de buffer TE por la noche a 4°C en un agitador rotativo. (Si el DNA no se disuelve déjelo más tiempo a 4°C en el agitador rotativo).

10. Mida la concentración de DNA en un espectrofotómetro (Pharmacia,GeneQuant) y corra 200 ng en un 1% gel de agarosa.

Preparación de DNA desde Células LinfoblastoideasReactivosCloroformoMallinckrodt, Cat. 4440Etanol, absolutoAlcohol isoamílicoSigma, Cat. I-3643Buffer fenolGibco BRL, Cat. 15513-039Buffer fosfato salino (PBS), 1XGibco BRL, Cat. 10010-023Proteinasa KGibco BRL, Cat. 24568-2Acetato de sodio, 3 M, pH 5.2Dodecilsulfato de sodio (SDS), 10%Buffer TAEBio Whittaker, Cat. 16-011VTris HCl, pH 8.0TrypsinGibco BRL, Cat. 25200-056Agua destiladaGibco BRL, Cat. 15230-170PreparaciónBuffer DNA1M Tris HCl, pH 8.0 100 ml0.5 M EDTA 100 mldH2O agua 300 mlCloroformo/Alcohol isoamílico 24:1Cloroformo 24 mlAlcohol isoamílico 1 ml

Procedimiento1. Tome el matraz con el cultivo celular y transfiera el contenido a un tubo de centrifuga de 15 o 50 ml.Centrifugue los cultivos celulares por 10 min a 1200 rpm. Lave el emplacado celular dos veces con 10 ml 1X PBS, centrifugando entre lavados.2. Remueva el supernadante, lave las células dos veces con 10 ml de buffer DNA y resuspenda en 10 ml de buffer DNA; incube por 10 min en hielo.3. Centrifugue por 10 min a 1200 rpm y remueva el supernadante. Añada 3 ml de buffer DNA; resuspenda el emplacado. Agregue 100 μl

de Proteinasa K (10 mg/ml) y 400 μl de 10% SDS. Agite suvemente e incube a 45°C en unbaño de agua por la noche.4. Añada 3.6 ml de fenol. Agite a mano por 10 min (RT); centrifugue por 10 min a 10°C a 3000 rpm.5. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 1.8 ml de fenol y 1.8 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), agite a mano por 10 min (RT); centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm).6. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 3.6 ml de cloroformo/alcohol isoamílico y agite a mano por 10 min (RT); centrifugue por 5 min a 10°C (3000 rpm).7. Transfiera el supernadante a un tubo nuevo de 50 ml. Añada 36 μl (1/10) de acetato de sodio 3 M (pH 5.2), mezlce suavemente, y agregue 3 volumenes de etanol al 100%; agite suavemente hasta que el DNA se precipite.8. Use una pipeta de vidrio estéril para transferir el DNA precipitado a un tubo de 30 ml de 70%. Coloque en un estante de invertido e invierta por 2 hr para enjuagar a fondo. Transfiera el DNA a un tubo eppendorf estéril.9. Centrifugue por 20 min a 14,000 rpm. Seque el emplacado en un speed vac por 5 min. Disuelva el DNA en 300 l agua estéril y coloque en un agitador rotativo por la noche a 4C.10. Mida la concentración de DNA y corra de 1-5 l (aproximadamente 200 ng)por electroforesis en gel de agarosa (1%) en buffer 1X TAE.

DNA desde sangre entera para PCR(from Higuchi, R. (1989) Amplifications 2: 1-3)

1. Obtenga de 65-100 µl de sangre por sangrado retroorbital con un tubo microcapilar heparinizado. Expulse la sangre inmediatamente a un tubo de microcentrifugación de 1.5 ml conteniendo 20 µl de 10 mM EDTA. Mezcle inmediatamente para prevenir la formación de coagulos. Almacene en hielo hasta el procesamiento.

2. Añada 200 µl de buffer lisis a cada tubo y arremoline para suspender uniformemente. 3. Microfugue 25 segundos a 16000xg para emplacar el nuclei. 4. Remueva y descarte el supernadante y repita los pasos del 2-4 dos veces más, o hasta que no

haya remanentes de hemoglobina. 5. Resuspenda el emplacado nuclear en 100 µl PBND con 60 µg/ml de proteinasa K e incube a 55 C

por 60 minutos (o por la noche si es conveniente). 6. Caliente las muestras a 97 C por 10 minutos para inactivar la proteinasa K. 7. Añada 1-5 µl de solución de DNA para 25 µl de reacción PCR.

Reactivos: 1) Buffer Lisis

0.32 M Sucrosa10mM Tris-HCl (pH 7.5)5 mM MgCl21% v/v Triton X-100

2) PBND (PCR Buffer con detergentes no iónicos)* 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl (pH 8.3) 2.5 mM MgCl2 0.1 mg/ml gelatina 0.45% (v/v) Nonidet P400.45% (v/v) Tween 20 Autoclave para esterilizar y disolver la gelatina Almacene en congelación

*Añada proteinasa K (60 µg/ml) inmediatamente previo a su uso)

Reacción típica de 25 µl PCR:1-5 µl DNA2.5 µl 10x Perkin Elmer buffer, 1.5 mM MgCl2 (final)2 µl 2.5 mM dNTP mezcla (2.5 mM each dNTP, 200 µM final)0.5 µl 20 µM forward primer (0.4 µM final)0.5 µl 20 µM reverse primer (0.4 µM final)0.1 µl Taq DNA polimerasa (puede decrecer a 0.05 µl)dH2O to 25 µl

Extracción de DNA desde sangre entera por silica gel.

Introducción

Aquí presentamos elnuevo simple y economic procedimiento en el cual el DNA puro es extraído de sangre entera en 15-20 min. La gran recuperación y la calidad del product son provistas por el uso del seleccionado adsorbente basado en video y la optimizada composición del lisado y de las soluciones de lavado.

El procedimiento tradicional para el aislamiento de DNA de sangre es laborioso y consumidor de tiempo. Comprende la separación de la fracción de células blancas de la sangre entera, lisis con detergente, digestion con proteinasa, extracción con fenol y precipitación del DNA con alcohol.

Siendo aplicado a pruebas humanas tal procedimiento complicado lleva al personal de laboratorio a un riesgo elevado de ser infectado por SIDA, hepatitis, citomegalovirus asi como otros virus potencialmente presentes en la sangre. Con respecto a esto un enfoque parece muy atractivo a tratar la sangre entera con un reactive tal que simultaneamente lise la sangre y desnaturalice las partículas virales. El uso del fuerte agente caotrópico GuSCN para lisar células humanas seguido de la adsorción de DNA en vidrio en polvo se describió por Boom (1) y Bush (2). Esta aproximación emplea la habilidad de los adsorbents basados en vidrio de ligar ácidos nucleicos en altas concentraciones de sal y liberar a bajas.

La gran variedad de adsorbentes de vidrio se ha reportado los últimos años para ser usados en la extracción de DNA desde varias fuentes, conteniendo ácidos nucleicos. Para referencia, el aislamiento de fragmentos de DNA de gel de agarosa (4), DNA plásmido de E.coli (3) y DNa genómico de células eucariótidas o procariótidas (1) podría ser traida. Sin embargo, la sangre entera representa una cierta dificultad para la extracción de DNA inmediata debido a la presencia de grandes cantidades de protein en la muestra. Asi, fue la razón de que extractos de DNA aparecieron contaminados por material rojo, inhibiendo la amplificación de PCR, cuando intentamos aplicar procedimientos de aislamiento de DNA basados en vidrio disponible directamente a la sangre entera.

Sin embargo, desarrollar un aparato automatizado para la extracción de DNA preferimos el concepto biomecanico basado en vidrio, que permitio la aplicación del procedimiento entero en un tubo. Parámetro optimizados del procedimiento, composición mejorada de las soluciones de lavado junto con la nueva selección de

adsorbente de vidrio resulto en un nuevo corto y económico protocolo el cual provee DNA de perfecta calidad para reacciones enzimáticas y análisis PCR.

Reactivos

La composición de la solución de guanidina fue: 6 M GuSCN, 20 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 6.5), 40 g/l Triton X-100 y 10 g/l DTT.

La mezcla ligadora fue preparada por resuspendido de 4 g de silica gel (Aldrich, #28,851-9) en 100 ml de solución de guanidina.

El lavado de propanol contenido de 25% iso-propanol, 25% etanol, 100 mM NaCl y 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). todos los reactivos pueden ser almacenados a la temperatura del cuarto.

Procedimiento

1. Mezcle en un tubo de minicentrifugación de 2.2 ml 0.5 ml de sangre entera (conteniendo 50 mM de EDTA como anticoagulante) con 1.0 ml de mezcla ligadora.

2. Incube a la temperatura del cuarto por 3 min. 3. Colecte silica gel por giro corto (3 seg, 5000 g). 4. Resuspenda el emplacado en 1.0 ml de solución de guanidina por

arremolinamiento. 5. Peletice el adsorbente por giro corto (a 5000 g). 6. Repita el lavado de la silica gel con la solución de guanidina. 7. Después, lave la silica gel con propanol de lavado (dos veces) y etanol puro (una

vez) de la misma forma. 8. Remueva a fondo el etanol y seque la silica gel a vacío aplicando calor. 9. Resuspenda la silica gel en 100 ul de buffer TE. Eluya DNA a 65oC por 3 min. 10. Resuspenda mezcla otra vez, centrifugue por 10 seg, tome el supernadante.

Tiempo, producto y calidad

El tiempo total del procedimiento es 15-20 minutos. El producto de DNA en el procedimiento es rutinariamente 40 ug por mililitro de sangre. El tamaño del DNA es mayor de 50 kb. La calidad del DNA provee una confiable amplificación de PCR y restricción enzimática. Las muestras pueden ser almacenadas a temperatura del cuarto por meses sin problema de degradación. La ausencia de nucleasas es provista por la incubación por la noche del DNA a 37oC en presencia de 10 mM MgCl2.

Parámetros del procedimiento

Los siguientes nuevos elementos han sido introducidos en el procedimiento con el fin de proveer una maxima productividad y calidad de DNA y eliminar de contaminantes el producto:

1. La silica gel Aldrich (#28,851-9) fue seleccionada como resultado de pruebas comparativas de adsorbentes basados en vidrio comerciales disponibles.

2. La sal caotrópica de tiocianato de guanidina fue usada en combinación con el detergente no iónico Triton X-100 a 4% de concentración y el agente antioxidante DTT a 1% de concentración en solución de guanidina.

3. Iso-propanol y NaCl fueron incluidos en la composición de la solcuón del alcohol de lavado.

4. Los parámetros del procedimiento fueron sistematicamente optimizados para proveer los requerimientos dichos.