Presentado por:Dra. Irene A. Gómez Espinel

2006

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN

DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA CLÍNICA

El ADN y su duplicaciòn

Componentes del ADN:

Azúcar

Bases

Grupo fosfato

Azùcares

Bases nitrogenadas

Complementariedad de las bases

BASE NUCLEÓSIDO Nucleótidos

A

Adenina

desoxiadenosina dAMP dATP desoxiadenosín trifosfato

TTimina

desoxitimidina dTMP dTTP desoxitimidín trifosfato

G Guanina

desoxiguanisina dGMP dGTP desoxiguanosín trifosfato

C Citosina

desoxicitidina dCMP dCTP desoxicitidín trifosfato

UUracilo

Bases nitrogenadas

DUPLICACIÒN DEL ADN

APLICACIÓN

Tipificación En el Laboratorio de Biología Molecular del departamento de patología clínica del HU.

A partir de ADN obtenido de sangre periférica.

La tipificación de los genes HLA (HLA-A, HLA-B, HLA-DR).

Obtención de la muestra

EXTRACCIÓN DE ADN

ADN

Comprobación cualitativa de la presencia de ADN

Comprobación cualitativa de la presencia de ADN

Comprobación cuantitativa de la presencia y pureza del ADN

FORMULA:

Ng/µl de ADN = (D.O 260 nm)(Factor de dilución)(50)

Factor de dilución = volumen total de la celda (1005)/ volumen de muestra (5 µl) = 201

50 = factor para ADN de doble cadena

35 = factor para ADN de cadena sencilla

40 = factor para ARN

                                             

Reacciòn en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Técnica de laboratorio simple y rápida de amplificación del ADN que hace posible

obtener múltiples copias y la identificación de secuencias específicas de ADN por medio de ciclos repetitivos utilizando el termociclador

1983

Historia de la PCR•1983 Kary Mullis Inventa la PCR

•1985 Primera publicación científica

•1986 Cetus corparation y Perkin Elmer inician desarrollo de reactivos e instrumentos para PCR

•1988 Se publica el uso de la Taq para PCR (Saiki et al)

•1990-1993 Batalla de las compañías por los derechos de fabricación de reactivos.

•1993 Kary Mullis recibe el premio Nobel en Química.

Componentes de la PCR

- DNA molde concentración de 25-200 ngconcentración de 25-200 ng//l.l.

-Iniciadores. (oligonucleotidos, primers, Cebadores).

- dNTP´S. (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

- DNA Polimerasa termoestable. (Taq, Tli, Pfu)

- Reguladores (Mg+2)

- Ciclos de temperatura (Termociclador)

Termocicladores

PCR: pasos y ciclos

Pasos de la PCR

1.- Desnaturalización del DNA (95 0C)

Pasos de la PCR

2.- Hibridación del Iniciador (50-70 0C)- Alineamiento

Pasos de la PCR3.- Polimerización (72 0C)

Ciclos de la PCR

PCR

Termocicladores MJ Research

PTC-100

OpticonTetrad

Dyad

Tipos de PCR

- PCR

- PCR-RFLP

- PCR in situ

- RTPCR

- PCR en tiempo real

-PCR POR GRUPOS ALÉLICOS

IDENTIFICACIÒN DE ALELOS DE IDENTIFICACIÒN DE ALELOS DE LOS GENES HLA-A y HLA-B EN LOS GENES HLA-A y HLA-B EN POBLACIÒN DEL NORESTE DE POBLACIÒN DEL NORESTE DE

MÈXICOMÈXICO

Sistema HLA

Los Antígenos Leucocitarios Humanos – HLA: • Son moléculas que se encuentran en los

leucocitos y en la superficie de casi todas las células de los tejidos de un individuo.

• Reconocen lo propio y lo ajeno

• Aseguran la inmunidad.

MoléculasComplejoMayor de Histocom (CMH)

Clase I y Clase II

Sistema HLA• Transmitidas de padres a hijos

• También denominado de Histocompatibilidad

• Existen tres clases de antìgenos HLA I, II, III

• Existen tres "lugares estratégicos": HLA-A, HLA-B y HLA-DR

MoléculasComplejoMayor de Histocom (CMH)

Clase I y Clase II

Cromosoma No. 6

Sistema HLA

• El tipo de antígeno presente en A, B y DR es lo que determina la posibilidad de aceptación del tejido de un donante por el organismo de un receptor.

• Para que dos personas sean compatibles, los antígenos presentes en cada uno de los tres lugares deben ser idénticos.

• Análisis del ADN en sangre.

Evoluciòn de los alelos

Clase I A B C E F G H J K L Total

266 511 128 6 1 15 0 0 0 0 927

Clase II DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 DMA DMB DOA DOB

3 403 23 53 20 101 4 6 8 8 629

TOTAL 2532

Alelos de HLA identificados al 2006

Genética

• Los genes del Sistema HLA se heredan siempre en bloque.

• Cada bloque se denomina haplotipo.

• El padre aporta un haplotipo (=mitad del genotipo) y la madre otro, dando origen al genotipo, perfil genético propio o individualidad del nuevo ser.

GenéticaSistema HLA

Padre Madre

Haplotipo a Haplotipo b Haplotipo c Haplotipo d

Hijos

Combinación 1 Combinación 2 Combinación 3 Combinación 4

Genotipo a-c Genotipo a-d Genotipo b-c Genotipo b-d

Genética

bcc

d bd

ac

ad

25 % ac, 25% ad, 25% bc, 25% bd

25% de posibilidades de coincidir con un hermano

a b

Gen de HLA

PCR

ELECTROFORÈSIS

Es el movimiento de partículas eléctricamente cargadas, a través de un gas, líquido y en soportes sólidos o semisólidos (geles), como resultado de un campo eléctrico formado entre los electrodos sumergidos en el medio acuoso.

Corrimiento electroforético

MPMMPM

EXON 2

EXON 3Cátodo

Ánodo

Corrimiento del gel

Carril de ejemplo

Marco de

plástico

Apilado del gel

Revelado de los geles

• Pasos a seguir:

1.- Solución fijadora 10´

2.- Colorante AgNO3 5´

3.- Lavar de 2 a 3 veces con H2O.

4.- Solución reveladora.

5.- Solución fijadora

Estos se realizan observando el DNA teñido con bromuro de etidio en un gel de agarosa.

Interpretación de resultados.

Interpretación de resultados.Con Nitrato de plata

Enfermedades asociadas a genes HLA

Espondilitis anquilosante HLA-B27

Síndrome de Reiter HLA-B27

Enfermedad celìaca y hepatitis crónica activa HLA-B8

Diabetes tipo 1 HLA-DR3 y DR4.

Artritis reumatoide con HLA-DR4.

Esclerosis múltiple HLA-DR2.

VENTAJAS ESTUDIO DE ADN  1.    Se puede detectar una mayor información que con la serología 2.    Los resultados pueden guardarse indefinidamente 3.    Se pueden identificar todos los componentes del sistema HLA 4.    más fiable en cuanto a la identificación de cada individuo. 5.    Más exacto ya que se eliminan reacciones cruzadas6.    Rapidez en los resultados.

Puntos críticos en la técnica de PCR

  1. Riesgo de contaminación:

• ADN de la muestra• Moléculas de ADN previamente amplificadas

2. Alto costo de los reactivos y equipo3. Espacio físico específico

Secuenciación automática

Secuenciaciòn de ADN

GRACIAS

Cromosoma 6