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METODOS MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN
DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES POR INJERTO
PARA LA CERTIFICACIÓN DE
PLANTAS CÍTRICAS
EN VENEZUELA.
Una propuesta para el intercambio de ideas.
Inv. Ezequiel A. Rangel Aranguren
INIA-CENIAP, Unidad de Protección Vegetal,
Laboratorio de Virología Vegetal
1) Selección o introducción. Producción y calidad, según
preferencias de la población, o requerimientos de la industria.
2) Saneamiento (termoterapia , cultivo de ápices) y verificación
mediante indización biológica y/o detección de patógenos
por métodos serológicos y/o moleculares.
3) Certificación (fidelidad al tipo, producción, calidad).
Establecimiento de categorías de árboles (Bloques de
Fundación, Bloques de árboles Registrados, Bloques de
propagación), plantas certificadas.
PRODUCIR PLANTAS CERTIFICADAS PARA
CUBRIR LA DEMANDA TRADICIONAL IMPLICA:
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
La certificación fitosanitaria y las medidas de cuarentena
están orientadas a patógenos específicos.
En el caso de cítricos en Venezuela, inicialmente: CTV, CPsV,
CEVd, CCaVd, otros viroides.
Se propone incluir otros patógenos cuarentenarios (ej:
Candidatus liberibacter asiaticum, C. liberibacter africanus, C.
liberibacter americanus, causantes de Huanglongbing (HLB);
Xillella fastidiosa causante de la clorosis variegada de los
cítricos), debido a su presencia en Sud América.
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
Diversidad biológica de patógenos está “parcialmente
caracterizada”. Proceso dinámico, modulado por las fuerzas
evolutivas. Cualquier método, (aún validado) está sujeto a
revisión para actualizar su idoneidad (evitar escapes).
Es deseable que los métodos a emplear sean validados por
establecimiento de valores predictivos aceptables a los efectos
de la certificación (política de calidad).
No existe un rasgo común a todos los virus u otros patógenos
que pueda ser usado como diana para la detección universal
(en sentido amplio) en un solo ensayo.
Aunque no existe un método “perfecto” para la detección de
cualquier patógeno, debe existir, o existe al menos un método
de referencia o “gold standard” para cada caso estudiado.
Algunos tienen potencial para detectar una gama de virus de
plantas o aislados dentro de una especie…(otros representan el
estado del arte en detección)
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
-ELISA
-ARNdc.
-Sondas universales, polisondas.
-amplificación isoterma
-RT-PCR multiplex
-RT-PCR cuantitativa (a tiempo real)
-Macro y micromatrices de baja y alta densidad
-Metagenómica y pirosecuenciación (menor sesgo)
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
El método mas sensible (PCR cuantitativa, PCR a tiempo
real) no ha evolucionado aún para su aplicación a gran
escala.
ELISA aún es el método mas empleado, aunque no el mas
sensible, su aplicación combinada con cualquier otro método
confirma el resultado.
El método mas moderno (pirosecuenciación + metagenómica),
requiere aún considerable trabajo y manipulación de la
muestra antes de efectuar la amplificación –secuenciación.
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
La hibridación de ácidos nucleicos (ARN) con ribosondas ,
es una opción factible:
* Mayor sensibilidad que ELISA
* Mayor escalabilidad que PCR cuantitativa y micromatrices
* Menor costo que PCR cuantitativa, micromatrices y
pirosecuenciación
* Mayor facilidad de proceso
* Diseño de sondas ajustable al espectro de detección
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
La hibridación de ácidos nucleicos (ARN) con ribosondas ,
es una opción factible:
* Las condiciones de reacción pueden variar el
espectro de detección de la molécula diana.
* Menor tiempo de ejecución de ensayo
* Apropiada para el actual escenario en el cual la
población organizada se incorpora al proceso
de producción artesanal y requiere acompañamiento.
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
La hibridación de ácidos nucleicos (ARN) con ribosondas ,
es una opción factible:
La producción artesanal de semilla no está reñida con
la adopción de políticas de el control de calidad , y es coherente
con el cumplimiento de la Ley de Salud Integral (Artículo 10)
DECRETO CON RANGO, VALOR Y FUERZA DE LEY
DE SALUD AGRICOLA INTEGRAL
TITULO II
DE LA SALUD AGRICOLA INTEGRAL
CAPITULO I
DISPOSICIONES GENERALES
Competencias
Artículo 10. Entre otros aspectos establece que “El Ejecutivo Nacional, a
través de sus órganos y entes competentes, es responsable de la organización,
coordinación, ejecución, seguimiento, supervisión y evaluación de todas las actividades
relacionadas con la prevención, protección, control zoosanitario y fitosanitario,
la epidemiología y vigilancia fitosanitaria … la cuarentena animal y vegetal… la
Red Nacional de Laboratorios de Diagnóstico Zoosanitario y Fitosanitario…”
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
La hibridación de ácidos nucleicos (ARN) con ribosondas ,
es una opción factible (respecto a los patógenos considerados):
Se dispone de suficiente información sobre la diversidad
genética de CTV, CPsV y de los viroides de cítricos, así como de
la estructura, organización y función del genoma de estos
patógenos en poblaciones caracterizadas alrededor del mundo.
Esto facilita el trabajo que debe realizarse en Venezuela para el
desarrollo de métodos moleculares de producción nacional..
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
Algunos métodos empleados en Venezuela para la detección
de patógenos en cítricos, son importados y funcionan bien
(p.ej. estuche de ELISA con anticuerpos monoclonales
3CA5+3DF1 para detectar CTV).
No hay experiencias sistemáticas ni resultados consistentes
para la detección de CPsV con diferentes estuches de ELISA
basados en diversas combinaciones y tipos de anticuerpos .
La opción de estuches de ELISA para la detección de viroides
en cítricos no es posible.
DETECCIÓN DE PATÓGENOS TRANSMISIBLES
POR INJERTO MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES
CON FINES DE CERTIFICACIÓN
La amplia referencia al uso de métodos de fácil aplicación
y escalabilidad no intenta excluir la opción del uso de métodos
de alta sensibilidad y sofisticación.
Ofrece una alternativa de aplicabilidad “a corto plazo” con alto
impacto potencial en amplias zonas de la geografía nacional
y posibilita adelantar acciones compatibles con la certificación
hasta tanto se desarrollen métodos que ofrezcan el máximo
nivel de fiabilidad para su incorporación en el sistema de gestión
de calidad fitosanitaria de la certificación de cítricos.