Práctica N° 14

DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINA Y SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES

I. INTRODUCCIÓN

Los riñones forman la orina mediante tres procesos: la filtración glomerular, reabsorción tubular y secreción tubular. Durante estas etapas la orina en formación adquiere diversas concentraciones y solutos que difieren con la orina que se excreta. En la orina excretada de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares debido a que en el borde en cepillo de las células tubulares proximales se reabsorbe (reabsorción tubular) la glucosa que se filtra en el glomérulo renal (filtración glomerular). Este mecanismo se basa en el transporte activo secundario que produce el gradiente de concentración de Na+. En el epitelio de las células tubulares proximales existen dos proteínas cotransportadoras de glucosa y sodio (SGLT2 y SGLT1) que utilizando la energía del gradiente de Na+ llevan glucosa al citoplasma celular en contra de un gradiente de concentración. Luego la glucosa difunde fuera de la célula por el lado basolateral a través de transportadores de glucosa GLUT2 y GLUT1 a favor del gradiente de concentración.

Sin embargo, en distintas afecciones existe una alteración de la capacidad de la reabsorción tubular de la glucosa lo que produce que se excrete este carbohidrato en la orina, lo que se conoce como glucosuria. Este fenómeno es el signo característico de la diabetes tanto tipo I como tipo II. Se produce por el fallo de la regulación de la glucemia por parte de la insulina que conlleva a aumento de esta. Ante este hecho, la reabsorción tubular absorbe una cantidad mayor de glucosa de la que en estado basal absorbe; sin embargo, existe un límite. Este último es de aproximadamente 10mmol/L de glucosa en sangre o de 180 mg/dl. Por lo tanto, la valoración de la presencia de glucosa urinaria permite descartar patologías en el organismo.

Por otro lado, en la orina, además de glucosa, puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar:

- Otros azúcares reductores: lactosa, fructuosa, galactosa y pentosas.

- Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico, creatinina, ácido úrico, ácido glucorónico, ácido ascórbico.

- Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral, formaldehído, etc.

Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina, pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico.

La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático), de uso generalizado en clínica.A pH 7, la glucosa está presente en solución en forma de hemiacetal cíclico, siendo un 63,6% β-D-glucopiranosa y un 36,4% α-D-glucopiranosa (la proporción de moléculas lineales y de furanosa es despreciable). La glucosa oxidasa se une específicamente a la β-D-glucopiranosa y no interacciona con α-D-glucopiranosa. Es capaz de oxidar toda la glucosa en la solución, dado que el equilibrio entre los anómeros α y β es conducido hacia la forma β conforme ésta va siendo consumida en la reacción, dando como productos D-glucono-1,5-lactona y iones H+. Este último interacciona con O2 produciendo H2O2. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa produce O – tolidinaLa prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno, por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorónico más peróxido de hidrógeno. Este, en presencia de peroxidasa oxida al indicador 0-tolidina (de color azul) más agua. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict.

II. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOSReactivos a utilizar:

Reactivo de Benedict. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas

(Glucocinta Lilly).Procedimiento: Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el

reactivo de Benedict. o Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. o Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el

tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo.

o Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo.

o Agregar orina problema: 5 gotas. o Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer

al fuego directo hasta ebullición por 1 min. o Observar si hay cambio de color y precipitado. Si

aparece un precipitado de color rojo ladrillo, la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras.

Observamos la formación del precipitado rojo ladrillo (Orina problema)

Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras, realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina.

No observamos la formación del precipitado rojo ladrillo (orina de compañero)

Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Procedimiento:

o Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5- 10 ml.

o Observar si a los 60 segundos, después de humedecida la cinta, adquiere o no color azul.

o Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa.

No realizamos este procedimiento por falta de la Glucocinta

III. CUESTIONARIO

1. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora, incluida la glucosa.

El reactivo de Benedict cualitativo es una disolución alcalina de ion cúprico, de color azul intenso. Se prepara de la siguiente forma: en un matraz de un litro se introducen 17,4 g de sulfato cúprico cristalino, 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio anhidro. Se van disolviendo con agua hasta completar la disolución a un litro. En un tubo de ensayo se vierten 5 ml del reactivo de Benedict y se calienta a ebullición. No debe cambiar el color azul. Se añaden 8 gotas de orina que se quiere estudiar y se hierve un minuto. Una turbidez verde indica la presencia de 0,1 a 0,3% de azúcar reductor y un precipitado rojo naranja indica que la concentración de azúcar supera el 1,5%.

2. ¿Qué resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina, primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa?

Si solo se tratase la muestra con el reactivo de Benedict podría erróneamente diagnosticarse glucosuria debido a que esta técnica es inespecífica para cualquier sustancia reductora. Sin embargo, mediante el método de la glucosa oxidasa el cual es específico se puede corregir la limitación del reactivo de Benedict.

3. ¿Qué presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo, al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa, da negativo?

La existencia de otros azúcares reductores (lactosa, fructuosa, galactosa y pentosas), o compuestos orgánicos (ácido homogentísico, creatinina, ácido úrico, ácido glucorónico, ácido ascórbico) o drogas y sus metabolitos.

4. Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas, en relación a la glicemia del paciente podría plantear?

Principalmente diabetes mellitusSecundariamente:- Gota, fiebres eruptivas, el cólera, la malaria, la cirrosis

hepática y enfermedades orgánicas del sistema nervioso.- Shock emocional- Emocional

- Ciertas drogas tóxicas pueden dar lugar a esta condición: morfina, atropina, ácido clórico, cianhídrico y el alcohol.

5. Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para

la detección de glucosuria.

Las tiras de glucosa oxidasa contienen mediante impregnación del área de prueba una mezcla de glucosa oxidasa, peroxidasa, cromógeno y solución amortiguadora para producir una reacción enzimática secuencial doble. En el primer paso, la glucosa oxidasa cataliza una reacción entre la glucosa y el aire ambiental para producir ácido glucónico y peróxido. En el segundo paso, la peroxidasa cataliza la reacción entre peróxido y cromógeno para formar un compuesto oxidado coloreado que representa la presencia de glucosa.

Luego el cromógeno oxidado coloreado se cuantifica mediante espectrofotometría.

6. Explique que es el umbral renal de la glucosa.Es la capacidad máxima de la reabsorción tubular para absorber el 100% de la glucosa que se filtra en el proceso de filtración glomerular del riñón. Esto representa una concentración de 10mmol/L de glucosa en sangre.

IV. Bibliografía- GUYTON, C.G. and HALL, J.E. Tratado de Fisiología Médica. 12ª

Edición. Elsevier, 2011.- José María Macarulla, Félix M. Goñi. Bioquímica humana: curso

básico. 2° Edición. Reverte, 1994- Susan King Strasinger, Marjorie Schaub Di Lorenzo. Análisis de

orina y de los líquidos corporales. 5° Edición. Ed. Médica Panamericana, 2010.

- Páginas web:http://www.salud.es/glucosuria/causas-glucosuria