practica 9 analisis microbiologico de mariscos

UNFV/FIIS AN LISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

PRACTICA N 9

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

I.INTRODUCCIN

Alteraciones en la manipulacin almacenamiento de mariscos

1.1 Cambios bioqumicas

Las modificaciones sufridas por el marisco desde su captura hasta que

llega al consumidor tienen aspectos similares a las del pescado, pero

difieren notablemente en otras. El envejecimiento y el deterioro de los

tejidos ocurren de modo parecido al del pescado, y se ve influido por

idnticos factores. La escasa cantidad de glcidos en los crustceos y la

riqueza en enzimas proteoliicos determinan una leve cada del pH y una

rpida alterabilidad, con liberacin de compuestos nitrogena dos

voltiles. Algunos enzimas oxidan pigmentos, que dan lugar a un

ennegrecimiento de la cabeza conocido como melanosis. En los

moluscos, la cifra de glcidos permite un mantenimiento mas prolongado

de su buen estado.

1.2 Derivados de los mariscos

Los productos derivados de los mariscos que recoge el Cdigo

Alimentario Espaol son: semiconservas, conservas, sopas de mariscos

y bullabesas y platos cocinados.

Tienen caractersticas parecidas a las de los derivados del pescado,

pero lgicamente la base la constituyen los crustceos y los moluscos.

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Semiconservas.-Son productos a base de crustceos y de moluscos sometidos a un tratamiento apropiado y mantenidos en

recipientes impermeables al agua a presin normal. Las

semiconservas deben almacenarse en frigorfico y su conservacin

es limitada en el tiempo. Pueden darse como mariscos enteros o

troceados y suelen llevar un lquido de cobertura, que puede ser

aceite vegetal, vinagre o la mezcla de ambos en diferentes

proporciones y con distintos condimentos.

Conservas.- Son aquellos productos hechos (OR moluscos o crustceos, con o sin adicin de sustancias autorizadas, contenidos

en envases hermticamente cerrados y tratados exclusivamente por

el vapor, para asegurar su conservacin.

1.3 Alteraciones en e almacenamiento

El marisco congelado almacenado sufre, al igual que el pescado,

procesos que cambian su composicin lipidia. Las grasas modificadas

con las protenas, dando lugar a complejos lipoproteicos y a compuestos

de molcula pequea. Aparecen pigmentos castao-rojizos, equivalentes

a la lipofucsina, que se utilizan para determinar la edad de los

crustceos marinos. La interaccin lipdico-proteica retarda la oxidacin

de las grasas durante e almacenamiento.

En los mariscos enlatados y sometidos a la accin del calor se precisa

realizar una serie de tareas. Las gambas y otros crustceos, despus

de descongeladas, se lavan, separado los ejemplares rotos, decolorados

o alterados y los residuos extraos. Ms tarde, se les quita la cabeza y

se pelan; posteriormente, se escaldan en salmuera hirviente. Estas

gambas precocidas se lavan de nuevo, se revisan, se categorizan y se

envasan a mano o a mquina.GUIA DE LABORATORIO Biol. Ms. C. Alicia Decheco EgusquizaMICROBIOLOGIA II

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Por ltimo, se aade salmuera, aceite o salsa y se cierran los envases.

En cuanto a las almejas y otros moluscos, en primer lugar se lavan para

que desaparezca la arena y el barro; luego, se precuecen al vapor. Mas

tarde, se extraen de las conchas a mano o a maquina y se cortan por un

lado para eliminar completamente la arena o el barro que pudiera

quedar. Tras un nuevo lavado se extirpan el sifn, las paredes laterales

del cuerpo y el estmago, procediendo, por ltimo, al envasado y a la

adicin de agua, salmuera, aceite, jugo o salsa.

Como ocurre en el pescado, tras someter a gambas, langostas y

cangrejos a la accin del calor, pueden aparecer manchas negras en la

superficie por el depsito de sulfuro de hierro.

2. Microbiologa de los mariscos

2.1 Caractersticas microbiolgicas

La presente de bacterias en la superficie de los crustceos es similar a la

del pescado. En el caso (de los moluscos, la contaminacin se reduce

ostensiblemente cuando se someten a depuracin en tanques con agua

marina limpia circulante. La posible existencia de grmenes patgenos

se corresponde con el lugar donde viven y con la forma de alimentarse,

caracterizada, en los moluscos bivalvos, por la filtracin de muchos litros

de agua cada da. Los microorganismos ms ubicuos son Salmonella,

Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Clostridium perfringens y

virus.


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2.2 Cambios microbiolgicos

Las alteraciones microbiolgicas que sufren los mariscos constituyen,

en muchos casos, graves problemas de salud pblica. Los crustceos se

suelen capturar en regiones alejadas de la costa, por lo que no suelen

portar grmenes patgenos. No obstante, se ha extendido su cultivo en

viveros de regiones costeras, en las que el peligro de contaminacin se

multiplica; de hecho, se han descrito importantes brotes de intoxicacin

por Vibrio parahaemolyticus, procedente de residuos terrestres, en

mariscos cocidos y recontaminados con posterioridad.

En los moluscos con alteraciones de detecta un crecimiento de bacterias

Gram negativas proteolticas: Pseudomonas y Vibrio, y sacarolticas:

Lactobacillus. Las primeras generan aminas y amoniaco; las segundas

reducen el pH. Tomar ciertos moluscos bivalvos crudos puede ocasionar

toxiinfecciones graves por Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,

Escherichia coli, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,

Staphylococcus aureus enterotoxignico, Vibrio parahaemolyticus y

virus. El consumo de otras alteradas puede acarrear cuadros de fiebres

tficas, paratficas, hepatitis vricas. Los mejillones crudos, mal cocinados

o recontaminados, pueden ser origen de fiebres tficas y de

salmonelosis.

Mencin aparte merece la contaminacin por biotoxinas marinas

fabricadas por los dinoflagelados presentes en el plancton. Algunos

biotoxinas afectan al sistema nervioso las neurotoxinas y otras, al tubo

digestivo enterotoxinas -. En determinadas circunstancias favorables,

los dinoflagelados ascienden hacia la superficie marina y se reproducen

rpidamente, dando lugar a coloraciones extraas, entre las que

predomina el rojo; este fenmeno se conoce como marca roja o purga

de mar. Los moluscos, en especial, los mejillones y las almejas, filtran

cada da grandes cantidades de agua y se alimentan de estos

organismos, y las toxinas se fijan al hepatopncreas o al sifn. Al ser GUIA DE LABORATORIO Biol. Ms. C. Alicia Decheco EgusquizaMICROBIOLOGIA II

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consumidos por el ser humano, sobreviene la intoxicacin que, en el

caso de la neurotoxina, puede ocasionar la muerte y en el de la

enterotoxina, provocar trastornos gastrointestinales.

2.3 Control microbiolgico de los mariscos

Las muestras de crustceos con caparazn se consiguen

desinfectando, su superficie con alcohol de 70C y, luego, se retiran

aspticamente con material estril. Si carecen de caparazn, la carne se

debe manipular tambin (le modo asptico con material estril).

Si se trata de moluscos se debe tomar un nmero suficiente (los

individuos para que el volumen de carne y de lquido intervalvar no sea

inferior a 0 ml.

Se deben limpiar concienzudamente a chorro y mediante un cepillo para

retirar todo tipo de sustancias extraas adheridas a las conchas como

algas, tierra, etc.

Tras un ligero flameado, las valvas se abren y recogen los cuerpos y el

lquido intervalvar sobre pro beta estril. Se aade diluyente hasta

obtener un dilucin 1:10 0; se puede utilizar como diluyente solucin

Ringer a 1/4 agua de triptona. Finalmente, la mezcla se tritura y

homogeneiza y se usa como solucin madre.

El protocolo de estudio microbiolgico en los mariscos es el siguiente:

Recuento de colonias aerobias revivificables.

Investigacin y recuento de Escherichia coli.

Investigacin y recuento de Enterobacteriaceae totales.

Investigacin de Salmonella y Shigella.


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Investigacin y recuento de Streptococcus aureus

enterotoxignico.

Investigacin y cuento de Streptococcus D. de Lancefield.

Investigacin de Vibrio paraharahaemolyticus

Investigacin de biotoxinas marinas hidrosolubles (PSP).

Investigacin de biotoxinas marinas liposolubles (DSP).

Investigacin de toxinas botulnicas.

Para la investigacin de toxinas marinas se puede recurrir a mtodos

biolgicos, inmunolgicos y qumicos. El bioensayo en ratn es el

Procedimiento oficial para determinar biotoxinas PSP, y es el mejor

mtodo de que se dispone. Se valora la posibilidad de sustituirlo por

algn otro mtodo, especialmente, fluoromtrico o HPLC. Para las

biotoxinas DSP se puede utilizar el bioensayo en ratn o HPLC.

ANLISIS MICROBIOLGICO DE MARISCOS

Preparacin de la muestra

Mariscos con valvas:

1. Recipiente con boca ancha con capacidad de 20 unidades de mariscos

con valvas aprox. 10 gr.

2. Recipiente con escurridero de agua.

3. Vaso de precipitacin con 500 ml. de capacidad.

4. Vaso de licuadora estril.

5. Escobilla dura.

6. Cuchillo estril

7. Cuchara estril

8. Servilleta estril.


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9. Balanza de capacidad no inferior a 2500 gr. y una sensibilidad de 0.1 gr.

10.Licuadora de 2 velocidades.

11. Alcohol etlico de 70%.

12.Solucin buffer de fosfato o agua de peptona el 01%.

13. Mechero.

14. Asa de siembra.

15. Tubo con cultivo puro.

16. Tubo con TSI.

17. Tubo con SIM.

18. Tubo con LIA.

19. Tubo con citrato.

PROCEDIMIENTO

1. Colocar 20 unidades de mariscos valvados en un recipiente de boca

ancha. Cepillar cada uno de ellos bajo el chorro de agua potable, con

especial atencin a las grietas y uniones de las valvas.

2. Colocar las muestras limpias en un recipiente con calador y dejar

escurrir el agua.

3. Lavar y desinfectar las manos con alcohol de 70%.

4. Colocar la muestra en la mano sobre una servilleta de papel limpia, de

tal forma que una de las partes convexos, descanse sobre la palma de la

mano.

5. Insertar el cuchillo en el punto de unin de las valvas. Cortar el msculo

de la valva superior, palanquear las valvas y dejar que el lquido caiga


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sobre el vaso de precipitados previamente tapados. Retirar la baada

superior y transferir la carne al vaso contenido el lquido valvar.

6. Pesar el vaso con la muestra extrada.

7. Transferir la muestra al vaso de la licuadora.

8. Adicionar una cantidad igual al peso de la muestra de solucin buffer de

fosfato o agua peptonada al 0.1%.

9. Homogenizar tomando las precauciones indicadas en preparacin y

dilucin de las muestras de alientos ( 2 ml de este, homogenizado

contienen 1 gr. de mariscos).

En caso de que el homogenizado resulte de consistencia pesada y difcil de

pipetear, adicionar 3 partes de diluyentes en peso de la muestra (4 ml., de

esta muestra contiene 1 gr de las muestras en examen). Corregir las

proporciones a ser tomadas para la siembra.

MEDIOS UTILIZADOS

CALDO AZIDA GLUCOSA

Art. Num 1590

Para ensayo previo orientativo de enterecocos y para enriquecimiento selectivo

de los mismos.

Este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de los

Estndar Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975).


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Forma de preparacin

La sodio-asida presenta en una concentracin que respeta al mximo a

los enterococos e inhibe notablemente a la flora gram-negativa que les puede

acompaar.

La utilizacin de sodio-azida como sustancia inhibidora selectiva de

bacterias gramnegativas se remonta a los trabajos de EDWARS (1933 1938)

y HARTMANN (1936) sobre el aislamiento del Str. Agalactiae, Ulteriormente,

MALLMANN (1940) y SNYDER aislamiento de enterococos a partir de aguas.

La demostracin de enterococos (Streptococcus faecalis, S. bovis y S.

Equinus) sirve como un indicador de contaminantes fecales, especialmente de

corrientes de agua, aguas residuales que contengan cloro y baos Yodo, en

todos los cuales pueden estar ya extinguidas en el momento de la

investigacin las bacterias coliformes menos resistentes, inclusive E. Coli.

Composicin (g/litro)

Peptona de casena 15.0; extracto de carne 4.8; D (+)-Glucosa 7.5;

Sodio cloruro 7.5; Sodio azida 0.2.

Preparacin

Disolver 35 g o 70 g por litro, distribuir y esterilizar autoclave. No recalentar.


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Empleo e interpretacin

Si la cantidad de producto a ensayar es pequea (hasta 1 ml, se incorpora en

el caldo de concentracin sencilla (35 g/litro) que queda as diluido a la

concentracin habitual.

Incubacin : desde 254 hasta 48 horas, a 37C.

La produccin de enturbamiento durante la incubacin (crecimiento)

permite sospechar la presencia de enterecocos. En este caso, y para su

confirmacin, se resiembra en Calco-purpura de bromocresol axida (MERCK,

Art. Num 30332). Si no se presenta turbidez alguna, puede desecharse con

seguridad la presencia de enterococos.

Agar ENDO-C

(Agar-fucsina-lactosa seg. ENDO, tipo)

ENDO-C Agar

Art. Num 4044

Medio de cultivo selectivo, para demostracin y aislamiento de E. Coli fecal y

coliformes en los ms diversos materiales.

Este medio de cultivo corresponde a lo prescrito en los Estndar

Methods for the Examination of Dairy Products (1967) y en los Estndar

Methods for the Examination odf Water and Wastewater (1975).


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Forma de actuacin

El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias gram positivas E. Coli

y coliformes utilizan lactosa con formacin de aldehdo y cido. Por otra parte,

el aldehdo libera fucsina a partir de la combinacin fucsina-sulfito, lo cual da

lugar a la coloracin roja de las colonias. En el caso de E. Coli, esta reaccin

es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar y por este motivo, confiere a

dichas colonias un brillo metlico estable, de reflejo verde (tpico de la fucsina

cristalizada).

Composicin (g/litro)

Peptona de carne 10.0; di-Potadio hidrogenofosfato 3.5; Lactosa 10.0

Sodio sulfito, anhidro 2.5; Fucsina 0.4; Agar agar 12.5.

Preparacin

Disolver 39 g/litro, esterilizar al autoclave y verter en placas. Si el medio

de cultivo muestra, tras la solidificacin, un tono rojo demasiado intenso puede

eliminarse dicho exceso de color aadiendo algunas gotas (hasta 1 ml/litro,

como mximo) de una solucin, anhdrido, MERCK, Art. Num 6657, e hirviendo

el conjunto a continuacin.

Ph 7.4 0.2

Por efecto del oxigeno atmosfrico y debido a la consiguiente oxidacin

del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y


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por lo tanto, inservible. Incluso conservado en la oscuridad y a la temperatura

de nevera, solo es utilizable durante pocos das.

Empleo e interpretacin

Sembrar las placas en estra por agotamiento

Incubacin: 24 horas, a 37C.

Colonias MicroorganismosRojas

Rojas con brillo metlico

Estable

Rojas hasta rojizas, semi-esfricas

mucosas

Lactosa positivos

E. coli

Enterobacter aerogenes,

Klesbsiella y tros.Incoloras, claras Lactosa (-)


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ANLISIS DE LA MUESTRA:

1. Preparar las diluciones decimales, siguiendo una de las tcnicas

descritas en preparacin y dilucin de las muestras de alimentos, hasta la

dilucin 10-4 o 10-5 si es necesario.

2. Efectuar las determinaciones microbiolgicas de acuerdo al esquema de

trabajo y a la metodologa descrita.

3. Reportar los resultados por gramo de muestra.

Pruebas Bioqumicas

La lectura en placa no es suficiente para poder identificar al (los)

microorganismos (s) en estudio, para ello emplearemos las pruebas

bioqumicas con las cuales podemos llegar a identificar el nombre del

espcimen cultivado.

Los medios de diferenciacin ms empleados en el laboratorio de

microbiologa para la identificacin de bacterias son: el agar citrato de

Simmons, el medio de SIM, el agar hierro tres azucares (TSI) y el medio de

LIA.

Luego se proceder de la siguiente manera:

1. Flamear el asa de siembra

2. Tomar una muestra del cultivo puro y sembrar en estra y por picadura en

los tubos con medios TSI, LIA y citrato. En el medio de SIM sembrar

nicamente por picadura.


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3. Incubar los tubos y hacer la lectura de los mismos a las 24 horas despus

de la siembra.

4. Realizar la prueba de indol aadiendo unas gotas de

dimetilaminobenzaldehido.

5. Realizar la prueba de la catalasa para lo cual aadir unas gotas de perxido

de hidrgeno sobre las colonias.


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CUESTIONARIOCUESTIONARIO

1. Explique la importancia de evitar contaminacin por Vibrio vulnigicus y

Salmonella en mariscos y pescados.

2. Parsitos que puedan ser transmitidos por alimentos marinos.

3. Explique como se realiza el recuento de mohos y levaduras en muestras de

alimentos marinos.

4. Explique la toma de muestras, preparacin de muestras y anlisis

microbiolgicos de los alimentos marinos.

5. Que microorganismos se pueden encontrar en el agua de mar, en las

lagunas y ros.

6. Busque en alguno recuento o Internet algn proyecto o trabajo de

investigacin relacionable a productos hidrobiologicos.

7. Cual es la finalidad del uso del medio TSI, que tipos de azucares participan

en este medio y a que microorganismos permite reconocer.

8. Cual es la finalidad del uso del medio de LIA, que reacciones nos permite

evaluar y que microorganismos nos permite identificar.

9. Que pruebas se pueden realizar en el medio citrato y que microorganismos

se pueden diferenciar con este medio.

10.Para que se emplea el medio de SIM, que microorganismos se pueden

reconocer con ste y como.


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11.Con que finalidad se realiza la prueba de la catalasa y la prueba del indol.


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