posibilidades de la - agilent.com · cuantitativa de cromatogramas de iones con masa exacta....

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Posibilidades de la

Espectrometría de

Masas y del software

de análisis estadístico

“Mass Profiler

Professional” en

Investigación Clínica

Espectrometría de Masas y

Bioinformática: una herramienta

esencial en los laboratorios

actuales de investigación

Biomédica

Isidre Masana

Especialista Productes LC/MS

Agilent Technologies

Divisió Biociència i Anàlisi Químic

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Posibilidades de la

Espectrometría de



“Mass Profiler

Professional” en


PROGRAMA:

1.- Introducción a la Espectrometría de Masas más Utilizada en Investigación.

2.- Flujos de Trabajo en Análisis Comparativos por Espectrometría de Masas.

3.- Concepto de Biología Integrada.

4.- Conclusiones.

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1.- Cuantificación y Perfilado de Compuestos Diana.

1A.- Análisis de un nº “limitado” de fármacos, metabolitos, péptidos, … con disponibilidad de patrones. Típica aplicación QqQ en MRM.

1B.- Perfilados masivos de un nº “ilimitado”/muy elevado de compuestos sin* disponibilidad de patrones (* La confirmación y cuantificación

de positivos si requerirá la disponibilidad de patrones).

2.- Análisis Comparativos: Correlaciones entre composición y propiedades de las poblaciones comparadas (enfermedades, pacientes clasificados, origen,…); descubrimiento biomarcadores,…

3.- Identificación de picos cromatográficos desconocidos.

Típicos Escenarios de Aplicación de las Técnicas de

LC/MS en Clínica y Toxicológia.

En LC/MS el equipo “ideal” dependerá del “escenario central” de trabajo

Típicas aplicaciones de TOF y Q-TOF (masa exacta)

BASE en investigación mediante MS (imprescindible en la no dirigida) Lab

ora

tori

os In

ve

sti

ga

ció

n

---

-

R

uti

na

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HPLC: todo tipo analitos GC: analitos volatilizables CE: analitos iónicos

Para poder ser detectadas

en MS las moléculas

necesitan ser ionizadas

Cromatografía

HPLC MS: QTOF

GC MS

Ejemplo Instrumentación MS: LC/MS-Q-TOF

JUAN

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Importancia de la Masa Exacta en Investigación: Selectividad

Cuantitativa de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina

IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da

Clenbuterol S/N = 14

Rango extracción típico Cuadrupolo

IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm

S/N = 102

LC/MS-TOF Agilent 6210

Exactitud

Masa (ppm)

Nº posibles

fórmulas

empíricas

Tecnología

165 ppm 209 QUAD/TRAP

10ppm 13

5 ppm 7

2 ppm 2 TOF /Q-TOF Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z

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Extraer IC con masa exacta es la clave para Comparar/

Cuantificar RELATIVAMENTE perfiles de muestras complejas

El área específica de este pico se utilizará en la cuantificación relativa

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Posibilidades de la

Espectrometría de



“Mass Profiler

Professional” en


PROGRAMA:




4.- Conclusiones.

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2 Tipos de Estudios Comparativos en Clínica: Genéricos y Específicos

Comparación de

Perfiles Genéricos del Metabol/Prote-oma /…..

(metabolitos, péptidos,…

conocidos + desconocidos)

Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo

espectral con masa exacta

Típico para Descubrimiento de

Nuevos Biomarcadores

LC/MS-QTOF

GC/MS-QTOF

LC/MS-QqQ

GC/MS-QqQ

Comparación de Perfiles Específicos (metab./pépt. concretos)

Se trabajará con MS (QTOF/QqQ) en modo

MS/MS o en MS en modo selectivo

Típico para Validación de Biomarcadores

Cambios en ciclos concretos del metabolismo

Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Comparativos de

Perfilado Genérico (típico p.e. en “Un-Targeted Metabolomics”)

Extraer automáticamente la información para cuantificar

relativamente MILES de compuestos desconocidos

Soft. Deconvolución: MFE

GC/MSD PCA

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Align, Normalize, Filtering, ANOVA,….

PCA

Modo MS

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Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass

Hunter Molecular Feature Extractor” para obtener por la

Masa Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados en la

Muestra Espectros Deconvolucionados

TIC IC’s 0

Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF

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MFE proporcionará para cada analito deconvolucionado

• Masa Exacta y Tiempo ret. ID

• Intensidad señal Cuantificar

Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de

Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)

Buscar Correlaciones entre Grupos de Complejos Datos Espectrales

Intensidad, Tr, Masa exacta

GC/MSD

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Align, Normalize, Filtering, ANOVA,….

PCA

Modo MS

Modo MS/MS

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Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras

Análisis

Estadístico

Admite Experimentos:

• Estudios simples (A vs. B)

• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….

• Clasificación (/ Autentificación) de muestras

Proporciona Muy Potentes Herramientas Estadísticas y de Visualización Comparación: • Filtrado simple (test de frecuencia)

• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)

• Análisis de Componentes Principales (PCA)

• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),

• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)

• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)

• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……

• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…)

• Permite exportar la lista de iones precursores para realizar MS/MS y confirmar la identificación de los metabolitos de interés con Q-TOF’s de Agilent.

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Página 12

Proyectos

Ensayos de Metabolómica/ Proteómica/ X-ómicas basados

en LC/MS, GC/MS, CE/MS

Platforma Multi-ómica: GeneSpring IB / MPP 12.5 Cambios de expresión reflejados directamente en las rutas

Ensayos Expresión Génica/ Transcriptomica basados en:

Microarrays, NGS, q-PCR

Enrichment Analysis on curated pathways and computationally – derived networks

Importación Genérica para equipos NO

Agilent: *.xls, *.xlsx, *.TXT or * .CSV files

Nexo unión experimentos multi–ómicos (p.e.transcriptomics/

metabolomics): Rutas Metabolicas

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A.-Electrospray Polaridad Positiva:

• Total metabolitos: 6747

• Filtrados (25% lineas celulares) : 3632

• Filtrados (p<0.005 FC>2.0) : 311

A B

• 22Rv1, LNCaP and VCaP: androgen responsive (prostate cancer),

• DU145 and PC3: androgen non-responsive (prostate cancer)

• RWPE (benign).

B.- Electrospray Polaridad Negativa:

• Total metabolitos: 2288

• Filtrados (25% lineas celulares) : 863

• Filtrados (p<0.005 FC>2.0) : 171

Permite predecir qué pacientes NO responderán al tratamiento

99.5% fiabilidad

Benignos

Responden tratamiento

NO Responden

Ejemplo Clasificación Pacientes Cancer de Prostata: Análisis de Componentes Principales (PCA) de metabolitos

significativamente alterados entre las 3 clases p<0.005 Fold Change >2.0

Benignos

Responden tratamiento

NO Responden tratamiento

1Cancer Center, Medical College of Georgia, Augusta, GA; 2Metabolomics Laboratory Agilent Technologies, Santa Clara, CA,….

Bases de Datos (PCD) y Bibliotecas de MS/MS (PCDL)

con Masa Exacta para Identificación y “Screenings”

Masivos por LC/MS-TOF/QTOF

Accurate Mass PCDBs and MS/MS

PCDLs METLIN Metabolite

PCDL 64.092 entries plus 8,712 MS/MS spectra for

2,286 metabolites

METLIN Metabolite

PCDB 64.092 entries

Forensics/Tox * PCDL

7,360 entries plus 8,263 MS/MS

spectra for 2,720 compounds

Forensics/Tox * PCD

7,360 entries

Pesticide PCD*

1,609 entries

Identificación y “Screenings” Masivos para aplicaciones

forenses/toxicológicas, seguridad alimentaria y

medioambiental, estudios metabolómicos,…..

*Kits de aplicaciones disponibles

Los TOF y QTOF facilitan mucho la ampliación del alcance del laboratorio (nº compuestos a monitorizar).

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Incluye:

680 metabolitos con T.Ret.

31.011 lípidos

Incluye

448 MS/MS de lípidos

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Abundancias Diferenciales de 3 Metabolitos de la Ruta de la Arginasa (Ciclo Urea) en Eritrocitos infectados por Malaria.

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15-10m

Rojo: Eritrocitos INFECTADOS

Azul: Eritrocitos NO INFECTADOS

Ver en que rutas metabólicas

están involucrados los

metabolitos relevantes del estudio

diferencial y cómo cambian.

Eritrocitos INFECTADOS // NO INFECTADOS

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2 Tipos de Estudios Metabolómicos: Genéricos y

Específicos

Comparación de Perfiles Genéricos del

Metaboloma (metabolitos conocidos

+ desconocidos)

Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo

espectral con masa exacta

Típico para Descubrimiento de

Nuevos Biomarcadores

Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos)

Se trabajará con QqQ/QTOF en modo

MS/MS o en MS (QTOF/TOF) en modo

selectivo (masa exacta)

Típico para Validación* de Biomarcadores

Cambios en ciclos concretos del metabolismo

*Se corroborarán los resultados de PCA con perfiles específicos de un elevado

nº de individuos.

LC/MS-QTOF

LC/MS-QqQ

16-9m

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UntargetTarget Discovery by “Pathway to Database

Tool”: PMDC

Convierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent “Personal Compound Database” (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS con masa exacta y finas ventanas de masa de extracción ):

• Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés de: Wikipaths, BioCyc, KEGG…

• Elimina metabolitos redundantes.

• Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos:

• CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura

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Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de

Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)

GC-QqQ

LC-QqQ

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Predicción Automática de Clases: Lab. R&D QC

Etapas: 1.-Se genera un modelo predictivo

(lab. I&D) mediante algoritmos de predicción de clases (mediante Mass Profiler Profesional “MPP” a partir de datos de Mass Hunter MH ):

– Partial Least Squares Discrimination – Naïve Bayes – Decision Tree – Support Vector Machine – Neural Network

2.-El modelo predictivo generado se aplica en laboratorios Control Calidad (GC/MS Q/ QqQ/QTOF –LC/MS TOF/QTOF/QqQ) para clasificar nuevas muestras automáticamente sin intervención del usuario (mediante SCP: “Sample Class Predictor”).

Acquisition Feature

Extraction SCP

Mo

delo

Report _____________

_______

__________

__________

Acquisition Feature

Extraction SCP

Mo

delo

Report _____________

_______

__________

__________

Acquisition Feature

Extraction SCP

Mo

delo

Report _____________

_______

__________

__________

Acquisition Feature

Extraction SCP

Mo

delo

Report _____________

_______

__________

__________

Acquisition Feature Extraction Chemometric

Analysis

Aplicación Automática Modelo via Scripting (QC lab)

Mo

delo

P

red

icti

vo

MPP MassHunter (MH) MassHunter (MH)

MassHunter (MH)

MassHunter (MH)

MassHunter (MH)

Desarrollo del Modelo (lab. R&D)

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Posibilidades de la

Espectrometría de



“Mass Profiler

Professional” en


PROGRAMA:




4.- Conclusiones.

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Concepto y Aportaciones

de la Biología Integrada

• La Integración de datos experimentales de diferentes –ómicas permitirá:

• Reducir el ruido debido a la enorme variabilidad de las muestras biológicas.

• Validar los resultados experimentales a través de una coherente interpretación

biológica de los cambios de expresión observados entre distintas las distintas

poblaciones de individuos/ tratamientos/ enfermedades/…. comparadas en el estudio.

• Alternativa a validación biológica: la validación mono-ómica de biomarcadores

requiere efectuarla con unos miles de individuos de cada población.

• Dificultad : Extrema complejidad y variabilidad entre individuos de los procesos biológicos:

• La inhibición de una ruta metabólica es habitual que genere la

activación de otras vías alternativas.

• Mutaciones, defectos en la transcripción, modificaciones postraduccionales,…..

• Todas las –omicas acaban influenciándose unas a otras.

• ….

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DNA RNA Protein Metabolite

RNA Protein Metabolite


DNA

DNA RNA

Protein

Protein Metabolite


El reto de la Biología




DNA

DNA RNA

Protein

Protein Metabolite


“-Omics” Biological Processes

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El Concepto de Biología Integrada

R

R

HO

Gene B

Gene A

Gene X

R

R

HO

Gene B

Gene A

Gene X R

R

HO

Gene B

Gene A

Gene X

• Identificar qué caminos están activos.

• Reducir el ruido biológico (por variabilidad).

• Sugerir experimentos de seguimiento.

Las rutas metabólicas constituyen el nexo de unión entre distintas -ómicas

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La visión integrada de datos de

multiples fuentes (/-ómicas) ayuda a

una mejor interpretación de los

resultados en su contexto (/biológico).

La visión de resultados de

disciplinas (/-ómicas) individuales

describe sólo una parte del cuadro.

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Enrichment Analysis on curated pathways and computationally – derived networks

Gene Product Data Overlay

Metabolite Data Overlay

Análisis Multi-ómico en Mass Profiler Professional 12-IB:

Cambios expresión representados en las propias rutas

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Posibilidades de la

Espectrometría de



“Mass Profiler

Professional” en


PROGRAMA:




4.- Conclusiones.

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Resumen.

• Los Estudios Metabolómicos basados en

Espectrometría de Masas y PCA son una

herramienta muy poderosa para el

Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores.

• La Espectrometría de Masas es una herramienta

clave en laboratorios -ómicos y clínicos para

Investigación Biomédica y Monitorización

Terapéutica de Drogas (TDM).

• La Metabolómica guiada por Rutas metabólicas

es una herramienta muy poderosa para estudios

de Nuevos Biomarcadores y de Toxicidad de

nuevos fármacos.

• Los enfoques multi -ómicos reducen el "ruido de

muestras biológicas" (debida a su gran diversidad).

• La Metabolómica puede ayudar mucho en la

evolución hacia una medicina Predictiva,

Preventiva, Personalizada y Participativa.

Para colaboraciones científicas o servicios de análisis -ómicos, Agilent le puede poner en contacto con grupos de investigación / laboratorios que disponen de todas estas herramientas.

[email protected]

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[email protected] Especialista de Productos LC/MS Agilent Technologies

www.metabolomics-lab.com

http://www.chem.agilent.com

[email protected]

Tel. 901.11.6890

¿Preguntas?

posibilidades de la - agilent.com · cuantitativa de cromatogramas de iones con masa exacta....

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