Clenbuterol y formoterol disminuir la producción de fuerza en aislados intactos de ratón haces de fibras muscularesesqueléticas a través de un mecanismo de b2-adrenérgicos independiente

Clenbuterol y disminución de la producción de fuerza en el formoterol aislados intactos de ratón haces de fibras musculares esqueléticas a través de una?2-adrenoceptorindependent mecanismo. J Appl Physiol 109: 1716-1727, 2010; DOI:?10.1152/japplphysiol.00592.2010.-Although las acciones agudas de acción corta2-adrenérgicos en la producción de fuerza en fibras aisladas de músculo esquelético de mamífero han sido objeto de una serie de estudios previos, los de acción prolongada? 2-adrenérgicos nunca han sido investigados. Además, se sabe poco acerca de los eventos de transducción de señales celulares que median sus acciones. Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue investigar los efectos agudos de tratamiento de rápida y lenta contracción del ratón haces de fibras musculares con el clenbuterol, el formoterol y salbutamol. Tanto el clenbuterol y el salbutamol incrementó los niveles de cAMP en ambos tipos de fibra, y este efecto fue revertido por ICI-118551. Por otro lado, el clenbuterol y formoterol redujo la producción de fuerza en ambos tipos de fibras. También aumentó la fosforilación de fosfolamban y? 2-adrenérgicos en los haces de fibras de contracción lenta, y sus efectos fueron insensibles al propranolol, ICI-118551, y amida 14-22. En contraste, el salbutamol aumentó la producción de fuerza en ambos tipos de fibras. También aumentó elfosforilación de la? 2-adrenoceptores en las fibras de contracción lenta solamente, perono tuvo efecto sobre la fosforilación de fosfolamban en cualquier tipo de fibra. Estos efectos fueron contrarrestados por el propranolol y el ICI-118551, pero no por 14-22amida. En su lugar, 14-22 amida más potenciado los efectos del salbutamol en la fuerza.En resumen, a largo y corto de acción? 2-adrenérgicos tienen efectos opuestos sobre la producción de fuerza en los aislados intactos de ratón haces de fibras muscularesesqueléticas. A partir de estos resultados, se sugiere que las acciones agudas de corta duración? 2-adrenérgicos en la producción de fuerza en los músculos esqueléticos de mamíferos están mediadas a través de la? 2-adrenérgicos, mientras que los delongactin? 2-adrenérgicos no lo son.

cAMP

2-adrenérgicos son los broncodilatadores de gran alcance que se prescriben para el aliviode los síntomas de asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además de susefectos broncodilatadores, 2-adrenérgicos también se han mostrado tener efectos anabólicos (27, 37), especialmente cuando se administra sistémicamente durante varias semanas, y los efectos

positivos inotrophic (3, 43, 44), cuando se aplica a los músculos de forma aguda. Los últimos efectos están influenciados por muchos factores, incluyendo el modo de administración de fármacos (2, 5, 6, 11, 12, 38, 43), así como la composición del tipo de fibra y el grado de activación de los músculos (2, 3, 11 , 15, 38, 41). Así, cuando2-adrenérgicos se administra sistémicamente, afectan submáximo

contracciones (2, 3, 11, 15, 41), y sus efectos en los músculos de contracción lenta son muy inconsistentes (2, 3, 11, 15, 38, 41). Por el contrario, si los medicamentos son entregados directamente en el músculo, que afectan tanto a las contracciones submáximas y máximas (5, 6, 12), y sus acciones en rápidas y lentas músculos son similares (4, 5). Sin embargo, todos estos estudios se realizaron utilizando la epinefrina (un symphathomimetic) o terbutalina (un shortacting? 2-adrenérgico), y ningún estudio ha investigado los efectos agudos de larga duración? 2-adrenérgicos, como el clenbuterol y el formoterol .

Además de sus efectos ionotrophic,? 2-adrenérgicos son también potentes promotores de crecimiento, especialmente cuando se administra sistémicamente durante períodos prolongados (27, 28, 33,35). Debido a sus propiedades que promueven el crecimiento, se ha sugerido que podrían ser prescrito para el tratamiento de la sarcopenia y la caquexia asociada con enfermedades tales como cáncer, virus de la inmunodeficiencia humana, la insuficiencia renal crónica, y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (25, 26) . Sin embargo, su uso clínico se ve obstaculizada por la falta de conocimiento sobre cómo funcionan, sobre todo en el músculo esquelético (26, 45).

Por lo tanto, los principales objetivos de este estudio fue investigar 1) los efectos agudos de dos de acción prolongada? 2-adrenérgicos (clenbuterol y formoterol) y una ampliamente prescritos de acción corta? 2-adrenérgicos agonistas (salbutamol) en la producción de fuerza en el aisladas de mamíferos intactos los paquetes de fibras musculares esqueléticas y 2) los eventos de transducción de señales celulares que median las acciones de estos compuestos en el músculo esquelético. Nuestros resultados muestran que, aunque ambas clases de? 2-adrenérgicos aumento de la concentración de cAMP en todos los haces de fibras y que estos efectos fueron contrarrestados por la? 2-adrenérgicos-inhibidor específico de ICI-118551, que tiene efectos opuestos en la fuerza. Por lo tanto, el clenbuterol y el formoterol redujo la producción de fuerza, mientras que el salbutamol se incrementó. También muestran que los efectos de clenbuterol y formoterol en la fuerza fueron insensibles al propranolol, ICI-118551, y amida 14-22, mientras que aquellos de salbutamol se invierte por tanto propranolol e ICI-118551, pero no por 14-22 amida. A partir de estos resultados, se sugiere que los

efectos del salbutamol en ionotrophic aisladas de mamíferos intactos los paquetes de fibras musculares están mediadas a través de la? 2-adrenérgicos, mientras que los de clenbuterol y formoterol no lo son.

MATERIALES Y MÉTODOSPreparación de paquetes intactos los músculos esqueléticos de fibras. Para asegurar una distribución uniforme en toda la preparación de todos los compuestos usados y laperfusión adecuada de todas las fibras en una preparación, los pequeños paquetes de fibras musculares esqueléticas aisladas, ya sea del músculo extensor largo de los dedos (EDL) del músculo (sobre todo una contracción rápida del músculo) o sóleo muscular (un músculo predominantemente de contracción lenta) de los adultos mayores de 56 ratones CD1 4 días (rango: 46 bis € "80 días, n 41) se utilizaron en este estudio. Los ratones fueron asesinados por el cuello del útero desarticulación de conformidad con legislación del Reino Unido [para un resumen de los reglamentos, ver ref. 7)], y todos los experimentos se ajustaban a las directrices locales Comité de Bienestar Animal. EDL ymúsculos sóleos se aislaron entonces, y pequeños paquetes que contienen 10â € "15fibras (media en sección transversal de diámetro: 320 16,3 m, n 51) fueron disecados. Se tuvo cuidado para asegurar que todas las fibras en un paquete eran eléctricamenteexcitables, y sólo aquellos paquetes que mostraban una disminución de la fuerza de 5% al final del experimento (s) fueron incluidos en el análisis final.

Determinación de los efectos de 2-adrenérgicos en vigor. El procedimiento utilizado en este experimento fue básicamente similar a la descrita anteriormente en la referencia. 13.En pocas palabras, haces de fibras fueron montadas horizontalmente entre los dos ganchos de acero inoxidable, con una conectada a un transductor de fuerza (modelo400A, Aurora Científico, Ottawa, ON, Canadá) y el otro a un servo-motor (modelo 322C, Aurora Scientific) en un músculo cámara con un fondo de vidrio. Ellos fueron perfundidosentonces a una velocidad de 1 ml / min con solución de Ringer o solución de Ringerestándar estándar más diversas concentraciones de clorhidrato de clenbuterol [4-amino--(t-butylaminomethyl) -3,5-diclorobencil clorhidrato de alcohol] disuelto directamente en elsolución de Ringer, fumarato de formoterol dihidratado {(R *, R *)-N-[2-hidroxi-5-(1 -ydroxy-2-{[2 - (4-metoxifenil) - 1-metiletil] amino} etil) fenil ] formamida fumarato}disuelto en DMSO, o salbutamol {albuterol; - [(terc-butilamino) metil] - 4-hidroxi-m-xileno-,-diol =} disolvió en metanol (todos adquiridos a Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido).Solución de Ringer estándar contenía (en mM) 109 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, CaCl2 4, 24NaHCO3, 1 NaHPO4, y 10 piruvato de

sodio con 200 mg / l bovina de suero de ternera, y su pH se mantuvo a 7,4? 0,2 burbujeando continuamente con O2 95% y CO2 5%. La temperatura dentro de la cámara de músculo se monitorizó continuamente utilizando untermopar colocado cerca del extremo transductor de fuerza del haz de fibras del músculo y se mantuvo a 20? 0,1 ° C por medio de un controlador de termoeléctrica (modelo 825A, Aurora científico) y un dispositivo Peltier coloca al lado de la cámara de los músculos. Al comienzo de cada Xperiment, la longitud del sarcómero de cada preparación se fijó en2,4? M utilizando un láser de He-Ne (Líneas láser, Oxon, Reino Unido). Los preparativosfueron entonces estimulados eléctricamente una vez cada 90 s usando un estímulosupramáxima sola para provocar las contracciones musculares de contracción y una vez cada 5 min con trenes de estímulos (30-60 Hz en las fibras de contracción lenta y 90-120Hz en las fibras de contracción rápida) para generar totalmente fusionado tetani. Haces de fibras fueron perfundidos luego con solución de Ringer o solución de Ringer estándarestándar más diversas concentraciones de clenbuterol, formoterol, salbutamol o para determinar la dependencia de la dosis de la fuerza. Contracciones Twitch y tetánica se registraron a continuación, en presencia o ausencia de cada uno de los fármacos.Después de estas determinaciones iniciales, todos los experimentos se realizaron con50? M clenbuterol, 100? M formoterol, salbutamol y 500 nm.

Se utiliza a concentraciones superiores a 1 mM, DMSO puede deprimir significativamentetanto nerviosa y submáximas contracciones tetánicas (34). Por lo tanto, para asegurar que los vehículos utilizados en este estudio (700 M de DMSO en el caso de formoterol y 500metanol M en el caso de salbutamol) no afectó a la producción de fuerza, algunas de lasfibras jas bollo erantratados durante 1 h con solución de Ringer que contiene ya sea 700 M de DMSOo 500 M de metanol. Twitches y tetani se registraron a continuación, en elpresencia o ausencia de los vehículos. A las concentraciones que se utilizan,los vehículos no tuvo ningún efecto sobre las características de ambos y contracción contracciones tetánicas (Fig. 1).

Determinación de los eventos de transducción de señales celulares que median los efectos agudos de clenbuterol, el formoterol, salbutamol, y en la fuerza. Para investigar los hechos de la señal de transducción de celulares que subyacen a los efectos agudos delos? 2-adrenérgicos en la fuerza, otro grupo de pequeños haces de fibras musculares se trató con solución de Ringer normal por lo menos durante 30 minutos. Solución de Ringerse reemplazó luego con una que contiene los inhibidores se muestran en la Tabla 1durante 20 min. Fue entonces sustituido por uno que contiene el inhibidor más la?2-

adrenérgico, cuyos efectos estaban siendo investigados por al menos otros 30 minutos. Finalmente, los haces de fibras fueron cambiados de nuevo en solución de Ringer estándar. Durante cada tratamiento, espasmos y tetani fueron registrados y almacenados en un ordenador para su posterior análisis. En otro experimento, haces de fibras aisladas de seis ratones se dividieron en dos grupos. La mitad (6 haces de fibras / tratamiento) fueron tratados con solución de Ringer o solución de Ringer estándarestándar más vehículo (DMSO o metanol en los experimentos de formoterol y salbutamol,respectivamente) durante al menos 1 hora. Estos haces actuaron como controles. La otra mitad (que consta de 6 paquetes de fibras especiales, el tratamiento) fue tratado por el mismo período de tiempo con solución de Ringer normal más 50? M clenbuterol, 100? Mformoterol, salbutamol o 500 nM por lo menos durante 30 minutos. En otro experimento,haces de fibras se preincubaron en solución de Ringer estándar más los inhibidores de lamuestra en la Tabla 1 durante 20 min. Se incubaron luego en solución de Ringer que contiene el inhibidor más el? 2-adrenérgico, cuyos efectos se están investigando durante 1 h. Al final de los experimentos, los haces de fibras musculares se procesaron para el análisis de inmunotransferencia como se describe a continuación.

Los datos de manipulación y análisis. Fuerza (desde el transductor de fuerza) y temperatura (desde el termopar) se recogieron las señales a través de una interfaz delaboratorio CED 1401 Micro mediante la señal de software 2,11 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido) y se almacena en unaordenador. Las amplitudes de las contracciones musculares de contracción y tetánica se determinaron a continuación, utilizando la señal 2,11 software. La amplitud de los registros de fuerza bajo cada condición experimental se promediaron y dividido por la fuerza media registrada a partir de la misma fibra bajo las condiciones de control. Los datos (en%) se presentan como medios de control de la SEtensión.Todas las transferencias de Western se realizaron por triplicado y cada experimento se repitió al menos tres veces. La intensidad de las bandas de cada experimento seanalizaron mediante Scion imagen (NIH) y después se normaliza a la de la actina. El análisis estadístico de los datos se realizó con SigmaPlot 11,2 (Systat Software, Londres, Reino Unido). La comparación de los diversos conjuntos de datos se realizó medianteANOVA de una vía, y los valores de p de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

RESULTADOSEfectos del tratamiento de haces de fibras con largo y shortacting? 2-adrenérgicos en force.Treatment máxima isométrica de los haces de fibras con clenbuterol condujo a una reducción dosis-dependiente en la fuerza isométrica máxima (Po, igual a la tensión, la figura 2A.). Cambios similares se observaron cuando los haces de fibras fueron tratados con formoterol, otro de acción prolongada? 2-adrenérgico (trazas no mostrado). En contraste, el tratamiento de los haces de fibras con el salbutamol condujo a un incremento en Po (Fig. 2B). Aunque los rastros se muestra en la fig. 2 son de haces de fibras de contracción rápida, resultados similares fueron observados cuando de contracción lenta haces de fibras fueron tratados con los compuestos. Los cambios en Po se observaron en todas las concentraciones investigadas. Se produjo dentro de 10-15 minutos después de la aplicación de los fármacos y podría ser fácilmente revertido por conmutación de los haces de fibras de nuevo en solución de Ringer estándar [trazas etiqueta de lavado (WO) en la figura. 2, A-C].

Resumen de los datos de 6 de contracción rápida y 6 de contracción lenta haces de fibras musculares por experimento se muestran en la figura. 2C. El tratamiento de los haces de fibras musculares, ya sea con el clenbuterol o formoterol condujo a una reducción en Po, cuya magnitud depende de la concentración de los fármacos utilizados, y no se observaron diferencias estadísticas cuando los datos de las fibras rápidas y contracción lenta-fueron comparados ( P? 0,05). Por ejemplo, en haces de contracción rápida fibras musculares, 5? M clenbuterol condujo a un 10,3? 4,8% (n? 8 fibras) la reducción de Po, mientras que a los 50? M que llevó a un 55,5? 4,1% (n? 8 fibras) caída de la Po. Los valores correspondientes en los paquetes de contracción lenta las fibras musculares fueron de 13,7? 4,1% (n? 6 fibras) y 54,2? 5,4% (n? 6 fibras), espectively.Adicionalmente, el tratamiento de los haces de fibras con concentraciones de clenbuterol de? 150? M y formoterol de? 250? M completamente abolido Po (resultados no mostrados). También cabe destacar que a pesar de clenbuterol y formoterol tenían efectos similares sobre el Po, el aumento de las concentraciones de este último se requiere para inducir a reducciones similares en el Po como el primero.

Efectos del tratamiento de los haces de fibras musculares con? 2-adrenérgicos en la tensión nerviosa. Los efectos del tratamiento de los haces de fibras con clenbuterol, el formoterol, salbutamol, y en las contracciones musculares de contracción eran básicamente similares a los que estos compuestos tenían en el Po. Así, el tratamiento de los haces de fibras con clenbuterol y formoterol condujo a una disminución de la fuerza de contracción (ver fig. 3, A y B), mientras que el tratamiento con salbutamol 

aumento del mismo (Fig. 3C). Al igual que Po, los cambios en la fuerza de contracción aumenta con la dosis de los agonistas utilizados y no fueron estadísticamente diferentes entre los dos tipos de fibra (P 0,05;? Fig. 3D). Así, 25? M clenbuterol condujo a un 69,8?2,1% (n? 6 haces de fibras) disminución de la fuerza de contracción máxima en haces de fibras musculares de contracción rápida del músculo y un 69,4? 3,1% (n? 6 de fibra paquetes) disminución de la fuerza de contracción de las fibras de contracción lenta (Fig. 3D). En contraste, 500 nM salbutamol condujo a un 20,2? 1,8% y 20,3? 2% de aumento en la fuerza de contracción en los haces de fibras rápidas y lentas, respectivamente (Fig. 3D). A pesar de los tres compuestos afectada la amplitud de contracción, que no tuvo ningún efecto significativo en el tiempo de subida. Sin embargo, tanto el clenbuterol y el formoterol aumenta ligeramente la tasa de contracción de la relajación. Por ejemplo, los tiempos de subida media de la fuerza de contracción de las fibras de contracción lenta fue de 21.8? 0,8 y 23,4? 0,4 ms (n? 6) en ausencia y presencia de clenbuterol, respectivamente. Por otro lado, el medio de relajación de la fuerza de contracción en las mismas fibras disminuyó de 310,2? 6 a 500,5? 3 ms (n? 6) en presencia y ausencia de clenbuterol, respectivamente.

Como los efectos sobre la producción de fuerza de los tres? 2-adrenérgicos examinados no fueron estadísticamente diferentes entre los dos tipos de fibra en todas las concentraciones examinados (P? 0,05), en el resto de los datos del estudio de ambos tipos de fibras se analizaron en conjunto. Además, como sus efectos sobre la tensión de contracción fueron similares a los que tenían en Po, sólo sus efectos sobre Po fueron considerados en el resto del estudio. 

Efectos del propranolol e ICI 118,551, de los cambios en la fuerza inducidas por? 2-adrenérgicos. Para determinar si los cambios en la fuerza informado anteriormente fueron mediadas a través de la? 2-adrenérgicos, algunos de los haces de fibras fueron pretratadas con 10? M propranolol (un general?-Adrenérgico) o 10? M ICI-118551 (uno específico? 2 -adrenérgico) durante 20 min. La solución de Ringer fue cambiado a uno que contiene el propranolol o ICI-118.551, más el 2 - agonista de los receptores adrenérgicos, cuyos efectos estaban siendo investigados por otros 30 minutos. Fuerza se registró a continuación, en presencia y en ausencia de los inhibidores y / o drogas. El tratamiento de los haces de fibras con 10? M propranolol solo condujo a un 10,3? 3,8% (n? 7 fibras) disminución de la Po, y combinarlo con cualquiera de clenbuterol o el formoterol no suprimió sus efectos sobre la Po (Fig. 4, A y C). En contraste, el pretratamiento de haces de fibras

con propranolol invertido completamente los efectos del salbutamol sobre Po (Fig. 4, B y C). Se obtuvieron resultados similares cuando los haces de fibras fueron tratados con los fármacos más el? 2-adrenérgicos-inhibidor específico de ICI-118551 (fig. 5). Sin embargo, a diferencia de propranolol, ICI-118551 solo no tuvo ningún efecto sobre Po (Fig. 5, A y B). 

Efectos de la amida 14-22 sobre los cambios en la fuerza inducida por? 2-adrenérgicos.Se cree generalmente que el 2 -? Agonistas adrenérgicos ejercen sus efectos a través de la activación de PKA por AMPc (10, 17, 36, 42). Sin embargo, una serie de estudios (10, 39) han demostrado recientemente que el AMPc puede ejercer efectos que son independientes de la PKA. Por lo tanto, en otro experimento, se examinaron los efectos de la inhibición de la PKA sobre los cambios en la fuerza inducidas por los tres? 2-adrenérgicos. El tratamiento de los haces de fibras con 10 nM 14-22 amida, una celda de permeabilidad PKA inhibidor específico, no resultó significativamente afectan a la producción de fuerza en ambos tipos de fibra (P? 0,05). 

Además, no suprimir los efectos de los? 2-adrenérgicos (Fig. 6). En efecto, además potenció los efectos del salbutamol sobre Po (Fig. 6, B y C). Por ejemplo, el tratamiento de los haces de fibras con salbutamol solo condujo a un 15? 2% (n? 5 fibras) el aumento de Po, y esta cifra ascendió a 21,5? 3% cuando los haces de fibras fueron tratados con ambos salbutamol y amida 14-22. ? 2-Adreceptor expresión rápida y de contracción lenta haces de fibras musculares esqueléticas. Anteriormente, un número de estudios de unión de radioligandos (8, 16, 20) han demostrado que la? 2-adrenérgicos es el principal?-Receptor presente en el músculo esquelético de mamíferos y que su concentración es mayor en el músculo soleus que en el músculo EDL ( 8, 16, 20). Sin embargo, poco se sabe

sobre su expresión en el nivel de proteínas, así como su grado de fosforilación después?estimulación agonista 2-adrenérgicos. También es incierto si su fosforilación puede dar cuenta de los cambios en la fuerza que hemos detectado en este estudio. Por lo tanto, en otro experimento, se analizó la expresión y la fosforilación de la? 2-adrenérgicos en pequeños haces de fibras musculares aisladas de la EDL (contracción rápida) y sóleo(contracción lenta) los músculos de ratones adultos antes y después del tratamiento con?2-adrenérgicos agonistas. En todos los haces de fibras examinados, el receptor estaba presente con independencia de si son derápido o lento-contracción muscular (fig. 7). Además, en cada tipo de fibra, las formas fosforiladas y fosforilada del receptor eran recíprocos, es decir, cuando una fibraexpresado altas concentraciones de una forma, se expresaron niveles bajos de la otra.

Por lo tanto, las fibras de contracción rápida expresa principalmente la isoformafosforilada, mientras que las fibras de contracción lenta expresa de forma predominantela forma fosforilada, del receptor (Fig. 7, A y B). Por otra parte, el tratamiento de los bultoscon cualquiera de los 2 - agonistas de los receptores adrenérgicos aumento de la fosforilación del receptor en los paquetes de contracción lenta las fibras musculares (ver Fig. 7C)..

Efectos del tratamiento de los haces de fibras musculares con? 2-adrenérgicos en la fosforilación de la PLB. En general se cree que el efecto de lusitrophic?-Adrenérgicosestimulación de los músculos cardíacos surge de la fosforilación de PLB, un retículosarcoplásmico pequeño Ca2-ATPasa proteína pumpassociated, por PKA (18, 22). Sin embargo, si los cambios similares en la fosforilación de PLB ocurrir en esqueléticolas fibras musculares después? 2-adrenérgicos tratamiento con agonistas es incierto.También es incierto si los cambios en su fosforilación contribuido a los cambios en la fuerza reportados en otras partes

en este informe. Por lo tanto, en otro experimento, se examinaron los efectos del tratamiento de pequeños haces de fibras musculares con el clenbuterol, el formoterol,salbutamol, y en la fosforilación de la PLB. El tratamiento de los haces de fibras con el clenbuterol aumentó la fosforilación de PLB en haces de fibras de contracción lenta pero disminuyó en haces de fibras de contracción rápida (fig. 8, A y B). Se obtuvieron resultados similares cuando los haces de fibras fuerontratados con formoterol (resultados no mostrados). En contraste, el tratamiento de los haces de fibras con el salbutamol no tuvo efecto sobre la fosforilación de PLB en haces de fibras de contracción lenta. Sin embargo, se suprimió completamente la fosforilaciónde PLB en haces de contracción rápida fibras musculares (Fig. 8, C y D).

Efectos de la? 2-adrenérgicos sobre las concentraciones de AMPc en haces de fibras.En la mayoría de los tejidos,? 2-adrenérgicos estimulación activa la adenilato ciclasa, lo que lleva a un aumento en los niveles de cAMP intracelulares (10, 17, 36, 42), y el tratamiento de las fibras del músculo esquelético de rata con dibutiril-AMPc tiene efectos similares sobre la fuerza como la terbutalina (6, 12). Por lo tanto, en otro experimento, se investigó los efectos del tratamiento de los haces de fibras musculares con 50? Mclenbuterol salbutamol o 500 nM en las concentraciones de cAMP. Ambos agonistasllevado a una de dos a tres veces en aumentar la concentración de cAMP en todos los lotes examinados con independencia de si eran de músculos rápidos-

o contracción lenta-(Fig. 9). Además, el pretratamiento de los haces de fibras con 10? M ICI-118551 invertido completamente el incremento de cAMP inducida por los agonistas en ambos tipos de fibras (fig. 9, A y B). Por ejemplo, el tratamiento de los haces de fibras de contracción rápida con clenbuterol aumento de los niveles de cAMP de 556? 10 a 1.371? 57 pmol / gmúsculo (n? 3 fibras), y el tratamiento previo de los paquetes con ICI-118551 invertido esta a 157? 12 pmol / g músculo.

DISCUSIÓN Aunque los efectos agudos de terbutalina (5, 12) y el salbutamol (43) sobre la producción de fuerza en mamíferos haces de fibras del músculo esquelético previamente han sido investigados, esta es la primera vez que los de una acción prolongada? 2-adrenérgico han sido examinados. 

Los resultados aquí presentados muestran que los efectos del tratamiento de pequeñas intactas mamíferos haces de fibras del músculo esquelético con? 2-adrenérgicos en la producción de fuerza dependerá de las CLAS del agonista y no en la composición del tipo de fibra del músculo, como ya se sugirió (2, 4, 11, 15, 38, 41). Por lo tanto, el tratamiento de los haces de fibras con la corta duración? 2-adrenérgico salbutamol aumentó la producción de fuerza en los dos haces de fibras rápidas y Slowtwitch, mientras que el tratamiento con los de acción prolongada? 2-adrenérgicos clenbuterol y el formoterol tuvo el efecto opuesto en fuerza (ver Figs. 2 y 3). 

También es digno de mención que los efectos del salbutamol reportedin el presente estudio y las que se presentan en otra parte (5, 12, 43) son similares (por ejemplo, comparar los resultados que se muestran en las Figs. 2 y 3 del presente estudio con los que se muestran en las Figs. 3 y 4 de ref. 5). Así, el tratamiento de los haces de fibras, ya sea con salbutamol o terbutalina condujo a un aumento de 14-20% tanto en contracción y fuerza tetánica. Además, el aumento de la fuerza se produjo en ambos tipos de fibras con independencia de si los haces eran de ratones (presente estudio y ref. 4) o ratas (refs. 5 y 12). Por lo tanto, es probable que un aumento de la fuerza es un general propiedad de todos los de acción corta? 2-adrenérgicos en pacientes adultos músculos esqueléticos de mamíferos, independientemente de su composición tipo de fibra, y las diferencias en la fuerza observadas en algunos estudios previos (2, 3, 15) probablemente reflejan los preparados que se utilizan o se utilizan las técnicas de estimulación .

Uno de los efectos adversos de la? 2-adrenérgicos, particularmente después de la administración oral o por inhalación a dosis elevadas, es temblores del músculo

esquelético (21, 23). Aunque los mecanismos moleculares que subyacen a los tembloresson aún poco conocidos, algunos investigadores creen que se derivan de la acción de losagonistas en la periferia? 2-adrenérgicos (29).

Sin embargo, como los resultados reportados en los estudios de este y los anteriores (5,6, 12, 43) demuestran claramente, el tratamiento de pequeños haces de fibras del músculo esquelético con diferentes concentraciones de clenbuterol (5-100? M),formoterol (5-150? M ), el salbutamol (0,001 hasta 1,0? M) (presente estudio y ref. 43) yterbutalina (0.1-10? M) (refs. 5 y 6) no indujo contracturas en cualquiera de las preparaciones. Por lo tanto, no creo que los temblores surgende las acciones directas de estos compuestos en? 2-adrenoceptores en músculos esqueléticos de mamíferos. En su lugar, especular thatthey surgir ya sea desde la acción de estos compuestos en el sistema nervioso autónomo o de la hipopotasemia que inducen en vivo (9).

En general, se cree que a corto y de larga duración? 2-adrenérgicos ejercen sus efectospositivos en inotrophic músculos esqueléticos de mamíferos a través de la? 2-adrenérgicos (5, 12). Por lo tanto, sus efectos deberían ser fácilmente revertidos porcualquiera de propranolol (un general?-Bloqueante) o ICI 118,551 (un? 2-adrenérgicosespecíficos bloqueador). Sin embargo, como los resultados reportados en el presente estudio muestran, esto no es siempre el caso(véanse las Figs. 4 y 5). Así, ambos inhibidores totalmente suprimido el aumento de lafuerza inducida por salbutamol, e ICI-118551 también invierte el aumento de cAMPinducida por tanto el clenbuterol y el salbutamol (ver fig. 9). En contraste, ambos inhibidores no tuvo efecto sobre la disminución de la fuerza inducida por tanto el clenbuterol y formoterol.

Nuestra interpretación de estas observaciones es que en los mamíferos haces de fibras del músculo esquelético, de corta duración? 2-adrenérgicos modulan la fuerza, principalmente a través de las? 2-adrenérgicos, mientras que los de acción prolongada? 2-adrenérgicos no. Esta sugerencia se ve reforzada por las observaciones que ICI-118551 (12) y propanolol (5) tambiénabolió los efectos de la terbutalina sobre la producción de fuerza en aislados de rata haces de fibras musculares esqueléticas, mientras que ICI-118551 y octavos de final de la? 2-adrenérgicos no tuvo ningún efecto sobre el aumento de la captación de glucosa inducida por clenbuterol en el ratón haces de fibras musculares esqueléticas (32). Del mismo modo, la retirada mecánica del sarcolema en la rata rápido y fibras de contracción lenta del músculo esquelético no abolió los efectos del clenbuterol en el retículo sarcoplásmico carga de Ca2 (1). En conjunto, todas estas observaciones sugieren que el clenbuterol tiene

efectos sobre la producción de la fuerza y la captación de glucosa en los mamíferos las fibras musculares esqueléticas que no están mediadas a través de la? 2-adrenérgicos.

En esquelético de rata haces de fibras musculares, el aumento de la fuerza inducida por la acción corta? 2-adrenérgicos es acompañado por un aumento de AMPc (43) y la concentración de Ca2 intracelular (4, 6, 12). También puede ser imitado por dibutyrylcAMP (5, 12).

Por lo tanto, se ha sugerido que el aumento de la fuerza surge de la mayor liberación de Ca2 del retículo sarcoplásmico, y, para que esto ocurra, la fosforilación de rianodina / dihidropiridina receptores por PKA es necesario (6, 12). Aunque en el presente estudio, tanto el clenbuterol y el salbutamol aumentó los niveles de AMPc en todos los haces de fibras investigados, y aunque esto se invierte por completo por el pretratamiento de los haces de fibras con ICI-118551, el pretratamiento de los haces de fibras con 14-22 amida, un PKAspecific inhibidor, no tuvo efecto sobre la disminución de la fuerza inducida por el clenbuterol y formoterol. Además, el pretratamiento de los haces de fibras con 14-22 amida no abolió el aumento de la fuerza inducida por salbutamol. En su lugar, además potenció los efectos del salbutamol en la fuerza. Algunas de estas observaciones dan mayor credibilidad a la idea de que los de acción prolongada? 2-adrenérgicos tienen efectos directos sobre la fuerza. También sugieren que, en las fibras musculares esqueléticas de mamíferos, los pasos intermedios de la PKA puede tener efectos negativos en la producción de fuerza.

De hecho, en los músculos cardíacos, la activación de PKA conduce a la fosforilación de la troponina I y miosina de unión de la proteína C, y esto se ha demostrado que disminuye la sensibilidad miofibrilar Ca2. También aumenta la tasa de ciclos de puentes cruzados, y la redefecto de todas estas acciones es la reducción de la tensión nerviosa (15, 19, 30).Además, como los efectos del clenbuterol y el formoterol fueron insensibles a 14-22 amida, le sugerimos que no están mediadas a través de cualquiera de PKA. Otra consecuencia de la activación de PKA en los músculos esqueléticos estriados es la fosforilación de la PLB. PLB es una proteína 22-kDa oligimeric que actúa como un modulador de sarco (endo) plasmático Ca2-ATPasa del retículo (SERCA) en las fibras musculares cardíacas y dos de contracción lenta-esqueléticos (18). Normalmente, se inhibeDe la recaptación de Ca2 por SERCA, pero una vez que se fosforilados en Ser16 y Thr17 por la PKA, sus efectos inhibitorios son abolidas, y esto aumenta la actividad de la SERCA, resultando en unaumento de la tasa de Ca2 recaptación y, por lo tanto, la relajación de tensión

(40).Además de sus efectos sobre la fuerza, la terbutalina también aumenta la tasa de relajación de tensión en las fibras musculares de rata de contracción lenta (12), pero no en ratones de contracción rápida haces de fibras musculares (4). Por lo tanto, estas observaciones se han tomado como un indicio de que la terbutalina aumenta la fosforilación de PLB en mamíferos fibras del músculo esquelético (6, 12). Sin embargo, como los resultados mostrados en la figura. 8 demuestran, el salbutamol no aumentó la fosforilación de PLB en cualquiera de los haces de fibras, lo que sugiere que los de acción corta? 2-adrenérgicospuede tener ningún efecto sobre la fosforilación de PLB. En efecto, dibutiril-AMPc se ha demostrado que no tienen ningún efecto sobre la descomposición de Ca2 transitorios registrados a partir de los músculos sóleos de ambos ratones transgénicos y de tipo salvaje (24). En conjunto, estos hallazgos sugieren que un aumento en la fosforilación de la PLB no puede ser una característica constante de tratamiento de mamíferos haces de fibras del músculo esquelético con acción corta? 2-adrenérgicosagonistas.

En contraste, el tratamiento de ambos rápidas y lentas haces de fibras musculares con clenbuterol y el formoterol siempre conduce a una disminución de la fuerza en ambos tipos de fibra (Figuras 2 y 3) y un aumento de la fosforilación de PLB en las fibras de contracción lenta solamente (Fig. 8). Además, en estas fibras, los cambios en la fuerza fueron siempre acompañada por un marcado incremento en la tasa de relajación de tensión. De hecho, todos los haces de fibras tratadas con? 50? M clenbuterol y 100? M formoterol fueron incapaces de mantener el tétanos, y sus contracciones tetánicas en la presencia de las drogas siempre parecía contracciones musculares de contracción. A partir de estas observaciones, se sugiere que la fosforilación de PLB por tanto el clenbuterol y el formoterol puede jugar un papel importante en la disminución de la fuerza inducida por estos compuestos. Sin embargo, comoPLB se encuentra principalmente en las fibras de contracción lenta, esto no puede ser el único mecanismo que subyace a la reducción de la fuerza inducida por estos compuestos en las fibras musculares esqueléticas de mamíferos. Por lo tanto, otra posibilidad es que estos compuestos actúan directamente para desacoplar ciclismo puentes cruzados. De hecho, es bien sabido que?-Estimulación de los adrenoceptores puede mejorar ciclos de puentes cruzados en los miocitos ventriculares (14), y esto puede explicar por qué las acciones de clenbuterol y el formoterol fueron insensibles al propranolol e ICI 118,551. Sin embargo, más estudios para confirmar esto se justifica. En resumen, los resultados que presentamos aquí muestran que el salbutamol, terbutalina, como, aumenta la producción de fuerza en las fibras intactas aisladas de mamíferos del músculo esquelético, mientras que el clenbuterol y el formoterol tiene los efectos

opuestos sobre la fuerza. También muestran que los efectos del salbutamol están mediadas a través de la 2 -? Drenoceptor,mientras que los de clenbuterol y formoterol no lo son. A partir de estos resultados, se sugiere que los efectos del clenbuterol y formoterol en la producción de fuerza en zonas aisladas, intactas de mamíferoshaces de fibras musculares esqueléticas puedan derivarse de sus acciones directas sobre puentes cruzados.