plasmidos y transposones

Universidad Nacional San Luís Gonzaga de IcaFacultad de Medicina Humana “Daniel Alcides Carrión” _______________________________________________________________________

CONTENIDO

A. PLASMIDOS

I. Definición……………………………………………………………………

……………………… 03

II. Clasificación…………………………………………………………………

……………………. 06

III. Estructura de un

plásmido………………………………………………………………. 06

IV. Mecanismos de transferencia genética……………………………..

…………….06

V. Usos terapéuticos ……………………………………………………….

……………………. 06

B. TRANSPOSONES

I. Definición ………………………………………………………………..

……………………. 06

SEMINARIO DE MICROBIOLOGIA 1


II. Clasificación

………………………………………………………………………...

………. 06

III.Estructura de un transposón

………………………………………………………. 06

IV.Tipos de transposones bacterianos en función de su

estructura .. 06

V. Aplicaciones

…………………………………………………………………………………

. 06

INTRODUCCION



A. PLASMIDOS

I. DEFINICION

Toda la información genética esencial para la vida de la célula bacteriana, está contenida en una

única molécula de ADN de doble cadena, circular y covalentemente cerrado, a la que podemos

referirnos como “cromosoma bacteriano”. Muchas bacterias, poseen además ADN extra

cromosómico, también circular cerrado, denominado ADN plasmídico, por estar contenido en

estructuras llamadas “plásmidos”, que portan información génica para una variedad de funciones

no esenciales para la célula en condiciones normales de crecimiento. En términos bioquímicos, la

composición y estructura de los ácidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier

célula.



Brevemente, conviene recordar que los ácidos

nucleídos son macromoléculas compuestas de

nucleótidos unidos en forma covalente por

medio de enlaces fosfodiester entre los

carbonos de las posiciones 3´ y 5´ de dos

residuos de azúcares adyacentes, que

conforman un esqueleto de azúcares y fosfatos

que es constante a lo largo de toda la

macromolécula.

La variación entre los distintos nucleótidos que conforman la cadena de ácido nucleico, está dada

por sus bases nitrogenadas, que en el caso del ADN son Adenina (A), Timina (T), Citocina (C) y

Guanina (G), y en el caso del ARN en vez de T se encuentra Uracilo (U). A y G se denominan bases

púricas o purinas, mientras que T, U, y C se denominan bases pirimidínicas o pirimidinas. De esta

manera, una cadena o hebra de ácido nucleico, tendrá una estructura primaria determinada por la

secuencia de las bases que la componen.

El ADN como macromolécula, está compuesto por 2 cadenas nucleotídicas o hebras antiparalelas,

que se enlazan entre si conformando una doble hélice. Los enlaces entre las dos hebras de ADN

están dados por puentes de hidrógeno entre las purinas de una cadena con las pirimidinas de la

otra. De esta forma, la A forma dos puentes de hidrógeno con la T, mientras que la C forma 3

puentes de hidrógeno con la G. A esto se le llama complementariedad de bases, es decir que la A

es complementaria a la T y la C lo es a la G. Estos enlaces permiten mantener estable la estructura

de la doble hélice de ADN en la que pueden distinguirse pares de nucleótidos o mejor dicho pares

de bases (pb). Estos pb pueden utilizarse como unidad de tamaño o longitud para las moléculas de

ADN, y de esa manera podemos decir por ejemplo que el ADN cromosómico de Escherichia coli

tiene un tamaño de 4,2 millones de pb o lo que es lo mismo 4.200 kilobases (Kb).

Como se mencionó, muchas bacterias

poseen información génica contenida en

moléculas de ADN distintas a las del

cromosoma bacteriano, denominadas

plásmidos. Los plásmidos, son moléculas

circulares de ADN de doble cadena que



constituyen una unidad de replicación independiente del cromosoma. Por esto pueden

encontrarse más de una copia del mismo plásmido dentro de la célula bacteriana. En general los

plásmidos de mayor tamaño, se encuentran en una o unas pocas copias, mientras que los más

pequeños pueden estar en hasta 100 copias por célula (plásmidos multicopia).

Si bien el ADN plasmídico no porta información genética esencial para la vida de la bacteria, sí

portan genes que le confieren nuevas propiedades fenotípicas y que en algunos casos le son muy

útiles para su adaptación al crecimiento en ciertos ambientes.

Muchas bacterias potencialmente patógenas para el hombre, solo son capaces de comportarse

como tales, cuando portan un plásmido en particular que contiene genes que le permiten expresar

moléculas de adhesión a los tejidos del huésped o sintetizar sustancias tóxicas para éste.

Como ejemplo, podemos mencionar el caso de la producción de la toxina tetánica, por Clostridium

tetani, agente causal del tétanos. En muchos casos, los plásmidos contienen genes que codifican

para enzimas capaces de degradar algunos antibióticos, permitiendo que la bacteria sobreviva a la

acción de los mismos. Este es el caso de la producción de beta lactamasas por cepas Neisseria

gonorrhoeae, Staphylococcus aureus o Haemophylus influenzae, que poseen un plásmido que les

confiere resistencia a ciertos antibióticos beta lactámicos como Penicilina y Ampicilina.

Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de replicación u

ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual habilita al ADN para ser duplicado

independientemente del ADN cromosomal. Los plásmidos de la mayoría de las bacterias son

circulares, pero también se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente los

cromosomas de la mayoría de eucariontes

Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada",

esto es, están presentes en forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su

aislamiento y purificación.

Hay algunos plásmidos

integrativos, vale decir tienen la

capacidad de insertarse en el

cromosoma bacteriano.

Digamos que rompe el

cromosoma y se sitúa en

medio, con lo cual,



automáticamente la maquinaria celular también reproduce el plásmido. Cuando ese plásmido se

ha insertado se les da el nombre de episoma, puede mantenerse en contacto por un largo tiempo,

ser duplicado en cada división celular del del huésped y volverse parte básica de su mapa genético.

Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética por su capacidad de reproducirse de manera

independiente del ADN cromosomal como así también porque es relativamente fácil manipularlos

e insertar nuevas secuencias genéticas.

Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les confieren

resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros métodos de

selección además de la resistencia a antibióticos, como los basados en fluorescencia o en

proteínas que destruyen las células sin uso de antibióticos. Estos nuevos métodos de selección de

plásmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologia, debido a la fuerte crítica de grupos

ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibióticos en los organismos modificados

genéticamente.

Los plásmidos usados en ingeniería genética son llamados “vectores”. Estos son usados para

transferir genes desde un organismo a otro y típicamente contienen un marcador genético

confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a favor o en contra. La mayoría también

contienen un polivinculador o sitio de clonado múltiple (MCS), el cual es una pequeña región que

contiene los sitios de restricción más comúnmente usados, permitiendo una fácil inserción de

fragmentos de ADN en ese lugar.

II. CLASIFICACIÓN

SEGÚN SEAN AUTOTRANSMISIBLES POR CONJUGACIÓN O NO:

a) Plásmidos conjugativos (auto transmisibles)

Son aquellos que transportan los genes para los pilis sexuales y para la transferencia de

los plásmidos a otra célula.

Pueden transmitirse de una célula a otra

sin que la célula donadora los pierda.

Algunos de estos plásmidos no sólo se



transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre

especies y géneros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de plásmidos

promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia horizontal

de información genética entre grupos bacterianos filogenéticamente alejados.

b) Plásmidos no conjugativos,

Carentes de esta propiedad de conjugación,

pueden transferirse de una célula a otra mediante

su inserción en un plásmido conjugativo o en un

cromosoma o mediante un proceso de

transformación cuando son liberadas de una célula

muerta.

SEGÚN SU CONTROL DE REPLICACIÓN VEGETATIVA:

a) Plásmidos de control estricto del número de copias:

Tienen bajo número de copias por cromosoma en la misma célula. Suelen ser plásmidos de

tamaños medianos (unas 30 kb) a grandes (cientos de kb) P. ej., el factor F se mantiene a

1-2 copias por cromosoma.

b) Plásmidos de control relajado

Alto nº de copias por cromosoma (más de 10). Suelen ser plásmidos pequeños (menos de

10 kb). Algunos de ellos tienen un sistema de replicación especial, y son amplificables

cuando a las bacterias que los poseen se les añade cloramfenicol: este antibiótico detiene

la síntesis de proteínas, lo que afecta a la replicación del cromosoma, ya que para que se

inicie cada ciclo de replicación cromosómica se necesita un nuevo “pool” de determinadas

enzimas. Pero esto no afecta a la replicación del plásmido, que de esta manera se

“amplifica” y aumenta aún más su proporción respecto del cromosoma.



SEGÚN EL TIPO DE FENOTIPOS QUE CODIFICAN :

a) Plásmidos R (Factores R o factores de resistencia)

Confieren a las bacterias que los contienen, resistencia frente a uno o varios antibióticos.

Tienen una enorme importancia desde el punto de vista clínico. Son plásmidos que

contienen genes que codifican enzimas que destruyen o modifican moléculas que

constituyen el antibiótico. Por ejemplo:

B- lactamasas: son enzimas que degradan específicamente el anillo b-

lactámico, que es la estructura de penicilinas y derivados

CAT( cloranfenicol acetil transferasa): que es una enzima que acetila la

molécula del cloranfenicol, inactivándola, por lo que las bacterias que

secreten esta enzima serán resistentes al cloranfenicol

b) Plásmidos bacteriocinogénicos

Contienen genes que codifican a una Bacteriocina, una proteína de secreción que es tóxica

para otras células de la misma especie que no contengan el mismo factor

Bacteriocinogénico. Son proteínas tóxicas, producidas por las bacterias para competir con

bacterias de la misma especie.

c) Plásmidos toxigénicos:

Son plásmidos que contienen genes que codifican proteínas de secreción que son tóxicas

para el ser humano. Son factores de virulencia.



Dentro de una misma especie bacteriana, aquellas cepas que contengan un Plásmidos

toxigénico serán virulentas, de lo contrario no lo serán. Un buen ejemplo de esto son las

cepas enterotoxigénicas de E.coli, E. coli es habitante habitual del intestino, por lo que

normalmente no es un microorganismo virulento, pero existen cepas que si lo son,

algunas de ellas debido a la presencia de Plásmidos toxigénicos que contienen genes que

codifican una enterotoxina muy potente que cuando se libera en la mucosa intestinal da

lugar a un cuadro diarreico

d) Plásmidos que codifican factores de colonización

Para la invasión de los tejidos de su hospedador.

e) Plásmidos de cepas de Pseudomonas,

Que confieren rutas metabólicas capaces de utilizar como fuentes de carbono y energía

sustancias que otros organismos no pueden catabolizar:

i) plásmidos OCT (degradación del octano);

ii) plásmidos TOL/XYL (degradación del tolueno y xileno);

iii) plásmidos NAF (degradación del naftaleno), etc.

Existen igualmente plásmidos que codifican más de un tipo de fenotipos: p. ej., plásmidos que

suministran resistencia a antibióticos y capacidad de virulencia.

SEGÚN EL GRUPO DE INCOMPATIBILIDAD.

Dos plásmidos son incompatibles (no pueden permanecer establemente en la misma célula)

Como se sabe, desde hace algún tiempo que ciertas parejas de plásmidos (por ejm: un plásmido F

y un plasmido F’ o dos clases diferentes de plásmidos F’) no pueden replicarse de manera estable

en la misma célula bacteriana. Se dice que dos de estos plásmidos son incompatibles, porque

comparten un mismo sistema de replicación y segregación de las copias. Una colección de

plásmidos incompatibles constituye un grupo de incompatibilidad. Una gran variedad de pruebas

sugiere que los plásmidos miembros de un mismo grupo de incompatibilidad (designado por Inc,

seguido de una letra mayúscula y a veces de un número) están estrechamente relacionados, por lo

que esta propiedad es utilizada con frecuencia como sistema de clasificación. El hecho de saber a

qué grupo de incompatibilidad pertenece un plásmido, con frecuencia revela otras cosas acerca de



él. Por ejemplo, los miembros del grupo de incompatibilidad IncP1 poseen todos la propiedad de

ser capaces de replicarse de manera estable en una amplia gama de células bacterianas

hospedadoras.

III. ESTRUCTURA DE UN PLASMIDO

IV. MECANISMOS DE TRANSFERENCIA GENETICA

V. USOS TERAPEUTICOS

PRODUCCIÓN DE VACUNAS DE DNA

Recientemente se ha reportado que las muertes al año por

tuberculosis son de tres millones, las de malaria de dos

millones y las del SIDA de un millón. En la actualidad, el uso de

plásmidos para la producción a gran escala de vacunas de DNA

está orientado a la prevención de enfermedades como las

mencionadas, para las cuales no existen vacunas aún, o su

costo es muy elevado. Se considera que las vacunas de esta

nueva generación serán más seguras, baratas, y más fáciles de

producir que las convencionales.

TERAPIA GÉNICA

Otra aplicación de los plásmidos es en terapia génica, donde se

introducen genes en células del cuerpo humano. Estos genes, al

expresarse codifican y realizan una acción terapéutica, como el



tratamiento de enfermedades hereditarias monogénicas o adquiridas, como la hemofilia, la

fibrosis cística, cáncer, problemas vasculares y desórdenes neurológicos.

Los plásmidos utilizados con fines terapéuticos y de prevención, exhiben tres partes básicas en su

conformación: el gen de resistencia a antibióticos, el gen insertado y el origen de replicación.

Un prerrequisito para el uso efectivo de la terapia génica o de la vacunación con DNA es la

transferencia eficiente del material genético a la célula receptora. Actualmente, alrededor del 24%

de los protocolos en desarrollo emplean plásmidos superenrollados como vehículos de

transferencia debido a que éstos son más eficientes en la transferencia del material genético, que

otro tipo de plásmidos, ya que ofrecen mayores ventajas de seguridad y de aplicación que los

vectores de tipo viral.

PRODUCCIÓN DE GRANDES CANTIDADES DE PROTEÍNAS

Otro uso importante de los plásmidos es fabricar

grandes cantidades de proteínas. En este se deja crecer

la bacteria que contiene el plásmido que encierra al

gen de interés. Solo como la bacteria produce la

proteína que le confiere si resistencia a los antibióticos,

este también puede ser usado para producir proteínas

en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es

una forma barata y fácil de producir genes o proteínas

que este codifica de forma masiva, como por ejemplo

insulina, o inclusive antibióticos.

Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran escala, ya que

podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción,

como en el caso de la insulina humana, que actualmente es producida por bacterias en grandes

recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy

rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de proteínas, es posible lograr una

sobreproducción de la proteína deseada. A esto justamente se dedica la biotecnología, es decir a

la utilización de organismos vivos o de sus productos con fines prácticos.



B. TRANSPOSONES

I. DEFINICION

Un transposón o elemento genético transponible es una secuencia de ADN que puede moverse de

manera autosuficiente a diferentes partes del genoma de una célula, un fenómeno conocido como

transposición. En este proceso, se pueden causar mutaciones y cambio en la cantidad de ADN del

genoma. Anteriormente fueron conocidos como "genes saltarines" y son ejemplos de elementos

genéticos móviles.

El transposón modifica el ADN de sus inmediaciones, ya sea arrastrando un gen codificador de un

cromosoma a otro, rompiéndolo por la mitad o haciendo que desaparezca del todo. En algunas

especies, la mayor parte del ADN basura (hasta un 50% del total del genoma) corresponde a

transposones.

A diferencia de los provirus, los transposones se integran en el ADN celular en lugares bien

determinados. Su existencia fue propuesta por Barbara McClintock en el maíz, sin embargo, su

existencia no se demostró hasta mucho más tarde en bacterias. Por ello fue laureada con el

premio nobel en 1983.

II. CLASIFICACION

Existe una amplia diversidad de elementos genéticos móviles y pueden ser clasificados en base a

su contenido y su estrategia y mecanismo de transposición.

SEGÚN CONTENIDO

Transposón simple

Secuencia de inserción o elemento de inserción (IS): contienen una secuencia central con

información para la transposasa, una enzima necesaria para la transposición, y en los

extremos una secuencia repetida en orden inverso. Esta secuencia repetida en orden

inverso no es necesariamente idéntica, aunque muy parecida. Cuando un transposón



simple se integra en un determinado punto del ADN aparece una repetición directa de la

secuencia diana (5-12 pb).

Transposón compuesto (Tn)

Contienen un elemento de inserción (IS) en

cada extremo en orden directo o inverso y

una región central con la transposasa que

además suele contener información de otro

tipo. Por ejemplo, los factores de

transferencia de resistencia (RTF), poseen

información en la zona central para

resistencia a antibióticos como el

cloranfenicol, la kanamicina, la tetraciclina,dándole una ventaja selectiva a las bacterias

que lo posean.

SEGÚN ESTRATEGIA DE TRANSPOSICIÓN

Clase I o DNA transposones:

Se mueven directamente de una posición a otra en el genoma usandouna transcriptasa

para copiar y pegarse en otro locus del mismo.

Clase II o retrotransposones:

Se mueven en el genoma siendo transcritos a ARN y después en ADN por

retrotranscriptasa. A su vez, se clasifican en los de origen retroviral (retrotransposones con

LTR) y de origen no retroviral (retrotransposones sin LTR).

Clase III o MITE,

Por sus siglas en inglés "Miniature Inverted-repeats Transposable Elements".



SEGÚN MECANISMO DE TRANSPOSICIÓN

Transposición conservativa:

EL transposón sale de la sede donadora que queda vacía y se incorpora en una nueva sede

(sede receptora). No aumenta el número de copias del transposón en el interior de la

célula.

Se expresa la transposasa, y realiza dos cortes de

doble cadena a la misma altura en el genoma

donante, dejando aislado el transposón. A

continuación localiza una secuencia diana

(pongamos, ATGCA) en el genoma aceptor, y

realiza un corte cohesivo. Tras eso une los

extremos a los del transposón aislado, y la ADN

Polimerasa de la célula rellena las zonas de cadena sencilla dejadas en la secuencia señal

tras el corte cohesivo. Debido a esto, la secuencia señal queda duplicada. Queda, sin

embargo, un hueco en el genoma donante, que puede ser letal si no se repara. Realmente,

en este caso se habla más de recombinación que de transposición.

Transposición no conservativa:

En este caso la transposasa realiza un corte cohesivo no solo en la secuencia diana, sino

también en el genoma donante, dejando un corte a cada lado del transposón. A

continuación integra todo el genoma donante con el aceptor, mediante un curioso

mecanismo que forma un intermediario llamado “estructura entrecruzada”. Esta

estructura es resuelta por un segundo enzima, la resolvasa, que según cómo lo resuelva

dará lugar a una de las siguientes transposiciones:

o Transposición no replicativa: el genoma donante se libera, dejando el integrón en

el genoma receptor. Al igual que en la transposición conservativa, queda un hueco

en el genoma donante, que puede ser letal si no se repara.



o Transposición replicativa: se produce una replicación desde los extremos 3’ del

genoma aceptor, lo que acaba por duplicar el transposón, y produciendo un

genoma mixto llamado “cointegrado”. A continuación la resolvasa rompe el

cointegrado mediante una recombinación recíproca, que une los extremos del

ADN aceptor original (ahora con una de las copias del integrón) y libera el genoma

donante de nuevo con su transposón.

III. ESTRUCTURA DE UN TRANSPOSÓN

Un transposón se define como un segmento de ADN que no codifica sus propias funciones de

replicación, pero sí aquellas relacionadas con la capacidad de moverse entre los elementos de

ADN replicativos (plásmidos y cromosomas) sin la ayuda de la maquinaria recombinatoria del

hospedador. Es un elemento móvil no replicativo.

Una característica común en los transposones, exceptuando aquellos denominados transposones

Rolling Circle ‐ (RC), es que contienen secuencias repetidas en sus extremos denominadas

secuencias repetidas invertidas (IR). Son dos secuencias que, siendo una idéntica o prácticamente

idéntica a la otra, se encuentran dispuestas en orientación inversa, una en cada hebra, generando

un eje de simetría entre ellas:

En el caso de los transposones, estas secuencias generadas a cada lado del eje de simetría, no se

hallan contiguas, pero aún así siguen formando una repetición invertida. Las IR de los

transposones suelen tener varios pb (entre 10 y 30) y no siempre son una copia perfecta entre

ellas, basta con que presenten alta homología.



Otra característica común, exceptuando a los transposones RC, es la presencia adicional de

secuencias cortas repetidas directas (DR) en el ADN diana una vez ha ocurrido el proceso de

transposición (sitio diana en azul). Su presencia es consecuencia de la inserción del transposón.

Durante el proceso de transposición, la secuencia de inserción o transposón se inserta en este

corte generado en el ADN diana. Una vez ocurrida la transposición, hay un proceso natural de

rellenado de “huecos” que deriva en la formación de estas DR al duplicarse en la misma cadena:

IV. TIPOS DE TRANSPOSONES BACTERIANOS EN FUNCIÓN DE SU ESTRUCTURA GENÉTICA.

Secuencias de inserción: IS

Las secuencias de inserción son los transposones bacterianos más pequeños. Fueron descubiertas

y estudiadas, no porque transportasen ningún tipo de gen relevante, sino porque las mutaciones

insercionales que provocaban implicaban la inactivación del gen en el cual se transponían.

Actualmente se conocen múltiples familias de IS. Se denominan con las siglas IS y un número. Las

familias son: IS1, IS3, IS4, IS5, IS6, IS21, IS30, IS66, IS91, IS110, IS200/IS605, IS256, IS630, IS982,

IS1380, ISAs1 e ISL3. Su estructura es sencilla, ya que codifican poco más que la transposasa que

les permite promover su propia transposición e integrarse en multitud de sitios específicos. Esta

enzima está codificada por uno o dos marcos de lectura abierta que consumen la práctica

totalidad de la longitud del elemento. Como ya se ha apuntado en el apartado anterior, las IS van

flanqueadas por unas secuencias repetidas invertidas, IRR e IRL (Inverted Repeat Right/Left

respectivamente). Sólo algunas excepciones notables carecen de ellas: son las familias IS91, IS110

e IS200/605.



Tras la inserción se generan las DR en el ADN diana, que quedan flanqueando la IS. La longitud de

estas DR, de entre 2 y 14 pb, es característica para cada elemento y generalmente siempre se

generará una duplicación de longitud determinada, por ejemplo, para IS1 son 9 pb. Las IR tienen

una doble funcionalidad: por un lado, proporcionan el sitio exacto para el reconocimiento

específico de la transposasa, y por otro son el punto de anclaje en las reacciones de corte y

transferencia de cadena que llevan a la transposición del elemento.

TRANSPOSONES COMPUESTOS (CLASE I)

Son elementos genéticos móviles formados por una serie central de genes, que por si solos no

podrían transponerse, flanqueados por una pareja de IS del mismo tipo formando así un

transposón compuesto. Una de las diferencias con una IS, es que aporta al menos una alteración

del fenotipo celular por la expresión de dichos genes centrales.

TRANSPOSONES COMPLEJOS (CLASE II)

Se cree que los anteriores transposones de clase I surgen, por casualidad, a través de múltiples

eventos de transposición, estableciéndose de manera estable entre la población bacteriana

portadora gracias a las propiedades que confieren y permiten a dicha población sobrevivir a las

fuerzas selectivas a las que normalmente se ve afectada. El origen de la generación de esta otra

clase II de transposones está mucho menos clara que el propuesto para los de clase I.

Los transposones complejos pueden moverse entre el cromosoma bacteriano y los plásmidos

presentes en la bacteria. La estructura genética consta de una transposasa junto a una resolvasa,

más los determinantes de resistencia que transporte, todo ello flanqueado por una copia de una IR

en cada extremo. La presencia de estas dos enzimas les permite su recombinación e integración en

el cromosoma bacteriano o en plásmidos.

Hay un grupo de transposones de clase II que pueden transferirse con una estructura circular

similar a la de los plásmidos, son los transposones conjugativos.



POS DE TRANSPOSONES EN FUNCIÓN DE LA TRANSPOSASA

Transposones DDE:

Las transposasas de la mayoría de los transposones con mecanismo conservativo, y también las de

otras como Tn3, transposón con mecanismo replicativo, poseen una característica común: la

presencia de tres aminoácidos esenciales para su actividad: dos ácidos aspártico (D) y un ácido

glutámico (E), de ahí la denominación DDE. Estos tres aminoácidos no están próximos en el

polipéptido, pero sí lo están en el centro activo cuando se genera la proteína. Estas enzimas

pertenecen a una antigua superfamilia de proteínas que catalizan reacciones de transferencia de

grupos fosforilo (PO4) a través de mecanismos basados en la presencia de dos iones metálicos. Un

centro activo tal que éste se puede hallar también en otras conocidas proteínas como la integrasa

del VIH y la proteína RAG 1 (generación de anticuerpos en vertebrados) entre otros.‐

Recientemente se ha determinado este centro activo en la transposasa codificada por IS1. La

función de las TnpA de estos transposones es atrapar y mantener dos iones Mg2+ que participan

en la fragmentación del enlace fosfodiéster del ADN durante el proceso de transposición.

Transposones Y2: Transposones Rolling circle ‐ (Tn RC) ‐

Las transposasa de este tipo de transposones poseen dos tirosinas esenciales en su centro activo,

de ahí la denominación Y2. Su representante es IS91. En este caso, el mecanismo de transposición

no pasa por un intercambio de hebras, como ocurre en los transposones DDE, sino que implica un

movimiento RC para integrarse en el ADN diana. En todos los casos donde se da un movimiento

genético por RC, la proteína ejecutora tiene una tirosina en su centro activo cuya función es unirse

covalentemente al grupo fosfato en el extremo 5’ del ADN implicado en el proceso de replicación

o transferencia. Ejemplo de este tipo de mecanismo es uno de los tres tipos de replicación en

plásmidos.

Transposones S e Y.



Existe otra clase de elementos genéticos que se transfieren sin utilizar ni TnpA DDE ni TnpA Y2.‐ ‐

Según posean en su centro activo una tirosina o una serina, se denominan transposones Y y

transposones S. Este tipo de elementos están a medio camino entre integrasas y transposasas. Los

transposones Y y S se transponen por un mecanismo de recombinación no homóloga específica de‐

sitio.

V. APLICACIONES

Transposones como vectores para transgénesis estable de genes a células madre y generación de

células madre pluripotentes inducidas.

Tecnologías basadas en transposones pueden ser eficaces para transferir genes a cultivos celulares.

Por ejemplo se pueden introducir horquillas (hairpins) cortas en cromosomas para obtener un

sistema de bloqueo mediante interferencia por ARN. Los transposones son vectores prometedores

para terapia génica y celular. La eficiencia en la transferencia estable de genes por el sistema SB es

similar a la obtenida con vectores virales.

El reciente descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs: induced Pluripotent

Stem Cells) abre un futuro



prometedor para la medicina regenerativa. Con sólo inducir la expresión de los genes que codifican

las proteínas Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc se consigue transformar células somáticas en células

pluripotentes con capacidades similares a las células madre embrionarias. Inicialmente esto solo

podía conseguirse mediante retro o lenti-viral transducción, limitando su aplicación clínica por

motivos de seguridad. La variante hiperactiva SB y los transposones piggyBac muestran una

eficiencia comparable a la de los vectores virales en la transgénesis. Además el mecanismo “cortar y

pegar“ muchas veces no se completa y en los casos en los que se corta sin pegarse el transposón

desaparece. Esto permite la eliminación del transgen una vez completada la reprogramación. Ya se

ha conseguido generar iPSCs mediante el sistema de trasposición piggyBac y la eliminación del

transgen que contenía los factores responsables de la reprogramación celular. Es cierto que aún falta

cerrar del todo la posibilidad de que el transposón salte a una nueva localización durante su proceso

de eliminación del genoma, pero la reprogramación celular usando transposones como vector

augura un futuro brillante a la medicina regenerativa.

TRANSGÉNESIS EN OOCITOS Y EMBRIONES

En vertebrados, los métodos clásicos para expresar genes no presentes en el genoma se basan en la

micro-inyección de construcciones de genes en oocitos o en huevos fertilizados. Esto tiene varios

problemas como:

Baja tasa de integración

Integración de varias copias repetidas seguidas, lo que muchas veces causa el silenciamiento

de su expresión

La integración se produce tarde en el desarrollo lo que causa mosaicismo con respecto al

transgen.

Todos estos problemas se pueden solucionar usando transposones. En este sentido se ha

desarrollado ya un sistema basado en la transposasa hiperactiva SB100X que permite una

transgénesis del 45% en embriones de ratón.

MUTAGÉNESIS A ESCALA GENÓMICA



La mutagénesis de genes específicos permite diseccionar su función pero en la mayoría de los casos

la función de un gen no puede analizarse aisladamente. Es necesario estudiar cada gen dentro de las

rutas biológicas en las que participa. La mutagénesis insercional a escala de genoma realizada con

transposones permite este tipo de estudios globales y es una de la las tecnologías más productiva y

versátil de las existentes para bloquear y manipular genes a escala de genoma.

La mutagénesis insercional en células somáticas plantea el reto de trabajar con genomas diploides.

La inactivación de las 2 copias de un gen suele ser siempre necesaria para detectar cambios

fenotípicos, pero la probabilidad de generar mutaciones bialélicas de un mismo locus es

extremadamente baja. Las células embrionarias deficientes en Blm tienen una elevada tasa de

recombinación homóloga con lo que tienden a perder la heterocigosidad y en muchos casos pueden

convertir una mutación simple en una bi-alélica. El sistema Blm se usa para realizar mutagénesis

insercional a escala genómica en células somáticas. Se ha usado el transposón piggyBac en células

madre embrionarias de ratón Blm-deficientes, para buscar componentes involucrados en la

reparación de ADN. Este sistema fue capaz de detectar 4 genes involucrados en reparación de ADN

mientras que previos estudios que usaban como vector retrovirus sólo fueron capaces de detectar 2

genes.

En el sistema experimental de 2 componentes la transposición está controlada por la trans-

suplementación de la transposasa. En este sistema se acopla por un lado la transposasa, y por otro

un sistema de captura de genes (gene-trapping) que se encarga de la mutagénesis y de proporcionar

una señal detectable para poder seleccionar los mutantes. Las construcciones para captura de genes

llevan en 3’ un sitio para splicing alternativo, un gen que codifica una proteína “reporter” que sea

fácilmente detectable directa o indirectamente (fluorescencia, color) y en 5’ una secuencia poli-A

que determina la terminación de la transcripción. El sistema de 2 componentes al insertarse en un

intrón bloquea la expresión del gen en el que se inserta, pero permite la transcripción del gen

reportero que sirve para seleccionar los mutantes. Se han usado sistemas de transposición de 2

componentes basados en el uso los transposones SB, Minos, PiggyBac y Tol2.

MUTAGÉNESIS CON LINE-1



El uso del retrotransposon LINE-1 para mutagénesis tiene varias ventajas:

Como su mecanismo de transposición es de tipo “copiar y pegar” el donante se mantiene

estable.

Se pueden diseñar de forma que la transposición se produzca una sola vez

La retro-transposición puede controlarse usando sistemas como Cre-loxP

Un problema del uso de LINE-1 es que un 90% de las transposiciones se asocian con

reordenamientos y esto puede dificultar la determinación de los nuevos sitios de inserción.

TRANSPOSONES EN SISTEMAS EXPERIMENTALES DE CÁNCER

SB ha sido usado en ratón para sobre-expresar genes y generar modelos animales de cáncer

experimental. El sistema es similar al basado en retrovirus pero permite establecer tumores en

regiones como hígado y cerebro en las que antes no era posible. El sistema que asocia SB a un

sistema de captura de oncogenes permite tanto bloquear la expresión de oncogenes como sobre

expresarlos.


plasmidos y transposones

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