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Antagonismo Microbiano 2013

INTRODUCCION

Muchas bacterias producen péptidos que inhiben el crecimiento o matan a otras especies estrechamente relacionadas o incluso a otras estirpes de la misma especie, estos péptidos se denominan bacteriocinas. El Antagonismo microbiano o exclusión competitiva incluye la competencia entre microbios. Una consecuencia de esta competencia es que la microflora normal protege al huésped contra la colonización por posibles microbios patógenos porque compite por los nutrientes, produce sustancias nocivas para los microbios invasores, y afecta condiciones como el pH y la disponibilidad de oxígeno. En este practica se explicara el efecto antagónico de Streptomyces spp. frente al hongo Fusarium verticillioides causante de la pudrición del maíz. Los actinomicetos son microorganismos muy ubicuos, que se encuentran en la gran mayoría de sustratos naturales, ampliamente distribuidos en variedades de hábitats diferentes: suelo, agua marina, agua dulce, estiércol, lagos, fangos de ríos. Estos son saprofitos y algunas especies producen enfermedades en plantas, animales domésticos incluso al hombre. Se encuentran en casi todos los tipos de suelos y bajo condiciones extremas disminuyen levemente su concentración de su población. Su número varía en gran proporción según el caso, pero es común encontrarlos en suelos fértiles en una concentración de 106 ufc g-1 de suelo seco. (Balakrishna et al.,2012).

Los actinomicetos como Streptomyces spp. son cualitativamente importantes en la rizosfera y pueden colonizar las raíces en presencia de microbiota nativa. Algunos Streptomyces son asilados de semillas, hojas, tubérculos e inclusive existen estreptomicetos endofíticos, que colonizan en nichos ecológicos similares a los fitopatógenos. Estos microorganismos que se establecen y multiplican en las raíces son ideales por su antagonismo como agentes de biocontrol de hongos y bacterias causantes de enfermedades de plantas. Estos presentan mecanismo de antibiosis, degradación de fitotoxinas, síntesis de proteínas extracelulares como quitinasas y glucanasas, que degradan el constituyente mayoritario de las paredes celulares de las plantas, propiedades asociadas a su capacidad para controlar fitopatógenos como Fusarium verticillioides.

El cultivo del Maíz “Zea mays”, es el segundo cereal más sembrado en el mundo para la alimentación humana y animal, debido a su valor histórico, económico y gran capacidad de adaptabilidad a diferentes climas y suelos. En el Perú, el maíz es el cuarto cultivo más importante de actividad agrícola, generando 3600 jornales al año. En la costa se cultiva maíz amarillo duro y semiduro, destinado a la elaboración de alimentos balanceados y obtención de derivados. A su vez, en la sierra se cultiva maíces blancos amiláceos, en su mayoría para la alimentación humana. No obstante, el cultivo y rendimiento del maíz se ven afectados por diversos factores limitantes, como la baja fertilidad del suelo, asi como el ataque de fitopatógenos e insectos plagas, requiriéndose de mayores costos de inversión, con disminución de la rentabilidad del cultivo.

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1. Objetivos Determinar la actividad antagónica del Streptomyces spp. frente al hongo del

genero Fusarium. Establecer la relación de entre el hongo y la bacteria promotora del

antagonismo por medio de la inhibición del crecimiento de Fusarium en placa.

2. Materiales Material biológico: Mazorca de maíz nativa - Cepa de Azotobacter spp. Medios de Cultivo: Agar papa dextrosa (PDA) + Antibiótico Placas petri Tubos dilución Beakers Papel secante Ansas bacteriológicas Sacabocado Solución de Hipoclorito de Sodio al 10% Agua destilada estéril

3. Fundamento Teórico 3.1. Aislamiento e Identificación de Fusarium verticillioides

En campos comerciales de maíz donde se observe síntomas de pudrición de tallo y de la mazorca colectar cinco tallos y aleatoriamente 200 granos de maíz, procedentes de diez mazorcas desgranadas y recién cosechadas en el campo. Para el aislamiento de hongos según Ríos & Zuñiga (2012), lavar los tallos para eliminar el exceso de suelo adherente. Después, en asepsia cortar en fragmentos aproximados de 1 cm, que serán depositados en un vaso de precipitación, donde se adicionaran 40 mL. de hipoclorito de sodio comercial al 10% (v/v) y se homogenizara el contenido con movimientos rotatorios durante 2 minutos. A continuación, eliminar el sobrenadante y vertir 50 mL. de agua destilada estéril. A su vez, seleccionar 60 granos de maíz aleatoriamente y según García & Martínez (2010) desinfectarlos superficialmente con Hipoclorito de sodio comercial al 1% (v/v) durante un minuto. Finalizada la desinfección, los fragmentos de tejido vegetal y semillas de maíz serán depositados sobre papel filtro estéril, para eliminar el exceso de humedad y luego serán llevados en número de seis, dispuestos radialmente sobre placas de petri con agar papa dextrosa (PDA) más cloranfenicol. Después de la incubación a 30°C, hasta por siete días, fragmentos delos micelios desarrollados se cultivaran en viales con PDA, se incubaran a 30°C, por cuatro días y constituirán los cultivos puros de hongos, que serán guardados en refrigeración. La identificación de los hongos fitopatógenos se realizara según las claves de Barnett y Hunter (1999).

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3.2. Prueba de antagonismoPara la prueba de antagonismo utilizar la técnica de enfrentamiento en “cultivo dual” descrita por Fernández & Vega (2001), según la cual cada bacteria nativa se siembra masivamente en un extremo de la placa petri con PDA, ocupando aproximadamente un cuarto del área de la placa y se incuba a 30°C/72 hrs. A continuación, un fragmento del hongo fitopatogeno se deposita en el extremo dela placa opuesto al de la bacteria y se incuba a 30°C., hasta que el patógeno detenga su crecimiento. Después de cinco días de medir el radio de la colonia del hongo fitopatogeno y comparar con una placa testigo para determinar si el crecimiento fúngico es afectado por Streptomyces spp. Los resultados se expresan con porcentaje de inhibición del crecimiento respecto al testigo.

4. Procedimiento

4.1. En primer lugar obtenemos la mazorca entera (con apariencia enferma), será luego desgranada y los granos de maíz (15 gr. Aprox.) serán tratados con lavados de Hipoclorito de Sodio al 10%.

4.2. Después lavar con agua destilada, realizar este procedimiento dos veces; luego de esto los granos de maíz serán puestos en un papel secante o absorbente, previamente estéril, esto evitara que el maíz tenga un exceso de humedad.

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4.3. Una vez seca las semillas, se procede a sembrar en la placa con el medio de PDA más antibiótico, los granos serán predispuestos en un círculo y un grano en el centro (en total siete granos). Este estará en incubación hasta por siete días a una temperatura de 30°C. Después del tiempo de incubación se observara un micelio característico del hongo fitopatogeno (color salmón); se escogerá el grano con las características mencionadas, para su posterior trabajo.

4.4. Los mejores granos que produjeron el fitopatogeno serán sembrandos en un tubo con medio PDA para obtener un cultivo del hongo. Una vez crecido el hongo en el medio se replicara en placa con medio PDA, para tener el hongo puro; esta vez sin el grano de maíz.

4.5. Antes de demostrar la prueba de antagonismo, se debió tener una placa con PDA en la cual se sembró la bacteria Azotobacter spp. (centro de la placa con un 1cm de grosor) inhibidora de crecimiento (efecto antagónico), esta será incubada a 30°C/ 24 hrs.

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4.6. Una vez la placa de PDA con la bacteria ya crecida se procede a realizar la prueba de antagonismo, para ello es necesario obtener una pequeña área del hongo fitopatogeno, esto se logra con un sacabocado estéril que corta círculos del hongo más el medio. Estos serán depositados en los extremos de la placa (2 bocados), para ello será necesario que se tenga un placa control para ver el crecimiento y comparar el porcentaje de antagonismo con la del control.

5. Resultados La bacteria sembrada en la prueba de antagonismo, inhibió el crecimiento del hongo fitopatógeno, para ello se midió el diámetro de crecimiento en centímetros del hongo en un periodo de 3 días, con el promedio de desarrollo de los halos se pudo obtener el porcentaje de inhibición por cada día; esto fue comparado con la placa testigo para comparar los resultados y que estos sean de una manera fiables.

Tabla 1. Porcentaje de Inhibición de Azotobacter spp. Bacteria promotora de antagonismo

6. Conclusiones La práctica cumplió con los objetivos propuestos, pues se demostró concretamente la prueba de antagonismo microbiano, por parte del microorganismo Azotobacter

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Tiempo (horas)

Diámetro (cm) Inhibición (%)Bacteria Testigo

72 2.3 -2 2.4-2.5 12.24%96 2.9-2.6 3.1-3.2 12.69%120 3.2-3.4 3.9-4.1 17.5%


spp. en contra del hongo fitopatogeno Fusarium spp. lo cual fue observado en placa, indicando que el la bacteria es capaz de producir sustancias inhibitorias (células, quitinasas, proteasas, etc) que no permiten el crecimiento del hongo en presencia de estos factores. El porcentaje de inhibición demostró cuantitativamente como el hongo es inhibido por la bacteria, por medición de sus diámetros se pudo obtener estos datos casi exactos, además la presencia de un testigo es importante para realizar cálculos y obtener datos más fiables, todo este proceso de antagonismo microbiano se realizó enfrentando la bacteria al hongo en un periodo de 3 días, aunque la teoría indica que se debería realizar con más tiempo, para obtener resultados más precisos.

Bibliografía

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Franco, M. (2008). Evaluacion de caracteres PGPR en Actinomicetos e Interacciones de estas Rizobacterias con Hongos formadores de Micorrizas. Tesis de Doctorado.Universidad de Granada, España.

Garcia, G & Martinez, F. (2010). Especies de Fusarium en granos de maíz recién cosechado y desgranado en el campo en la región de Ciudad Serdan, Puebla. Revista Mexicana de Biodiversidad, 81, 15-20.

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