benemÉrita universidad autÓnoma de puebla posgrado … · además, existen diversos factores...
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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA
POSGRADO EN CIENCIAS MICROBIOLÓGICAS
INSTITUTO DE CIENCIAS (ICUAP)
“BÚSQUEDA DE GENES RELACIONADOS CON LA
RESISTENCIA A DESECACIÓN EN BACTERIAS,
MEDIANTE METAGENÓMICA DE SUELOS DE PUEBLA Y
QUERÉTARO.”
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS
(MICROBIOLOGÍA) CON OPCIÓN EN BIOQUÍMICA Y
GENÉTICA MICROBIANA
Presenta:
Lic. QFB Daniel Vazquez Sandoval
Director de tesis:
D. C. Verónica Quintero Hernández
Puebla, Pue. Enero 2019
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1. AGRADECIMIENTOS
Se agradece a la Vicerrectoría de Investigación y Estudios de Posgrado por el apoyo
otorgado para la conclusión de esta tesis dentro del programa II. Investigación y
posgrado. Aseguramiento de la calidad en el posgrado. Indicador establecido en el
plan de desarrollo institucional 2013-2017.
Se agradece el apoyo brindado de CONACyt para la realización de esta tesis, con
número de becario: 603790
Agradezco a mi directora de tesis la Dra. Verónica Quintero Hernández por la
confianza depositada en mí y permitirme realizar el presente trabajo. Al Dr. Jesús
Muños Rojas por permitirme el acceso al laboratorio de Ecología Molecular
Microbiana, así como el uso de sus equipos e instalaciones. Le agradezco a la Dra.
América Paulina Rivera Urbalejo por el apoyo técnico en el laboratorio y por
compartir sus conocimientos. A la Dra. Griselda Karina Guillen y al Dr. Antonino
Báez por sus observaciones durante la elaboración de la tesis.
Me gustaría que estas líneas sirvieran para expresar mi más profundo y sincero
agradecimiento a todas aquellas personas que directa o indirectamente participaron
opinando, corrigiendo y animándome: Flor, Lilia, Lesther, Laura Abisai, Sonia,
Maritza, Raúl, Osvaldo y Ana Laura, con su ayuda han colaborado en la realización
del presente trabajo
Sobre todo, quiero agradecer a mi familia y a mis padres por su cariño y apoyo
incondicional que me otorgaron, por a ver entendido mis ausencias y mis malos
momentos; a pesar de la distancia, de una u otra forma estuvieron conmigo cada
uno de ustedes aportando un granito de arena; las palabras nunca serán suficientes
para expresar mi aprecio y agradecimiento.
¡Gracias a todos!
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2. ÍNDICE
1. AGRADECIMIENTOS ....................................................................................... 1
2. ÍNDICE .............................................................................................................. 2
3. RESUMEN ........................................................................................................ 4
4. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 5
4.1 Fertilizantes para incrementar el rendimiento de los cultivos ............................ 5
4.2 Microorganismos promotores del crecimiento de plantas ................................. 7
4.3 Desecación ........................................................................................................ 8
4.4 Anhidrobiosis ..................................................................................................... 8
4.5 Microorganismos no cultivables ...................................................................... 10
4.6 Metagenómica ................................................................................................. 11
5. ANTECEDENTES ........................................................................................... 15
6. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 18
7. OBJETIVOS .................................................................................................... 19
7.1 Objetivo general .............................................................................................. 19
7.2 Objetivos específicos ...................................................................................... 19
8. METODOLOGÍA ............................................................................................. 20
8.1 Obtención y liofilización de muestras de suelos áridos ................................... 20
8.2 Extracción de dna ............................................................................................ 20
8.3 Construcción de la biblioteca metagenómica .................................................. 21
8.4 Ensayos de desecación controlada ................................................................. 22
8.4.1 Liofilización por 24 horas .............................................................................. 23
8.4.2 Liofilización por 48 horas .............................................................................. 24
8.5 Ensayos de estrés osmótico por NaCl ............................................................ 24
8.6 Verificación de las cepas ................................................................................. 25
8.7 Análisis estadístico .......................................................................................... 25
9. RESULTADOS ............................................................................................... 26
9.1 Extracción de DNA de suelos áridos liofilizados .............................................. 26
9.2 Construcción de la biblioteca metagenómica .................................................. 27
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9.3 Búsqueda de genes de resistencia a desecación ........................................... 29
9.4 Corroboración del fenotipo de resistencia a desecación controlada ............... 32
9.5 Verificación de la identidad de la cepa utilizada y recuperada después de la
liofilización. ............................................................................................................ 36
9.6 Ensayos de estrés osmótico por NaCl ............................................................ 38
10. DISCUSIÓN................................................................................................. 40
11. CONCLUSIONES ........................................................................................ 45
12. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 46
13. ANEXOS ..................................................................................................... 52
Anexo A: Extracción de DNA utilizando el kit ZR Soil Microbe DNA Miniprep™ ... 52
Anexo B: Preparación de células competentes ..................................................... 53
Anexo C: Técnica de goteo en placa para la cuantificación de colonias bacterianas
.............................................................................................................................. 53
Anexo D: Técnica de goteo por sellado en placa masivo (GSPM) ........................ 53
Anexo E: PCR de colonia ...................................................................................... 54
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3. RESUMEN
En el presente trabajo se realizó la búsqueda de genes relacionados con la
resistencia a desecación en bacterias, mediante metagenómica de suelos áridos. A
partir del DNA extraído de los microorganismos presentes en una muestra de suelo
árido liofilizada se logró generar una biblioteca metagenómica utilizando como cepa
receptora a E. coli DH5α. Con el objetivo de seleccionar solo las clonas que
presentaran el fenotipo de resistencia a la desecación, se realizó un pre-screening
(pre-selección) el cual consistió en liofilizar durante 24 h y 48 h los diferentes pools
de la banca metagenómica. Obteniendo que algunos pools de la biblioteca
presentaron una mayor resistencia a la desecación en comparación a los controles,
lo cual podría indicar un sinergismo entre varias clonas presentes en esos pools
evaluados. Para intentar obtener una clona aislada con resistencia a la desecación
las colonias obtenidas en el pre-screening de liofilización fueron sometidas a una
segunda prueba de desecación, lamentablemente no se logró obtener clonas
aisladas resistentes a la desecación. Los experimentos realizados en este trabajo
de investigación demostraron que la clonación de fragmentos grandes de DNA
metagenómico en las clonas evaluadas no afectó su resistencia a la desecación sin
embargo se observó una disminución en su resistencia al estrés osmótico por NaCl.
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4. INTRODUCCIÓN De acuerdo con los datos proporcionados por el fondo de población de las naciones
unidas (UNFPA) el crecimiento poblacional ha aumentado drásticamente con los
últimos años y se estima que seguirá en aumento (UNFPA, 2014). Como
consecuencia de este incremento, la agricultura ha enfrentado el reto de cómo
intensificar y obtener mayor rendimiento de los cultivos para abastecer de alimento
a la población mundial que va en aumento (Gibbon, 2012).
4.1 Fertilizantes para incrementar el rendimiento de los cultivos Entre los años 1960-1980 por primera vez se generó un incremento en la
productividad agrícola, a este fenómeno se le conoce como “Revolución verde”,
cuyo propósito era eliminar el hambre mediante un mayor rendimiento de los
cultivos, utilizando como estrategia la aplicación de grandes cantidades de
fertilizantes químicos, pesticidas, mayor irrigación y nuevas variedades de cultivos;
esta iniciativa fue propuesta por Norman E. Borlaug quien es considerado el padre
de la revolución verde y por la que recibió el Premio Nobel de la Paz en 1970
(Novotny et al., 2009). En los últimos años la utilización de fertilizantes químicos se
ha convertido en una práctica común en todo el mundo (Figura 1). Sin embargo, los
rendimientos por unidad de fertilizante aplicado han ido disminuyendo desde 1960
(Figura 2). El uso intensivo de fertilizantes ha generado efectos adversos en el
ambiente, ha ocasionado que el agua subterránea de zonas agrícolas se contamine
con nitratos, se acelere la eutrofización del agua y se provoque la acidificación del
suelo, por otra parte, tiene un impacto adverso sobre las comunidades microbianas
del suelo reduciendo significativamente la biodiversidad microbiana (Vassilev et al.,
2015).
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Figura 1. Uso de fertilizantes a nivel mundial en el periodo 1960 – 2004. Gráfica tomada de:
Novotny et al., 2009.
Figura 2. Rendimiento de la cosecha de granos por unidad de masa de fertilizante aplicado.
Gráfica tomada de: Novotny et al., 2009.
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4.2 Microorganismos promotores del crecimiento de plantas
Como alternativa a la aplicación de fertilizantes, se ha propuesto el uso de
microorganismos promotores del crecimiento de plantas (PGPM), los cuales son
microorganismos capaces de colonizar la rizosfera y/o las raíces de las plantas así
como de promover el crecimiento de las plantas mediante diversos mecanismos
como fijación de nitrógeno, solubilización de nutrimentos, producción de
fitohormonas, antagonismo de patógenos y mediante la producción de sideróforos,
antibióticos así como quitinasas (Kumar, 2016). Los PGPM se pueden dividir en dos
grupos: bacterias y hongos (Figura 3). Las bacterias pertenecientes a los PGPM
pueden clasificarse dependiendo del tipo de asociación que realice con la planta,
por lo que pueden ser bacterias intracelulares o bacterias inter/extracelulares. En el
caso de los hongos estos pueden ser hongos de tipo no micorriza asociados a raíz
(RAF) o micorrizas (Owen, Williams, Griffith, y Withers, 2015). Debido a las
características de los PGPM se han realizado varios esfuerzos para poder utilizar a
estos microorganismos como biofertilizantes, siendo esta una de las alternativas
más prometedoras para la agricultura, y cada año se incrementa la utilización de
estos a menudo con el fin de reducir la utilización de productos químicos en la
agricultura (Malusà y Vassilev, 2014).
Figura 3. Principales microorganismos promotores del crecimiento de plantas utilizados en
biofertilizantes comerciales. Figura modificada de: Owen, Williams, Griffith, y Withers, 2015.
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Cabe señalar que los biofertilizantes a base de PGPM no han sido ampliamente
aceptados por los agricultores, debido a que frecuentemente es difícil reproducir sus
efectos benéficos a nivel de campo. Es evidente que, si un inoculante microbiano
no se produce, formula o aplica adecuadamente, los beneficios del biofertilizante no
pueden ser adquiridos (Bashan et al., 2014; Vassilev et al., 2015).
Además, existen diversos factores bióticos (la depredación por protozoarios, el
antagonismo microbiano) y abióticos (la temperatura, el pH, la disponibilidad de
nutrimentos, etc.), a los que se enfrentan los microorganismos después de ser
introducidos en el suelo, estos factores ocasionan una disminución progresiva en la
población microbiana inoculada. Uno de los factores que más limita el efecto de un
biofertilizante es la disponibilidad de agua en el ambiente, si el agua es escasa, los
microorganismos pueden morir en los primeros momentos de la interacción con las
plantas (Vilchez y Manzanera, 2011).
4.3 Desecación En la célula, el agua tiene diferentes funciones, actúa como disolvente de diversas
moléculas, como sustrato o producto de la actividad metabólica, además ayuda al
mantenimiento de la integridad estructural y funcional de la membrana y de las
macromoléculas (Weekers, Rodriguez, Jacques, Mergeay, y Thonart, 2001). Es
importante diferenciar entre sequía y desecación: la sequía es baja disponibilidad
de agua en el ambiente, muchos organismos son capaces de sobrevivir a la sequía
a través de mecanismos tales como el almacenamiento de agua, pero no sobreviven
a la desecación. Por otra parte, la desecación es la pérdida de agua en las células.
Una definición cuantitativa de la desecación total es la pérdida de agua hasta
alcanzar un valor de 0.1 g de agua por cada gramo de masa seca, lo que genera
que el metabolismo en esta célula se detenga. Con base a esta definición se
considera que existen dos tipos de desecación las cuales pueden ser total o parcial;
en esta última el metabolismo de la célula no se detiene (Alpert, 2005).
4.4 Anhidrobiosis
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Como grupo, los microorganismos tienen la capacidad para adaptarse a ambientes
extremos, la definición de ambiente extremo desde un punto de vista
antropocéntrico es donde las condiciones fisicoquímicas difieren de las requeridas
por los seres humanos para vivir. Este concepto de ambiente extremo no
necesariamente puede ser apropiado para los microorganismos, debido a que
estos se encuentran prácticamente en todo tipo de hábitats; ambientes que
consideramos extremos pueden ser habitados por un microbiota adaptada a este
entorno. Para fines prácticos nos referiremos a ambientes extremos desde un punto
de vista antropocéntrico (Torsvik y Øvreås, 2008).
Las condiciones ambientales extremas obligan a los organismos a desarrollar
mecanismos eficaces de protección celular y molecular, tal es el caso de diversos
organismos anhidrobióticos, los cuales son capaces de sobrevivir a periodos de
desecación mediante un fenómeno conocido como anhidrobiosis (Gusev et al.,
2010). La anhidrobiosis o tolerancia a la desecación se define generalmente como
la capacidad que posee un organismo para perder agua intracelular hasta llegar a
un equilibrio con un ambiente seco y posteriormente al ser hidratado recuperar su
estado fisiológico normal (Alpert, 2005). Otros organismos sometidos a la
desecación presentan un daño en sus orgánulos y membranas, como ocurre en la
mayoría de los animales los cuales pueden llegar a morir si pierden más de un 15 –
20 % de agua, lo mismo ocurre para la mayoría de las plantas superiores las cuales
pueden morir si pierden del 20 - 50% de su contenido de agua.
La mayoría de los organismos anhidrobióticos presentan estrategias para la
deshidratación lenta, esto quiere decir que no pueden sobrevivir a la desecación
total a menos que hayan experimentado un primer período de pérdida de agua; esta
pérdida es en forma gradual y a una humedad relativa alta; durante este periodo de
deshidratación lenta se inducen diferentes mecanismos relacionados con la
anhidrobiosis. Otros organismos anhidrobióticos son capaces de pasar de un estado
completamente hidratado a un estado de desecación total en un corto periodo de
tiempo, esta tolerancia a la desecación está caracterizada por la expresión
constitutiva de moléculas protectoras y un mecanismo inducible de reparación que
es activado después de la rehidratación (Tyson et al., 2012). Se han logrado aislar
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bacterias resistentes a la desecación a partir de muestras de suelo que previamente
fueron sometidas a un tratamiento de secado, lo cual indica que los factores de
estrés juegan un papel importante en la diversidad bacteriana, incrementando la
posibilidad de aislar bacterias de interés cuando son sometidas a una condición de
estrés deseada (Rokitko et al., 2003).
Los suelos poseen una gran diversidad microbiana, lamentablemente ha sido poco
explorada debido a que una gran cantidad de microorganismos no se ha logrado
cultivar utilizando medios convencionales, por lo tanto, la caracterización de estos
microorganismos no cultivables no está disponible a través de métodos comunes,
actualmente la metagenómica ha permitido el análisis del material genético de la
mayoría de los microorganismos presentes en una muestra de un determinado
ambiente (Liu et al., 2016).
4.5 Microorganismos no cultivables
Entre las evidencias de que los microorganismos cultivados no representan la
diversidad total, se encuentra la “anomalía del recuento en placa”, la cual consiste
en una gran discrepancia entre la población estimada de una muestra ambiental
mediante diluciones en placa y la estimada por microscopia. Las discrepancias
pueden ser bastante evidentes llegando a diferir de 104 a 106 UFC (unidades
formadoras de colonias) en el recuento de placas comparado con células viables
estimadas por tinción de naranja de acridina (Handelsman, 2004; Harwani, 2012).
Otra evidencia en la que se apoya esta idea es el concepto de organismo viable no
cultivable el cual surgió cuando se demostró que cepas de Vibrio cholerae estaban
vivas y eran virulentas cuando se aislaron de ambientes acuáticos, pero no
crecieron en cultivo hasta después de pasar a través de un hospedero
(Handelsman, 2004). Evidencia adicional de la presencia de bacterias que no se
pueden cultivar en el laboratorio proviene de herramientas moleculares como la
secuenciación del gen 16S rRNA, lo cual permitió obtener información de la
diversidad microbiana independientemente de la viabilidad del organismo que
albergaba el DNA (Handelsman, 2004; Harwani, 2012; Stewart, 2012). La palabra
incultivable o no cultivable indica que, con las técnicas de cultivo de laboratorio
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actuales y en los medios de cultivo disponibles, una determinada bacteria no puede
crecer en el laboratorio. Se espera que muchos de los microorganismos que
actualmente no se pueden cultivar en el laboratorio puedan llegar a ser cultivados
en el futuro, por lo tanto, incultivable no significa que nunca se pueda cultivar, sino
que, actualmente carecemos de información sobre la biología de este
microrganismo (Stewart, 2012). Los microorganismos no cultivables no se han
logrado aislar debido a diversas razones, como la falta de simbiontes, nutrientes o
superficies necesarias, compuestos inhibidores excesivos, combinaciones
incorrectas de temperatura, presión o composición de gases atmosféricos,
acumulación de desechos tóxicos de su propio metabolismo y la velocidad de
crecimiento intrínsecamente lento o dispersión rápida de las colonias (Barua et al.,
2017).
La microbiología ha experimentado cambios durante las últimas décadas debido a
que se demostró que la mayoría de los microorganismos no pueden cultivarse en
las condiciones del laboratorio, lo cual nos ha obligado a replantearnos qué tanto se
conoce acerca de la diversidad microbiana y metabólica debido a que nuestro
conocimiento sobre la vida microbiana se basaba en información obtenida
exclusivamente de organismos cultivados. El punto central del nuevo enfoque de la
microbiología está en la comprensión de que es menor la cantidad de
microorganismos cultivables (se estima que el 0.1- 1%) en comparación al gran
número de microorganismos no cultivables y que este mundo invisible puede ser
estudiado mediante nuevos enfoques como la metagenómica (Solden et al., 2016).
4.6 Metagenómica
La metagenómica se enfoca al estudio de los genomas colectivos en una comunidad
ambiental sin la necesidad del cultivo o el aislamiento de los microorganismos,
mediante un conjunto de técnicas de biología molecular, bioinformática, genómica
y otras ciencias ómicas. Tal comunidad puede ser de suelo o de una muestra de
agua, del intestino o de heces fecales humanas, etc. Estas muestras a través del
análisis metagenómico proporcionan más información de las comunidades
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microbianas totales que la información que podrían proporcionar las poblaciones
cultivables, aportando información sobre el potencial metabólico, la historia
evolutiva de los microbios, la composición microbiana de un nicho ecológico y sus
interacciones, etc. (Handelsman et al., 2007; Singh et al., 2008).
La metagenómica puede dividirse en dos categorías: la metagenómica funcional, la
cual se basa en el tamizado de las bibliotecas de expresión clonal con el objetivo de
buscar genes con una función determinada; y la metagenómica estructural, la cual
consiste en un análisis bioinformático de los datos obtenidos durante la
secuenciación de DNA metagenómico. El primer enfoque se centra en la búsqueda
de funciones distintas o de una función específica en lugar de una descripción de
toda la comunidad, lo que permite descubrir nuevos genes que no han sido descritos
anteriormente. El segundo enfoque trata de resolver dos preguntas clave con los
datos obtenidos de la secuenciación del DNA metagenómico: ¿Qué
microorganismos están presentes en él? y ¿Qué hace cada uno de ellos? (Ravin et
al., 2015).
Los estudios metagenómicos generalmente consisten en la clonación de
fragmentos de DNA aislados directamente de la mayoría de los microorganismos
presentes en un ambiente dado, seguido de la secuenciación y/o análisis funcional
de los fragmentos clonados (figura 4).
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Figura 4. Representación esquemática de un estudio metagenómico a partir de muestras
ambientales. Esquema modificado de: Handelsman, 2004.
En la última década, la metagenómica se ha utilizado como una poderosa
herramienta para el descubrimiento de nuevas enzimas y otras valiosas
biomoléculas producidas por microorganismos no cultivados. La mayoría de las
investigaciones que utilizan esta tecnología tiene como objetivo demostrar la
distribución de genes en un entorno específico, esto incluye la asignación de
funciones putativas a proteínas a través de homología de secuencia o ensayos
basados en actividad. Se han aislado nuevas enzimas de bibliotecas
metagenómicas construidas a partir de diversos ambientes, muchas con potencial
para aplicaciones biotecnológicas e industriales (tabla1).
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Tabla 1. Ejemplos de trabajos donde se ha utilizado metagenómica funcional para la búsqueda
de compuestos o enzimas de interés
Muestra Cepa receptora del DNA
metagenómico
Vector Compuesto o enzima
encontrada
Referencia
Suelo Agrobacterium tumefaciens
Burkholderia graminis
Caulobacter vibrioides
Escherichia coli
Pseudomonas putida
Ralstonia metallidurans
pJWC1 Compuesto con actividad
antimicrobiana: N-(4-amino-2-
hidroxibutil) tetradecanamida y
aminoácidos N-acil aromáticos
Craig et al.,2010
Suelo E. coli TOP 10 pZerO-2 Enzima estireno
monooxigenasa
Van Hellemond et
al., 2007
Suelo E. coli DH10B pBeloBAC11 Compuesto con actividad
antimicrobiana: ampicomicina
A y turbomicina B
Gillespie et al., 2002
Sedimento
de mar
E. coli DH5α puc19 Enzima quitin desacetilasa Liu et al., 2016
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5. ANTECEDENTES
El genoma de Pseudomonas putida KT2440 está formado por un solo cromosoma
circular, constituido por 6 181 863 pb con un contenido medio de G + C de 61.6 %,
es el huésped preferido para la clonación y expresión de genes provenientes de
bacterias Gram negativas del suelo (Nelson et al., 2002). Pseudomonas putida
KT2440 es capaz de colonizar la raíz de diferentes plantas (Espinosa, Kolter, y
Ramos, 2002). Mediante quimiotaxis es capaz de reconocer todos los intermediarios
del ciclo de los ácidos tricarboxilicos (TCA) presentes en los exudados de las raíces,
estos son reconocidos por quimiorreceptores MCPS, los cuales transmiten una
señal al motor flagelar, lo que promueve que P. putida se movilice hacia las raíces
(Lacal et al., 2010). Las características anteriores, hacen de P. putida KT2440 una
especie de gran potencial biotecnológico en el área agrícola, ya que representa una
buena alternativa para la rizorremediación de compuestos xenobióticos y la
promoción del crecimiento en plantas. Sin embargo, algunos estudios han
demostrado que P. putida KT2440 es sensible a la desecación (Manzanera et al.,
2002; Pazos, 2011; Pazos, et al., 2018). Muñoz et al., (2006) mencionan que
algunos disacáridos pueden proteger a P. putida KT2440 de la liofilización, sin
embargo, los resultados son a corto plazo y hacen falta más estudios para
determinar la estabilidad y viabilidad de la cepa durante su supervivencia a largo
plazo en condiciones ambientales. También se ha observado que Klebsiella
variicola T29A2 es capaz de proteger a P. putida KT2440 de la desecación, cuando
son co-inoculadas y algunos genes implicados en esta protección se están
explorando (Hernández, 2015). De acuerdo a lo anterior, la supervivencia de P.
putida KT2440, puede mantenerse con ayuda de diversos mecanismos. No
obstante, la importancia de lograr que esta cepa resista periodos largos de
desecación de manera eficiente radica en la posibilidad de integrarla a
bioinoculantes bacterianos con un efecto benéfico mayor y más prolongado.
Para comprender la respuesta al estrés por desecación se han utilizado a otras
bacterias como modelo de estudio, una de estas bacterias es Klebsiella variicola
T29A2, la cual se utilizó para generar una banca de 8974 mutantes mediante
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mutagénesis al azar, identificando 15 mutantes sensibles a la desecación y varios
posibles genes involucrados en la respuesta al estrés por desecación (Corral, 2010).
Otra bacteria utilizada como modelo de estudio ha sido E. coli la cual es una cepa
sensible a la desecación como lo demuestran varios estudios (Billi et al., 2000; Leslie
et al., 1995). Actualmente se sabe que los mecanismos de respuesta a diversos
tipos de estrés pueden o no estar relacionados, tal y como reporto Rodríguez quien evaluó la supervivencia a congelación descongelación y salinidad de15 mutantes de
K. variicola T29A2 sensibles a desecación (Rodríguez, 2011).
El aislamiento de bacterias resistentes a desecación a partir de suelos secos ha sido
reportado en varios estudios (Narváez, et al., 2010; Rokitko et al., 2003). La
República Mexicana tiene 1,056,830 km2 de zonas áridas, semiáridas o
subhúmedas que representan el 54% de la superficie total de nuestro territorio (Abd
El-Ghani et al., 2017). De esta superficie, las zonas áridas representan el 15.7%; las
semiáridas, el 58% y el 26.3% restante corresponde a las zonas subhúmedas secas
(SEMARNAT, 2013). De los 32 estados que conforman la República Mexicana, 25
de ellos presentan áreas áridas en mayor o menor proporción, entre estos Puebla y
Querétaro poseen pequeñas zonas áridas y semiáridas en las cuales el número de
meses secos al año varía de 8 a 10 meses (Abd El-Ghani et al., 2017). En el sur y
centro oeste del estado de puebla el clima es seco y semiseco, con una precipitación
pluvial media anual que varía de 125 a 400 mm y de 400 a 600 mm, dependiendo
de la zona (figura 5) (CONABIO, 2019), la temperatura media es 22 a 28 °C y de 18
a 22 °C respectivamente (figura 6) (SEMARNAT, 2019). El estado de Querétaro
presenta clima seco y semiseco localizado en la región centro, con una precipitación
pluvial media anual de 400 a 600 mm (CONABIO, 2019) y una temperatura media
de 12 a 16 °C (SEMARNAT, 2019).
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Figura 5. Precipitación pluvial media anual de los estados de Puebla y Querétaro, donde los
colores representan la cantidad de precipitación pluvial media anual de cada zona. Figura
modificada de: CONABIO, 2019.
Figura 6. Temperatura media anual de los estados de Puebla y Querétaro, donde los colores
representan la temperatura media anual. Fuente modificado de SEMARNAT, 2019.
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6. JUSTIFICACIÓN
Actualmente en la agricultura, los esfuerzos científicos se centran en el aislamiento
y selección de microorganismos benéficos de plantas y su posterior aplicación en
el sistema suelo-planta en condiciones controladas. Lamentablemente cuando los
microorganismos benéficos se exponen a condiciones ambientales no siempre se
puede garantizar su viabilidad, debido a que existen diversos factores bióticos y
abióticos que limitan la función benéfica. Uno de estos factores abióticos limitantes
es la desecación, la cual pueden sufrir los microorganismos una vez que son
aplicados en los suelos, por lo que encontrar genes que confieran resistencia a
bacterias benéficas sensibles a la desecación es de gran relevancia. Lograr que
una bacteria perteneciente a los PGPM resista periodos largos de desecación
asegura que este fenómeno no será un factor limitante para su efecto benéfico, lo
cual posibilita la integración de dicha bacteria a la formulación de diversos
biofertilizantes. La existencia de microorganismos adaptados a un amplio rango de
condiciones fisicoquímicas, mediante diferentes mecanismos moleculares
implicados, como consecuencia de la expresión de ciertos genes bajo esas
condiciones ambientales, posibilita la opción de clonar genes que confieran el
mismo fenotipo a otros microorganismos. En este proyecto se plantea realizar
estudios de metagenómica de suelos áridos poco perturbados de los estados de
Puebla y Querétaro, para descubrir genes que confieran tolerancia a la desecación
a la bacteria benéfica sensible P. putida KT2440.
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7. OBJETIVOS
7.1 Objetivo general
Generar librerías metagenómicas a partir de DNA aislado de suelos áridos de
Puebla y Querétaro para realizar búsqueda de genes que confieran tolerancia a la
desecación a P. putida KT2440.
7.2 Objetivos específicos
Conseguir DNA total de los microorganismos presentes en los suelos colectados y
liofilizados.
Generar librerías metagenómicas a partir de DNA aislado.
Obtener clonas resistentes a la desecación controlada a partir de la librería
metagenómica generada.
Identificar las secuencias de DNA que confieran resistencia a las clonas obtenidas
de la librería metagenómica mediante secuenciación y análisis.
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8. METODOLOGÍA
8.1 Obtención y liofilización de muestras de suelos áridos
Se recolectaron muestras de suelos áridos procedentes de los estados de Puebla y
Querétaro las cuales fueron tomadas de la parte superficial de los suelos y
transportadas en tubos Falcon de 50 ml estériles, para posteriormente ser
liofilizadas y resguardadas para su posterior uso. Las muestras se liofilizaron en un
liofilizador Virtis SP Scientific, previamente a la liofilización se colocó un tapón de
algodón a cada uno de los tubos que contenían las muestras de suelo,
posteriormente se congelaron durante 24 horas a -20 °C, el proceso de liofilización
se realizó durante 48 horas bajo las siguientes condiciones: el condensador se pre-
enfrió a -40 ºC una vez alcanzada esta temperatura se colocaron las muestras en la
cámara del equipo, a continuación se estabilizo la temperatura del condensador a
-50 ºC y a una presión de vacío de 100 militorr.
8.2 Extracción de DNA A partir de las muestras liofilizadas se seleccionaron 4 muestras de suelo a las
cuales se les realizó la extracción de DNA. Para la extracción del DNA se utilizó el
kit ZR Soil Microbe DNA MiniPrep™ con base a las instrucciones del fabricante (ver
anexo A). Para determinar la integridad del DNA metagenómico extraído se realizó
una electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) en TAE 1X teñido con GelRed™ y
se visualizó el DNA utilizando un transiluminador. La concentración del DNA se
determinó mediante espectrofotometría a las siguientes longitudes de onda 230 nm,
260 nm y 280 nm utilizando un espectrómetro NanoDrop ™. Una disminución en la
relación de absorbancia a 260 nm/230 nm (<1.2) y 260 nm/280 nm (<1.7) se utilizó
como indicador de la presencia de ácidos húmicos y proteínas respectivamente.
21
8.3 Construcción de la biblioteca metagenómica Para este proyecto se planteó el uso del vector de amplio espectro de hospedero
pLAFR-3 (figura 7), el cual posee un cassette de resistencia a tetraciclina y en su
sitio de clonación múltiple (MCS) al gen lacZ que codifica para la proteína -
galactosidasa. Por lo anterior se verificó la α complementación del gen lacZ en E.
coli DH5α, por dicho vector, con el propósito de utilizar el gen lacZ como gen
reportero y de esa forma facilitar la identificación de clonas de E. coli DH5α con el
vector pLAFR-3 más un inserto de DNA total. Una vez verificada la α
complementación del gen lacZ se prosiguió con la construcción de la biblioteca
metagenómica para lo cual el vector pLAFR-3 se linealizó con la enzima de
restricción BamHI y posteriormente se desfosforiló utilizando la enzima fosfatasa
alcalina de camarón SAP con base a las instrucciones del fabricante. Por otra parte,
se realizó la digestión parcial del DNA metagenómico utilizando la enzima de
restricción Sau3AI en este paso se requirió optimizar las reacciones de digestión
con diferentes concentraciones de la enzima de restricción con la finalidad de
obtener fragmentos del tamaño adecuado (10 a 20 kb). Las condiciones utilizadas
fueron las siguientes: para cada 800 ng de DNA total se utilizaron 0.3 U de la enzima
Sau3AI y 2 µl de buffer 10x de la enzima, el volumen total de reacción se ajustó con
agua a 22 µl. Posteriormente se cortó la banda de gel de agarosa correspondiente
a los tamaños de DNA total deseados y se prosiguió a la purificación utilizando el
kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System siguiendo las indicaciones del
fabricante, de igual manera fue purificado el vector pLAFR-3 que previamente fue
linealizado. La ligación de los fragmentos de DNA metagenómico con el vector
pLAFR-3 se realizó utilizando la enzima DNA ligasa T4 con base a las instrucciones
del fabricante, posteriormente se realizó la transformación utilizando células
quimiocompetentes de E. coli DH5α las cuales se prepararon como se indica en el
anexo B. La transformación se realizó de la siguiente manera, se agregaron 50 µl
de la ligación a 200 µl de células quimiocompetentes de E. coli DH5α las cuales se
dejaron en hielo durante 30 min, transcurrido este tiempo se realizó un choque
térmico utilizando un equipo termoblock a 42 °C durante 2 min, posteriormente se
dejaron en hielo por 5 min, a continuación se agregaron 800 µl de medio LB estéril
22
y se incubó a 37°C durante 2 h con agitación constante. La transformación se plateó
en 10 placas de agar LB con tetraciclina a una concentración de 15 µg/ml más 1.25
mg de IPTG y 1 mg de X-gal. Se tomó una colonia al azar a la cual se le realizó
extracción del vector y posteriormente digestiones con las enzimas de restricción
BamHI y PstI cada una por separado para corroborar que tuviera un fragmento de
DNA clonado. Las colonias que no presentaron coloración y tenían la resistencia a
tetraciclina se resguardaron como pools (conjunto de colonias) para lo cual se
agregó 1 ml de LB fresco a la placa donde previamente se plateo y con ayuda de
una pipeta se homogenizo, a la mezcla de medio LB con bacterias se le agregó
glicerol estéril en una proporción 7:3 V/V (volumen/volumen), para su resguardo.
Figura 7.- Representación gráfica del vector pLAFR-3. MCS es el sitio múltiple de clonación,
TetR es el cassette de resistencia a tetraciclina, LacZ es el gen que codifica para la enzima -
galactosidasa, OriV es el origen de replicación del vector.
8.4 Ensayos de desecación controlada
23
Con el objetivo de seleccionar solo las clonas que presentaran el fenotipo de
resistencia a la desecación a partir de la biblioteca metagenómica, se realizó un pre-
screening (pre-selección) rápido el cual consistió en liofilizar durante 24 h y 48 h las
siguientes bacterias: E. coli DH5α, E. coli DH5α con pLAFR-3 y los diferentes pools
(denominados: pool 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y hasta pool 10) de la banca
metagenómica de E. coli DH5α con pLAFR-3 + DNA total.
8.4.1 Liofilización por 24 horas: Las cepas fueron cultivadas por separado en
tubos para centrífuga de 50 ml los cuales contenían 10 ml de medio LB durante 12
h, a 37 °C. Una vez transcurrido este tiempo fueron inoculadas por separado en
matraz con 50 ml de medio LB, ajustando a una densidad óptica inicial de 0.05 (620
nm) e incubadas hasta la fase de crecimiento estacionaria. A continuación, estos
cultivos se centrifugaron a 5000 r.p.m. durante 8 minutos, decantando el
sobrenadante. Después, las células se resuspendieron con 50 ml de agua destilada
estéril y se prepararon alícuotas de 500 μl en microtubos de 1.5 ml a los cuales se
les colocó un tapón de algodón para permitir la pérdida de agua durante la
liofilización, posteriormente los microtubos se colocaron en un congelador a -20 ºC
durante 24 h. Los microtubos sometidos a congelación se pasaron al liofilizador, al
cual previamente se le había pre-enfriado su condensador a -40 ºC. Las alícuotas
se dejaron liofilizando 24 h bajo las siguientes condiciones: Temperatura del
condensador de -55 ºC y 90 militores de presión de vacío. Una vez realizada la
liofilización se resguardaron las alícuotas a temperatura ambiente, previamente se
les retiró el tapón de algodón para poder cerrar los microtubos. A los días 0, 18, 22,
26 y 30 se rehidrataron todas las cepas evaluadas por triplicado, la rehidratación se
llevó a cabo con 500 μl de agua destilada dejando reposar durante 20 minutos, a
continuación, se platearon 20 μl en agar LB con ácido nalidíxico y LB con tetraciclina
más ácido nalidíxico, las placas se incubaron a 37 °C durante 48 horas. Una vez
pasado el tiempo de incubación se observó cuáles eran las clonas que crecían, con
el fin de determinar las clonas resistentes a la desecación.
24
8.4.2 Liofilización por 48 horas: se realizó bajo las mismas condiciones
previamente descritas en el experimento de liofilización por 24 horas con las
siguientes variantes: el tiempo de liofilización fue de 48 horas y las rehidrataciones
se realizaron a los días 0, 4, 6 y 8 posteriores a la liofilización.
8.4.3 Corroboración del fenotipo de resistencia a desecación controlada: las
colonias de E. coli DH5α con pLAFR-3+inserto (DNA metagenómico) que resistieron
más tiempo a la desecación en comparación con el control: E. coli DH5α con
pLAFR-3 (vector vacío, sin inserto de DNA clonado), fueron resguardadas para
realizar posteriores pruebas de desecación controlada, las cuales consistieron en
un proceso de liofilización por 48 horas bajo las condiciones del liofilizador
previamente descritas. Durante este experimento se realizaron conteos bacterianos
antes de liofilizar y a los días 0, 2, 4 y 6 después de liofilizar, los conteos bacterianos
se realizaron por el método de Goteo por Sellado en Placa Masivo (GSPM) o
mediante el método de goteo en placa (anexo C y D, respectivamente) para poder
determinar la tasa de supervivencia bacteriana (BSR), la cual se define como la
relación logarítmica del número de bacterias inicial con respecto al número de
bacterias capaces de resistir después de ser enfrentadas a un determinado estrés:
𝐵𝑆𝑅 =𝐿𝑜𝑔 ( 𝑁𝑜. 𝑈𝐹𝐶 𝑑𝑒𝑠𝑝𝑢é𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑒𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 + 1)
𝐿𝑜𝑔 ( 𝑁𝑜. 𝑈𝐹𝐶 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑒𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛) 𝑥100
8.5 Ensayos de estrés osmótico por NaCl
Con el propósito de evaluar el efecto del estrés osmótico sobre los diferentes pools
estudiados en los experimentos de desecación controlada (pool 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9 y hasta pool 10), se prepararon alícuotas de 500 μl en microtubos de 1.5 ml a
partir de las células resuspendidas con agua destilada estéril preparadas en los
experimentos de desecación controlada (pre-screening). Se tomaron 3 muestras de
suspensión bacteriana de cada tratamiento y se llevó a cabo la valoración cualitativa
(presencia o ausencia de bacterias) en placas de medio LB adicionadas con NaCl
a concentraciones 1.0 M, 1.5 M y placas de medio LB normal como control, cada
25
una de las placas fue inoculada con 20 μl de la suspensión bacteriana previamente
preparada. Adicionalmente, las colonias obtenidas durante el pre-screening de
liofilización por 48 h (48RD3a y 48RD4a) fueron sometidas a ensayos de estrés
osmótico por NaCl, para este experimento se usaron placas de LB y LB con NaCl
1.2 M, realizando conteo mediante el método de GSPM.
8.6 Verificación de las cepas
Las colonias que sobrevivieron al pre-screening de liofilización fueron resembradas
como se describe a continuación: con ayuda de un palillo estéril se tomó una porción
de la colonia, para posteriormente realizar un rayado en agar LB con Ac. nalidíxico
y tetraciclina, una vez observado crecimiento, se resembro por estría cruzada,
considerando a este nuevo crecimiento como una clona pura. Debido a que durante
la liofilización y el almacenamiento de los liófilos (microtubos con la colonias
sometidas a liofilización) puede ocurrir contaminación con otras bacterias, se verificó
que las colonias obtenidas a partir del pre-screening de liofilización por 24 h y 48 h
pertenecieran a E. coli para ello se realizó la amplificación del gen 16S RNAr
mediante PCR de colonia (anexo E) y a este se le realizó un análisis de restricción
del DNA ribosomal (ARDRA) utilizando las enzimas de restricción HhaI, al mismo
tiempo se realizó un análisis in silico utilizando el programa SnapGene
(http://www.snapgene.com/), las secuencias de los genomas utilizados para el
análisis fueron obtenidas de la base de datos del GenBank del sitio del NCBI
(National Center for Biotechnology Information).
También se verificó que las cepas aun mantuvieran el vector, para lo cual se
realizaron extracciones de los diversos vectores, así como un perfil de restricción
utilizando la enzima BamHI.
8.7 Análisis estadístico
Los resultados de este trabajo se analizaron mediante la prueba de ANOVA, usando
el programa Minitab 17 (https://www.minitab.com/es-mx/).
26
9. RESULTADOS
9.1 Extracción de DNA de suelos áridos liofilizados
La concentración y pureza del DNA total (tabla 2) extraído de 4 diferentes muestras
de suelos áridos liofilizadas fue diferente en función de la muestra de suelo; aún
siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de extracción de DNA, la pureza
del DNA total no fue la óptima ya que las relaciones de Absorbancia (Abs) a 260 nm
/ Abs 280 nm fueron menores a 1.5 siendo lo ideal 1.8, para el caso de Abs 260 /
230 fueron menores a 0.8 siendo lo ideal 2.0. Debido a estos resultados se decidió
utilizar la muestra 1AV para realizar la biblioteca metagenómica debido a que es la
que presentó la mayor concentración y las mejores relaciones de absorbancia. El
corrimiento electroforético del DNA en gel de agarosa al 1% durante 1 hora a 100
Volts (V) teñido con GelRed™ (figura 8) confirmó la presencia de DNA, el cual
presenta un corrimiento característico que consiste en DNA con diferentes patrones
de migración en el gel. El DNA de la muestra 1AV tiene una buena integridad ya
que presenta un tamaño mayor a 10 kb, lo cual nos indicó que el método de
extracción utilizado no fragmenta el DNA durante la parte de lisis, la cual suele ser
la etapa más agresiva del proceso de purificación del DNA.
Tabla 2.- Concentración y pureza del DNA de 4 muestras de suelos áridos liofilizados.
MUESTRA Abs 260 / Abs 280 Abs 260 / Abs 230 [ng/µl]
1 AV 1.46 0.72 75.4
7 AV 1.45 0.40 43.0
8 AV 1.03 0.39 26.0
12 AV 0.97 0.41 27.9
27
Figura 8.- A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% durante 1 hora a 100 V, donde se muestra
Carril 1: DNA de la muestra 1AV, Carril 2: DNA de la muestra 7 AV, Carril 3: DNA de la muestra
8 AV y Carril 4: DNA de la muestra 12 AV. B) Electroforesis en gel de agarosa al 0.7 % durante
3:30 horas a 30 V. Carril 1: DNA de la muestra 1AV, Carril 2: Marcador de 20 Kb.
9.2 Construcción de la biblioteca metagenómica
Todas las colonias obtenidas en agar LB con tetraciclina, IPTG y X-gal fueron
colonias blancas (figura 9), lo que indicó la generación de una biblioteca
metagenómica en la cepa DH5 con el vector de expresión pLARF-3 + DNA
metagenómico insertado en el sitio MCS interrumpiendo el gen que codifica para la
enzima Beta-galactosidasa y resultando así las colonias blancas (al no ser utilizado
el sustrato de esta enzima). Al mismo tiempo nos indica que la estrategia seguida
para la elaboración de la biblioteca fue adecuada debido a que no se obtuvo ninguna
colonia azul. Para corroborar la correcta generación de la biblioteca metagenómica
se tomó una colonia al azar a la cual se le realizó extracción del vector y
posteriormente digestiones con las enzimas de restricción BamHI y PstI cada una
por separado (figura 10), los resultados obtenidos del perfil de restricción confirman
la clonación de un fragmento de DNA metagenómico, con un tamaño aproximado
de 15 kb.
C1 C2 C3 C4 C1 C2
20000 pb
5000 pb
1500 pb
B) A)
500 pb
28
Figura 9. – A) colonias de E. coli DH5α transformadas con la reacción de ligación (pLAFR-3
más DNA 1AV), B) Control: cepa E. coli DH5α sin vector (no hubo crecimiento como se
esperaba); ambas cepas fueron crecidas en medio LB con Tc 15 µg /ml y X-gal e IPTG.
Figura 10. - Electroforesis en gel de agarosa al 0.6 % con TBE durante 4:00 horas a 30 V. C1:
Marcador 20 Kb, C2: vector pLAFR-3 sin digerir, C3: pLAFR-3 + DNA 1AV, C4: vector pLAFR-
3 digerido con BamHI, C5: pLAFR-3 + DNA 1AV digerido con BamHI (se visualiza un doblete
alrededor de 20 Kb), C6: pLAFR-3 digerido con PstI, C7: pLAFR-3 + 1AV digerido con PstI (se
linealiza).
A) B)
29
9.3 Búsqueda de genes de resistencia a desecación
Para seleccionar solo las clonas con el fenotipo de resistencia a la desecación a
partir de la biblioteca metagenómica, se realizaron dos experimentos los cuales
consistieron en someter la banca metagenómica a liofilización durante 24 h y 48 h.
En el experimento de 24 h (tabla 3) se seleccionaron las colonias del día 26 posterior
a la liofilización de tres pools, debido a que al día 26 el control (E. coli DH5α con
pLAFR-3) no presentó crecimiento, por el contrario, muestras de la biblioteca
metagenómica denominadas pool 1 y 9 presentaron crecimiento en agar LB con
ácido nalidíxico y tetraciclina. Los pools 3, 4, 5, 7 y 8 presentaron crecimiento en LB
con ácido nalidíxico, pero fueron excluidos debido a que en el medio con tetraciclina
no crecieron; para el pool 10 se hizo una excepción debido a que al día 22 después
de la liofilización era el que presentaba el mayor crecimiento. Todas las colonias de
los pools 1, 9 y 10 se resembraron en agar LB con ácido nalidíxico y tetraciclina. Se
han omitido los resultados del día 0 y 18 por carecer de relevancia, desde nuestro
punto de vista, para el día 22 el control y todos los pools evaluados presentaron
crecimiento en LB con ácido nalidíxico y tetraciclina, a excepción del pool 2, 6 y 8,
para el caso del día 30 no hubo crecimiento de ninguna cepa o pool evaluado.
30
Tabla 3. - Supervivencia de E. coli DH5α transformada con la banca metagenómica sometidas
a desecación controlada por 24 h. Pool significa una alícuota de la biblioteca metagenómica
pLARF-3+DNA metagenómico. Los días mencionados son días después del proceso de
liofilización.
A partir del experimento de liofilización por 48 h se seleccionaron las colonias de
dos pools; estos fueron los pools 3 y 4 debido a que ambos resistieron hasta el día
8 después de la liofilización (figura 11 y tabla 4), por el contrario, los controles E. coli
DH5α y E. coli DH5α con pLAFR-3 solo resistieron hasta el día 6, a partir de este
día no hubo crecimiento para ambos controles. Las clonas que resistieron fueron
resembradas en agar LB con Ac. nalidíxico y tetraciclina.
Dia 22 DIA 26
LB con
Ac. Nal
LB con Ac.
Nal + Tc
LB con
Ac. Nal
LB con Ac.
Nal + Tc
E. coli DH5α ++ ---- + ----
E. coli DH5α con pLAFR-3 + + ------ ----
Pool 1 ++ + + +
Pool 2 ---- --- ----- -----
Pool 3 ++ + + -----
Pool 4 ++ + + -----
Pool 5 +++ + + -----
Pool 6 + ------- ----- -----
Pool 7 ++ + + -----
Pool 8 ++ ---- + -----
Pool 9 ++ + ++ +
Pool 10 ++++ +++ + ---
Nota: una + representan menos de 10 UFC, ++ representan mas de 10 UFC,
+++ representan colonias incontables y ----- representa ausencia de
crecimiento
31
Figura 11.- Supervivencia de E. coli DH5α (E), E. coli DH5α con pLAFR-3 (P) y los diferentes
pools (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9) después de la liofilización por 48 h. A) cepas crecidas en agar
LB con Ac. nalidíxico antes de la liofilización, B) cepas crecidas en agar LB con Ac. nalidíxico
8 días posteriores a la liofilización, C) cepas crecidas en agar LB con Ac. nalidíxico y
tetraciclina antes de la liofilización, D) cepas crecidas en agar LB con Ac. nalidíxico y
tetraciclina 8 días posteriores a la liofilización.
E
E P
P
4
3
3
4
E
E
P
P
3
4
4
A) B)
C) D)
5
6
E
7
8
1
2
9
5
6 7
8
1
2
9
6
5
7
8
9
2
1
5
6
7 8
1
2
9
32
Tabla 4.- Supervivencia de E. coli DH5α transformada con la banca metagenómica sometidas
a desecación controlada por 48 h.
9.4 Corroboración del fenotipo de resistencia a desecación controlada
Las colonias obtenidas en el pre-screening de liofilización durante 24 h, fueron
sometidas a una segunda prueba de desecación en la cual el proceso de liofilización
duró 48 h, en esta ocasión se evaluaron como colonias individuales y el número de
colonias se determinó mediante el método de goteo en placa. En la figura 12 se
muestra que al día 6 después de la liofilización la BSR de tres clonas individuales
(24RD1a, 24RD9a y 24RD10a), cada una perteneciente a un diferente pool (1, 9 o
10), es mayor en comparación con los controles (E. coli DH5α y E. coli DH5α con
pLAFR-3), además la prueba de ANOVA mostró una diferencia significativa entre
las BSR de las colonias evaluadas (P valor 0). Para corroborar la resistencia a la
Dia 2 DIA 6 Dia 8
LB con
Ac. Nal
LB con Ac.
Nal + Tc
LB con
Ac. Nal
LB con Ac.
Nal + Tc
LB con
Ac. Nal
LB con Ac.
Nal + Tc
E. coli DH5α +++ ------ ------ ------ ------ ------
E. coli DH5α con
pLAFR-3
+++ +++ ------ ------ ------ ------
Pool 1 +++ +++ + ------ ------ ------
Pool 2 +++ +++ ------ ------ ------ ------
Pool 3 +++ +++ +++ ++ ++ +
Pool 4 +++ +++ +++ ++ ++ +
Pool 5 +++ +++ + + ------ ------
Pool 6 +++ +++ + ------ ------ ------
Pool 7 +++ +++ + + ------ ------
Pool 8 +++ +++ ------ ------ ------ ------
Pool 9 +++ +++ ------ ------ ------ ------
Pool 10 +++ +++ ------ ------ ------ ------
Nota: una + representan menos de 10 UFC, ++ representan mas de 10 UFC, +++ representan
colonias incontables y ----- representa ausencia de crecimiento
33
desecación de estas clonas, se realizaron dos nuevos experimentos de desecación
cada uno por separado y por triplicado; esta vez el número de colonias fue
determinado por el método de goteo en placa y GSPM respectivamente (figura 13).
En estos últimos experimentos no se observó una diferencia estadísticamente
significativa en la BSR de las colonias evaluadas (P valor 0.064), estas variaciones
en la BSR se las atribuimos a las condiciones de almacenamiento de los liófilos
después de la liofilización y al método utilizado para realizar los conteos.
Las colonias obtenidas en el pre-screening de liofilización por 48 h fueron sometidas
a una segunda prueba de desecación (liofilización por 48 h) en esta ocasión las
colonias de los pools 3 y 4 se evaluaron como colonias individuales (48RD3a y
48RD4a) utilizando el método de Goteo por Sellado en Placa Masivo para
determinar el número de colonias. En la figura 14 se muestran los resultados
obtenidos; como podemos apreciar no hubo diferencias en la BSR de las colonias
evaluadas (P valor 0.22).
34
Figura 12.- Comparación de la supervivencia de 3 clonas de la banca metagenómica
identificadas como posibles resistentes a la desecación con respecto a la cepa silvestre E.
coli DH5α y a E. coli DH5α con pLAFR3 sometidas a liofilización durante 48 h. La evaluación
de la BSR se realizó a diferentes tiempos y el método utilizado para determinar el número de
UFC fue goteo en placa. En la gráfica A) y B) se muestran los resultados para el primer y
segundo experimento respectivamente. Cada punto representa el promedio de 3 réplicas, las
barras representan la desviación estándar.
A)
B)
Días antes a la liofilización Días posteriores a la liofilización
Días antes a la liofilización Días posteriores a la liofilización
35
Figura 13.- Comparación de la supervivencia de 3 clonas de la banca metagenómica
identificadas como posibles resistentes a la desecación con respecto a la cepa silvestre E.
coli DH5α y a E. coli DH5α con pLAFR3 sometidas a liofilización durante 48 h. La evaluación
de la BSR se realizó a diferentes tiempos y el método utilizado para determinar el número de
UFC fue GSPM. Cada punto representa el promedio de 5 réplicas, las barras representan la
desviación estándar
Figura 14.- Comparación de la supervivencia de 2 clonas de la banca metagenómica
identificadas como posibles resistentes a la desecación con respecto a la cepa silvestre E.
coli DH5α y a E. coli DH5α con pLAFR3 sometidas a liofilización durante 48 h. La evaluación
de la BSR se realizó a diferentes tiempos y el método utilizado para determinar el número de
UFC fue GSPM. Cada punto representa el promedio de 5 réplicas, las barras representan la
desviación estándar
0
20
40
60
80
100
-2 -1 0 1 2 3 4
BSR
Dias antes a la liofilizaciòn Dias posteriores a la liofilizaciòn
E. coliE. coli + pLAFR324RD1a24RD9a24RD10a
0
20
40
60
80
100
-2 -1 0 1 2 3 4
BSR
Dias antes a la liofilización Dias posteriores a la liofilización
E.coli
E. coli + pLAFR3
48RD3a
48RD4a
36
9.5 Verificación de la identidad de la cepa utilizada y recuperada después de
la liofilización.
Mediante ADRA se determinó el patrón de tamaños generado con la enzima HhaI
para el gen 16S RNAr de E. coli DH5α, el cual consistió en cinco fragmentos con
los siguientes tamaños: 531, 374, 197, 164 y 136 bp. El patrón de tamaños
generados mediante ADRA coincide entre las diferentes colonias obtenidas durante
el pre-screening, así como con los controles (E. coli DH5α y E. coli DH5α con
pLAFR-3) tanto in silico como in vitro (figura 15).
En cuanto a la extracción de los vectores todas las cepas presentaron el vector, por
lo que se les realizó un perfil de restricción (figura 16), en el cual se aprecia que los
vectores de las colonias 24RD1a y 24RD9a tienen el mismo patrón de restricción a
pesar de provenir de diferentes pools, algo similar se observó en los vectores de las
colonias 48RD3a y 48RD4a estos comparten el mismo patrón de restricción entre
ellos, pero difiere de los vectores presentes en las colonias 24RD1a y 24RD9a.
37
Figura15. – Análisis de restricción del DNA ribosomal de diversas cepas obtenidas durante
los pre-screening de desecación, en donde MW representa el marcador de peso molecular,
los carriles 1 al 8 pertenecen a P. putida, E. coli, E. coli con pLAFR-3, 24RD1a, 24RD9a,
24RD10a, 48RD3a y 48RD4a, respectivamente. A) análisis in vitro, B) análisis in silico.
bp
1500 500 400
300
200
MW 1 2 3 4 5 6 7 8 A)
B)
38
Figura 16.- Perfil de restricción de varios vectores pertenecientes a las colonias obtenidas
durante el pre-screening de desecación, en donde MW representa el marcador de peso
molecular, el carril 1 corresponde al vector de la colonia 48RD3a digerido con BamHI , el carril
2 corresponde al vector de la colonias 48RD4a digerido con BamHI, los carriles 3 y 4
corresponden al vector de la colonias 24RD1a sin digerir y digerido con BamHI
respectivamente, los carriles 6 y 7 corresponden al vector de la colonia 24RD9a sin digerir y
digerido con BamHI respectivamente.
9.6 Ensayos de estrés osmótico por NaCl
Todos los pools de la librería metagenómica evaluados fueron capaces de crecer
en LB con NaCl 1 M; sin embargo, al incrementar la concentración de NaCl a 1.5 M
ningún pool fue capaz de crecer a esta concentración, lo mismo ocurrió para los
controles E. coli DH5α y E. coli DH5α con pLAFR-3 (figura 17). Por otra parte, al
someter a ensayos de estrés osmótico a las colonias 48RD3a y 48RD4a (obtenidas
durante el pre-screening de liofilización por 48 h) estas fueron incapaces de crecer
en LB con NaCl 1.2 M, sin embargo, para los controles E. coli DH5α y E. coli DH5α
con pLAFR-3 se obtuvieron valores de BSR de 87 y 86 respectivamente (figura 18).
1 2 WM 3 4 6 7
WM WM bp
20000 10000 7000 500O 4000
3000
2000
bp 20000 10000 7000 500O 4000
3000
2000
39
Figura 17.- Efecto de las concentraciones de NaCl en el crecimiento de E. coli DH5α (E), E. coli
DH5α con pLAFR-3 (P) y los diferentes pools (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). A) colonias cultivadas en agar
LB con Ac. nalidíxico, B) colonias cultivadas en agar LB con NaCl 1M, C) colonias cultivadas
en agar LB con NaCl 1.5 M.
Figura 18. Supervivencia de E. coli DH5α (E), E. coli DH5α con pLAFR-3 (P), 48RD3a (3) y
48RD4a (4). A) en LB con Ac. nalidíxico, B) en LB con NaCl 1.2 M
5
4
6 7
P
1
2 3
E
6
5
4
3 2
1
P
7
E
6 7
5
4
3 2
1
P
E
A) B) C)
P E 3 4
E P 3 4
A) B)
40
10. DISCUSIÓN
Uno de los puntos críticos para el estudio de los genomas colectivos de muestras
ambientales es la extracción de DNA de alta calidad y alto peso molecular;
actualmente se cuenta con una gran diversidad de kits comerciales para la
extracción de DNA metagenómico al igual que una gran cantidad de protocolos han
sido reportados. Pero, sin lugar a duda, ningún kit o protocolo funcionan igual para
la gran diversidad de ambientes, por lo que es importante mencionar que,
dependiendo del tipo de muestra, será el tipo de reto a sortear (Bag et al., 2016).
En este trabajo se realizó la búsqueda de genes relacionados con la resistencia a
la desecación generando una librería metagenómica a partir de DNA aislado de
suelos áridos. Durante la extracción del DNA total de 4 diferentes muestras de
suelos áridos liofilizados se observó una variación en la concentración y pureza del
DNA en función de la muestra de suelo utilizada. En varios estudios se ha informado
que el rendimiento de DNA obtenido de muestras de suelo está influenciado por las
propiedades de este último, entre las que se incluye el contenido celular, el valor del
pH, la presencia de cationes, la capacidad de dispersión del suelo y el contenido de
ácido húmico (Ettenauer et al., 2012; Young et al., 2014; Zhou et al., 1996). En
cuanto a la pureza del DNA los valores obtenidos en la relación de Abs 260 / 230
fueron menores a 0.8 siendo lo ideal 2.0, estos valores pueden ser debido a la
presencia de ácidos húmicos los cuales pueden llegar a dificultar pasos
subsiguientes en la construcción de bibliotecas metagenómicas (Tanveer et al.,
2016), sin embargo, a pesar de no obtener un DNA de alta pureza, se logró digerir
el DNA con la enzima Sau3AI, el DNA utilizado tuvo una relación de Abs 260 / 230
de 0.72. Se sabe que la extracción directa de DNA de muestras ambientales puede
resultar en una co-extracción de otros componentes como los ácidos húmicos y
metales pesados los cuales pueden interferir con los subsiguientes procesos tales
como la modificación enzimática de DNA, el análisis por PCR y la reducción de la
eficacia de transformación, así como la especificidad de la hibridación del DNA;
bajas cantidades de aproximadamente 10 ng de esas moléculas pueden ocasionar
tales efectos (Sagar et al., 2014; Techer et al., 2010). Si bien la relación de Abs 260
/ 230 suele usarse como indicador de la presencia de ácidos húmicos, esta es
41
incapaz indicarnos la cantidad exacta de ácidos húmicos presentes en la muestra,
se ha reportado que algunas enzimas de restricción presentan actividad
endonucleasa en DNA obtenido de muestras de suelo con concentraciones de 8
ng/µl de ácido húmico y una relación de Abs 260 / 230 de 0.8 (Sagar et al., 2014).
Por otra parte, en los experimentos de desecación controlada mediante liofilización
se observó la variación en el tiempo de supervivencia entre los experimentos de
liofilización durante 24 y 48 horas y esto podría deberse a diferencias en el
contenido de humedad residual entre cada experimento, lo cual pudo afectar a la
supervivencia bacteriana. Todos los productos liofilizados tienen una pequeña
cantidad agua remanente denominada humedad residual, la cantidad de agua que
queda en el material depende de la naturaleza del producto y la duración del
secado (Gaidhani et al., 2015). En concreto, el contenido de humedad residual
durante la liofilización tiende a disminuir conforme aumenta el tiempo del proceso
(Ten Have et al., 2016). La relación entre el contenido de humedad residual y la
supervivencia de E, coli ha sido descrita previamente por Nei et al., quien reportó
que, en células liofilizadas y almacenadas bajo atmósfera de aire, presentan una
tasa de supervivencia menor cuando el contenido de humedad residual es bajo
(Nei et al.,1966). Con base a los resultados obtenidos se decidió evaluar la
resistencia a desecación utilizando un periodo de 48 h de liofilización, por lo que
las cepas obtenidas en el pre-screening de liofilización por 24 h fueron sometidas
a otros eventos de liofilización (por 48 h) para corroborar el fenotipo de resistencia
a desecación. Al comparar los resultados entre cada experimento se observaron
discrepancias en los valores de BSR obtenidos; estas variaciones pueden estar
relacionadas con el método utilizado para cuantificar el número de bacterias. Los
datos muestran una subestimación del número de colonias por el método GSPM
debido a que al utilizar este método no se logran recuperar bacterias al día 4
posterior a la liofilización de ninguna de las cepas evaluadas, en cambio al utilizar
el método de goteo en placa se logran recuperar colonias hasta el día 6 posterior
a la liofilización de algunas de las cepas evaluadas. Otro de los inconvenientes es
que, a medida que la población bacteriana disminuye, la desviación estándar
aumenta en ambos métodos utilizados, lo cual puede conducir a datos menos
42
precisos. En general todos los métodos para determinar el número de unidades
formadoras de colonias tienen ventajas y desventajas ya que no están exentos de
errores, como lo demuestran diversos estudios. Un ejemplo claro de esto son los
resultados obtenidos por Speranza et al., quienes al comparar el método de conteo
por vertido en placa con el método de conteo directo por microscopía
epifluorescente, concluyeron que el método más sensible para estimar células
planctónicas es el conteo por vertido en placa. Por otro lado, la cuantificación por
microscopía epifluorescente dio los mejores resultados al contar células sésiles
(Speranza et al., 2014). Otro claro ejemplo es el trabajo de Barbosa et al., quienes
observaron diferencias entre el método de goteo y esparcido en placa; estas
variaciones dependen del tipo de bacteria empleada para realizar los conteos
(Barbosa et al., 1995). Corral et al., compararon cuatro métodos utilizados para la
cuantificación de bacterias (GSPM, plateo, goteo en placa y 6x6), empleando
cultivos puros de la cepa P. putida KT2440; bajo esas condiciones el número de
bacterias obtenido fue estadísticamente igual para los cuatro métodos (Corral et
al., 2012), sin embargo, el método GSPM nunca ha sido comparado contra otro
método bajo condiciones tales como bajas poblaciones bacterianas, agregados
bacterianos en matrices, bacterias liofilizadas, etc. por lo que no podemos
descartar una subestimación de las poblaciones con este método. Se sabe que a
bajos número de UFC la precisión de los recuentos bacterianos es baja debido a
que las UFC siguen una distribución de Poisson, por lo que el error de la estimación
es la raíz cuadrada de la media (Sutton, 2011), esto explica por qué nuestras
desviaciones estándar fueron grandes y podría ser la razón por la que hubo
discrepancias en los valores obtenidos entre cada experimento. A pesar de ello no
podemos atribuirle completamente las variaciones observadas en los
experimentos debido a que durante y posterior a la liofilización hay muchos
factores que pueden generar cambios en la supervivencia bacteriana, entre ellos
está la temperatura y humedad a la que se almacenan lo liófilos; en nuestros
experimentos no se contralaron estos factores por lo que no se puede descartar el
hecho de que haya influido en nuestros resultados.
43
Algo interesante que pudimos apreciar durante el pre-screening de resistencia a la
desecación es que las colonias que sobrevivieron (24RD1a y 24RD9a) parecen
tener el mismo vector+inserto, de tal manera que bajo esas condiciones (24 h de
liofilización) una clona en específico es la que logró sobrevivir. Por otra parte,
cuando las condiciones del tiempo de liofilización se cambiaron (48 h de
liofilización), las colonias que sobrevivieron parecen presentar el mismo
vector+inserto (48RD3a y 48RD4a) pero este difiere del vector+inserto que poseen
las colonias 24RD1a y 24RD9a. Es un hecho que la detección de clonas que
posean secuencias de interés a partir de una banca metagenómica se ve
influenciada por la manera en que se realiza el cribado (Terrón et al., 2016). Es
importante mencionar que algunos organismos anhidrobióticos poseen mecanismos
que les permiten pasar de un estado completamente hidratado a un estado de
desecación total en un corto periodo de tiempo. Esta tolerancia a la desecación está
caracterizada por la expresión constitutiva de moléculas protectoras, sin embargo,
no todos los microorganismos anhidrobióticos toleran un estado de desecación total
sin antes pasar por un periodo de desecación parcial (Tyson et al., 2012). Esto
explicaría por qué dependiendo de las condiciones del pre-screening realizadas se
obtuvieron vectores+insertos aparentemente diferentes.
Si bien no se logró obtener una clona aislada que fuera más resistente a la
desecación (a diferencia de los pools), en comparación con los controles, creemos
que la supervivencia a la desecación de las clonas 24RD1a, 24RD9a,24RD10a,
48RD3a y 48RD4a no se vio afectada debido a la secuencia clonada, ya que
diversos estudios muestran que la carga metabólica ocasionada por el
mantenimiento y la expresión génica innecesaria genera efectos tales como tasas
de crecimiento específicas más bajas, viabilidad celular reducida, filamentación
celular, etc. Sin embargo, si la expresión génica ayuda en el metabolismo de un
sustrato, o le confiere cierta característica de adaptación, la expresión génica
proporciona un beneficio a la célula (Malakar et al., 2014; Silva et al., 2012).
Además, el hecho de que las clonas que sobreviven bajo ciertas condiciones de
estrés presenten aparentemente el mismo vector apoya nuestra idea de que las
secuencias de DNA que poseen esos vectores ayudan a que su supervivencia no
44
se vea afectada.
En cuanto a los ensayos de estrés osmótico, se observó que tanto los pools como
los controles fueron capaces de crecer a concentraciones de NaCl 1M, sin
embargo, a NaCl 1.5 M fueron incapaces de crecer, por lo que ninguna de las
clonas evaluadas conteniendo fragmentos clonados de la banca metagenómica
confirió el fenotipo de resistencia a estrés osmótico por NaCl. Al evaluar la
supervivencia a NaCl 1.2 M de las colonias 48RD3a y 48RD4a, se observó una
disminución en su tasa de supervivencia en comparación con E. coli DH5α y E. coli
DH5α con pLAFR-3; creemos que esta disminución en su supervivencia es debido
a una carga metabólica ocasionada por el gran tamaño del vector que contiene
además el inserto clonado. En varios trabajos se ha evaluado el efecto de las
concentraciones de NaCl en el crecimiento de E. coli, en uno de estos trabajos se
reportó que E. coli es capaz de crecer a concentraciones de NaCl 1.02 M y que su
crecimiento se ve inhibido a 1.36 M de NaCl (Conner, 1992). Esta supervivencia a
NaCl puede verse afectada por la producción de proteínas innecesarias que
estarían codificadas en los insertos clonados, debido a que esto representa una
carga para el crecimiento celular; tal y como se demostró al cultivar a E. coli en
glicerol en presencia de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) bajo estrés
osmótico, observando una disminución en su tasa de crecimiento en comparación
con un cultivo de E. coli en glicerol sin IPTG, en este caso la síntesis de la β-
galactosidasa no ofreció ningún beneficio para el crecimiento bajo condiciones de
estrés osmótico por lo que la expresión génica innecesaria se convirtió en una
carga metabólica para la célula (Malakar et al.,2014).
Por otra parte durante el pre-screening se observó que algunos pools presentaron
una mayor supervivencia a la desecación en comparación a los controles, lo cual
podría indicar un sinergismo entre varias clonas presentes en esos pools
evaluados, tal y como reportó Molina et al., quien observó un incremento en la
supervivencia bacteriana de P. putida KT2440 al ser sometida a desecación como
parte de una mezcla bacteriana conformada por Azospirillum brasilense Sp7,
45
Acinetobacter sp. EMM02, Sphingomonas sp. OF178, y P. putida KT2440 (Molina
et al.,2017). Por lo que es importante resaltar que uno de los principales objetivos
de este trabajo era generar una biblioteca metagenómica en el vector pLARF-3, lo
cual se logró y dicha librería metagenómica servirá para que se continúe evaluando
en el futuro (la producción de xeroprotectores, la supervivencia a la desecación de
diferentes mezclas de la librería metagenómica las cuales pueden variar en la
clona utilizada, el número de células de cada clona, el número de clonas diferentes
utilizadas en cada mezcla, la metodología utilizada para el screening, etc.) debido
a que son muchas variantes en todo el proceso de selección y desecación por lo
cual el trabajo realizado y reportado en esta tesis servirá como guía para futuros
tamizados de la biblioteca.
11. CONCLUSIONES
➢ Se generó una banca metagenómica utilizando como cepa receptora a E.
coli DH5α, los fragmentos de DNA metagenómico clonados en el vector
pLAFR-3 tienen un tamaño de entre 10-20 Kb.
➢ Aunque no se obtuvo una clona aislada con resistencia a la desecación en
E. coli DH5 mediante la clonación de fragmentos de DNA metagenómico
obtenido a partir de una muestra de suelo árido, se observó que algunos
pools de la biblioteca presentaron una mayor resistencia a la desecación en
comparación a los controles, lo cual podría indicar un sinergismo entre
varias clonas presentes en esos pools evaluados
➢ La clonación de fragmentos grandes de DNA metagenómico en las clonas
24RD1a, 24RD9a, 24RD10a, 48RD3a y 48RD4a no afectó el valor de su
resistencia a la desecación.
➢ Se identificaron 2 clonas (48RD3a y 48RD4a) de la banca metagenómica
46
sensibles a estrés osmótico por cloruro de NaCl 1.2 M.
12. BIBLIOGRAFÍA
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13. ANEXOS
Anexo A: extracción de DNA utilizando el kit ZR Soil Microbe DNA MiniPrep™
En un tubo ZR Bashing Bead™ se colocaron 250 mg de muestra de suelo y se
añadieron 750 µl de solución para lisis, con ayuda de un vortex se agitó durante 5
minutos a su máxima velocidad para lisar las células, posteriormente se sometió a
centrifugación durante 1min a 10000 xg, a continuación se transfirieron 400 µl del
sobrenadante del lisado celular a un filtro Zymo-Spin ™ IV acoplado a un tubo y se
centrifugó a 7000 xg durante 1 minuto, posteriormente se adicionaron 1200 µl de
Soil DNA Binding Buffer al filtrado. De esta mezcla se transfirieron 800 µl a una
columna Zymo-Spin™ IIC la cual se acopló a un tubo para su posterior
centrifugación a 10000 xg durante 1 minuto, se desechó el fluido del tubo. Posterior
a esto se añadieron 200 µl de tampón de prelavado de DNA a la columna Zymo-
Spin ™ CII la cual estaba acoplada a un tubo nuevo, posteriormente se sometió a
centrifugación durante 1 minuto a 10000 xg. A continuación, se añadieron 500 µl de
tampón de lavado de DNA a la columna Zymo-Spin ™ CII y se centrifugó a 10000
xg durante 1 minuto. Se colocó un nuevo tubo a la columna Zymo-Spin™ CII y
posteriormente se agregaron 100 µl de tampón para eluir el DNA a la columna
Zymo-Spin™ CII, la cual se centrifugó a 10000 xg por 30 segundos. A continuación,
se acopló el filtro Zymo-Spin ™ IV-HRC a un tubo para centrifugarlo a 8000 xg
durante 3 minutos para posteriormente transferir el DNA eluido al filtro Zymo-Spin
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™ IV-HRC el cual estaba acoplado a un nuevo tubo, y finalmente se centrifugó a
8000 xg durante 1 minuto.
Anexo B: preparación de células competentes
A partir de un pre-inóculo de una noche de crecimiento de E. coli DH5α se transfirió
1 ml a un matraz con 100 ml de medio LB fresco y se dejó incubando a 37 °C durante
~ 2 horas a 250 rpm hasta alcanzar una DO600 de 0.4 a 0.7, posterior a esto se
centrifugó a 7000 rpm durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se
agregaron 50 ml de CaCl2 0.1 M frio, se dejó en hielo por 2 horas, a continuación se
centrifugó a 7000 rpm durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante para
posteriormente agregar 5 ml de CaCl2 0.1 M y 850 µl de glicerol estéril, finalmente
se hicieron alícuotas de 200 µl. Las células se resguardaron a – 80 °C hasta su uso.
Anexo C: técnica de goteo en placa para la cuantificación de colonias
bacterianas
A partir de una solución bacteriana se tomaron 100 μl los cuales se diluyeron en 900
μl de agua destilada contenida en un microtubo, la muestra se homogenizó por 10
segundos con ayuda de un vortex; a continuación, se tomaron 100 μl del tubo
anterior para diluirlos en 900 μl de agua destilada contenidos en un nuevo microtubo,
la muestra se homogenizó por 10 segundos con ayuda de un vortex; se repetieron
los dos últimos pasos hasta alcanzar la dilución deseada. A continuación, se
tomaron 20 μl de cada dilución (vortexeando previamente por 5 segundos) y se
depositaron las gotas en placas con agar, iniciando con la muestra más diluida; las
placas inoculadas se Incubaron hasta observar colonias bacterianas. Se registró
como el número de colonias en aquella dilución en donde fue posible contar
colonias; para obtener el número de colonias en 1 ml de esa dilución se multiplico
este número por 50 y posteriormente por el factor de dilución, conociéndose así el
número de unidades formadoras de colonias por mililitro de la solución original
(UFC/ml).
Anexo D: técnica de Goteo por Sellado en Placa Masivo (GSPM)
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Se realizaron diluciones (base 10) de las muestras líquidas en una placa multipozos
con la ayuda de una pipeta multicanal. Una vez realizadas las diluciones, una
muestra representativa de ellas se tomó con la ayuda de un replicador y
posteriormente se inocularon en medio sólido, en el cual fue posible contabilizar las
UFC/ml después de un periodo de incubación.
Anexo E: PCR de colonia
A partir de un cultivo overnight se transfirió 1 µl a un microtubo, el cual contenía la
siguiente mezcla: 3 µl de agua libre de nucleasas, 6.25 µl de GoTaq® Green Master
Mix 2x, 1 µl del oligonucleótido 16SF: TAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG [10 µM]
y 1 µl del oligonucleótido 16SR: CAG GGG CGG TGT AC [10 µM]. La amplificación
se realizó usando el programa: 95 °C por 10 min, 35 ciclos de 95 °C por 35 s, 52 °C
por 40 s, 72 °C por 1 :45 min, y un ciclo de 72 °C por 5 min.