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PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE ANTÍGENO Y ANTICUERPOS DEL VIRUS DE LA

INMUNODEFICIENCIA HUMANA POR ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA

CÓDIGO: P-SA-62 FECHA DE EMISIÓN: 16/10/2015

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ELABORÓ REVISÓ APROBÓ REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN




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1. OBJETIVO

Determinar cualitativamente el antígeno p24 del virus de la inmunodeficiencia humana HIV‑1 y de los anticuerpos contra el HIV‑1, incluyendo el grupo O, y contra el HIV‑2 en suero humano por la técnica de Electroquimioluminiscencia (ECLIA). 2. ALCANCE

Aplica para la determinación cualitativa del antígeno p24 del HIV-1 y de los anticuerpos contra el HIV-1 incluyendo el grupo O y contra el HIV-2 en muestras de suero. Este procedimiento se realiza a sueros de pacientes procedentes de los Laboratorios Públicos y privados de la Red Departamental de Laboratorios y a muestras de pacientes que son tomadas en el Laboratorio de Salud Pública para diagnóstico. 3. DEFINICIONES • Anticuerpo: Sustancia de naturaleza glucoproteica denominada

inmunoglobulina (Ig) que es producida como respuesta del sistema inmunitario ante la presencia de una sustancia extraña llamada antígeno. Cada anticuerpo se fabrica expresamente para un determinado antígeno con tal grado de especificidad que antígeno y anticuerpo suelen designarse con el nombre del antígeno y el prefijo anti-.

• Antígeno: Sustancia extraña al organismo capaz de estimular el sistema inmunitario. Puede tratarse de proteínas, polisacáridos, glucoproteínas o sustancias más complejas como lípidos, ácidos nucleicos o microorganismos. Sólo una pequeña parte del antígeno, el llamado determinante antigénico, es el responsable de estimular el sistema inmune y unirse al anticuerpo.

• ECLIA: Inmunoensayo de Electroquimioluminiscencia, se basa en que la

quimioluminiscencia emitida es producida por un salto electrónico en la cámara de reacción

• VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana que ataca el sistema inmunológico

y provoca el SIDA. Es un virus del género Lentivirus, perteneciente a la familia




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de los retrovirus. Su información genética o génoma está en forma de cadena de ARN monocatenario.

4. RESPONSABLES Es responsabilidad de los profesionales del Laboratorio de inmunoensayo cumplir con los lineamientos establecidos en este procedimiento, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado. 5. GENERALIDADES: 5.1 Características El virus de VIH constituye el agente causal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida SIDA y pertenece a la familia de los retrovirus. El VIH puede transmitirse por sangre o hemoderivados, por contacto sexual o de una madre a su hijo antes, durante y tras el parto. Hasta el día de hoy se han identificado dos tipos de virus de inmunodeficiencia humana, denominados HIV-1 y HIV-2. Se han descrito varios subtipos, de los conocidos virus IH, cada uno con distribución geográfica diferente. El VIH-1 puede dividirse en tres grupos remotamente vinculados: el grupo M (por “main” o principal), el grupo N (por “no M, no O”), y el grupo O (por “outlier”). Basándose en su interrelación genética, dentro del grupo M del VIH-1 se han identificado como mínimo 9 subtipos diferentes (de A a D, sw F a H, J, K). Existen virus recombinantes de VIH-1 que consisten en secuencias de 2 o aun más subtipos diferentes que se están diseminando de forma epidémica.

5.2 Referencias Inserto HIV combi PT 6. DESARROLLO

6.1 Fundamento

Los anticuerpos contra las proteínas de VIH que indican la presencia de una infección por VIH pueden encontrarse en suero generalmente dentro de 6 a 12




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semanas tras contraer la infección. Con la detección del antígeno p24 del VIH-1 en muestras de pacientes recientemente infectados con una alta carga viral, el VIH se consigue determinarse alrededor de 6 días antes de lo que lo hacen los ensayos de anticuerpos tradicionales. El presente ensayo de 4ta generación permite detectar simultáneamente anticuerpos anti VIH y el antígeno p24 del VIH obteniéndose así una mayor sensibilidad y una ventana diagnostica más reducida. La prueba permite detectar simultáneamente y en una única determinación el antígeno p24 del HIV-1 y los anticuerpos anti-HIV-1 y anti-HIV-2. A fin de determinar los anticuerpos específicos anti-HIV, esta prueba utiliza antígenos recombinados derivados de las regiones env-y pol del HIV-1 (incluyendo el grupo O) y del HIV-2. Para detectar el antígeno p-24 del HIV-1, se emplean anticuerpos monoclonales específicos. Técnica sándwich con una duración total de 27 minutos.

§ 1ª incubación: Pretratamiento de 40 μL de muestra con detergente. § 2ª incubación: Anticuerpos biotinilados monoclonales anti‑Ag p24, contra el

antígeno específico recombinado del HIV y contra los péptidos específicos del HIV, así como anticuerpos monoclonales anti‑Ag p24,contra el antígeno específico recombinado del HIV y contra los péptidos específicos del HIV marcados con quelato de rutenio) forman un complejo sándwich.

§ 3ª incubación: Después de incorporar las micropartículas recubiertas de estreptavidina, el complejo formado se fija a la fase sólida por interacción entre la biotina y la estreptavidina.

§ La mezcla de reacción es trasladada a la célula de lectura donde, por magnetismo, las micropartículas se fijan a la superficie del electrodo. Los elementos no fijados se eliminan posteriormente con el reactivo ProCell/ProCell M. Al aplicar una corriente eléctrica definida se produce una reacción quimioluminiscente cuya emisión de luz se mide con un fotomultiplicador.

§ El software proporciona automáticamente los resultados comparando la señal de electroquimioluminiscencia generada por la reacción de la muestra con la señal del valor de corte obtenido anteriormente por calibración.

6.2. Materiales

6.2.1. Equipos

• Cobas e 411




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• Nevera muestras • Nevera de reactivos • Pipeta (1000 ul)

6.2.2. Reactivos

• Estuche de reactivo HIV combi PT (Listos para uso) • Calibradores HIVCOMPT Cal 1 y HIVCOMPT Cal 2 • PreciControl HIV • ProCell (tampón del sistema) • CleanCell (solución detergente para la célula de lectura). • SysWash (aditivo para el agua de lavado).

6.2.3. Otros

• Agua destilada o desionizada • Probeta 100 ml • Copillas (Servir muestras) • Copilla (Reacción- AssayCup) • Puntas de pipeta (AssayTip)

6.3. Procedimiento

6.3.1. Preparación De La Muestra

§ Tipo de muestra: Suero recogido en tubos estándar de muestra o en tubos que contienen gel de separación. Criterio: Identificación correcta de las muestras negativas y positivas. • Estabilidad: 4 semanas a 2‑8 °C, 7 días a 25 °C, 3 meses a ‑20

°C. Las muestras pueden congelarse hasta 5 veces.

Si las muestras se procesan en tubos primarios (sistemas de recogida de muestras), seguir las instrucciones del fabricante de los tubos. Centrifugar las muestras que contienen precipitado antes de efectuar la prueba. No emplear muestras inactivadas por calor. No utilizar muestras ni controles estabilizados con azida.




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Se debe garantizar una temperatura de 20‑25 °C para la medición de muestras, calibradores y controles. Para evitar posibles efectos de evaporación, determinar las muestras, los calibradores y los controles que se sitúan en los analizadores dentro de un lapso de 2 horas.

• Identificación de muestras: La muestra es identificada con el código interno asignado en el momento de la recepción de la misma.

6.3.2. Preparación de reactivos Los reactivos contenidos en el estuche están listos para el uso (excepto HIVCOMPT Cal1 y HIVCOMPT Cal2) y se suministran en frascos compatibles con el sistema.

ü Calibradores HIVCOMPT Cal 1 y HIVCOMPT Cal 2: Para la reconstitución,

disolver cuidadosamente el contenido de un frasco añadiendo exactamente 1.0 ml de agua destilada o desionizada. Dejar reposar 15 minutos en frasco cerrado. Mezclar con cuidado, evitando la formación de espuma. Transferir los calibradores reconstituidos a los frascos suministrados vacíos, etiquetados y de cierre hermético.

ü SysWash: 35 ml de sysWash y se completa a volumen de 3000 ml con agua

6.3.3. Controles y/o curvas de calibración • Para la calibración:

Colocar los calibradores reconstituidos en los racks del analizador a 20‑25°C sólo con el objeto de efectuar una calibración. Después del uso, cerrar los frascos inmediatamente y guardar a 2‑8 °C.




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Debido a posibles efectos de evaporación, se recomienda no efectuar más de 5 calibraciones por juego de frascos de calibradores. Nota: Todos los datos necesarios para calibrar el test se introducen automáticamente en el analizador. Intervalos de calibración:

Efectuar la calibración una vez por lote de reactivos empleando los calibradores HIVCOMPT Cal 1 y HIVCOMPT Cal 2. Se recomienda repetir la calibración:

• Tras un mes (28 días) si se trata del mismo lote de reactivos. • Tras 7 días (al emplear el mismo estuche de reactivos en el

analizador) • En caso necesario: por ejemplo si el control de calidad

PreciControl HIV esta fuera del intervalo definido. Después de efectuar una calibración, guardar los calibradores de 2°C -8°C o desecharlos según sea el caso. Conservar los calibradores en posición vertical a fin de evitar que la solución se pegue a la tapa hermética.

• Para los controles: Para el control de calidad emplear PreciControl HIV

colocar los controles en los rack. Todos los datos necesarios para realizar en control del test se introducen automáticamente en el analizador

Efectuar el control: • Junto con el test cada 24 horas. • Con cada estuche de reactivos • Después de cada calibración.

Verificar que los resultados de los controles se encuentren entre los intervalos de aceptación definidos (Verificación en el equipo)




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6.4. Consideraciones generales:

• Evite la formación de espuma en reactivos y muestras de todo tipo

(especímenes, calibradores y controles). • Los reactivos se deben almacenar entre 2 ºC y 8ºC. No congelar. (Ver inserto

conservación y estabilidad) • Conservar el estuche de reactivos en posición vertical para garantizar la

disponibilidad total de las micropartículas durante la mezcla automática antes del uso.

• Se debe garantizar una temperatura de 20-25°C para la medición de muestras, calibradores y controles.

6.4.1. Acondicionamiento y manejo de equipos

El acondicionamiento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los mismos y el F-AS-34 Control Interno de Equipos 6.4.2. Condiciones ambientales

El análisis se puede efectuar dentro de las siguientes condiciones ambientales:

Condición Ambiental Rango Temperatura Ambiente 20 y 25 °C

Las condiciones de temperatura se registran en el F-SA-44 Control de temperatura y humedad relativa ambiental

6.4.3. Descripción del método

Antes del uso, atemperar los reactivos refrigerados a aproximadamente 20 °C y colocarlos en el rotor de reactivos (20 °C) del analizador. Evitar la formación de espuma. El analizador realiza automáticamente los procesos de atemperar, abrir y tapar los frascos.

• Calibrar y pasar controles en el equipo (Ver 6.3.3)




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Corrida de muestras:

• Las muestras recepcionadas para control de calidad deben ser procesadas

por duplicado, las muestras de pacientes gestantes y muestras para diagnóstico, solo se procesan una sola vez, y en caso de ser reactivo el resultado, se procesa nuevamente por duplicado.

- Agregar aproximadamente 500 ul de muestra a las copillas o colocar los

tubos primarios en el racks de muestras.

- Programar las muestras en el equipo con el rack respectivo y código de la muestra asignado en el momento del ingreso al sistema de información.

6.4.4. Cálculos y/o valores de referencia El analizador calcula automáticamente el valor de corte basándose en la medición de HIVCOMPT Cal1 y HIVCOMPT Cal2. Los resultados se indican como reactivos o como no reactivos así como en forma de índice de corte (señal de la muestra/valor de corte). Interpretación de los resultados: Las muestras con un índice de corte (IC) < 0.90 son no reactivas en la prueba Elecsys HIV combi PT. Estas muestras se consideran negativas para el HIV-1 Ag y para anticuerpos anti-HIV-1/-2 y no requieren más análisis. Las muestras con un índice de corte dentro del intervalo ≥ 0.90 a < 1.0 se consideran limítrofes en el test Elecsys HIV combi PT. Las muestras con un índice de corte ≥ 1.0 se consideran reactivas en la prueba Elecsys HIV combi PT. Se recomienda volver a analizar por duplicado con el test Elecsys HIV combi PT todas las muestras inicialmente reactivas o limítrofes. Si en ambos casos se encuentran valores < 0.90 para el índice de corte, las muestras se consideran negativas para HIV-1 Ag y anticuerpos anti-HIV-1/-2.




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Las muestras inicialmente reactivas o limítrofes con un índice de corte ≥0.90 en cualquiera de las determinaciones se considera repetidamente reactivas. Las muestras repetidamente reactivas deben ser confirmadas según los esquemas confirmatorios recomendados Por el Instituto Nacional de Salud y Ministerio de Salud y Protección Social.

INTERPRETACION DE RESULTADOS DE MUESTRAS

INDICE DE CORTE (IC)

REACTIVO para anti-HIV y antígeno HIV > 1.0 LIMITROFES ≥ 0.90 a < 1.0 NO REACTIVA para anti-HIV y antígeno HIV <0.90

6.4.5. Obtención de resultados Los resultados del índice de corte (IC) de controles y muestras procesadas, se verifican en la pantalla del equipo y al finalizar la corrida se imprimen para luego ser digitados en el Sistema Interno de Información del Laboratorio. Los resultados impresos emitidos por el equipo se archivan en una carpeta.

6.4.6. Aseguramiento de calidad de resultados

• Realizar análisis de la muestra por duplicado. • Verificar que los reactivos estén vigentes • Verificar calibración y mantenimiento de equipos. • Procesar controles positivos y negativos en cada corrida de muestras.

6.4.6.1. Control de calidad Interno

La prueba cuenta con los siguientes controles que se realizan por cada corrida analítica:

CONTROLES HIV COMBI PT INTERVALO DIANA DEL INDICE DE CORTE

PC HIV 1 0.00-0.67




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PC HIV 1 10.0-32.0 PC HIV 1 30.0-100

Los intervalos exactos, indicados como índice de corte, están incluidos en los códigos de barras y se encuentran a disposición impresos en la ficha de valores adjunta de los controles o de manera electrónica.

Si los valores obtenidos para los controles se encuentran fuera de los rangos especificados, la prueba se considera inválida y por lo tanto deberá repetirse nuevamente.

Criterios de rechazo

CRITERIO RANGO DE ACEPTACION ACCION PARA

INCUMPLIMIENTO DE CRITERIOS

PreciControl Según la ficha de valores del PreciControl Repetir Análisis

Reactivos vigentes Vigencia del reactivo Repetir Análisis

Mantenimiento de equipos Calibración, verificación y mantenimiento vigente

Repetir Análisis y solicitar mantenimiento y

calibración

6.4.6.2. Control de Calidad Externo

El laboratorio participa en programas de evaluación externa como MLE para HIV y con el Instituto Nacional de Salud (PIVI).

Los resultados de los controles se registran en el análisis de resultados de control de calidad externo F-SA-109




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7. REGISTROS

Registro Responsable Como conservarlo

Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-34 Control Interno

de equipos

Director Técnico /Profesional de

Laboratorio

Medio físico y/o electrónico

Según Listado Maestro de

documentos F-MC-04, Según F-MC-03 -Listado

maestro de registros y/o

tabla de retención

documental


documentos F-MC-04, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla

de retención documental



maestro de registros y/o tabla


F-SA-44 Control de

temperatura y humedad relativa

ambiental


Laboratorio





tabla de retención

documental








F-SA-109 análisis de

resultados de control de

calidad externo


Laboratorio





tabla de retención

documental








F-SA-18 Hoja de vida de

Equipos


Laboratorio





tabla de retención

documental








8. ANEXOS. No Aplica




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9. HISTORIAL

VERSIÓN VIGENCIA IDENTIFICACIÓN DE LOS CAMBIOS

1 16/10/2015 Versión inicial

p-sa-62 procedimiento para la determinacion de … · el hiv‑2 en suero humano por la técnica de...

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