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Obtención de Carbohidratos con Potencial Antiinflamatorio y
Citóxico de Agaricus blazei por Fermentación Sumergida
Propuesta Tesis Doctoral
Estudiante
Doctorado en Ciencias Agrarias
LILIANA MARÍA VARGAS DEL RÍO. Esp.
Director (a)
SANDRA MONTOYA BARRETO, Ph.D.
Grupo de Investigación en Alimentos y Agroindustria
Departamento de Ingenierías, Facultad de Ingenierías.
Universidad de Caldas
Co-director
JUAN CARLOS SEPÚLVEDA ARIAS, Ph.D.
Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias de la Salud.
Universidad Tecnológica de Pereira.
UNIVERSIDAD DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
DOCTORADO EN CIENCIAS AGRARIAS
MANIZALES, 2014
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RESUMEN
El sector agropecuario colombiano necesita generar mayor integración con el sector industrial,
consolidando las cadenas agroindustriales y explorando vías de aprovechamiento de sus residuos
para producir valor agregado. Es así, como el uso de residuos amiláceos como materias primas para
procesos biotecnológicos, es una alternativa potencial para dar respuesta a las necesidades de
aprovechamiento de estos materiales con el desarrollo de bioprocesos, aplicables al entorno
departamental y nacional. Se busca generar el conocimiento necesario para obtener carbohidratos
por fermentación sumergida a nivel de banco de residuos amiláceos con Agaricus blazei.
Igualmente, se pretende seleccionar e implementar el esquema de extracción de los carbohidratos
contenidos en la biomasa y el caldo de cultivo de dicho bioproceso. Finalmente, se requiere evaluar
la actividad biológica antiinflamatoria y citotóxica de las fracciones obtenidas en los esquemas de
extracción de los carbohidratos de Agaricus blazei.
Los experimentos se llevarán a cabo en dos etapas: la primera etapa consiste en la fermentación
sumergida a nivel de laboratorio, con la cual se definirán condiciones del proceso, primero si se
realiza o no la gelatinización del almidón obtenido de residuos de papa previamente a su uso como
fuente de carbono, el pH del medio de cultivo y el tiempo de proceso para la obtención de
carbohidratos potencialmente bioactivos sobre el sistema inmune. En la segunda etapa, la
fermentación a nivel de banco en un biorreactor marca Applikon de 7 L, se determinará si se
mantiene o no constante el pH del medio de cultivo durante el tiempo de fermentación conforme a
la producción de biomasa y de carbohidratos. Por último, se estandarizará el proceso de
fermentación y se evaluará la actividad antiinflamatoria y citotóxica de las fracciones de
carbohidratos obtenidas.
Los principales impactos académicos esperados con el desarrollo de este proyecto, incluyen
tanto el desarrollo del proceso de producción de carbohidratos potencialmente bioactivos sobre el
sistema inmune por fermentación sumergida de residuos de papa empleando Agaricus blazei a
escala de banco, como la evaluación de la actividad citotóxica y antiinflamatoria de las fracciones
de carbohidratos obtenidas. Desde el punto de vista social, el proyecto aporta al uso de los hongos
medicinales como alternativa para personas con problemas en el sistema inmune, generando a su
vez una potencial solución ambiental y tecnológica para el uso de residuos amiláceos como materias
primas alternativas para la obtención de productos de alto valor y de interés para las industrias
alimentaria y farmacéutica, especialmente como sustancias potencialmente antiinflamatorias y
antitumorales.
Palabras clave: Agaricus blazei, fermentación sumergida, residuos amiláceos, carbohidratos
bioactivos.
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1. INTRODUCCIÓN
El crecimiento de la población mundial genera diferentes impactos, siendo uno de los más
importantes el incremento de los residuos producidos por las actividades cotidianas, como son
alimentarse, asearse, trabajar, viajar, entre otros. Por otro lado, los estados presentan dificultades
para disponer de manera segura esta amplia gama de residuos. Es así, como se hace cada vez más
necesario el desarrollo de alternativas que reduzcan el impacto ambiental negativo de dichos
materiales y al mismo tiempo generen valor agregado. En el caso de los residuos agrícolas y
agroindustriales, estos son ampliamente aceptados como potenciales materias primaspara el
desarrollo de tecnologías con la obtención de productos de alto valor, aportando al mismo tiempo a
disminuir y compensar el deterioro ambiental, debido a que los residuos agrícolas en países del
tercer mundo representan cerca del 70% del total de los residuos generados (Montoya, 2012).
Los hongos, especialmente los hongos de pudrición blanca cuentan con un complejo enzimático
que les permite descomponer los materiales lignocelulósicos, presentando varias aplicaciones en
diferentes industrias, no solo como degradadores de estos materiales sino también como potenciales
productores de sustancias de alto valor. Por ello, se pueden emplear en la obtención de metabolitos
como enzimas, β-glucanos, ácidos grasos, polifenoles, flavonoides, colorantes, entre otros, los
cuales presentan diferentes usos en la industria farmacéutica, alimentaria y química, principalmente
(Cheung, 2008; Montoya, 2012; Suárez A. y Nieto, 2013).
Es así, como el inminente incremento de la población del mundo acompañado del incremento en
la demanda de alimentos y por ende de la generación de residuos orgánicos, siendo estos últimos
considerados como causantes de graves problemas ambientales, generan la necesidad de
investigación aplicada y el desarrollo tecnológico por parte tanto de los grupos de investigación
como del sector empresarial, aportando así soluciones reales a esta problemática. La transformación
de los residuos en materias primas de procesos productivos, la producción de sustancias para
diferentes usos, nuevos procesos tecnológicos para tratar los residuos, la producción de abonos y
alimentos para animales, el uso de la biomasa fúngica para el tratamiento de aguas residuales,
constituyen opciones de alto interés para responder a retos actuales de la humanidad (Montoya,
2012).
La presente propuesta de Tesis del Doctorado en Ciencias Agrarias de la Universidad de Caldas,
se enmarca en la línea de investigación en Biotecnología de Macromicetos del Grupo de
Investigación Alimentos y Agroindustria de la Universidad de Caldas. Esta propuesta cuenta con
financiación por parte del proyecto “Implementación de una estrategia integral a través de
innovación biotecnológica para el aprovechamiento de residuos en el departamento de Caldas”,
aprobado en la convocatoria de Ciencia, Tecnología e Innovación del Fondo Nacional de Regalías
vigencia 2012. Con la realización de este proyecto, se pretende consolidar procesos de investigación
dentro del grupo Alimentos y Agroindustria, en Ingeniería de Bioprocesos, Química de Hongos y
Farmacología, los cuales se constituyen en un eslabón de la cadena para impactar tanto el sector
agrícola como el sector de la salud. Así, se pretende mejorar los indicadores de desempeño
ambiental del departamento de Caldas, desarrollando e implementando un proceso de fermentación
sumergida con el tratamiento y aprovechamiento de residuos amiláceos como parte de la generación
de valor en el sector agrícola y agroindustrial de Caldas. Con este desarrollo, se aportará al enfoque
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biotecnológico de la investigación en Manizales, el cual cruza todas las áreas y disciplinas e
impacta en numerosos sectores productivos incrementando su competitividad. En el escenario
mundial, la aplicación de la biotecnología dio origen a un conjunto de grandes empresas, instaladas
en numerosos sectores industriales ligadas por mecanismos contractuales o de propiedad entre sí o
con pequeñas empresas innovadoras (Alcaldía de Manizales, 2012). El objetivo de esta propuesta de
tesis doctoral es obtener carbohidratos con potencial antiinflamatorio y citotóxico a partir de
residuos amiláceos con Agaricus blazei por fermentación sumergida.
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
2.1. Descripción del problema de investigación
El sector agropecuario colombiano necesita generar mayor integración con el sector industrial,
consolidando así las cadenas agroindustriales en pro de incrementar la producción y los beneficios a
cada eslabón de la cadena. De igual manera, la tendencia de incrementar la productividad para
alimentar a la población que sigue en aumento, genera la necesidad de proponer alternativas de
aprovechamiento para los residuos agroindustriales producidos en estas actividades, contribuyendo
no solo a disminuir el impacto ambiental sino también al crecimiento económico y social
colombiano.
En el Departamento de Caldas no se realiza una adecuada disposición de los residuos
agroindustriales y agrícolas, entre los que se encuentran los residuos amiláceos. Los residuos
amiláceos provienen principalmente de los cultivos o procesos de transformación de yuca, plátano,
papa y maíz, que son los principales productos de este tipo cultivados en diferentes municipios de
Caldas (Secretaría de Agricultura de Caldas, 2013). Generalmente, estos materiales son
abandonados en las fincas, mal utilizados como suplementos nutricionales de los suelos o
empleados para alimentación de animales de cría. Los residuos amiláceos son una buena fuente de
energía, por lo que pueden ser utilizados por varios organismos para la obtención de productos de
alto valor, y se constituyen en una materia prima de menor costo que las convencionales. Caldas no
cuenta con información oficial de investigaciones realizadas para evaluar la influencia de los
residuos amiláceos sobre los procesos de producción por fermentación sumergida de bioproductos
para la industria alimentaria o farmacéutica empleando macromicetos de pudrición blanca. Este tipo
de residuos pueden servir como fuente de carbono, ya que dichos organismos cuentan con un
complejo enzimático que los capacita para degradar estos sustratos y transformarlos en
biosustancias, como por ejemplo los carbohidratos con potencial bioactividad sobre el sistema
inmune (Sánchez, 2009; Hamedi et al., 2012). Por otro lado, hace falta investigar la producción de
biosustancias por fermentación sumergida empleando macromicetos es un campo muy amplio,
tomando como referente que en la actualidad se conocen alrededor de 14000 especies de hongos
que representan el 10% de las especies de hongos estimadas. De estas especies, cerca del 50%, 7000
especies, se considera que poseen diferentes grados de comestibilidad, y más de 3000 especies de
31 géneros son consideradas como comestibles. De estas especies, 200 se cultivan
experimentalmente, 100 cultivadas económicamente, aproximadamente 60 cultivadas
comercialmente, y alrededor de 10 han llegado a ser cultivadas a escala industrial en varios países.
A nivel mundial, aproximadamente 2000 setas se consideran medicinales con una variedad de
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atributos para la salud. Sin embargo, no se reporta la realización de pruebas in vitro de la actividad
antiinflamatoria y citotóxica de varios productos obtenidos por fermentación sumergida con
macromicetos en Colombia, incumpliendo así con la Resolución 8430 de 1993, en la cual se
contempla que este tipo de bioensayos deben aplicarse sobre las sustancias consideradas
medicinales tanto para evaluar sus efectos benéficos como para asegurar su inocuidad (Ministerio
de Salud, 1993; Chang y Miles, 2004).
Debido a las altas cifras de incidencia de cáncer en Colombia, el Plan Decenal Contra el Cáncer
2010 a 2021, que está alineado con el Plan de Desarrollo Nacional y se articula con el Plan Decenal
de Salud Pública para el período 2012-2021, tiene contemplado mejorar la calidad de vida de
personas con cáncer, disminuir el impacto económico y el negativo desarrollo social, incrementar la
productividad científica de los grupos dedicados a investigación en cáncer, mejorar la difusión, el
uso y la apropiación de la información y el conocimiento generado en cáncer. En lo que respecta a
Manizales, en el Plan de Desarrollo 2012 – 2015 se tiene contemplado aplicar estrategias que
impacten en la morbilidad por cáncer de cuello uterino y de mama, debido a que se presentan
niveles que no muestran control efectivo (Alcaldía de Manizales, 2012; Murillo et al., 2012). Sin
embargo, la investigación para la obtención de bioproductos para la industria alimentaria y
farmacéutica dirigida a enfermedades que afecten el sistema inmune y a disminuir factores de riesgo
en cáncer es un campo poco explorado en Colombia.
Según varios investigadores, es importante profundizar más en el proceso de fermentación
sumergida a nivel de banco con residuos amiláceos de Agaricus blazei para la obtención de
carbohidratos con potencial uso medicinal, realizando primero ensayos preliminares para conocer el
comportamiento del hongo en biorreactor y evaluando el efecto de la fuente de carbono y el pH del
medio de cultivo, cumpliendo con las condiciones necesarias para asegurar una matriz inocua para
el consumo humano (Ministerio de Salud, 1993; Shu et al., 2004; Gao y Gu, 2007; Shu et al., 2007;
Yang y He, 2008; Hamedi et al., 2012)
Los esquemas de extracción de los carbohidratos bioactivos tanto del micelio como del medio
de cultivo revisten gran importancia, ya que se ha que se ha reportado que las estructuras, los pesos
moleculares y en general las propiedades fisicoquímicas y biológicas de los carbohidratos fúngicos
varían de acuerdo al macromiceto del cual provengan, a las condiciones del proceso de
fermentación y a los esquemas de extracción (Rowan et al., 2002). Estos esquemas de extracción
deben ir acompañados de un método analítico preciso para construir los perfiles de carbohidratos de
las fracciones obtenidas, se empleará la cromatografía iónica con detector electroquímico que sirve
para el análisis directo de carbohidratos. Así, es importante para el desarrollo de esta investigación
seleccionar de acuerdo a la bibliografía, las condiciones adecuadas para la extracción de
carbohidratos del micelio y el caldo de cultivo con miras a conservar las estructuras de los
carbohidratos con potencial actividad sobre el sistema inmune y evaluar su actividad citotóxica y
antiinflamatoria a nivel in vitro, al igual que seleccionar las condiciones del análisis cromatográfico
para construir los perfiles de carbohidratos de las fracciones obtenidas.
2.2. Formulación del problema
¿Es posible obtener carbohidratos con potencial antiinflamatorio y citotóxico por fermentación
sumergida de residuos amiláceos empleando Agaricus blazei?
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2.3. Justificación
La producción de sustancias con potencial farmacológico a partir de macromicetos de pudrición
blanca por fermentación sumergida ha mostrado incremento a nivel mundial (Rowan et al., 2002;
Cheung, 2008; Wasser et al., 2013). Al igual que el uso de residuos agrícolas y agroindustriales
como materias primas en procesos de fermentación, especialmente aquellos residuos que
representan fuentes de energía y carbono para los organismos para la obtención de productos de
interés, como es el caso de los residuos amiláceos para los macromicetos, que se ha convertido en
una alternativa de gran interés para disminuir el impacto ambiental de estos residuos y a su vez
generar valor agregado (Jaramillo y Zapata, 2008; Montoya, 2012; Chegwin y Nieto, 2013).
Metabolitos fúngicos como los β-glucanos, ácidos grasos, polifenoles, fenoles, entre otros, han sido
objeto de investigación en países como China, Japón, Taiwan, Korea, India, Israel, Brasil, Estados
Unidos, Portugal, Cuba, entre otros. Dentro de estos metabolitos, los carbohidratos revisten gran
interés, debido a sus actividades como agentes antitumorales, agentes anticancerígenos,
potenciadores del sistema inmunológico, regeneradores celulares, entre otras. Algunos
carbohidratos bioactivos obtenidos de Coriolus versicolor, Lentinula edodes, Schizophyllum
commune, Ganoderma lucidum, Agaricus blazei, Hericium erinaceus y Grifola frondosa, han
exhibido propiedades antitumorales, y han sido empleados en la producción de medicamentos
comerciales que sirven como coadyuvantes en tratamientos contra el cáncer. Además, es creciente
la presencia de suplementos alimentarios y medicamentos derivados de hongos, en países como
Estados Unidos, Cuba y Colombia, especialmente con actividades biológicas como agentes
inmunomoduladores y anticancerígenos (Cheung, 2008; Brown y Williams, 2009; Ramberg et al.,
2010; Llauradó et al., 2011; Montoya, 2012).
En general, los grupos de investigación en sustancias bioactivas colombianos han realizado
proyectos de investigación para evaluar la actividad biológica sobre el sistema inmune,
especialmente la actividad antiinflamatoria, y también la actividad antitumoral de diferentes
agentes bioactivos fitoquímicos extraídos de plantas medicinales, especies marinas y residuos
agrícolas. Con respecto a la investigación sobre sustancias bioactivas de hongos, se reportan
algunas investigaciones, especialmente frente a la producción de micelio por fermentación
sumergida y del basidioma por fermentación en estado sólido de Pleurotus ostreatus, Agaricus
blazei, Ganoderma lucidum, Grifola frondosa, Coriolus versicolor y Lentinus edodes, para su uso
en las industrias de alimentos, cosmética y farmacéutica
(Montoya, 2012; Rojas et al., 2012; Suárez, 2012; Chegwin y Nieto, 2013; Montoya et al., 2013).
En cuanto a la evaluación de la actividad biológica del micelio obtenido por fermentación
sumergida de macromicetos se han reportado investigaciones que incluyen pruebas de actividad
antioxidante (Rojas et al., 2012). Sin embargo, hace falta investigación sobre la producción de
carbohidratos fúngicos con potencial antiinflamatorio y citotóxico en Colombia.
La especie Agaricus blazei, también llamada Agaricus brasiliensis, se encuentra como uno de
los macromicetos investigados en procesos de fermentación sumergida para la producción de
biosustancias. Estos metabolitos, incluyen polisacáridos y otros compuestos con posibles usos
farmacológicos por sus actividades hipocolesterolémica e hipoglicémica, siendo de interés especial
para el desarrollo de esta tesis doctoral las actividades reportadas de los carbohidratos obtenidos a
partir de este macromiceto como estimulador del sistema inmune y antitumoral (Lima et al., 2008;
Ziliotto et al., 2009; Wu et al., 2012; Yamanaka et al., 2012; Suárez A. y Nieto, 2013). Así, la
investigación de la actividad antiinflamatoria y citotóxica de las fracciones de carbohidratos
obtenidas del micelio y el caldo de cultivo de Agaricus blazei servirá como referente para futuros
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trabajos de investigación en biofármacos, y se aportará igualmente al desarrollo de conocimiento en
el área de la salud en Colombia.
3. ESTADO DEL ARTE
3.1. Antecedentes
El departamento de Caldas tiene vocación en la producción agropecuaria, lo cual se refleja en
que el 14,7% del PIB del Departamento se atribuye al sector de la agricultura, caza, ganadería,
silvicultura y pesca (Ministerio de Comercio Industria y Turismo, 2013). Por lo tanto, la producción
agropecuaria del departamento representa un renglón de gran importancia económica, y por ello en
el plan de desarrollo del departamento de Caldas 2012- 2015 se tiene consignado impulsar el sector
agrícola con el cultivo de café, caña de azúcar, plátano, cacao y frutales de clima frío (Secretaria de
Planeación Departamental, 2012). De igual manera, Caldas tiene inclinación agroindustrial
representada por las empresas transformadoras de café, empresas de productos de panadería y
productos lácteos, entre otras (Alcaldía de Manizales, 2012). Estas empresas agroindustriales
generan una importante cantidad de residuos, los cuales pueden ser aprovechados de acuerdo a la
tendencia mundial de disminuir los impactos ambientales ocasionados en los procesos industriales
(Montoya, 2012).
Uno de los principales problemas de las actividades agrícolas y agroindustriales en Colombia es
la acumulación de los residuos sólidos generados durante la cosecha o el procesamiento industrial
de materias primas de origen agrícola, estos residuos equivalen hasta al 70 % del total de los
residuos generados a nivel mundial y dan lugar a problemas ambientales si no se disponen
adecuadamente. Además, los costos de disposición y tratamiento generan gastos que deben ser
asumidos por las empresas o por las comunidades rurales. Debido a esto, cada vez crece más el
interés de darle un manejo adecuado a los residuos agrícolas y agroindustriales, buscando nuevas
alternativas de obtención de productos que dinamicen la economía agraria y generen crecimiento
económico y social de las diferentes regiones colombianas. Estas alternativas van desde el uso de
estos residuos como materias primas para producción de biocombustibles, compostaje,
lombricultivo, biofertilizantes o alimento para animales hasta el desarrollo de otros bioprocesos, en
los cuales se pueden utilizar como sustratos para la producción de ácidos orgánicos, enzimas,
carbohidratos, etanol y otros metabolitos de interés para las industrias alimentaria y farmacéutica
(Granda et al., 2005; Sánchez et al., 2005; Sánchez T. y Cardona A., 2007; Jaramillo y Zapata,
2008; Cruz et al., 2009; Guevara, 2011; Knowles et al., 2012; Montoya, 2012; Núñez, 2012;
Chegwin y Nieto, 2013; Rojas, 2014).
Los cambios demográficos, económicos y ambientales en el mundo, han repercutido en
diferentes aspectos de la vida, siendo muy significativa la incidencia en enfermedades como el
cáncer, el cual está relacionado en casos específicos con fuertes factores de riesgo como las
infecciones por parásitos, virus y bacterias, y estas infecciones están directamente relacionadas con
el funcionamiento del sistema inmune. Infecciones por helicobacter pylori, virus de la hepatitis B y
C, y el virus del papiloma humano fueron los causantes de 1,9 millones de casos de cáncer de los
12,7 millones de casos nuevos que se presentaron a nivel mundial en 2008 (De Martel et al., 2012).
Según los últimos reportes de la Agencia Internacional para Investigación en Cáncer (IARC), en el
año 2012 se reportaron 14,1 millones de casos nuevos de cáncer a nivel mundial, más del 80% de
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estos casos nuevos se presentaron en países en vía de desarrollo, 8,2 millones de muertes por cáncer
y 6,2 millones de personas que vivían con cáncer (Ferlay et al., 2012; Murillo et al., 2012). En
Colombia el cáncer representa un problema de salud pública creciente. Teniendo como causas
principales de muerte por cáncer: La historia familiar (5–10%), el tabaco (25-30-%), la dieta (30-
35%), la obesidad (10-20%), las infecciones (15-20%), el alcohol (4-6%) y otros (10-15%). Sin
embargo, en este país el estado socioeconómico, las infecciones y las exposiciones ocupacionales
tienen porcentajes mayores a las estimaciones mencionadas (Murillo et al., 2012).
En Colombia la incidencia de cáncer corresponde a cerca de 70.887 casos nuevos de cáncer por
año, esto según las cifras estimadas por el Instituto Nacional de Cancerología (INC) con respecto a
los años 2000 a 2006, durante los cuales el cáncer fue la tercera causa de muerte en este país. En el
departamento de Caldas se presentan 1.347 casos de cáncer en mujeres y 985 en hombres, siendo
los cinco tipos de cáncer con mayor incidencia respecto a su localización en el cuerpo humano
(excepto cáncer de piel) para los hombres: próstata, estómago; pulmón; colon, recto y ano; y en el
caso de las mujeres: tiroides; mama; cuello del útero; estómago; colon, recto y ano. Notablemente,
se tienen en común el cáncer de estómago y el de colon, recto y ano, aunque se observa una
tendencia al incremento de la mortalidad por cáncer de mama y pulmón en mujeres y próstata, colon
y recto en ambos sexos (Cendales y Pardo, 2012). Por otra parte, los macromicetos se conocen
desde hace siglos por sus propiedades nutricionales y medicinales para el tratamiento de
enfermedades en el hombre. En oriente, las sustancias bioactivas derivadas de los hongos de
pudrición blanca, tanto del micelio como del cuerpo fructífero o del medio de cultivo, han sido
objeto de investigación, principalmente en países como China, Japón, Corea del Sur y Taiwán. Por
otra parte, debido a las actividades farmacológicas comprobadas de metabolitos primarios y
secundarios, y a su alto valor nutricional, los estudios sobre macromicetos, también han tenido y
siguen teniendo lugar en varios países occidentales como son Brasil, Estados Unidos y Cuba. Los
metabolitos que se han investigado incluyen carbohidratos, policétidos, ácidos grasos, polifenoles,
flavonoides y terpenoides, principalmente. Estos compuestos exhiben una o varias de las siguientes
actividades biológicas: antioxidante, hipocolesterolémica, hipoglicémica, antiviral, antitumoral,
anticancerígena e inmunomoduladora, entre otras (Chang y Miles, 2004; Cheung, 2008; Suárez A. y
Nieto, 2013). Así, durante la 7a Conferencia Internacional de Hongos Medicinales llevada a cabo en
Beijing, (China) en agosto de 2013, se encontraron investigadores notables en el área de hongos
medicinales como S.P Wasser, S. T. Chang, Yu Li, Yijian Yao, Mingjie Chen, Jichuan Kang,
Junfang Lin, entre otros, para compartir sus últimas investigaciones y visiones en la temática. En
general, los temas tratados fueron: Los valores potenciales de productos de hongos medicinales; La
ciencia y la tecnología; Nuevos desarrollos en suplementos dietarios; Control de calidad y
regulaciones; Producción industrial y mercadeo; Tecnología de cultivo y fermentación; Ganoderma
spp.: Perspectivas y desafíos; Ophiocordyceps sinensis, Cordyseps militaris e Isaria cicadae:
Perspectivas y desafíos; Taiwanofungus camphoratus y otros hongos medicinales (Hericium
erinaceus, Trametes versicolor, Grifola frondosa) y Hongos medicinales en producción y salud
animal. Se resaltaron las actividades biológicas de polisacáridos fúngicos como mejorar la
inmunidad, actividad anti-tumoral, actividad antioxidante, actividad antiviral, actividad anti-
envejecimiento, reducción de la glucosa en la sangre, entre otros, con pocos efectos secundarios.
Así, se mostró que actualmente los polisacáridos también son usados en oncología clínica para
aumentar la efectividad de las preparaciones quimioterapéuticas y reducir sus efectos secundarios.
Se evidenció el potencial terapéutico de los polisacáridos extraídos de los hongos y que ellos
representan una rica fuente para futuros descubrimientos y desarrollos de compuestos nuevos de
valor medicinal (Wasser et al., 2013).
En Colombia se han realizado estudios sobre hongos que incluyen el uso de macromicetos de
pudrición blanca para producción de biomasa y el estudio de su actividad antioxidante, también se
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han realizado estudios sobre el uso de Trametes versicolor para tratamiento de aguas residuales, y
sobre la producción de enzimas ligninocelulolíticas de los hongos Phanerochaete chrysosporium,
Pleurotus ostreatus, Schyzophillum commune, Ganoderma applanatum, Ganoderma lucidum,
Auricularia delicata, Lentinus edodes, Grifola frondosa, Pycnoporus sanguineus y Trametes
versicolor (Martínez-Salgado et al., 2005; Montoya, 2008; 2012; Rojas et al., 2012).
Los investigadores en biotecnología han implementado la fermentación sumergida de diferentes
especies de macromicetos para la obtención de biosustancias, las cuales están presentes tanto en la
biomasa como en el medio de cultivo agotado, siendo éste último generalmente desechado en
procesos de fermentación en estado líquido, pero en este caso representa una fuente muy importante
de sustancias de valor agregado, los exopolisacáridos. Así, varias investigaciones ponen de
manifiesto que la proporción de carbohidratos producidos varía principalmente de acuerdo al
estadio del hongo, a las condiciones del proceso y al medio en que es cultivado. Respecto a las
condiciones de proceso, el pH inicial, la temperatura del medio de cultivo y la velocidad de
agitación, influyen significativamente tanto en el crecimiento celular como en la concentración de
intrapolisacáridos (IPS) y exopolisacáridos (EPS) obtenidos. El pH inicial del medio de cultivo ha
mostrado tener gran efecto sobre la estructura química de los exopolisacáridos obtenidos y se ha
indicado que esto afecta la actividad biológica de los mismos. Por ello, Gao y Gu han sugerido que
se realicen investigaciones con diferentes pH del medio de cultivo sin control y con control, es decir
manteniéndolos constantes durante todo el tiempo de proceso, y evaluando su efecto sobre el
crecimiento micelial, al igual que sobre la concentración y la estructura química de IPS y EPS a
partir de Agaricus blazei. Por otro lado, la velocidad de agitación cambia la concentración de
oxígeno disuelto en el medio, lo cual es muy importante en este proceso por el metabolismo
aeróbico del hongo (Shu et al., 2004; Gao y Gu, 2007; Shu et al., 2007; Yang y He, 2008; Hamedi
et al., 2012; Montoya, 2012; Suárez A. y Nieto, 2013).
3.2. Marco teórico
Los macromicetos de pudrición blanca han mostrado tener amplias aplicaciones a nivel
industrial. Naturalmente, estos organismos pueden degradar materiales de difícil degradación, como
es el caso de los residuos lignocelulósicos, al igual que xenobióticos tanto en líquidos como en
sólidos. También, se han utilizado de forma recurrente para realizar compostajes, los cuales tienen
gran utilidad en la agricultura. A partir de los hongos se pueden producir gran variedad de
sustancias con diferentes fines, como son las enzimas (hidrolasas y oxido-reductasas,
principalmente), las cuales pueden ser empleadas a nivel industrial. Los carbohidratos fúngicos
también presentan alto valor, ellos se utilizan para la producción de suplementos alimentarios y
medicamentos. Además, los hongos son fuentes de colorantes, espesantes, saborizantes, entre otros,
los cuales tienen aplicación en la industria de alimentos (Montoya, 2012).
La transformación de los residuos en materias primas de procesos productivos, la producción de
sustancias de uso farmacológico, nuevos procesos tecnológicos para tratar los residuos, la
producción de abonos y alimentos para animales, el uso de la biomasa fúngica para el tratamiento
de aguas residuales, constituyen opciones de alto interés para responder a retos actuales de la
humanidad. Los carbohidratos fúngicos, especialmente, son una alternativa potencial para el
mejoramiento de la calidad de vida de personas con enfermedades relacionadas con el
funcionamiento del sistema inmune, ya que en diferentes investigaciones se han reportado que los
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carbohidratos contenidos tanto el cuerpo fructífero, como en el micelio y el caldo de cultivo,
presentan diferentes actividades como inmunomoduladores, al igual que se han reportado sus
efectos como agentes antitumorales y anticancerígenos, coadyuvantes en quimioterapia, anti-
inflamatorios, antioxidantes, cicatrizantes, anticolesterolémicos, antidiabéticos, entre otros (Miles y
Chang, 1999; Chang y Miles, 2004; Lin et al., 2010; Hirahara et al., 2012; Montoya, 2012; Silva et
al., 2012; Fangkrathok et al., 2013; Han et al., 2013; Montoya et al., 2013; Wasser et al., 2013).
3.2.1. Carbohidratos fúngicos
El metabolismo de los hongos es la suma de los cambios que ocurren durante su crecimiento y
desarrollo, tales cambios químicos corresponden a la sumatoria del catabolismo y anabolismo. Los
diferentes procesos metabólicos de los hongos ocurren a velocidad específica máxima (µmax) cuando
todos los nutrientes disponibles se encuentran en el medio. El proceso de síntesis de polisacáridos
por los hongos basidiomicetos recién empieza a investigarse y hace falta mayor conocimiento sobre
el funcionamiento interno de las hifas y su interacción con el medio en el que se desarrollan
(Montoya, 2012).
La pared celular de los hongos ha emergido como una estructura dinámica en lugar de una
estructura inerte de la célula. Su construcción puede cambiar en respuesta al estrés ambiental, como
por ejemplo choque osmótico. En todos los casos los mayores componentes son polisacáridos:
quitina, glucanos y manoproteínas en Ascomicetos, Basidiomicetos y hongos mitospóricos;
quitosano, quitina y ácido poliglucurónico en Zigomicetos; celulosa y otros glucanos en Oomicetos.
También hay proteínas y glicoproteínas específicas de la pared celular en todos los grupos de
hongos mencionados (Carlile et al., 2001).
Los β-glucanos son sintetizados a partir de glucosa por las enzimas excretadas por los hongos,
estos pueden ser homoglucanos o heteroglucanos según el tipo de enlace de los que esté compuesta
la cadena. También se ha evidenciado la formación de otras sustancias más complejas a partir de
monosacáridos sintetizados por los hongos, estos son polisacáridos compuestos por diferentes
monosacáridos y disacáridos, además de glucosa, como son manosas, pentosas, fructosa, otras
hexosas, celobiosa, entre otros; y otras sustancias producto de la unión de un polisacárido con uno o
varios aminoácidos, denominados amino-glucanos o proteo-glucanos. Estos polisacáridos son
metabolitos primarios formados por los hongos, los que le sirven como reserva energética, y
cumplen otras funciones como limitar la movilidad de las enzimas extracelulares para optimizar las
reacciones de conversión de alimento y su absorción (Montoya, 2012).
Los polisacáridos producidos por los hongos pueden ser intra o exopolisacáridos, los cuales
presentan diferencias estructurales, de pesos moleculares y sus combinaciones dependiendo de la
estructura donde sean encontrados o el medio líquido o sólido donde sean excretados, en el caso de
la fermentación líquida, varias de estas sustancias son arrojadas al medio y solubilizadas en él, y en
el caso de la fermentación sólida son excretadas al medo de cultivo cuando el hongo se encuentra en
la fase de colonización del medio. Sin embargo, una gran cantidad de polisacáridos se encuentran
como intrapolisacáridos haciendo parte de la estructura de los carpóforos o del micelio (Montoya,
2012).
11
3.2.2. Fermentación sumergida de macromicetos
La fermentación sumergida es un proceso en biorreactor de tanque agitado que involucra el
desarrollo de microorganismos en un medio líquido rico en nutrientes, para la producción de
biomasa y metabolitos, y que generalmente se realiza en presencia de oxígeno. Estos nutrientes
deben ser preferiblemente solubles en agua o encontrarse en suspensión. Es el tipo de fermentación
más empleado en la industria debido a que pueden controlarse más variables que en la fermentación
en estado sólido (FES) y generalmente los productos que quedan en el medio de cultivo son más
sencillos de recuperar (Montoya, 2012; Suárez, 2012). Adicionalmente, se pueden controlar la
transferencia de oxígeno y la homogeneidad del cultivo, permitiendo que el proceso sea
reproducible y se pueda monitorear. La descomposición de los sustratos es llevada a cabo por
enzimas producidas para tal fin por los microorganismos, de allí que la fabricación industrial de
enzimas se realiza principalmente por fermentación sumergida (Montoya, 2012; Suárez A. y Nieto,
2013).
Respecto a los macromicetos comestibles, sólo hasta hace unos años se ha empezado a
desarrollar esta tecnología. Para lo cual, durante el proceso de la fermentación se deben controlar
principalmente la temperatura, pH del medio de cultivo, la velocidad de agitación, la aireación y la
composición de los medios. Diferentes estudios evidencian la importancia del pH en la
fermentación sumergida de macromicetos, especialmente por su influencia en la producción de
biomasa y de exopolisacáridos, igualmente reportan un efecto del pH sobre las estructuras de los
carbohidratos obtenidos en estos procesos (Shu et al., 2004; Hamedi et al., 2012; Suárez A. y Nieto,
2013). Por otro lado, los macromicetos pueden crecer en variadas condiciones ambientales, es decir
que su crecimiento se puede dar en un rango de temperatura amplio(Shu et al., 2007; Suárez A. y
Nieto, 2013). Aunque, generalmente en la fermentación sumergida se utilizan temperaturas entre26
y 36 °C, considerando que un incremento en la temperatura puede aumentar el metabolismo del
hongo y también disminuir la solubilidad del oxígeno en el medio, ocasionando una disminución en
el crecimiento y metabolismo, ya que los macromicetos son organismos aerobios. Otra variable
importante es la aireación, ésta influye en la concentración de oxígeno disuelto, pero puede
controlarse fijando el volumen de aire suministrado al medio de cultivo durante el proceso (Kim et
al., 2008; Suárez A. y Nieto, 2013).
El desarrollo de las células fúngicas o hifas a menudo resulta en el crecimiento incontrolado del
micelio, ocasionando efectos muy importantes en la transferencia de masa, velocidad metabólica y
secreción de productos. El micelio fúngico puede enrollarse alrededor de las esferas o pellets de la
misma biomasa, causando bloqueos y extendiéndose en todo el medio de cultivo, incrementando la
viscosidad, lo que genera dificultades frente a la transferencia de masa y de oxígeno en el
biorreactor. Por ello, el tiempo de fermentación está limitado de acuerdo al manejo de estas
variables (Montoya, 2012). La agitación también juega un papel muy importante tanto en la
integridad del micelio como en la concentración de oxígeno disuelto en el medio de cultivo, si la
agitación es muy fuerte se producirá rompimiento del micelio y por lo tanto la formación de pellets
disminuye, y al mismo tiempo se ve afectada la producción de biomasa y de los metabolitos de
interés, como es el caso de los exopolisacáridos. Los pellets pueden sufrir daño por la interacción
entre las partículas y los remolinos, el impacto entre las partículas y los impulsores o deflectores y
la colisión entre partículas (Cui et al., 1997; Suárez A. y Nieto, 2013)
La fuente de carbono más comúnmente utilizada en la en la formulación del medio de cultivo
para la producción de carbohidratos fúngicos y otros metabolitos a partir de macromicetos es la
glucosa. Para Agaricus blazei se han estudiado otras fuentes de carbono como manitol, galactosa,
almidón, lactosa, maltosa, encontrando de forma preliminar que la producción de biomasa y la
producción de exopolisacáridos puede estar beneficiada por el uso almidón(Shu et al., 2004; Liu y
12
Wang, 2007; Shu et al., 2007; Kim et al., 2008; Hamedi et al., 2012). Por consiguiente, se pueden
usar residuos amiláceos como fuente de carbono para fermentación sumergida de macromicetos
(Montoya, 2012). Es así, como los factores mencionados y otros como la variabilidad de cepas
fúngicas y las características físico-químicas de los productos obtenidos, evidencian que el
desarrollo de procesos de fermentación sumergida con residuos amiláceos empleando hongos de
pudrición blanca para la producción de intra y exopolisacáridos con potenciales usos farmacéuticos
es una línea promisoria de investigación (Montoya, 2012; Rojas et al., 2012; Suárez, 2012;
Montoya et al., 2013; Suárez A. y Nieto, 2013).
3.2.3. Actividad biológica
La actividad biológica o farmacológica de una sustancia es una expresión que describe los
efectos benéficos o adversos de un fármaco o principio activo de un medicamento sobre la materia
viva. La farmacología (del griego pharmakon, fármaco, medicamento y logos, tratado) es parte de
las ciencias biomédicas que estudia las propiedades de los fármacos y sus acciones sobre el
organismo (Lorenzo et al., 2008). Un fármaco además de su significado primitivo como purgante o
purificante, actualmente y en sentido genérico, es toda sustancia química que al interactuar con un
organismo vivo da lugar a una respuesta medible o sensible, sea esta beneficiosa o tóxica, y que se
absorbe, puede transformarse, almacenarse o eliminarse (Brunton et al., 2006; Lorenzo et al., 2008).
En el mismo contexto, un medicamento es toda sustancia química que es útil en el diagnóstico,
tratamiento y prevención de enfermedades o de síntomas o signos patológicos o que es capaz de
modificar los ritmos biológicos, el medicamento sería entonces un fármaco útil con fines médicos.
Por otro lado, una droga en sentido clásico se refiere a una sustancia, generalmente de origen
vegetal, tal como la ofrece la naturaleza u obtenida a partir de sencillas manipulaciones, siendo el
principio activo la sustancia responsable de la actividad farmacológica de la droga (Lorenzo et al.,
2008). La farmacocinética es el estudio de la absorción, distribución, transformación y eliminación
de un medicamento en un organismo; comprende procesos de liberación del principio activo,
absorción, distribución, metabolización y excreción del fármaco (Universidad de Salamanca, 2013).
Los modelos in vivo pueden indicar si un agente es capaz de mejorar la respuesta inmune y
hasta qué punto puede antagonizar una infección severa o letal. Esto permite comprobar el potencial
terapéutico o la capacidad protectora de dicho agente. Además, en el modelo de animal
inmunodeprimido se puede detectar si una droga o compuesto bajo estudio puede restaurar el
sistema inmune parcialmente deteriorado. Sin embargo, para la selección rigurosa y masiva de
compuestos, los bioensayos in vitro son los más adecuados, pues además de su relativo bajo costo,
pueden orientar sobre los posibles mecanismos de acción de las sustancias investigadas. Por otra
parte, como los resultados obtenidos a este nivel no se correlacionan necesariamente con los
resultados en organismos vivos, es necesario confirmar los resultados obtenidos in vitro con
modelos in vivo, y viceversa. Esto puede suceder cuando uno o varios tipos de células o sistemas
mediadores, no todos ellos presentes en un sistema celular in vitro, son responsables del efecto in
vivo. En consecuencia, por lo general, es necesario realizar varios ensayos in vitro ya que no hay un
sistema maestro o una célula única que regule y gobierne las diversas vías inmunológicas (Sánchez
et al., 2002)
13
i) Sistema inmune y enfermedad
La comprensión de los mecanismos básicos de la inmunidad ha permitido avanzar en el
conocimiento de las alergias, las enfermedades autoinmunes; desarrollar nuevos procedimientos y
técnicas de diagnóstico; iniciar procedimientos de inmunoterapia para el control de muchas
enfermedades; facilitar los trasplantes de órganos, y entender cómo las inmunodeficiencias
congénitas o adquiridas dificultan una defensa adecuada contra patógenos. Normalmente el sistema
inmune reconoce lo extraño y lo ataca en un mecanismo de defensa; si es inmunodeficiente en
forma congénita o adquirida, no logra destruir al agresor. Por lo general respeta lo propio, lo tolera,
si lo ataca da origen a enfermedades autoinmunes (Rojas M., 2004).
El funcionamiento del sistema inmune está relacionado específicamente con, la defensa inmune
contra infecciones bacterianas; respuesta inmune contra infecciones virales, por parásitos y por
hongos; enfermedades de la piel, del tracto gastrointestinal y del hígado, del sistema cardiovascular,
del riñón, del sistema nervioso, endocrinas, articulares, de los músculos, oftalmológicas, entre otros
(Rojas M., 2004). El impacto que tiene el sistema inmune sobre la salud humana, ha generado que
la investigación se incremente en varios campos relacionados, tal es el caso de la inmunosupresión
y la inducción de tolerancia, debido a que el sistema inmune limita los procedimientos de trasplante
de órganos. La inmunosupresión no específica o general está bastante desarrollada, mientras que la
tolerancia específica, es decir, que conserve la actividad normal del sistema inmune contra los
demás antígenos distintos a aquél contra el cual se busca la tolerancia, está en una etapa apenas
inicial, pero que ofrece muchas expectativas. Sin embargo, se ha encontrado que la
inmunomodulación como terapia en procesos autoinmunes ha tenido éxito en muchos experimentos
con animales, pero ha presentado inconvenientes en evaluaciones clínicas realizadas con humanos
(Rojas M., 2004). Por ello, la realización de proyectos de investigación dirigidos a incrementar el
conocimiento sobre el sistema inmune y las variables que afectan al buen funcionamiento del
mismo son vigentes en cualquier sociedad.
ii) Modificadores de la respuesta biológica.
La lista de agentes inmunológicamente activos que se investigan en la actualidad es extensa.
Para este grupo de sustancias, de naturaleza muy variada, ha sido propuesto el término
“Modificador de la Respuesta Biológica” (BRM). Estas sustancias incluyen agentes químicamente
definidos, extractos y preparaciones de origen microbiano, fúngico, plantas superiores y sustancias
producidas por procedimientos de ADN recombinante. Funcionalmente estos agentes pueden
dividirse entre aquellos que actúan sobre las células T, células B, células NK o macrófagos o
aquellos que son específicos o inespecíficos en su acción. Se ha acumulado una amplia información
sobre la actividad inmunofarmacológica de tales compuestos, pero se conoce poco sobre su
comportamiento farmacocinético, principalmente debido a la ausencia de métodos de ensayo
sensitivos para determinar su presencia en bajas concentraciones en los tejidos biológicos. Sin
embargo, aún con el limitado conocimiento disponible, existen posibles aplicaciones clínicas,
logrando la aprobación de su uso por parte de entes gubernamentales en países como Japón y
Alemania. Sobre estos productos y sus efectos se tienen informes muy positivos, aunque también se
presenta información crítica y advertencias sobre sus limitaciones (Sánchez et al., 2002).
Existen algunos factores que dificultan el uso de los modificadores de la respuesta biológica
(BRM), inicialmente muchas preparaciones no han sido completamente caracterizadas o su
estandarización ha sido insuficiente; algunos compuestos han demostrado ser tóxicos o producen
efectos secundarios graves, por lo que existe gran dificultad en determinar la dosis óptima y el
14
modo apropiado de administración; y finalmente resulta difícil evaluar el estado del sistema inmune
en un paciente y a partir de allí proponer un terapia inmune apropiada utilizando un modificador de
la respuesta inmune. A pesar de esto, en países como Japón y Alemania, la experiencia terapéutica
acumulada ha sido la base para la elaboración de formulaciones farmacéuticas que se utilizan con
éxito en la práctica médica actual (Sánchez et al., 2002). Debido a lo expuesto anteriormente, es
necesario continuar la investigación sobre la inmunofarmacología y farmacocinética de los BRM
para incrementar la información disponible y dar uso adecuado a los mismos
iii) Estructura química y actividad inmunomoduladora.
Desde el punto de vista molecular, los compuestos con actividad inmunomoduladora pueden
pertenecer a cualquier clase química estructural. Se han identificado compuestos activos que
pertenecen a los siguientes grupos de sustancias: carbohidratos, terpenos, esteroides, fenoles,
cumarinas, aminoácidos, péptidos, proteínas, glicoproteínas, alcaloides y otras sustancias orgánicas
nitrogenadas. En esta revisión se hará un enfoque especial sobre carbohidratos de origen fúngico
con actividad inmunomoduladora.
Los carbohidratos aislados de hongos, principalmente glucanos y algunos mananos han
demostrado actividad inmunomoduladora. El peso molecular de estos polisacáridos oscila entre 5 y
1000 kDa. Son compuestos típicos de este grupo el lentinan, aislado de Lenitinus edodes, el
esquizofilano de Schizophyllum commune y el polisacárido H11 de micelios de Poria cocos. Estos
glucanos neutros han demostrado actividad antitumoral. En la tabla 1 se presentan algunos
carbohidratos de origen fúngico con diferentes efectos sobre el sistema inmune como agentes
inmunomoduladores y antitumorales.
4. HIPÓTESIS
La realización de un diseño experimental factorial tomando como factores: pH del medio,
fuente de carbono y tiempo de proceso, permitirá establecer las condiciones de operación de la
fermentación sumergida a escala de banco empleando residuos amiláceos para la producción de
carbohidratos con potencial citotóxico y antiinflamatorio a partir del macromiceto Agaricus
blazei.
Los intra y exo-polisacáridos del micelio y el medio de cultivo agotado se pueden separar en
fracciones mediante esquemas de extracción, para así construir sus perfiles de carbohidratos y
evaluar sus actividades anti-inflamatoria y citotóxica con bioensayos in vitro.
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo General
Obtener carbohidratos con potencial anti-inflamatorio y citotóxico de Agaricus blazei
empleando residuos amiláceos por fermentación sumergida.
15
5.2. Objetivos Específicos
5.2.1. Definir las condiciones de la fermentación sumergida a escala de banco de residuos
amiláceos con Agaricus blazei para la obtención de carbohidratos con potencial citotóxico
y antiinflamatorio.
5.2.2. Seleccionar e implementar el esquema de extracción de los carbohidratos contenidos en la
biomasa y el caldo de cultivo de la fermentación sumergida de residuos amiláceos con
Agaricus blazei.
5.2.3. Evaluar la actividad biológica anti-inflamatoria y citotóxica de las fracciones obtenidas del
esquema de extracción de los carbohidratos de Agaricus blazei.
Tabla 1. Carbohidratos bioactivos obtenidos de hongos de pudrición blanca con actividad
antitumoral e inmunomoduladora. Especie Tumor / Cáncer tratado /
Actividad
inmunomoduladora
Origen Compuestos bioactivos
Coriolus
versicolor
Sistema digestivo /
inmunomodulador
Cultivo
micelial
Glucoproteínas, (1-4), (1-3)-β-D-
glucan, Polisacaropéctido
Lentinus
edodes
Cáncer de
estómago/actividad
inmunomoduladora
Cuerpo
fructífero,
medio de
cultivo
(1-3)-β-D-glucano, manoglucanos,
glucanos, lentinan, complejo
poliscáridos-proteina
Cordyceps
sinensis
Inmunomodulador Cuerpo
fructífero,
micelio, caldo
de cultivo
Glucano, heteroglucanos,
cordiglucanos
Flamulina
velutipes
Inmunomodulador Carpóforo,
micelio
Complejo proteo-glucano,
Schizophyllum
commune
Cáncer cervical Micelio y
carpóforo
(1-3), (1-6)-β-D-glucano
Ganoderma
lucidum
Actividad antitumoral
genérica/inmunomoduladora
Micelio y
carpóforo
Ácido ganodérico, manoglucano,
glicopeptidos, heteroglucano,
Agaricus blazei Actividad antitumoral
genérica
Micelio y
carpóforo
(1-6)-β-D-glucano
Grifola
frondosa
Actividad antitumoral
genérica/inmunomoduladora
Cuerpo
fructífero ,
medios de
cultivo
(1-3), (1-6)-β-D-glucano,
Glicoproteínas, heteroglucanos,
galactomananos, grifolan
Hericium
erinaceus
Actividad
inmunomoduladora
Cuerpo
fructífero,
micelio
Heteroglucanos, complejo péptido-
heteroglucano
Pleurotus
ostreatus
Actividad
inmunomoduladora
Cuerpo
fructífero,
micelio, medio
de cultivo
Heterogalactan, proteoglucano
Modificado de Montoya (2012)
16
6. METODOLOGÍA
El desarrollo de esta investigación se llevará a cabo en la Planta de Bioprocesos de la
Universidad de Caldas. Durante la realización de este proyecto se pretende obtener fracciones con
alta concentración de carbohidratos, mediante fermentación sumergida de residuos de papa
empleando el macromiceto de pudrición blanca Agaricus blazei. También, se construirán los
perfiles de carbohidratos de dichas fracciones por cromatografía iónica, y finalmente se evaluará su
actividad antiinflamatoria y citotóxica con bioensayos in vitro.
6.1. Metodología para el objetivo 1
Como fuente de carbono en el medio de cultivo se utilizará almidón obtenido de residuos de
papa. Estos residuos son los más abundantes al igual que los de maíz en Manizales, aunque estos
últimos corresponden en su mayoría a maíz cocido, del cual no es posible obtener almidón crudo. El
almidón de los residuos de papa se obtendrá siguiendo las etapas descritas en la figura 1, mediante
la extracción del jugo del tubérculo que se someterá a filtración por tamices metálicos para separar
el almidón de la suspensión, se realizarán varios lavados, para luego secar y almacenar el almidón
crudo en refrigeración hasta su uso.
Para el proceso de fermentación sumergida se utilizarán tres fuentes de carbono en el medio de
cultivo: almidón crudo, almidón gelatinizado y glucosa. Para obtener el almidón de papa
gelatinizado, se definirá el rango de temperatura de gelatinización según el método reportado por
Watson descrito en la figura 1, y si es necesario se aplicará un tratamiento con ultrasonido para
mejorar la solubilidad del almidón gelatinizado (Ruales et al., 2000; Iida et al., 2008). La
formulación completa del medio de cultivo estará compuesta además de la fuente de carbono, por
extracto de levadura como fuente de nitrógeno orgánica, aceite de soya y sales como sulfato de
magnesio heptahidratado, sulfato de manganeso, cloruro de calcio y fosfato de potasio.
Se realizarán dos diseños experimentales para el desarrollo de este objetivo. El primer diseño
experimental propuesto es un diseño factorial con 3 factores completamente aleatorizado. Este
diseño estará compuesto por tres niveles en la fuente de carbono: Almidón crudo, almidón
gelatinizado y glucosa; tres niveles en pH: 4,5; 5,5 y 6,5 y tres tiempos de fermentación: 10, 14 y 21
días. Se proyecta realizar 9 tratamientos con tres repeticiones para un total de 81 experimentos. Este
primer diseño experimental se realizará en matraces de 1000 mL con 300 mL de medio de cultivo
como unidad experimental, los cuales serán inoculados con el 5 % de biomasa adaptada (micelio de
Agaricus blazei). La adaptación del micelio de Agaricus blazei, se realizará tomando un trozo de
micelio extendido en agar de 0,5 cm de lado en 50 mL de medio líquido con glucosa, extracto de
levadura y sales, en matraces de 250 mL de capacidad. Estos matraces se llevarán a fermentación
sumergida en una incubadora orbital con agitación por 14 días a 100 rpm, 25 °C y penumbra hasta
la formación de pellets, hecho que indica la adaptación del micelio al medido líquido, a fin de ser
inoculado posteriormente en los medios seleccionados para el diseño experimental. La variable de
respuesta para este diseño experimental será la cantidad de β-glucanos en el caldo de cultivo.
Se realizarán varios ensayos preliminares para conocer el comportamiento del hongo Agaricus
blazei en el biorreactor marca Applikon con capacidad para 7 L. Se desarrollará un segundo diseño
experimental factorial con 2 factores completamente aleatorizado, donde se evaluará la
fermentación sumergida del hongo en el biorreactor como unidad experimental. Los factores a
considerar en este diseño experimental son: Fuente de carbono con 2 niveles (Almidón seleccionado
en el primer diseño experimental y glucosa) y pH del medio de cultivo seleccionado con 2 niveles
17
(pH con control y sin control). Adicionalmente, a cada uno de los medios formulados para los
experimentos, se les realizará análisis fisicoquímicos para determinar el pH inicial de los medios,
que se llevará al valor correspondiente usando soluciones de una base o un ácido grado alimentario
que también se adicionarán automáticamente para el caso del pH controlado durante todo el tiempo
de la fermentación; se determinará la concentración de sustrato y la viscosidad del medio de cultivo
al inicio y al final de la fermentación. De forma preliminar, se proyecta realizar 4 tratamientos con 3
repeticiones, lo que en total corresponde a 12 observaciones usando 5 L de medio de cultivo. Para el
montaje del proceso de fermentación sumergida en el biorreactor, se realizará el proceso de
adaptación al micelio del hongo Agaricus blazei desde el micelio extendido en agar hasta que la
biomasa llegue adaptada al medio de cultivo en el biorreactor. Las variables de respuesta para este
segundo diseño son la biomasa (en estado vegetativo), determinada como la cantidad de micelio
seco obtenido en el proceso de fermentación, y la composición proximal de β-Glucanos del micelio
y el caldo de cultivo que se obtendrá con el análisis de las fracciones obtenidas de los esquemas de
extracción.
El análisis de los datos durante el desarrollo de los experimentos se llevará a cabo con la
herramienta estadística del software Matlab. Se realizará el análisis de varianza a los datos para
determinar los efectos de los dos factores, igualmente se evaluará la normalidad de errores con la
prueba de Shapiro – Wilk, la homocedasticidad de varianzas con la prueba de Bartlett y la
independencia de los errores.
Figura 1. Etapas para la extracción y gelatinización de almidón de residuos de papa. Fuentes:
(Ruales et al. (2000); Rodríguez et al. (2003); Noda et al. (2004); Mazzeo et al. (2008))
Los aspectos generales de las técnicas analíticas que se emplearán para el desarrollo de este
proyecto se muestran en la tabla 2. Para evaluar el consumo de sustrato en el proceso de
fermentación, se realizará la determinación de azúcares reductores por el método del ácido 3,5-
18
dinitrosalicílico (DNS) y el almidón total por el método espectrofotométrico (visible). Para los
productos de la fermentación, se determinará la concentración de biomasa por el método del peso
seco y se determinará la concentración de 1,3-β-glucano y 1,6-β-glucano en las fracciones de
carbohidratos según el método descrito por Koizumi et al. (1989).
Tabla 2. Determinación de compuestos durante el proceso de fermentación sumergida Compuesto Método Referencia
Azúcares reductores Método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) a una
longitud de onda de 540 nm
Miller (1959)
Almidón total Método espectrofotométrico (visible) a una longitud
de onda de 630 nm
Ruales et al. (2000)
Biomasa Método de peso seco Montoya (2012)
1,3 -β-glucano y 1,6 -β-glucano Cromatografía iónica con detector electroquímico Koizumi et al. (1989)
6.2. Metodología para el objetivo 2
6.2.1. Selección de los esquemas de extracción
Para seleccionar los esquemas de extracción adecuados para obtener las fracciones con los
carbohidratos potencialmente bioactivos, se realizarán ensayos preliminares con las metodologías
reportadas en la literatura por Dubois (Dubois et al., 1956), Mizuno (Rowan et al., 2002), Stephen
(Stephen et al., 2006) y Montoya (Montoya, 2012; Montoya et al., 2013), entre otros (Ver anexos 1
y 2). Así, se establecerá el protocolo de extracción de IPS y EPS para obtener fracciones de
carbohidratos, incluyendo los procedimientos de secado y almacenamiento de estas muestras para
su almacenamiento hasta posterior uso en el análisis cromatográfico y las pruebas de actividad
biológica. Al micelio se le realizarán 3 extracciones sólido – líquido, obteniendo así 3 fracciones,
posteriormente se realizará una nueva extracción a estas muestras iniciales obteniendo otras 3
fracciones, para un total de 6 fracciones del micelio. Al caldo de cultivo, se le realizará una
extracción líquido – líquido obteniendo una fracción a partir de éste, y se realizará otra extracción
obteniendo una segunda fracción, es decir dos fracciones del caldo de cultivo. La extracción de los
exopolisacáridos del caldo de cultivo, solubles en álcali y agua, se realiza de manera general
adicionando 4 volúmenes de etanol al 96 % a 0,5 mL de caldo y se dejan transcurrir 45 minutos, se
centrifuga a 14000 revoluciones por minuto (rpm) durante 15 minutos, obteniendo una primera
fracción. Posteriormente, a los componentes insolubles se les adiciona 0,5 mL de hidróxido de
sodio 1 M a 60 °C y se dejan durante 1 hora a 60 °C, para así obtener la segunda fracción (Montoya
et al., 2013).
6.2.2. Perfil de carbohidratos de las fracciones obtenidas
Los análisis cromatográficos se desarrollarán en el cromatógrafo iónico ICS-5000 con detector
electroquímico. Inicialmente, se realizarán ensayos para poner a punto las técnicas de preparación
de las muestras y del análisis cromatográfico de monosacáridos, oligosacáridos y β-glucanos, con
la correspondiente columna cromatográfica. Los monosacáridos y oligosacáridos se analizarán con
la columna cromatográfica CarboPac PA1 (4 x 250 mm) y guarda columna PA1 (4 x 50 mm). Para
poner a punto el método, se utilizará un estándar de monosacáridos de Dionex, hidróxido de sodio
19
16 mM como eluente, una velocidad de flujo de 1 mL/min., un volumen de inyección de 10 µL y
detector electroquímico (Dionex corporation, 2004). Para el análisis de β-glucanos, se utilizará la
columna IonPac ICE-AS6 utilizando luteosa y curdlano como estándares de 1,6 - β-glucano y 1,3-
β-glucano, respectivamente; Se emplearán soluciones de hidróxido de sodio y acetato de sodio para
preparar el eluente, variando las concentraciones de acetato de sodio desde 100 mM a 500 Mm de
acuerdo al β-glucano analizado, y la detección se realizará con detector electroquímico (Koizumi et
al., 1989). Posteriormente, se analizarán por duplicado las fracciones obtenidas de los esquemas de
extracción aplicados en los diseños experimentales, y el análisis de los datos se llevará a cabo con la
herramienta estadística del software Matlab. Finalmente, se construirán los perfiles de carbohidratos
de las fracciones a las cuales se evaluará su actividad biológica.
6.3. Metodología para el objetivo 3
6.3.1. Proceso de fermentación a escala de banco
Con las condiciones de pH, fuente de carbono y tiempo de proceso, definidas mediante los
diseños experimentales aplicados para el objetivo 1, se llevará a cabo el proceso de fermentación
por triplicado en biorreactor a escala de banco (Volumen de trabajo 5 L). Al mismo tiempo, se
realizará la extracción de los carbohidratos con los esquemas de extracción seleccionados
anteriormente tanto para el micelio como para el medio de cultivo, y paralelamente se realizarán los
análisis por cromatografía iónica para establecer los perfiles de carbohidratos de las fracciones
obtenidas. A partir de estas fermentaciones se obtendrán 9 fracciones a las cuales se les evaluará su
actividad citotóxica y antiinflamatoria, estas 9 fracciones corresponden a 6 fracciones del micelio, el
caldo de cultivo y 2 fracciones obtenidas del mismo. Las pruebas de actividad biológica de las
fracciones de carbohidratos obtenidas en el proceso de fermentación de Agaricus blazei, se
realizarán en el laboratorio del Dr. Juan Carlos Sepúlveda de la Universidad Tecnológica de Pereira.
A continuación, se describen los ensayos que se realizarán con cada línea celular.
6.3.2. Ensayos de actividad anti-inflamatoria
i) Línea celular. Se empleará la línea celular de Macrófagos Murinos RAW 264.7 obtenida en la
American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA); éstas células se cultivarán en medio
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) + Glutamax II (DMEM High Glucose 1X;
GIBCO/BRL, USA) suplementado con 10% de Suero Bovino Fetal inactivado, 200 μg/mL de
Penicilina, 200 μg/mL de Estreptomicina, 400 μg/mL de Neomicina, 5 μg/mL de Anfotericina,
1 mM de piruvato de sodio y 0,05 mM de 2-β-mercaptoetanol con una incubación a 37 °C y 5%
de CO2.
ii) Viabilidad celular. La viabilidad celular se realizará por el método del MTT (Bromuro de 3[4,5-
dimetiltiazol-2-ilo]-2,5-difeniltetrazol). Se cultiva en una placa de 96 pozos la línea celular a
una densidad de 50.000 células por pozo, se incuba durante 24 horas a 37 °C y 5% de CO2, se
descarta el medio y se adicionan las fracciones a tres concentraciones definidas en experimentos
previos usando como solvente DMSO (dimetilsulfóxido) y por duplicado, se incuba durante 24
horas bajo las mismas condiciones; se descartan las muestras y se adiciona 0,5 μg/mL de MTT,
se incuba por 4 horas a 37 °C y 5% de CO2, se elimina el contenido de los pozos teniendo
cuidado de no romper los cristales de formazan que se crean en el fondo de éstos; se adicionan
20
100 μL de DMSO al 99,8% para solubilizar los cristales, se agita la placa durante 15 minutos y
se lee la absorbancia a 492 nm en un lector de ELISA (ELx800, BioTek Instruments Inc.,
USA). Se realizan tres ensayos independientes por triplicado.
iii) Estimulación de los macrófagos con lipopolisacárido (LPS). Se siembra en una placa de 24
pozos 1 x 106 células/mL, se incuban por 24 horas a 37 °C y 5% de CO2, se descarta el medio
de cultivo y se adicionan las fracciones de carbohidratos a una concentración que se definirá en
experimentos previos y en presencia de LPS de Escherichia coli serotipo O111: B4 (Sigma
Chemical Co, Saint Louis, MO, EE.UU.) a una concentración de 10 μg/mL para el estímulo de
NO e interleucina y 5 μg/mL para el estímulo del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y
prostaglandina E2 (PGE2). Para la medición de NO se incubarán las células en presencia de las
fracciones y LPS durante 18 horas, mientras que para la determinación de TNF-α y PGE2 las
células se incubarán durante 12 horas y para la determinación de interleucina (IL-10) durante 6
horas. Se colectarán los sobrenadantes y se almacenarán a -80 °C hasta su uso. Previo al
estímulo de 12 horas para determinar los niveles de PGE2, se pretratarán las células durante 2
horas con Aspirina (50 µM, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EE.UU.), con el fin de
inactivar la Ciclooxigenasa 1 (COX-1). Se realizarán tres ensayos independientes por triplicado.
iv) Inhibición de la producción de óxido nítrico. El sobrenadante del estímulo con LPS 10 μg/mL
por 18 horas, se adiciona a una placa de 96 pozos (cada muestra por triplicado) y se agrega el
reactivo de Griess modificado 1X (1:1) (Sigma Chemical Co, Saint Louis, MO, USA), se
incuba a temperatura ambiente durante 25 minutos en oscuridad y se realiza la lectura de
absorbancia a 570 nm en un lector de microplacas (ELx800, BioTek Instruments Inc., USA).
La cantidad de nitritos presentes en cada muestra se determina utilizando una curva de
calibración de NaNO2 en medio suplementado. El porcentaje de inhibición en la producción de
NO se determina con la siguiente expresión matemática:
Donde, [NO blanco] es la concentración de NO en el blanco, [NO muestra] es la concentración de
NO en la fracción, y [NO control] es la concentración de NO en el control.
v) La cuantificación de PGE2 se determina utilizando el procedimiento descrito en el kit
(Prostaglandin E2 EIA Kit-Monoclonal) de Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, Mi, USA). El
porcentaje de inhibición en la producción de PGE2 se determina así:
Donde, [PGE2 blanco] es la concentración de PGE2 en el blanco, [PGE2 muestra] es la concentración
de PGE2 en el extracto, y [PGE2 control] es la concentración de PGE2 en el control.
21
vi) Para la medición de TNF-α se emplea la técnica de inmunoensayo ELISA (Enzyme-Linked
Immuno Sorbent Assay), usando el protocolo de kits comerciales (ELISA OptEIA Set, BD
Biosciences, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El porcentaje de
inhibición en la producción de TNF-α se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula:
Donde, [TNF-α blanco] es la concentración de TNF-α en el blanco, [TNF-α muestra] es la
concentración de TNF-α en el extracto, y [TNF-α control] es la concentración de TNF-α en el
control.
6.3.3. Ensayos en líneas tumorales.
i) Líneas celulares. Los cultivos celulares de hepatocarcinoma humano (Hep G2),
adenocarcinoma de cuello uterino humano (HeLa),adenocarcinoma de mama humano (MCF7)y
célula renal humana (HEK-293), fueron obtenidas en American Type Culture Collection
(ATCC, MD, USA); éstas células serán cultivadas en medio DMEM (Dulbecco´s Modified
Eagle Medium) + Glutamax II (DMEM High Glucose 1X; GIBCO/BRL, USA) suplementado
con 10% de Suero Fetal Bovino inactivado (SFB), 200 μg/mL de Penicilina, 200 μg/mL de
Estreptomicina, 400 μg/mL de Neomicina, 5 μg/mL de Anfotericina y 1 mM de piruvato de
sodio (Sigma Chemical Co, Saint Louis, MO, USA), mantenidas en incubación a 37 °C y 5% de
CO2.
ii) Viabilidad celular. La viabilidad celular se realizará por el método del MTT (Bromuro de 3[4,5-
dimetiltiazol-2-ilo]-2,5-difeniltetrazol). Se cultivan las tres líneas celulares en placas de 96
pozos a una densidad de 50.000 células por pozo, se incuban durante 24 horas a 37 °C y 5% de
CO2, se descarta el medio y se adicionan las fracciones a una concentración de fracciones
definida previamente en DMSO. Posteriormente se incuba durante 24 horas a 37 °C y 5% de
CO2. Después de la incubación se descarta el sobrenadante y se procede a realizar el ensayo del
MTT. Se adicionan 200 μL de MTT (0.5 mg/mL), se incuba por 4 horas a 37 °C y 5% de CO2,
se elimina el contenido de los pozos teniendo cuidado de no romper los cristales de formazan
generados; se adicionan 100 μL de DMSO para solubilizar los cristales, se agita la placa durante
15 minutos y se lee la absorbancia a 492 nm con corrección a 590 nm en un lector de ELISA.
Se realizan tres ensayos independientes por triplicado.
iii) Ensayo de Citotoxicidad. La actividad citotóxica de las células HEK-293 se determinará por el
método del MTT (Bromuro de 3[4,5-dimetiltiazol-2-ilo]-2,5-difeniltetrazol). Se cultivan 10.000
células/pozo en medio suplementado al 10% SFB en una placa de 96 pozos, con incubación por
24 horas a 37 °C y 5% de CO2. Luego, se descarta el medio de cultivo, se adicionan las
fracciones a 3 concentraciones definidas en DMSO (máximo 1% DMSO), al control negativo y
blanco óptico (sin células) medio de cultivo al 1% en DMSO y tetraciclina 100 µM como
control positivo por triplicado, preparados en medio al 2% SFB, se incuba durante 72 horas bajo
las mismas condiciones; se descartan las muestras, se adicionan 20 μL de MTT (5 mg/mL) a
cada pozo, se incuba por 4 horas a 37 °C y 5% de CO2, se elimina el contenido de los pozos
teniendo cuidado de no romper los cristales de formazan que se crean en el fondo de éste; se
adicionan 100 μL de DMSO para solubilizar los cristales, se agita la placa durante 15 minutos y
se lee la absorbancia a 570 nm en un lector de ELISA, se realizan dos ensayos independientes
22
por triplicado, expresando los resultados como porcentaje de citotoxicidad para determinar el
50% de la concentración citotóxica (CC50) utilizando el programa Matlab. El porcentaje de
citotoxicidad se calcula según la siguiente formula:
Donde, Abs. Control es la absorbancia del control celular sin muestra, Abs. Muestra es la
absorbancia de la muestra y Abs. Blanco es la absorbancia del blanco óptico.
iv) Ensayo de Anti-proliferación. El efecto de las fracciones sobre las células HepG2, HeLa, y
MCF7 se determinará utilizando el método del MTT (Bromuro de 3[4,5-dimetiltiazol-2-ilo]-
2,5-difeniltetrazol). Se cultivan 100 µL de cada línea celular a una densidad de 15.000
células/pozo para Hep G2, HeLa y MCF7 en medio suplementado al 10% SFB en una placa de
96 pozos, inmediatamente se adicionan 100 µL de las fracciones a concentraciones definidas en
experimentos previos (máximo1% DMSO). Se adicionan 100 µL de medio de cultivo al 1% en
DMSO al control negativo y blanco óptico (sin células) y 100 µL de tetraciclina 200 µM como
control positivo. Estos ensayos se realizan por triplicado. Se incuba durante 72 horas a 37 ºC y
5% de CO2; se descartan las muestras, se adicionan 20 μL de MTT (5 mg/mL) en PBS a cada
pozo, se incuba por 4 horas bajo las mismas condiciones, se elimina el contenido de los pozos
teniendo cuidado de no romper los cristales de formazan; se adicionan 100 μL de DMSO para
solubilizar los cristales, se agita la placa durante 15 minutos y se lee la absorbancia a 570 nm en
un lector de ELISA, se realizan dos ensayos independientes por triplicado, expresando los
resultados como porcentaje de inhibición para determinar el 50% de la concentración inhibitoria
(IC50).El porcentaje de inhibición se calcula según la siguiente formula:
Donde, Abs. Control es la absorbancia del control celular sin muestra, Abs. Muestra es la
absorbancia de la muestra y Abs. Blanco es la absorbancia del blanco óptico.
7. RESULTADOS ESPERADOS
Un documento con las metodologías desarrolladas para la obtención de carbohidratos de
Agaricus blazei
Los esquemas de extracción de las fracciones de intra y exopolisacáridos procedentes del
proceso de fermentación sumergida
Perfiles de carbohidratos de las fracciones obtenidas para su evaluación biológica
La actividad citotóxica y anti-inflamatoria de las fracciones
Divulgación científica: Dos artículos aceptados para publicación en revista internacional o
nacional tipo A o B
Participación en al menos un evento científico nacional o internacional.
Formación de un estudiante de doctorado
23
8. IMPACTOS ESPERADOS A PARTIR DEL USO DE LOS
RESULTADOS Desarrollo del proceso de obtención de carbohidratos con potencial citotóxico y
antiinflamatorio por fermentación sumergida de residuos amiláceos empleando Agaricus blazei
Contribución a la investigación sobre el uso de los hongos como organismos productores de
metabolitos bioactivos con la evaluación de la actividad citotóxica y antiinflamatoria de las
fracciones de carbohidratos obtenidas. Por otro lado, el potencial impacto sobre la comunidad
por el uso de los hongos medicinales como alternativa para personas con problemas en el
sistema inmune.
El impacto ambiental será la contribución al aprovechamiento de residuos amiláceos como
materias primas alternativas para la obtención de carbohidratos fúngicos potencialemnte
bioactivos, en el marco del proyecto “Implementación de una estrategia integral a través de
innovación biotecnológica para el aprovechamiento de residuos en el departamento de
Caldas”. Igualmente, esta investigación permitirá explorar vías para la reducción del impacto
ambiental por los residuos amiláceos del sector agrícola y agroindustrial de Caldas.
Formación de un investigador a nivel de doctorado.
24
9. PRESUPUESTO
Ítems RUBROS Cant.
UNIVERSIDADDE CALDAS
SISTEMA GENERAL DE REGALÍAS
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA
DE PEREIRA TOTAL
Recurrente No recurrente Recurrente
1. Servicios personales
100.000.000 142.352.000 48.000.000 290.352.000
1.1 Estudiante de doctorado tiempo completo por tres años y medio con matrícula
1
142.352.000
142.352.000
1.2 Director de Tesis doctoral con 10 horas de dedicación semanal por tres años y medio
1 100.000.000
100.000.000
1.3. Codirector de Tesis doctoral con 5 horas de dedicación semanal por tres años
1
48.000.000 48.000.000
2. Equipos requeridos
27.150.000 80.150.000 107.300.000
2.1 Para comprar
80.150.000 80.150.000
2.1.1 Cromatógrafo iónico 1 60.000.000
2.1.2 Espectrofotómetro 1 2.000.000
2.1.3 Liofilizador 1 18.000.000
2.1.4 Extractor de jugos 1 150.000
2.2 Que existen en la universidad
27.150.000
27.150.000
2.2.1 Biorreactor de banco (7 L) 1 12.000.000
2.2.2 pH-metro 1 400.000
2.2.3 Agitador orbital con calentamiento 1 1.600.000
2.2.4 Balanza analítica 1 500.000
2.2.5 Agitador vortex 1 100.000
2.2.6 Centrífuga 1 1.500.000
2.2.7 Bomba de vacío 1 250.000
2.2.8 Cabina de flujo laminar 1 1.000.000
2.2.9 Horno 2 1.000.000
2.2.10 Autoclave 1 1.000.000
2.2.11 Nevera 1 500.000
2.2.12 Cuarto frío 1 1.000.000
2.2.13 Viscosímetro 1 1.500.000
2.2.14 Caldera 1 2.500.000
2.2.15 Equipo de ultrafiltración 1 1.300.000
2.2.16 Compresor 1 1.000.000
3. Materiales, Insumos y reactivos
26.000.000 26.000.000
3.1 Consumibles cromatógrafo y equipo de ultrafiltración, otros
16.000.000 16.000.000
3.2 Reactivos, cepas y de campo
10.000.000 10.000.000
4. Materiales de vidrio y accesorios de plástico
2.000.000 2.000.000
5. Exámenes y pruebas de laboratorio 36.000.000 45.000.000 81.000.000
5.1 Pruebas de actividad biológica 35.000.000 45.000.000 81.000.000
5.2 Pruebas en microscopio electrónico de barrido (horas) 9 1.000.000 1.000.0000
6. Viajes de capacitación y pasantías
5.000.000 5.000.000
TOTAL
127.150.000 291.502.000 93.000.000 511.652.000
Porcentaje de fuentes
24,85% 56,97% 18,18% 100,00%
25
10. Cronograma de actividades
Actividades Semestres
1 2 3 4 5
Revisión bibliográfica xxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx
Estandarización del protocolo de
extracción de almidón a partir de residuos
de papa
x
Selección e implementación de los
esquemas de extracción de carbohidratos a
partir del micelio y del medio de cultivo
agotado.
xxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx
Estudio de las condiciones de producción
de carbohidratos bioactivos por
fermentación sumergida a nivel de banco.
xxxx xxxxxx xxxxxx
Poner a punto e implementar el método
cromatográfico para construir los perfiles
de carbohidratos de las fracciones
obtenidas en el proceso estandarizado
xxxxxx xxxxxx xxxxxx xxxxxx
Evaluación de la actividad farmacológica
de las fracciones obtenidas.
xxxxxx
Pasantía internacional x xx
Elaboración del informe final. xxxxxx
Divulgación de resultados. xxx xxxxxx xxxxxx
26
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