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ÍNDICE DE CONTENIDOS

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ÌNDICE DE CONTENIDOS.

ÌNDICE DE CONTENIDOS. ____________________________________________ 1

I. capítulo 1___________________________________________________________ 7

I-1. EQUILIBRIO DE FASES EN SISTEMAS DE UN COMPONENTE _____ 7 1.1. Regla de las fases _______________________________________________ 7 1.2. Ecuación de Clapeyron __________________________________________ 9 1.3. Metaestabilidad _______________________________________________ 11

I-2. DISOLUCIONES _______________________________________________ 12 2.1. Magnitudes molares parciales ____________________________________ 12 2.2. Magnitudes de mezcla __________________________________________ 15

I-3. DISOLUCIONES IDEALES______________________________________ 19 3.1. Potencial químico______________________________________________ 20 3.2. Presión de vapor. La ley de Raoult ________________________________ 21

I-4. DISOLUCIONES DILUIDAS IDEALES ___________________________ 23

I-5. DISOLUCIONES NO IDEALES __________________________________ 26 5.1. Actividades y coeficientes de actividad _____________________________ 26 5.2. Estados normales de disoluciones no ideales_________________________ 27 5.3. Determinación de actividades y coeficientes de actividad_______________ 29 5.4. Coeficientes de actividad de solutos no volátiles______________________ 30 5.5. Coeficientes de actividad en las escalas de molalidad y concentración molar 31

I-6. DISOLUCIONES DE ELECTROLITOS ___________________________ 33 6.1. Potencial químico del disolvente __________________________________ 34 6.2. Potencial químico del electrolito __________________________________ 35

6.2.1 Sin asociación iónica: _______________________________________ 36 6.2.2 Con asociación iónica: _______________________________________ 37

I-7. TEORÍA DE DEBYE-HUCKEL __________________________________ 38

I-8. PROPIEDADES COLIGATIVAS _________________________________ 43 8.1. Disminución de la presión de vapor________________________________ 43 8.2. Descenso del punto de congelación ________________________________ 45

II. capítulo 2 _________________________________________________________ 50

II-1. DEFINICIÓN DE ÓSMOSIS. LAS MEMBRANAS SEMIPERMEABLES__________________________________________________________________ 50

1.1. La ósmosis. La presión osmótica __________________________________ 50 1.2. Causa de la semipermeabilidad ___________________________________ 52

1.2.1 Teoría del cribado. __________________________________________ 52 1.2.2 Teoría de la solubilidad superficial o adsorción. ___________________ 52 1.2.3 Teoría de la presión de vapor. _________________________________ 54

II-2. MECANISMOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA ____________________ 55 2.1. Ley de la presión osmótica para disoluciones ideales.__________________ 55 2.2. El coeficiente osmótico _________________________________________ 58 2.3. Teorías sobre el origen de las presiones osmóticas ____________________ 60


2

2.3.1 Teoría del bombardeo de las moléculas de soluto. _________________ 60 2.3.2 Teoría del bombardeo de las moléculas de disolvente. ______________ 49 2.3.3 Teoría de la presión de vapor. _________________________________ 50

2.4. Mecanismo de equilibrio osmótico. El potencial químico. ______________ 51

II-3. LA PRESIÓN OSMÓTICA Y LA PRESIÓN DE VAPOR ____________ 52

II-4. UNIDADES DE MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA EN SISTEMAS BIOLÓGICOS_____________________________________________________ 55

III. capítulo 3 ________________________________________________________ 57

III-1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS _______________________________ 57

III-2. NECESIDAD DE MODELOS MATEMÁTICOS ___________________ 58

III-3. OBSERVACIONES EXPERIMENTALES ________________________ 60

III-4. MUERTE CELULAR. HIPÓTESIS DE LOS DOS FACTORES ______ 63

IV. Capítulo 4 ________________________________________________________ 66

IV-1. INTRODUCCIÓN_____________________________________________ 66

IV-2. APLICABILIDAD DEL MODELO ______________________________ 67 2.1. Caso de células aisladas _________________________________________ 67 2.2. Caso de células en tejidos _______________________________________ 67

IV-3. HIPÓTESIS SIMPLIFICATORIAS DEL MODELO IDEAL_________ 70

IV-4. LAS VARIABLES Y PARÁMETROS DEL MODELO. _____________ 74

IV-5. EL COEFICIENTE DE PERMEABILIDAD O LA CONDUCTIVIDAD HIDRÁULICA DE LA MEMBRANA CELULAR _______________________ 77

5.1. Introducción __________________________________________________ 77 5.2. Ley de la permeabilidad de la membrana celular______________________ 78 5.3. Determinación experimental de los parámetros del modelo de permeabilidad81

5.3.1 Método de las dos etapas (two – step) ___________________________ 82 5.3.2 Método de la calorimetría de escaneo diferencial (Differential scanning calorimetry. DSC) _______________________________________________ 85

IV-6. MODELO TEÓRICO IDEAL ___________________________________ 87 6.1. Introducción __________________________________________________ 87 6.2. El modelo teórico ideal para un perfil de enfriamiento arbitrario _________ 88 6.3. La curva de equilibrio. El subenfriamiento __________________________ 94

6.3.1 Interpretación física _________________________________________ 94 6.3.2 La ecuación de la Curva de Equilibrio___________________________ 95

6.4. Particularización de las ecuaciones del modelo_______________________ 97 6.4.1 Introducción _______________________________________________ 97 6.4.2 Ley de enfriamiento lineal ____________________________________ 98 6.4.3 Ley de enfriamiento cuadrática ________________________________ 99 6.4.4 Ley de enfriamiento exponencial______________________________ 101

6.5. Modelo de deshidratación para un perfil de enfriamiento nulo __________ 103 6.5.1 Introducción ______________________________________________ 103 6.5.2 Planteamiento de las ecuaciones ______________________________ 104

IV-7. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO IDEAL __________________________________________________________ 105

7.1. Introducción _________________________________________________ 105


3

7.2. Los perfiles de enfriamiento_____________________________________ 106 7.3. Curvas de Deshidratación para Espermatozoides de Ratón_____________ 110

7.3.1 Datos Físicos _____________________________________________ 110 7.3.2 Programación en MALTAB de las ecuaciones diferenciales ________ 112 7.3.3 Representación grafica de la deshidratacion _____________________ 118

7.3.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación diferencial de la deshidratación celular____________________________ 118 7.3.3.2 Representación gráfica de la deshidratación. _________________ 121 7.3.3.3 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre la deshidratación___ 126 7.3.3.4 Deshidratación para perfiles de enfriamiento no lineales ________ 131

7.3.4 Representación gráfica del subenfriamiento _____________________ 134 7.3.4.1 Programación en MATLAB del subenfriamiento______________ 134 7.3.4.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el subenfriamiento _ 136 7.3.4.3 El subenfriamiento para perfiles de enfriamiento no lineales_____ 141

7.3.5 Representación Gráfica del Flujo Osmótico _____________________ 143 7.3.5.1 Programa en MATLAB del flujo osmótico __________________ 143 7.3.5.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el caudal de flujo osmótico ___________________________________________________ 145 7.3.5.3 Curvas de flujo osmótico para perfiles de enfriamiento no lineales 150

7.3.6 Representación Gráfica a Temperatura Constante_________________ 151 7.3.6.1 Introducción __________________________________________ 151 7.3.6.2 Programación en MATLAB de la deshidratación a temperatura constante.___________________________________________________ 153 7.3.6.3 Resolución numérica y representación gráfica de la deshidratación a temperatura constante _________________________________________ 156 7.3.6.4 Aplicación de la etapa de deshidratación a temperatura constante para la optimización de protocolos de enfriamiento ______________________ 158

7.4. Análisis teórico del efecto de los parámetros físicos de las células sobre la deshidratación ___________________________________________________ 169

7.4.1 Introducción ______________________________________________ 169 7.4.2 El óvulo de ratón no fertilizado _______________________________ 170

7.4.2.1 Parámetros físicos ______________________________________ 170 7.4.2.2 Comparativa de la deshidratación celular ____________________ 171

7.4.3 Parámetros físicos de las células que afectan al proceso de deshidratación_____________________________________________________________ 175

7.4.3.1 La permeabilidad de la membrana celular ___________________ 175 7.4.3.2 Ratio Área membrana / Volumen celular____________________ 177

IV-8. MODELO TEÓRICO NO IDEAL ______________________________ 180 8.1. Revisión de las hipótesis simplificatorias __________________________ 180 8.2. El Modelo Teórico NO Ideal para un perfil de enfriamiento arbitrario____ 181 8.3. La curva de Equilibrio no ideal __________________________________ 190 8.4. Particularización de las ecuaciones del modelo no ideal _______________ 192

8.4.1 Introducción ______________________________________________ 192 8.4.2 Ley de enfriamiento lineal ___________________________________ 193 8.4.3 Ley de enfriamiento cuadrática _______________________________ 194 8.4.4 Ley de enfriamiento exponencial______________________________ 195

8.5. Modelo de deshidratación a temperatura constante ___________________ 196 8.6. Obtención de las leyes ideales a partir de las no ideales _______________ 197

8.6.1 Introducción ______________________________________________ 197 8.6.2 Determinación de la condición de idealidad _____________________ 198


4

8.6.3 Sustitución de la condición de idealidad en la ecuación del modelo no ideal_____________________________________________________________ 199 8.6.4 Comparación de las ecuaciones del modelo ideal, con la condición de idealidad, con las ecuaciones del modelo ideal________________________ 200

IV-9. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO NO IDEAL_______________________________________________________ 202

9.1. Introducción _________________________________________________ 202 9.2. Curvas de deshidratación para espermatozoides de ratón ______________ 203

9.2.1 Datos Físicos _____________________________________________ 203 9.2.2 Programación en MATLAB de las ecuaciones diferenciales ________ 204 9.2.3 Representación gráfica de la deshidratación _____________________ 206

9.2.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación diferencial de la deshidratación celular____________________________ 206 9.2.3.2 Representación gráfica de la deshidratación __________________ 208

V. capítulo 5 ________________________________________________________ 213

V-1. INTRODUCCIÓN ____________________________________________ 213

V-2. PROTOCOLO DE ADICIÓN DE AGENTES CRIOPROTECTORES_ 215 2.1. Introducción _________________________________________________ 215 2.2. Modelo matemático ___________________________________________ 216

2.2.1 Deshidratación inicial por la presencia de crioprotectores en el medio extracelular.___________________________________________________ 216 2.2.2 Rehidratación progresiva de la célula debido a la entrada de crioprotectores permeables____________________________________________________ 217

2.3. Resolución numérica para óvulos de ratón no fertilizados _____________ 219 2.3.1 Datos numéricos___________________________________________ 219 2.3.2 Adición de crioprotectores en una sola etapa_____________________ 220 2.3.3 Adición de crioprotectores en varias etapas______________________ 224

V-3. EFECTOS COLIGATIVOS DE LOS CRIOPROTECTORES PERMEABLES ___________________________________________________ 228

3.1. Introducción _________________________________________________ 228 3.2. Modelo matemático ___________________________________________ 229 3.3. Análisis del efecto de la presencia de crioprotectores permeables en el medio intracelular______________________________________________________ 232

3.3.1 Estudio de las curvas de deshidratación_________________________ 232 3.3.2 Estudio de las curvas de deshidratación a temperatura constante _____ 235 3.3.3 Estudio de las curvas de subenfriamiento _______________________ 239 3.3.4 Estudio de las curvas de flujo osmótico_________________________ 241 3.3.5 Estudio de las curvas de concentración de cloruro sódico___________ 243

VI. capítulo 6 _______________________________________________________ 246

VI-1. INTRODUCCIÓN____________________________________________ 246

VI-2. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD SIN PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES ____________________________________________ 248

2.1. Diagramas de Fases. Los Sistemas Eutécticos Simples________________ 248 2.1.1 Interpretación del Diagrama de Fases __________________________ 248

2.1.1.1 Curva de solubilidad ____________________________________ 249 2.1.2 Análisis de grados de libertad ________________________________ 251 2.1.3 Ejemplo _________________________________________________ 256


5

2.2. Efecto de la solubilidad en el proceso de deshidratación_______________ 258 2.2.1 Primera Etapa de Deshidratación______________________________ 258 2.2.2 Segunda Etapa de Deshidratación _____________________________ 259

2.2.2.1 Caso 1: La solución líquida saturada extracelular desaparece después de alcanzar el equilibrio con el medio intracelular ___________________ 261 2.2.2.2 Caso 2: La solución líquida saturada extracelular desaparece instantáneamente_____________________________________________ 266

2.3. Modelos teóricos de deshidratación con disoluciones saturadas _________ 272 2.3.1 Modelo de deshidratación celular con el medio extracelular con composición constante __________________________________________ 272

2.3.1.1 Hipótesis de la Capa Líquida Saturada ______________________ 272 2.3.1.2 Modelo matemático de la deshidratación ____________________ 273

VI-3. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD CON PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES PERMEABLES ______________________________ 275

3.1. Diagramas ternarios ___________________________________________ 275 3.1.1 interpretación del diagrama de fases ternario tridimensional ________ 275 3.1.2 Diagrama de fases bidimensional _____________________________ 280

3.1.2.1 Interpretación del diagrama_______________________________ 280 3.1.2.2 Propiedades de los diagramas bidimensionales _______________ 282

3.1.2.2.1 Coordenadas de un punto del interior del diagrama ________ 282 3.1.2.2.2 Isoplectas _________________________________________ 285

3.1.2.3 Ejemplo ______________________________________________ 286 3.1.3 Diagrama de fases bidimensonal del sistema ternario agua-ClNa-glicerol_____________________________________________________________ 289 3.1.4 Simplificación de la representación bidimensional de un sistema ternario_____________________________________________________________ 292

3.2. Efecto de la solubilidad en el proceso de deshidratación_______________ 296 3.2.1 Primera etapa de deshidratación_______________________________ 296 3.2.2 Segunda etapa de deshidratación ______________________________ 298 3.2.3 Tercera etapa de deshidratación_______________________________ 300 3.2.4 Cuarta etapa de deshidratación________________________________ 302

3.2.4.1 La solución líquida saturada extracelular desaparece después de alcanzar el equilibrio con el medio intracelular _____________________ 303 3.2.4.2 La solución líquida saturada extracelular desaparece instantáneamente___________________________________________________________ 308

3.3. Modelos teóricos de deshidratación con disoluciones saturadas _________ 314 3.3.1 Modelo de deshidratación con medio intracelular saturado en cloruro sódico _______________________________________________________ 314 3.3.2 Curva de descenso crioscópico ideal cuando la solución intracelular está saturada en cloruro sódico________________________________________ 316 3.3.3 Modelo de deshidratación con la solución intracelular saturada en cloruro sódico, con el medio extracelular saturado en cloruro sódico y crioprotector 317

VII. anexo programas ________________________________________________ 319

VII-1. PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 4. LA DESHIDRATACIÓN CELULAR _______________________________________________________ 319

VII-2. PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 5. LOS CRIOPROTECTORES ___ 370

VII-3. PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 6. EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD 387

VIII. bibliografía ____________________________________________________ 431


6

CAPÍTULO 1 FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS.

7

I. CAPÍTULO 1

FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS

I-1. EQUILIBRIO DE FASES EN SISTEMAS DE UN COMPONENTE

1.1. REGLA DE LAS FASES

Se define el número de grados de libertad L de un sistema en equilibrio, como el número de variables intensivas independientes necesarias para especificar su estado intensivo, es decir, su estado termodinámico a excepción del tamaño de sus fases.

Vamos a establecer el estado intensivo de un sistema termodinámico mediante las variables intensivas temperatura, presión, y las fracciones molares de todas las especies químicas en cada una de las fases. Hemos supuesto que en todas las fases tengo la misma temperatura y presión.

Para determinar el número de grados de libertad del sistema supondremos que no hay reacciones químicas, y que todas las especies químicas están en todas las fases.

• Número de variables intensivas: sea C el número de especies químicas presentes en cada una de las fases, y sea F el número de fases del sistema. El número de variables que habría que especificar para establecer el estado termodinámico del sistema sería:

o C·F variables correspondientes a las fracciones molares. o 1 correspondiente a la temperatura. o 1 correspondiente a la presión. o En total C·F+2

• Número de ecuaciones: no todas las variables intensivas anteriores son independientes.

o F ecuaciones asociadas a la igualdad 11

=∑=

c

iix en cada

fase, donde xi es la fracción molar del componente i. o F-1 ecuaciones asociadas a L=== δβα µµµ iii para cada

especie química, donde µτi son los potenciales químicos de los

componentes i en cada una de las fases τ del sistema. Para todas las especies químicas tendremos C·(F-1).

o En total F+C·(F-1)

El número de grados de libertad del sistema será L=F·C+2-F-C·(F-1)=C-F+2.


8

El número de grados de libertad si no consideramos la hipótesis de que existan todas las especies químicas en todas las fases es L=C-F+2, es decir, igual que antes. La razón es que la especie i que se encuentra ausente de una fase δ reduce el número de variables en uno, pues su fracción molar será cero en dicha fase, es decir, ya no es una variable pues conocemos su valor. También se reduce el número de ecuaciones en uno puesto que en el equilibrio el potencial químico de dicha especie en la fase δ no tiene porque igualarse con el resto de los potenciales químicos.

El número de grados de libertad si no consideramos la hipótesis de que no existan reacciones químicas es L=C-F+2-r donde r es el número de ecuaciones independientes y que introducen una condición de equilibrio químico de la forma:

∑=

=⋅c

iii

1

0µν Ec. 1

donde νi son los coeficientes estequiométricos de las especies químicas presentes en la reacción.

Relaciones debidas a condiciones estequiométricas o de electroneutralidad reducen en a el número de grados de libertad L=C-F+2-r-a, donde por tanto a es el número de ecuaciones adicionales asociadas a relaciones de estequiometría u otro tipo de propiedad.


9

1.2. ECUACIÓN DE CLAPEYRON

Esta ecuación nos permitirá calcular la pendiente de una curva de equilibrio entre dos fases en el diagrama Temperatura-Presión en un sistema de un componente.

Consideremos un sistema compuesto por dos fases α y β que se encuentran inicialmente en equilibrio termodinámico (estado 1). Mediante un proceso infinitesimal modificamos la temperatura y la presión de manera que el sistema en el estado final se encuentre de nuevo en equilibrio termodinámico (estado 2):

En el equilibrio de fases se cumple βα µµ = .

Como los potenciales químicos son por definición las energías libres de Gibbs molares en sistemas de un solo componente, podemos escribir la igualdad anterior de la forma:

βαmm GG = Ec. 2

El sistema en el estado 1 cumplirá:

βα1,1, mm GG = Ec. 3

El sistema en el estado 2 cumplirá:

ββαεβαmmmmmm dGGdGGGG +=+⇒= 1,1,2,2, Ec. 4

Sustituyendo Ec.3 en Ec.4 tenemos:

βαmm dGdG = Ec. 5

Teniendo en cuenta la expresión de la energía libre de Gibbs molar:

dpVdTSdG mmm ⋅+⋅−= Ec. 6


10

donde Sm es la entropía molar y Vm es el volumen molar, la igualdad de las variaciones infinitesimales de energía libre de Gibbs molar parcial queda :

dpVdTSdpVdTS mmmm ⋅+⋅−=⋅+⋅− ββαα Ec. 7

Reordenando, tenemos:

VTH

nV

nS

VS

dTdp

m

m

∆⋅∆

=∆

∆=

∆∆

= Ec. 8

donde hemos tenido en cuenta que la variación de entropía se produce en un cambio de fase reversible y a presión constante.

• Equilibrio líquido-vapor y sólido-vapor: en estas condiciones se cumple que Vm,gas<<Vm,liq , Vm,solido y por tanto podemos aproximar la variación de volumen molar por el volumen molar del gas. Si suponemos que el gas tiene comportamiento ideal entonces la ecuación de Clapeyron queda :

22

lnTR

HdT

pdTR

Hp

pTR

T

HdTdp mmm

⋅∆

=⇒⋅

∆⋅=

⋅⋅

∆= Ec. 9

En el caso de equilibrio Líquido-Vapor ∆Hm es el calor latente de vaporización molar. En el caso de equilibrio Sólido-Vapor ∆Hm es el calor latente de sublimación molar.

• Equilibrio Sólido-Líquido: la hipótesis simplificatoria anterior (Vm,gas<<Vm,liq , Vm,solido ),no tiene aquí validez. Sin embargo, aprovechando la elevada inclinación de la curva de fusión del diagrama Temperatura-Presión podemos afirmar que a menos que la presión cambie en una cantidad considerable, la variación de la temperatura de fusión durante el proceso de cambio de fase será pequeña.

∫ ∫ ⋅∆

∆≈−⇒

∆⋅

∆=

2

1 1

2

1,

1,12

,

, ln)(

)(2

1TT

TV

THppdT

VT

Hdp

fusm

fusmT

T fusm

fusm Ec. 10


11

1.3. METAESTABILIDAD

Se dice que una fase α es metaestable con respecto a una fase β a unas temperaturas y presiones dadas, si µα > µβ , es decir la fase β es la más estable y si además la velocidad de conversión de α a β es lo suficientemente lenta como para permitir que la fase α exista durante un periodo de tiempo grande en relación a los tiempos de experimentación.

Ejemplo son los líquidos subenfriados por debajo de sus puntos de congelación, hasta el punto de que podemos tener agua líquida a –40ºC.


12

I-2. DISOLUCIONES

Una disolución es una mezcla homogénea, es decir, un sistema monofásico con más de un componente.

La composición de una disolución se puede especificar de diferentes maneras. Un resumen de ellas se detalla a continuación:

• Fracción molar xi : cociente entre los moles de la sustancia i y los moles totales de la disolución.

• Concentración molar ci : cociente entre los moles de la sustancia i y el volumen total de la disolución. Cuando lo expresamos en moles por litro de disolución se denomina molaridad.

• Molalidad mi : cociente entre los moles de sustancia i y la masa de disolvente expresada en kilogramos.

A continuación vamos a introducir un concepto termodinámico fundamental para el tratamiento matemático de las disoluciones, la magnitud molar parcial.

2.1. MAGNITUDES MOLARES PARCIALES

Comencemos considerando n1, n2, ..., nr moles de sustancia 1,2,...r a temperatura T, y a presión p.

Los volúmenes molares de las sustancias puras serán *,

*2,

*1, ,,, rmmm VVV K .

El volumen total de sustancias sin mezclar será:

*,

*2,2

*1,1

*rmrmm VnVnVnV ⋅++⋅+⋅= L Ec. 11

Pues bien, experimentalmente se comprueba que cuando mezclamos las sustancias 1,2,...,r para formar una disolución, el volumen de la disolución resultante V, no coincide con la suma de los volúmenes de las sustancias puras mezcladas V*.

Esta propiedad que hemos descrito para el volumen de la disolución la cumple cualquier propiedad extensiva de la disolución, como la energía interna, la entalpía, la entropía, la energía libre de Gibbs, etc.

Nuestro interés se centra en encontrar funciones de la forma Y=Y(T,p,n1, n2, ...,nr) siendo Y una propiedad extensiva cualquiera de la disolución.

Vamos a realizar los desarrollos para el volumen de la disolución, siendo las ecuaciones análogas para el resto de propiedades extensivas.

Supongamos que existe una función de la forma V=V(T,p,n1,n2,...,nr). Una variación infinitesimal del volumen la podremos expresar de la forma:


13

∑= ≠

∂∂

+∂∂

+∂∂

=r

jj

nnpTjnTnp

dnnV

dppV

dTTV

dVijii 1 ,,,,

Ec. 12

Definimos el volumen molar parcial de la sustancia j en la disolución como la variación que experimenta el volumen de la disolución al variar en una unidad el número de moles de la sustancia j, manteniendo constante la temperatura, la presión, y el número de moles del resto de sustancias presentes en la disolución:

ij nnpTjj n

VV

≠∂∂

=,,

Ec. 13

El volumen molar parcial de la sustancia j es una magnitud intensiva por ser cociente de dos infinitésimos de propiedades extensivas. Por lo tanto, en general, una magnitud molar parcial de la sustancia j no dependerá de las cantidades de sustancias presentes en la disolución, sino de la proporción que exista entre ellas:

),,,,,( 21 rjj xxxpTVV K= Ec. 14

siendo xi las fracciones molares de las sustancias presentes en la disolución.

Se puede demostrar muy fácilmente que el volumen molar parcial de una sustancia pura es igual a su volumen molar:

*,

,,

*,

,,

**

*,

*

)(jm

nnpTj

jmj

nnpTj

jj

jmjj

Vn

Vn

n

VV

VnV

ijij

=∂

⋅∂=

∂

∂=

⋅=

≠≠

Ec. 15

Sin embargo, el volumen molar parcial de un componente j en una disolución, no es necesariamente igual al volumen molar de j puro.

Al ser el volumen de la disolución V una magnitud extensiva, es proporcional al número total de moles presentes en la disolución n para una temperatura, presión, y composición dada:

dnxxxpTfdVxxxpTfnV rr ⋅=⇒⋅= ),,,,,(),,,,,( 2121 KK Ec. 16

Al ser la temperatura y la presión constantes, la variación del volumen de la disolución será:

∑∑==

⋅⋅=⋅=r

jjj

r

jjj dnVxdnVdV

11

Ec. 17


14

Combinando ambas ecuaciones obtenemos la función f :

∑∑∑===

⋅=

⋅⋅=⇒⋅=

r

jjj

r

jjj

r

jjj VnVxnVVxf

111

T,p cte Ec. 18

Hemos llegado a la ecuación que estábamos buscando, que nos permite relacionar el volumen de la disolución, con las cantidades de sustancia que forman parte de la disolución, siendo el factor de proporcionalidad los volúmenes molares parciales de cada una de las sustancias presentes, y no, los volúmenes molares de las sustancias puras como habíamos intentado establecer al principio.

Para el resto de magnitudes extensivas llegamos a ecuaciones similares:

j

nnpTjj

r

jjj

nnpTjj

r

jjj

nnpTjj

r

jjj

nnpTjj

r

jjj

ij

ij

ij

ij

nG

GGnG

nS

SSnS

nH

HHnH

nU

UUnU

µ=∂∂

=⋅=

∂∂

=⋅=

∂∂

=⋅=

∂∂

=⋅=

≠=

≠=

≠=

≠=

∑

∑

∑

∑

,,1

,,1

,,1

,,1

;

;

;

;

Ec. 19

En la última igualdad vemos que la energía libre de Gibbs molar parcial coincide con la definición que hicimos anteriormente del potencial químico.

Todas las ecuaciones desarrolladas son válidas en procesos a temperatura y presión constante.

Estas últimas expresiones sugieren interpretar el producto jj Yn ⋅ , donde jY es la magnitud molar parcial del componente j de una propiedad extensiva cualquiera de la disolución, como la contribución del componente j de la disolución a la propiedad extensiva Y. Sin embargo esta interpretación es demasiado simplista puesto que debido a las fuerzas intermoleculares jY es una propiedad de la disolución en conjunto y no una propiedad exclusiva del componente j.

Las magnitudes molares parciales jY dan la velocidad de cambio de la magnitud extensiva Y en la disolución con respecto al número de moles de la especie j, en un proceso a temperatura y presión constante.

La interpretación física que podemos dar de una magnitud molar parcial es la de la variación de la magnitud extensiva de la disolución cuando se añade un


15

mol de sustancia j a una disolución de volumen infinito y con composición x1,x2,...,xr manteniendo la temperatura y la presión constantes.

La mayoría de las relaciones termodinámicas existentes entre propiedades extensivas las cumplen las magnitudes molares parciales. A modo de ejemplo vemos lo que ocurre con la energía libre de Gibbs molar parcial:

jjjj

nnpTjnnpTjnnpTj

STHGnS

TnH

nG

STHGijijij

⋅−==⇒∂∂

⋅−∂∂

=∂∂

⇒⋅−=≠≠≠

µ,,,,,,

Ec. 20

A partir de la última igualdad entre magnitudes molares parciales podemos concluir que se verifican las siguientes igualdades:

j

nT

jj

np

j Vp

ST

jj

=∂

∂−=

∂

∂

,,

;µµ

Ec. 21

Los potenciales químicos constituyen las propiedades clave de la termodinámica química. Los potenciales químicos determinan el equilibrio químico y el equilibrio de fases. Más aún, a partir de los potenciales químicos se pueden calcular todas las demás propiedades molares parciales y propiedades termodinámicas de la disolución.

2.2. MAGNITUDES DE MEZCLA

El cambio de magnitud extensiva Y producido en el proceso de mezclar los componentes puros para formar la disolución a temperatura y presión constante viene dado por la magnitud de mezcla , que representamos como ∆Ymez que definimos como ∆Ymez=Y-Y*, donde Y es el valor de la magnitud extensiva en la disolución y Y* es la propiedad extensiva de los componentes puros sin mezclar.

La magnitud de mezcla más importante es la que afecta a la energía libre de Gibbs:

( )∑∑∑===

−⋅=⋅−⋅=−=∆r

jjjj

r

jjmj

r

jjjmez nGnnGGG

1

*

1

*,

1

* µµµ Ec. 22

De la misma forma que se puede obtener jS y jV como derivadas parciales

de µj , también se pueden calcular ∆Smez y ∆Vmez como derivadas parciales de ∆Gmez, de ahí su especial importancia:

meznT

mezmez

np

mez Vp

GS

TG

jj

∆=∂

∆∂∆−=

∂∆∂

,,

; Ec. 23


16

La determinación experimental de ∆Gmez se lleva a cabo a partir de medidas de presión de vapor. Por ejemplo en el caso de una disolución de dos componentes A y B se miden las presiones parciales pA y pB en el vapor que se encuentra en equilibrio con la disolución y se miden las presiones de vapor p*

A y p*

B de A puro y B puro, y siguiendo el siguiente camino isotérmico hipotético obtengo ∆Gmez:

Vamos a ir calculando cada uno de los incrementos de energía libre de Gibbs cuya suma será igual a ∆Gmez:

∫∫ ⋅+⋅=∆+∆=∆**

*,

*,,1,11

BA p

plmBB

p

plmAABA dpVndpVnGGG Ec. 24

• 02 =∆G por ser un cambio de fase reversible.

∫∫ ⋅+⋅=∆+∆=∆B

B

A

A

p

pgmBB

p

pgmAABA dpVndpVnGGG

**

*,

*,,3,33 Ec. 25

• idealgasmezGG ∆=∆ 4 .Suponemos comportamiento de gas ideal: o Potencial químico de un gas ideal puro: la variación del

potencial químico con la presión la obtenemos a partir de la ecuación de Gibbs dG=-S·dT+V·dp. En una sustancia pura se cumple G/n=Gm=µ. Así la variación infinitesimal del potencial químico la podremos escribir como dµ=-Sm·dT+Vm·dp siendo Sm , Vm magnitudes molares.

La variación del potencial químico de un gas ideal en un proceso a temperatura constante será :

1

212 ln),(),(

pp

RTpTpTdppTR

d ⋅=−⇒⋅

= µµµ Ec. 26


17

Sea p1 la presión normal atmp 10 = .

Entonces )(),( 01 TpT µµ = el potencial químico normal del gas.

Con esta referencia del potencial químico normal a una temperatura dada, el potencial químico de un gas ideal a una temperatura T y a una presión p lo podemos expresar como:

00 ln)(),(

pp

RTTpT ⋅+= µµ Ec. 27

o Potencial químico de una mezcla de gases ideales: una mezcla de gases es ideal si cumple:

§ La ecuación de estado p·V=ntot·R·T siendo ntot el número total de moles del gas. § Si la mezcla se encuentra separada del gas puro i por

una membrana rígida, diatérmica, y permeable sólo al componente i entonces en el equilibrio la presión parcial pi=xi ·p del gas i en la mezcla es igual a la presión del sistema constituido por el gas i puro.

Vamos a definir el estado normal del componente i de una mezcla de gases ideales a la temperatura T como el gas ideal i puro a la temperatura T y a la presión p0 =1 atm.

Supongamos que tenemos un recipiente dividido en dos partes por una membrana permeable solamente al componente i . En una mitad del recipiente tenemos una mezcla de gases ideales, y en la otra mitad gas i puro a la misma temperatura:

La condición de equilibrio con una membrana permeable sólo al componente i es la igualdad de potenciales químicos :


18

),(),(),,,,,( ***21 iiiiri pTpTxxxpT µµµ ==K Ec. 28

La última igualdad se debe a la segunda condición que deben cumplir las mezclas de gases ideales.

Por lo tanto el potencial químico del componente i en una mezcla de gases ideales a la temperatura T y a la presión P es igual al potencial químico del gas puro i a la temperatura T y a la presión pi :

00

21 ln)(),,,,,(pp

RTTxxxPT iiri ⋅+= µµ K Ec. 29

Teniendo en cuenta esta última expresión, se puede comprobar muy fácilmente que ∆G4 es cero.

• 05 =∆G por ser un cambio de fase reversible.

dpVndpVndpVGP

pplmBB

P

pplmAA

P

pp BABABA

∫∫∫+++

⋅+⋅=⋅=∆ ,,6 Ec. 30

Despreciando las integrales que involucran a los volúmenes molares y a los volúmenes molares parciales de los líquidos frente a las integrales de los volúmenes molares de los gases, y teniendo en cuenta el comportamiento ideal de los gases llegamos a la siguiente expresión aproximada para ∆Gmez:

** lnlnB

BB

A

AAmez p

pTRn

pp

TRnG ⋅⋅⋅+⋅⋅⋅=∆ Ec. 31


19

I-3. DISOLUCIONES IDEALES

Desde el punto de vista microscópicos se define una disolución ideal como aquella en la cual las moléculas de las distintas especies son tan semejantes unas a otras que las moléculas de uno de los componentes pueden sustituir a las moléculas de otro componente de la disolución sin que se produzca una variación en la estructura espacial de la disolución o de la energía de las interacciones intermoleculares presentes en la disolución.

Este modelo sirve de referencia a la hora de discutir el comportamiento de las disoluciones reales.

Sin embargo dado que la termodinámica obvia la estructura molecular de la materia esta definición de disolución ideal que hemos dado no tiene sentido dentro de ella.

Así conviene definir alternativamente a la disolución ideal como aquella que cumple la siguiente relación:

∑=

⋅⋅⋅=∆r

jjjmez xnTRG

1

ln Ec. 32

Vamos a llegar a esta conclusión mediante la mecánica estadística. Vamos a partir de la definición molecular de disolución ideal para deducir la definición termodinámica.

Partimos de un recipiente que contiene dos tipos de moléculas C y B separadas por una pared (estado 1). A continuación retiramos la pared llegándose a una situación final de mezcla homogénea (estado 2).

Como las moléculas C y B no tienen diferencias en cuanto a interacciones intermoleculares, tamaños, y forma (definición molecular de la disolución ideal), las moléculas no tienen ninguna preferencia hacia ninguna localización particular, por lo que se encontrarán distribuidas de forma aleatoria, al igual que ocurre cuando se mezclan dos gases ideales. Por lo tanto la probabilidad de estados en una mezcla de gases ideales es la misma que en una disolución ideal, hasta el punto que una mezcla de gases ideales es una disolución ideal.

Podemos aplicar la mecánica estadística para calcular la entropía en gases ideales a nuestro caso de disoluciones ideales:

0=∆⋅+∆=∆∆⋅−∆=∆

mezmezmez

mezmezmez

VpUH

STHG Ec. 33

pues ∆Umez y ∆Vmez son cero por la definición molecular de la disolución ideal.


20

1

2lnpp

kSmez ⋅=∆ Ec. 34

Tanto para una mezcla de gases ideales como para una disolución ideal, la probabilidad de que una molécula cualquiera se encuentre en la parte izquierda de la mezcla es igual a V*

B / V donde V*B es el volumen de B antes de la mezcla

y V es el volumen de la mezcla. Por lo tanto la probabilidad del estado inicial será:

ACABCB Nn

C

Nn

B

N

C

N

B

VV

VV

VV

VV

p⋅⋅

⋅

=

⋅

=

****

1 Ec. 35

La probabilidad del estado final es uno pues es el estado de equilibrio, es decir:

p2 = 1. Ec. 36

Por lo tanto la entropía de mezcla se obtiene sustituyendo las ecuaciones Ec.35 y Ec.36, en la ecuación Ec34:

∑=

⋅⋅−=

+

−=

⋅

⋅=∆

r

jjj

n

C

n

BNn

C

n

BA

mez xnRVV

VV

R

VV

VVN

RS

CB

ACB 1

**

**

lnlnln1

ln

Ec. 37

Sustituyendo Ec.36 en Ec.33 obtenemos la definición termodinámica de las disoluciones ideales.

3.1. POTENCIAL QUÍMICO

Vamos a obtener la expresión del potencial químico de un componente cuando este se encuentra formando parte de una disolución ideal. Para ello emplearemos la definición termodinámica de disolución ideal, que hemos obtenido anteriormente:

( ) ( )

∑

∑∑

=

==

⋅⋅=∆

−⋅=−⋅=−=∆

r

jjjmez

r

jjjj

r

jjmjjmez

xnRTG

nGGnGGG

1

1

*

1

*,

*

ln

µµ

Ec. 38

Igualando ambas expresiones llegamos a la expresión del potencial químico buscado:

jjjj xRTpTxpT ln),(),,( * ⋅+= µµ Ec. 39


21

Se define el estado estándar de cada especie química j en una disolución líquida ideal como el líquido j puro a la temperatura y presión de la disolución:

),(*0 pTjj µµ = Ec. 40

Por lo tanto la expresión del potencial químico en función del estado estándar será:

jjjj xRTxpT ln),,( 0 ⋅+= µµ Ec. 41

3.2. PRESIÓN DE VAPOR. LA LEY DE RAOULT

La presión P del sistema de la figura es igual a la presión de vapor cuando la disolución está en equilibrio con su vapor. La presión de vapor P es la suma de las presiones parciales de los gases:

PxppP gjjj

j ⋅== ∑ ,;

La condición de equilibrio de fases entre una disolución ideal y su vapor es la igualdad de potenciales químicos: µj,l = µj,g.

Para una mezcla de gases ideales, el potencial químico de un componente será:

00,, ln)(

pp

RTT igjgj += µµ Ec. 42

Para una disolución ideal, el potencial químico de un componente será, según la ecuación Ec.39:

jljlj xRTPT ln),(*,, += µµ Ec. 43


22

Si consideramos el componente j puro en equilibrio con su vapor se cumplirá otra igualdad de potenciales químicos:

0

*0,

**,

**, ln)(),(),(

p

pRTTpTpT j

gjjgjjlj +== µµµ Ec. 44

Podemos sustituir la expresión de µ*j,l (T,p*

j) donde aparece µ*j,l (T,P) en la

ecuación Ec43 , puesto que los potenciales químicos de los compuestos en la disolución son poco sensibles a las variaciones de presión. Esta sustitución será tanto mejor cuanto más próximos sean los valores de las presiones de vapor de cada uno de los componentes a la presión total del sistema.

00,0

*0, ln)(lnln)(

p

pRTTxRT

p

pRTT j

gjjj

gj +=++ µµ Ec. 45

Despejando llegamos a la Ley de Raoult para disoluciones ideales:

*,,

*, jljgjjljj pxPxpxp ⋅=⋅⇒⋅= Ec. 46

donde P es la presión de vapor de la disolución, pj es la presión parcial del componente j en la disolución, y p*

j es la presión de vapor del componente j puro.


23

I-4. DISOLUCIONES DILUIDAS IDEALES

Como en el apartado anterior comenzaremos con una definición molecular de este tipo de sistemas, y a continuación plantearemos una definición termodinámica alternativa.

En una disolución diluida ideal las moléculas de soluto prácticamente sólo interaccionan con moléculas de disolvente, dada la elevadísima dilución de los solutos. La teoría que vamos a desarrollar sólo es válida para disoluciones de no electrolitos. En disoluciones de electrolitos las intensas fuerzas entre iones dan lugar a interacciones entre moléculas de soluto considerables, por lo que el modelo de disolución diluida no es válido en disoluciones de electrolitos, incluso a muy altas diluciones.

A diferencia de las disoluciones ideales, donde todas las especies químicas tenían la misma “categoría”, cumpliendo las mismas ecuaciones (sólo obtuvimos una ecuación para el potencial químico), en las disoluciones diluidas ideales se diferencian dos tipos de sustancias, los solutos y los disolventes, que verificarán ecuaciones diferentes. Utilizaremos la letra A para referirnos al disolvente, y la letra i para referirnos a cualquiera de los solutos.

Por los mismos razonamientos que en el caso de las disoluciones ideales necesitamos una definición termodinámica alternativa de una disolución diluida ideal.

Para ello vamos a plantear un experimento. Partimos de una disolución diluida ideal, a la que vamos a añadir una cierta cantidad de disolvente, para obtener una nueva disolución diluida ideal. Este proceso se conoce como dilución.


24

Primeramente vamos a obtener una expresión para la energía libre de mezcla ∆Gmez del proceso de dilución anteriormente descrito, a partir de conceptos termodinámicos. A continuación obtendremos la misma variable a partir de la mecánica estadística. Al comparar ambas expresiones llegaremos a las ecuaciones de los potenciales químicos en las disoluciones diluidas ideales.

Vamos a obtener ∆Gmez a partir de la termodinámica; relacionaremos de esta manera ∆Gmez con los potenciales químicos de cada uno de los componentes de la mezcla. Por definición la energía libre de Gibbs de mezcla se define como sigue:

)( *12 Amez GGGG +−=∆ Ec. 47

Las expresiones de las energías libres de Gibbs anteriores son:

( )2,2,2,2

*1,2,

*

1,1,1,1

AAii

AAAA

AAii

nnG

nnG

nnG

µµ

µ

µµ

⋅+⋅=

⋅−=

⋅+⋅=

Ec. 48

Sustituyendo valores obtenemos:

( ) ( ) ( )*1,1,

*2,2,1,2, AAAAAAiiimez nnnG µµµµµµ −⋅−−⋅+−⋅=∆ Ec. 49

A continuación vamos a obtener ∆Gmez a partir de la mecánica estadística ; relacionaremos de esta manera ∆Gmez con la composición de la mezcla, para ser más exactos con las fracciones molares de los solutos y el disolvente.

Se puede demostrar muy fácilmente que la energía libre de Gibbs de mezcla del proceso de dilución es igual a la energía libre de Gibbs de mezcla del proceso de formación de la disolución diluida ideal 2 menos la energía libre de Gibbs de mezcla del proceso de formación de la disolución diluida ideal 1:

),,,(),,,(),,,,( 1,2, AimezAimezAAimez nnPTGnnPTGnnnPTG ∆−∆=∆∆ Ec. 50


25

CAPÍTULO 1 FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS

26

I-5. DISOLUCIONES NO IDEALES

Los potenciales químicos en sistemas no ideales normalmente son expresados en términos de actividades y coeficientes de actividad, por lo que nuestro primer objetivo será definir estas magnitudes y ver cómo se miden.

5.1. ACTIVIDADES Y COEFICIENTES DE ACTIVIDAD

Para una disolución ideal o diluida ideal de no electrolitos, el potencial químico de cada componente es:

−=⇒+=

RTxxRT i

idi

iiiidi

00 expln

µµµµ Ec. 51

donde µ0i es el potencial químico en el estado normal adecuadamente definido.

Una disolución no ideal se define como aquella que no es ni ideal ni diluida ideal. Elegimos expresar los potenciales químicos no ideales µi de cada componente de una forma que recuerde lo más posible a los potenciales químicos ideales:

o El potencial químico del estado normal µ0i de cada componente

se elegirá de forma que se corresponda con el estado normal usado en una disolución ideal o diluida ideal.

o Definimos la actividad ai de la sustancia i en cualquier disolución, ideal o no, de no electrolitos como:

−=

RTa ii

i

0

expµµ

Ec. 52

De esta manera obtenemos una expresión para el potencial químico de cualquier disolución, que se parece mucho a las de las disoluciones ideales:

iii aRT ln0 += µµ Ec. 53

Teniendo en cuenta que el estado normal de una disolución ideal o diluida ideal coincide con el de una disolución no ideal, la diferencia entre el potencial químico de una disolución ideal y el potencial químico de una disolución no ideal será:

i

iidii x

aRT ln⋅=− µµ Ec. 54


27

El cociente ai / xi se define como el coeficiente de actividad, y lo denotamos por γi . Este coeficiente es una medida de la discrepancia con respecto al comportamiento ideal.

El potencial químico de una disolución no ideal expresado en función del coeficiente de actividad queda:

( )iiii xRT ⋅⋅+= γµµ ln0 Ec. 55

Tanto la actividad como el coeficiente de actividad son función de la temperatura, la presión, y la composición de la disolución:

),,,,(),,,,( 2121 KK xxPTxxPTaa iiii γγ == Ec. 56

Al igual que el potencial químico, la actividad ai da la tendencia de escape del componente i de la disolución.

5.2. ESTADOS NORMALES DE DISOLUCIONES NO IDEALES

Existen dos tipos diferentes de convenios de estado normal.

a) Convenio Ι : se usa para disoluciones donde las fracciones molares de todos los componentes pueden variar en un amplio intervalo. Es el estado normal que emplearemos cuando queramos comparar nuestra disolución con una disolución ideal. El Convenio Ι considera todos los componentes de la disolución a un mismo nivel, sin destacar a ninguno de ellos como disolvente.

El estado normal de cada componente i como líquido puro a la temperatura y presión de la disolución:

),(*0, PTiiI µµ = Ec. 57

Con la definición dada del estado normal vamos a interpretar el coeficiente de actividad:

iiIiiiIiIi xRTPTxRT ,*

,0, ln),(ln γµγµµ +=+= Ec. 58

Si xi tiende a uno, entonces la disolución será prácticamente componente i puro y se cumplirá que µi → µ*

i . Teniendo esto en cuenta en la expresión del potencial químico tenemos:

111ln ,,** →→⇒⋅+= iiIiIii xsiRT γγµµ Ec. 59

El coeficiente de actividad de la especie i tiende a uno, conforme la composición de la disolución tiende al componente i puro.


28

Como el estado normal del Convenio Ι es el mismo que el estado normal de la disolución ideal tendremos:

iiIiIi

iiIidi

xRT

xRT

,0,

0,

ln

ln

γµµ

µµ

+=

+= Ec. 60

Vemos que para una disolución ideal γΙ,i es igual a uno. Por lo tanto para disoluciones no ideales las desviaciones de los coeficientes de actividad γΙ,i con respecto a la unidad miden el alejamiento del comportamiento de la disolución con respecto al comportamiento de la disolución ideal.

b) Convenio ΙΙ : se usa cuando se quiere tratar a uno de los componentes de la disolución, el disolvente A, de una forma diferente a los otros componentes, los solutos i. Es el estado normal que emplearemos cuando queramos comparar nuestra disolución con una disolución diluida ideal.

a. Disolvente: el estado normal del disolvente se toma como líquido puro a la presión y temperatura de la disolución:

),(*0, PTAAII µµ = Ec. 61

Con la definición dada del estado normal vamos a comprobar que cuando la disolución tiende a disolvente puro el coeficiente de actividad del disolvente tiende a la unidad:

AAIIAAAIIAIIA xRTPTxRT ,*

,0

, ln),(ln γµγµµ +=+= Ec. 62

Si xA tiende a uno, entonces la disolución será prácticamente disolvente A puro y se cumplirá que µA → µ*

A . Teniendo esto en cuenta en la expresión del potencial químico tenemos:

111ln ,,** →→⇒⋅+= AAIIAIIAA xsiRT γγµµ Ec. 63

b. Soluto :aquí vamos a seguir el camino inverso. Vamos a imponer la relación entre γΙΙ,i y xi , y a continuación deducimos cual es el estado normal compatible con dicha relación.

El estado normal para cada soluto será aquel que verifique :

11, →→ AiII xcuandoγ Ec. 64

Ahora de lo que se trata es de determinar cual es el estado normal de los solutos compatible con la relación anterior.

En el estado normal µi = µ0ΙΙ,i y por lo tanto sustituyendo en la

expresión del potencial químico del soluto :


29

1ln ,,0

,0

, =⇒+= iiIIiiIIiIIiII xxRT γγµµ Ec. 65

Por la definición dada del estado normal de los solutos, el coeficiente de actividad del soluto será la unidad, γΙΙ,i =1 en el límite de dilución infinita, es decir cuando xA →1.

En el límite de dilución infinita, se cumple la ecuación del potencial químico del soluto en una disolución diluida ideal.

Con todo esto podemos afirmar que el estado normal del soluto es un estado ficticio donde se cumple la ecuación de solución diluida ideal (γΙΙ,i =1) cuando la fracción molar de soluto es xi=1. Vemos que en este estado ficticio se cumple simultáneamente γΙΙ,i =1 y xi=1 por lo que se cumple γΙΙ,i ·xi =1.

Este estado ficticio se corresponde al soluto i puro, en el cual cada molécula de soluto i experimenta las mismas fuerzas intermoleculares que experimentaría en una disolución diluida ideal.

Los estados normales según el Convenio ΙΙ para disolventes y solutos son los mismos que los usados para disoluciones diluidas ideales. Por lo tanto en una disolución diluida ideal se cumple que γΙΙ,A =1 y γΙΙ,i =1. Por lo tanto las desviaciones de γΙΙ,A y γΙΙ,i con respecto a la unidad, miden el alejamiento del comportamiento de la disolución con respecto al comportamiento de disolución diluida ideal.

5.3. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDADES Y COEFICIENTES DE ACTIVIDAD

Ambos parámetros normalmente se calculan a partir de medidas de presiones de vapor durante el equilibrio de fases; el potencial químico de la disolución será igual al potencial químico de la fase vapor; el potencial químico de la disolución depende del coeficiente de actividad γi y el potencial químico de la fase vapor, supuesto una mezcla de gases ideales, depende de las presiones de vapor de cada componente pi ; midiendo pi determino γi .

a) Convenio Ι: La ley de Raoult para disoluciones no ideales.

Cuando tenemos una disolución en equilibrio con su vapor se cumple la igualdad de potenciales químicos:

00

,

,*

,0,,

,,

ln),(

ln),(ln),(),(

),(),(

pp

RTPT

xRTPTxRTPTPT

PTPT

iigi

iiIiiiIiIli

gili

+=

+=+=

=

µµ

γµγµµ

µµ

Ec. 66

Planteando el mismo equilibrio para el componente i puro tenemos:


30

0

*0**

, ln),(pp

RTpT iiili += µµ Ec. 67

Puesto que el potencial químico de los líquidos es poco sensible a la presión podemos sustituir µ*

i (T,P) por la expresión de µ*i,l (T,p*

i ) . Operando llegamos a la Ley de Raoult para disoluciones no ideales:

*,,,

*, iliiIgiiiiIi pxPxpxp ⋅⋅=⋅⇒⋅⋅= γγ Ec. 68

b) Convenio ΙΙ: La ley de Henry en disoluciones no ideales.

Siguiendo los mismos razonamientos que nos llevaron a la ley de Henry para el caso de disoluciones diluidas ideales, y teniendo en cuenta ahora que el potencial químico de los solutos en la disolución es

iiIIiIIli xRTPTPT ,0

,, ln),(),( γµµ += Ec. 69

llegamos a la siguiente formulación de la Ley de Henry para el caso de disoluciones ideales:

liiIIigiiiIIii xPTKPxxPTKp ,,,, ),(),( ⋅⋅=⋅⇒⋅⋅= γγ Ec. 70

El disolvente verifica la ley de Raoult : *,,, AlAAIIgA pxPx ⋅⋅=⋅ γ

5.4. COEFICIENTES DE ACTIVIDAD DE SOLUTOS NO VOLÁTILES

Para una disolución de un sólido en un disolvente líquido, la presión parcial de vapor del soluto sobre la disolución es en general demasiado pequeña como para poder ser medida. Lo único que es accesibles la presión parcial del disolvente pA , que nos permitirá calcular el coeficiente de actividad γA en función de la composición de la disolución.

La ecuación de Gibbs-Duhem nos va a permitir expresar el coeficiente de actividad del soluto en función del coeficiente de actividad del disolvente. La ecuación de Gibbs-Duhem en procesos a temperatura y presión constante es:

∑=

=⋅r

jjj dn

1

0µ Ec. 71

siendo r el número de componentes de la disolución. Aplicándolo al caso particular de una disolución formada por un soluto y un disolvente tenemos:

( ) ( ) 0lnln

000 =+⋅++⋅

⇒=⋅+⋅

BBBBAAAA

BBAA

xRTdxxRTdx

dxdx

γµγµ

µµ Ec. 72


31

Operando llegamos a :

AB

AB d

xx

d γγ lnln ⋅−= Ec. 73

Integrando:

∫ −−=−

2

11,2, ln

1lnln A

A

ABIIBII d

xx

γγγ Ec. 74

Si consideramos al estado 1 como disolvente puro, entonces γΙΙ,B1 =1 y la integral queda:

AII

x

x A

ABII d

xxA

A

,1

, ln1

ln γγ ∫= −

= Ec. 75

5.5. COEFICIENTES DE ACTIVIDAD EN LAS ESCALAS DE MOLALIDAD Y CONCENTRACIÓN MOLAR

Para disoluciones de sólidos o gases en líquidos, los potenciales químicos de los solutos suelen expresarse en molalidades mi :

AAiiAA

i

AA

ii Mxmx

Mxx

Mnn

m ⋅⋅=⇒⋅

=⋅

= Ec. 76

donde ni , nA son los moles de soluto y disolvente respectivamente, y MA el peso molecular del disolvente. Sustituyendo la relación entre fracción molar y molalidad en el potencial químico de un soluto:

( )

⋅⋅+⋅+=

⋅⋅⋅⋅+=

0,00

,

0

0

,0

,

lnln

ln

mm

xRTmMRT

mm

MxmRT

iiIIAAiIIi

AAiiIIiIIi

γµµ

γµµ Ec. 77

donde m0 =1 mol / Kg se introduce para mantener las ecuaciones dimensionalmente correctas puesto que sólo podemos tomar el logaritmo de una cantidad adimensional.

Definimos el potencial químico del estado normal en la escala de molalidades como:

( )00,

0, ln mMRT AiIIim ⋅+= µµ Ec. 78

Definimos el coeficiente de actividad en la escala de molalidades como:


32

iIIAim x ,, γγ ⋅= Ec. 79

Nótese que con esta definición γm,i →1 si xA→1.

Con estas definiciones el potencial químico del soluto queda:

⋅+= 0,

0, ln

mm

RT iimimi γµµ Ec. 80

Por los mismos razonamientos que en el Convenio ΙΙ el estado normal del soluto es un estado ficticio donde se cumple la ecuación de solución diluida ideal, γm,i =1 cuando la molalidad del soluto es la unidad, mi =1.

Para el disolvente se emplea la escala de fracciones molares, que ya hemos visto anteriormente.

Puesto que los estados normales según el Convenio ΙΙ en la escala de molalidades para solutos, y el Convenio ΙΙ a secas para el disolvente son los mismos que los usados para disoluciones diluidas ideales, las desviaciones de γm,i y γΙΙ,A con respecto a la unidad miden las discrepancias del comportamiento de la disolución con respecto al comportamiento de la disolución diluida ideal.

Los potenciales químicos de los solutos también suelen expresarse en función de las concentraciones molares. Siguiendo los mismos pasos que para las molalidades llegamos a las siguientes ecuaciones:

( )

30

,*,

,

0*,

0,

0,

0,0,

/1

ln

ln

dmmolc

cVx

cVRT

cc

RT

iIIiAm

iic

AmiIIic

iicici

=

⋅⋅

=

⋅+=

⋅+=

γγ

µµ

γµµ

Ec. 81

Se cumple por la definición de γc,i que γc,i →1 cuando xA→1.


33

A.I) DISOLUCIONES DE ELECTROLITOS

Un electrolito es una sustancia que produce iones en disolución, lo cual se pone de manifiesto por el hecho de que la disolución presenta conductividad eléctrica. Para un disolvente dado, un electrolito se clasifica en fuerte y débil, según que la disolución a concentraciones moderadas sea un buen o un mal conductor de la electricidad.

Un cristal de NaCl, CuSO4 , o MgS está formado por iones positivos y negativos. Cuando un cristal iónico se disuelve en un disolvente polar, los iones se separan del cristal y quedan solvatados en la disolución. El término solvatado indica que en la disolución cada ión está rodeado por una envoltura formada por varias moléculas de disolvente, unidas al ión por fuerzas electrostáticas. Cuando el disolvente es agua, la solvatación recibe el nombre de hidratación.

Debido a las fuertes interacciones de largo alcance existentes entre los iones en la disolución, el uso de coeficientes de actividad al tratar disoluciones de electrolitos es esencial, incluso para disoluciones muy diluidas. Los iones positivos y negativos se producen juntos en disolución con lo que hemos de estudiarlos conjuntamente para determinar sus actividades. Por tanto es necesario un desarrollo especial de los coeficientes de actividad de los electrolitos.

Por simplicidad consideraremos una disolución compuesta por un disolvente A que no es un electrolito, como por ejemplo agua, con un electrolito que da lugar a dos clases de iones en disolución.

Sea el electrolito i de fórmula Mν+Xν- que al disolverse sigue el siguiente proceso:

)()()( disXdisMsXM zz −−

++−+ +⇒ νννν Ec. 82

donde (dis) denota especies en disolución.

A menudo se considera que sales como CuSO4 existen en disolución acuosa sólo en forma de iones. Esto es inexacto pues salvo para iones donde ν+=ν-=1, como por ejemplo ClNa, existe una asociación considerable entre iones de carga opuesta formando lo que se ha dado en llamar par iónico.

El equilibrio de formación de un par iónico en disolución es:

−+ +−+ ⇔+ zzzz MXdisXdisM )()( Ec. 83

A continuación plantearemos las ecuaciones de los potenciales químicos de los solutos y del disolvente en una disolución de electrolitos. Consideremos una disolución formada por ni moles de un electrolito fuerte i de fórmula Mν+Xν- y nA moles de disolvente A. Las especies presentes en disolución serán:


34

§ nA moles de moléculas de A, con potencial químico µA.

§ n+ moles de iones de Mz+, con potencial químico µ+.

§ n- moles de iones de Xz-, con potencial químico µ-.

§ nPI moles de pares iónicos −+ + zzMX ,con potencial químico µPI.

a.i.1 POTENCIAL QUÍMICO DEL DISOLVENTE

El potencial químico del disolvente puede expresarse en la escala de fracciones molares:

AAAxAAA aRTPTxRTPT ln),(ln),( ** +=+= µγµµ Ec. 84

donde γxA es el coeficiente de actividad en la escala de fracciones molares.

Esta expresión del potencial químico es la misma que la empleada en disoluciones de no electrolitos no ideales. Por lo tanto la ley de Raoult para disoluciones no ideales es de aplicación para el disolvente en una disolución de no electrolito:

*AAA pap ⋅= Ec. 85

donde pA es la presión de vapor del disolvente en la disolución, y p*A es la

presión de vapor del disolvente puro. Para llegar a esta ecuación supusimos que el vapor tenía comportamiento de gas ideal. Cuando el electrolito es no volátil, pA es aproximadamente la presión de vapor de la disolución.

Al trabajar con disoluciones de electrolitos, el potencial químico del disolvente también suele expresarse en función del coeficiente osmótico práctico φ del disolvente.

La definición de φ para una disolución de un electrolito fuerte es:

iA

AA

iA

A

mMTRmMa

⋅⋅⋅⋅−

=⋅⋅

−=ν

µµν

φ*ln

Ec. 86

Con esta definición, la expresión del potencial químico del disolvente queda:

iAAA mMTR ⋅⋅⋅⋅⋅−= νφµµ * Ec. 87

donde ν=ν++ν- , mi es la molalidad estequiométrica del electrolito y MA es la masa molar del disolvente.


35

La razón para usar φ en lugar del coeficiente de actividad del disolvente es que en disoluciones diluidas de electrolitos, el coeficiente de actividad del disolvente puede ser muy próximo a la unidad, a pesar de que el coeficiente de actividad del soluto se desvíe sustancialmente de uno, y el comportamiento de la disolución diste mucho del comportamiento de disolución diluida ideal.

a.i.2 POTENCIAL QUÍMICO DEL ELECTROLITO

Puesto que en una disolución de electrolitos no podemos variar fácilmente el número de moles del ión positivo, mientras se mantiene constante el número de moles del ión negativo, la determinación experimental del potencial químico de los iones es prácticamente imposible:

+−−

−+

+ ∂∂

=∂∂

=nnPTnnPT AA

nG

nG

,,,,,,

µµ Ec. 88

Por ello no hablaremos del potencial químico del ión positivo y del ión negativo, sino del potencial químico del electrolito como un todo:

AnPTii n

G

,,∂∂

=µ Ec. 89

El siguiente paso será relacionar el potencial químico del electrolito µi con el de los iones µ+ y µ -.

Para ello plantearemos la ecuación de Gibbs para una disolución de un electrolito:

PIPIAA dndndndnVdpSdTdG µµµµ +++++−= −−++ Ec. 90

Teniendo en cuenta que cuando se forman pares iónicos tanto el número de moles de cationes como el de aniones se reducen en nPI se cumplirá:

PIiPIi nnnnnn −⋅=−⋅= −−++ νν Ec. 91

La condición de equilibrio para la reacción de formación de pares iónicos es:

∑ −+ +=⇒=⋅ µµµµν PIii 0 Ec. 92

Aplicando estas relaciones a la ecuación de Gibbs obtenemos:

iAA dndnVdpSdTdG )( −−++ ++++−= µνµνµ Ec. 93

Teniendo en cuenta la definición de µi , la ecuación anterior nos proporciona la relación buscada:


36

−−++ ⋅+⋅= µνµνµ i Ec. 94

Estos potenciales químicos se expresan normalmente en la escala de molalidades:

⋅⋅+=

⋅⋅+= −

−−−+

+++ 00

00 lnln

mm

TRmm

TR γµµγµµ Ec. 95

Sustituyendo:

( ) ( )

⋅

⋅⋅+⋅+⋅=

−−

++−

−+

+−−++

νννν γγµνµνµ 00

00 lnmm

mm

RTi Ec. 96

Definimos el coeficiente de actividad iónico medio en la escala de molalidades γ± del electrolito Mν+Xν- como :

( ) ( ) ( ) −+−+−+

+± ⋅= νννν γγγ Ec. 97

Definimos el potencial químico del estado normal del electrolito como:

000−−++ ⋅+⋅= µνµνµ i Ec. 98

Con estas definiciones el potencial químico del electrolito queda:

( )

⋅

⋅+=

−+

−+±

νννγµµ 00

0 lnmm

mm

RTii Ec. 99

donde −+ += ννν .

La relación entre las molalidades iónicas m+ y m- y la molalidad del electrolito mi , dependerá de la existencia o no de asociación iónica:

a.i.2.1 SIN ASOCIACIÓN IÓNICA:

En este caso las molalidades iónicas son:

ii mmmm ⋅=⋅= −−++ νν Ec. 100

Definimos ν± como :

( ) ( ) ( ) −+−+± ⋅= ννν ννν Ec. 101

Con esta definición y teniendo en cuenta la relación entre molalidades iónicas y la molalidad del electrolito, el potencial químico del electrolito queda:


37

⋅⋅⋅⋅⋅+= ±± 0

0 lnmm

TR iii γννµµ Ec. 102

a.i.2.2 CON ASOCIACIÓN IÓNICA:

Este caso no se va a dar en el desarrollo posterior de nuestro proyecto y por ello sólo mostraré las ecuaciones.

El potencial químico del electrolito cuando se produce asociación iónica es:

±−

+

±

⋅

⋅−−⋅=

⋅⋅⋅⋅⋅+=

−

−+

γνν

ααγ

γννµµ

νν

νν

)1(1

ln 00

i

iiii m

mTR

Ec. 103

donde α es la fracción de iones Mz+ que no se asocia con los iones Xz- para formar pares iónicos.

A partir de esta expresión del potencial químico podemos obtener el potencial químico del electrolito sin asociación iónica, tomado α unidad.

Sustituyendo µi por µ0i vemos que el estado normal del electrolito i como

un todo tiene que cumplir la siguiente igualdad:

10 =⋅⋅± mmi

iγν Ec. 104

El estado normal del electrolito i se toma como el estado ficticio donde se verifica simultáneamente:

Kgmolm

mm

ii

i

±± =⇒=⋅

=

νν

γ

11

1

0

Ec. 105

La actividad ai del electrolito como un todo se define de tal modo que se satisfaga :

iii aRT ln0 += µµ Ec. 106

Por lo tanto para un electrolito fuerte la expresión de la actividad es:

⋅⋅= ± 0m

ma i

ii γν Ec. 107


38

I-6. TEORÍA DE DEBYE-HUCKEL

En 1923 Debye y Huckel desarrollaron un modelo muy simplificado de una disolución de electrolitos y mediante la mecánica estadística dedujeron expresiones teóricas para los coeficientes de actividad iónicos en la escala de molalidades γ+ y γ- .

Debido a la carga de los iones, éstos están sujetos a fuerzas culombianas, es decir, fuerzas de atracción y repulsión. Estas fuerzas interiónicas de atracción y repulsión son las que hacen que la distribución de iones no sea completamente al azar, sino que es de esperar que alrededor de un ion positivo sea más probable encontrar iones negativos. En realidad si no fuera por el movimiento térmico de las partículas de soluto y disolvente se obtendría una configuración perfectamente ordenada similar a la de un cristal iónico. Esto quiere decir que hay un equilibrio dinámico entre dos causas opuestas: una el movimiento térmico que tiende a desordenar los iones y otra la atracción culombiana que tiende a ordenarlos; como consecuencia cada ion está rodeado de una atmósfera de iones de signo opuesto que en un promedio se puede considerar de simetría esférica y en la que la carga está uniformemente distribuida.

La idea esencial de la teoría de Debye-Huckel es suponer que todas las desviaciones de la idealidad de una disolución son debidas a las interacciones eléctricas de los iones.

En su modelo los iones se consideran esferas rígidas de diámetro a cargadas uniformemente. La diferencia de tamaño entre los iones positivos y negativos se desprecia y a se interpreta como el diámetro iónico medio. El disolvente A se considera un medio sin estructura con una constante dieléctrica εr,A .

El potencial químico de un ion de carga i (+ o -) viene dado por la ecuación:

iiii RTmRT γµµ lnln* ++= Ec. 108

que se puede representar por

)()( eléctricoideal iii µµµ += Ec. 109

siendo

ii

iii

RTeléctrico

mRTideal

γµµµ

ln)(

ln)( *

=+=

Ec. 110

donde RTlnγi es la energía libre de Gibbs adicional por mol, debida a la interacción de las cargas de los iones.


39

El potencial químico por ion será:

iA

i kTN

eléctricoγ

µln

)(= Ec. 111

donde NA es el número de Avogadro y k es la constante de Boltzmann.

El objetivo de la teoría es poder calcular esta energía adicional que surge debido a las interacciones de los iones.

Con el propósito de hacer más claro el desarrollo de la teoría, ésta será dividida en varias etapas.

1) Ecuación de Poisson.

Supongamos un ion positivo en el origen de coordenadas. El potencial eléctrico ψ en un punto situado a una distancia r del ion central viene dado por la ecuación de Poisson:

ρεπ

ψ ⋅−=∇A

42 Ec. 112

donde εA es la constante dieléctrica del disolvente y ρ es la densidad de carga (carga por unidad de volumen).

Puesto que la distribución de carga alrededor de un ion central tiene simetría esférica es conveniente usar coordenadas esféricas:

ρεπψ

⋅−=

Adrd

rdrd

r41 2

2 Ec. 113

Para poder integrar esta ecuación necesitamos expresar ρ en función de ψ.

2) Ecuación de Poisson-Boltzmann.

Si zi es la valencia del ion i, y e es la carga del protón entonces zi ·e será la carga eléctrica del ion. Como el potencial eléctrico ψ en un punto se define como el trabajo necesario para llevar la unidad de carga desde el infinito a dicho punto, zi ·e·ψ será la energía necesaria para colocar dicho ion en el punto en que el potencial es ψ.

Por otro lado, la expresión de la densidad de carga ρ será:

∑ ⋅⋅=⋅⋅+⋅⋅= −−++ ii nezneznezρ Ec. 114

siendo ni el número de iones i por unidad de volumen.


40

Una de las suposiciones más importantes en la teoría de Debye-Huckel es la que se refiere a la distribución de iones en la disolución que viene dada por la ley de distribución de Maxwell-Boltzmann, es decir:

kTez

ii

i

ennψ⋅⋅

−⋅= 0 Ec. 115

donde n0i es el número de iones por unidad de volumen, con

energía eléctrica igual a cero.

La forma exponencial de esta ley de distribución es un inconveniente para resolver la ecuación de Poisson. Por ello introducimos la aproximación de que zi ·e·ψ <<kT para poder linealizarla, desarrollando en serie:

∑

+

⋅⋅−⋅⋅⋅= L

kTez

nez iii

ψρ 10 Ec. 116

Esto quiere decir que la energía potencial interiónica es mucho menor que la energía térmica, o que los iones están raramente juntos lo que restringe el tratamiento a disoluciones muy diluidas.

Teniendo en cuenta que

∑ =⋅ 00ii nz Ec. 117

y puesto que

10000 Aii

Ncn

⋅= Ec. 118

donde n0i es el número de iones por centímetro cúbico, ci el número de

iones por litro y que en disoluciones diluidas ci=mi ·ρA donde mi es la molalidad del ion y ρA es la densidad del disolvente, llegamos a :

∑∑ ⋅⋅=⋅ 220

21

10002

iiAA

ii zmN

znρ

Ec. 119

Definimos la magnitud fuerza iónica en la escala de molalidades como:

∑ ⋅= 2

21

iim zmI Ec. 120

Por lo tanto la expresión de la densidad de carga queda:

mAA I

NkT

e1000

22 ρψρ ⋅

⋅−= Ec. 121


41

Sustituyendo en la ecuación de Poisson obtenemos:

ψε

ρπψ⋅

⋅⋅

=

kTINe

drd

rdrd

r A

mAA

100081 2

22

Ec. 122

Si definimos la magnitud κ como

kTINe

A

mAA

ερπ

κ⋅

⋅=

10008 2

2 Ec. 123

entonces obtenemos

ψκψ

⋅=

22

2

1drd

rdrd

r Ec. 124

que es la ecuación de Poisson-Boltzmann.

La solución es de la forma:

re

Br

eA

rr ⋅⋅−

⋅+⋅=κκ

ψ Ec. 125

donde A y B son constantes de integración.

3) Proceso de carga de un ión.

Como dijimos en un principio la esencia de la teoría de Debye-Huckel es suponer que las desviaciones del comportamiento ideal son debidas a la carga de los iones y el objeto de la teoría era poder calcular el µi(eléctrico) de un ión para poderlo relacionar con el coeficiente de actividad del mismo.

Supongamos que todos los iones de la disolución están cargados, excepto el ión central. Sea a la distancia más pequeña a la que pueden acercarse los iones. Si ψa es el potencial eléctrico en la superficie de la esfera, el trabajo necesario para cargar ese ión central será:

∫ ⋅=q

ai dqW0

ψ Ec. 126

Puesto que el proceso es a temperatura y presión constante, este trabajo eléctrico se ha de relacionar con la variación de energía libre de Gibbs del proceso.


42

El resultado final que Debye y Huckel obtuvieron fue:

( )

∑ ⋅=

⋅=

⋅=

⋅⋅+

⋅⋅−=

⋅⋅+

⋅⋅−=

−−

++

2

21

,0

23

,0

22

1

21

212

21

212

21

2

42

1ln

1ln

iim

Ar

AA

ArAA

m

m

m

m

zmI

kTN

eB

kTe

NA

IaB

IAz

IaB

IAz

εερ

επερπ

γ

γ

Ec. 127

donde a es el diámetro iónico medio, NA es el número de Avogadro, k es la constante de Boltzmann, e es la carga del protón, ε0 es la permitividad del vacío, εr,A es la constante dieléctrica relativa del disolvente, ρA es la densidad del disolvente, e Im es la fuerza iónica en la escala de molalidades.

Aunque la teoría de Debye-Huckel nos da el potencial químico para cada ión, no los podemos medir experimentalmente. Por lo tanto expresamos el resultado obtenido en la teoría en términos del coeficiente de actividad iónico medio:

21

21

1ln

m

m

IaB

IAzz

⋅⋅+

⋅⋅⋅−= −+±γ Ec. 128

Esta ecuación es razonablemente exacta en disoluciones acuosas donde la fuerza iónica Im sea menor que 0.1 moles/ Kg.

A una fuerza iónica dada, la teoría funciona mejor cuanto menor es el valor de z+ ·|z-| ,es decir, que la teoría da resultados más fiables para electrolitos 1:1 (ClNa) que para los 2:2.


43

I-7. PROPIEDADES COLIGATIVAS

Cuando se añade un soluto a un disolvente A puro, la fracción molar de A, xA disminuye. Teniendo en cuenta que se cumple la relación :

0,,

>∂∂

≠ AxpTA

A

ixµ

Ec. 129

una disminución de xA debe traer consigo una disminución del potencial químico de A. Por lo tanto la adición a temperatura y presión constante de un soluto reduce el potencial químico del disolvente µA por debajo del valor correspondiente al soluto puro µ*

A.

Esta variación del potencial químico del disolvente modifica la presión de vapor, el punto de ebullición normal, el punto de congelación normal, y da lugar al fenómeno de la presión osmótica.

Estas cuatro propiedades son las propiedades coligativas. La principal característica de estas propiedades es que dependen fundamentalmente del número de moléculas presentes en disolución y no de su naturaleza.

De las cuatro propiedades coligativas sólo desarrollaremos en este capítulo dos de ellas, la disminución de la presión de vapor, y el descenso del punto de congelación. El aumento del punto de ebullición no lo describimos por carecer de interés en el estudio de este proyecto. Por el contrario el fenómeno de la presión osmótica lo desarrollaremos en el siguiente capítulo por su especial interés en los desarrollos posteriores del proyecto.

7.1. DISMINUCIÓN DE LA PRESIÓN DE VAPOR

Puesto que el potencial químico µA es una medida de la tendencia a escapar de la disolución, por lo que la disminución del potencial químico del disolvente originada por la adición de soluto hace que la presión parcial de vapor pA del disolvente en la disolución sea menor que la presión de vapor p*

A del disolvente puro.

Para cuantificar esta reducción supondremos que la disolución está formada por un soluto no volátil y un disolvente volátil, de manera que la contribución del soluto a la presión de vapor de la disolución es despreciable. De esta manera la presión de vapor de la disolución P es debida únicamente a la presencia del disolvente A.

Esta condición se cumple para casi todos los solutos sólidos. Para simplificar supondremos que las presiones son lo suficientemente bajas como para considerar hipótesis de gas ideal.

La ley de Raoult para disoluciones no ideales es :

*AAAA pxpP ⋅⋅== γ Ec. 130


44

La reducción de la presión de vapor es por definición ∆P=P- p*A.

Sustituyendo en la ley de Raoult obtenemos:

( )( )( ) *

*

11

1

ABA

AAA

pxP

pxP

⋅−−⋅=∆

⋅−⋅=∆

∑γ

γ Ec. 131

siendo xB las fracciones molares de los solutos presentes en la disolución. Vemos que ∆P es independiente de la naturaleza de los solutos.


45

7.2. DESCENSO DEL PUNTO DE CONGELACIÓN

En el punto de congelación normal T*f del disolvente puro, las fases sólidas

A(s) y líquida A(l) se encuentran en equilibrio y sus potenciales químicos son iguales:

*)(

*)( lAsA µµ = Ec. 132

Por debajo de T*f el sólido puro A es más estable que el líquido puro A,

cumpliéndose la desigualdad:

*)(

*)( lAsA µµ < Ec. 133

puesto que la fase pura más estable es aquélla con el valor más bajo del potencial químico.

La adición de soluto al disolvente líquido puro a temperatura y presión constante, siempre reduce µA y por tanto se cumplirá la desigualdad :

*)()( lAdisA µµ < Ec. 134

tal como puede apreciarse en la figura adjunta:

Esto hace que la intersección de las curvas de A(dis) con A(s) aparezca a una temperatura menor que en el caso de la intersección de A(l) con A(s).

Por tanto el punto de congelación de la disolución Tf es menor que el punto de congelación del disolvente puro A, T*

f .

A continuación vamos a calcular la expresión de partida que nos permitirá calcular en base a ciertas hipótesis simplificatorias el descenso del punto de congelación de un disolvente A debido a un soluto B. Supondremos que


46

únicamente la sustancia A pura se congela en la disolución cuando ésta se enfría hasta su punto de congelación.

La condición de equilibrio en el punto de congelación normal, es decir a 1 atm de presión, es aquella en la que los potenciales químicos del sólido A puro y de A en la disolución deben de ser iguales:

AfflAfsA

fdisAfsA

aTRPTPT

PTPT

ln),(),(

),(),(*

)(*

)(

)(*

)(

⋅⋅+=

=

µµ

µµ Ec. 135

El potencial químico de una sustancia pura es igual a la energía libre de Gibbs molar G*

m , por lo que podemos escribir:

Ec. 136

Teniendo en cuenta que la variación de la energía libre de Gibbs molar con la temperatura a presión constante es igual a la entropía molar cambiada de signo, al derivar la ecuación anterior con respecto a la temperatura a presión constante obtenemos:

ff

fAfusmA

f

fAfusm

Pf

A

fAfusmffAfusmfAfusm

f

fAfusm

f

fAfusm

Pf

A

dTTR

THad

TR

PTH

Ta

PTSTPTHPTG

TR

PTG

TR

PTS

Ta

2

*,,

2

*,,

*,,

*,,

*,,

2

*,,

*,,

)(ln

),(ln

),(),(),(

),(),(ln

⋅

∆=

⋅

∆=

∂∂

∆⋅−∆=∆

⋅

∆+

⋅

∆=

∂∂

Ec. 137

Integrando entre los estados 1 y 2 se llega a:

∫ ⋅

∆=

2

1

*,,

1,

2, )(ln f

f

fAfusm

A

A dTTR

TH

a

a Ec. 138

Si consideramos al estado 1 como la sustancia A pura, entonces Tf,1 será el punto de congelación de A puro T*

f y aA,1=1 quedando la ecuación anterior:

f

fAfusm

f

flAmfsAmA TR

PTG

TR

PTGPTGa

⋅

∆=

⋅

−=

),(),(),(ln

*,,

*)(,

*)(,


47

dTTR

THx

f

f

T

T

AfusmAA ∫ ⋅

∆=

*

)(ln

*,,γ Ec. 139

Para mostrar gráficamente la reducción del descenso del punto de congelación, vamos a aplicar la ecuación anterior a una disolución diluida ideal. Supondremos que la entalpía de fusión no dependerá de la temperatura.

La ecuación que describirá el descenso del punto de congelación en este caso particular será:

*

*,,

*

*,, 11

lnff

Afusm

ff

AfusmA TT

TR

H

TTR

Hx

⋅∆

⋅∆

−=

−⋅

∆−= Ec. 140

donde ?T=T*f - Tf , es el descenso crioscópico.

La representación gráfica de la ecuación anterior para el caso del agua es:

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2-25

-20

-15

-10

-5

0

5DESCENSO CRIOSCÓPICO DEL AGUA

Fracción molar de soluto

Tem

pera

tura

/(ºC

)


48

Es usual emplear una ecuación de descenso crioscópico aun más simplificada. Para disoluciones diluidas Tf y T*

f no son muy diferentes y por tanto se puede reemplazar Tf ·T*

f por Tf*2.

Al ser la solución diluida, xA será muy próximo a la unidad, y por lo tanto ln xA˜ -xA.

Así la ecuación de descenso crioscópico queda:

2*

,,

f

AfusmA T

TR

Hx

∆⋅

∆= Ec. 141

Como consecuencia de que estamos considerando una disolución diluida, podemos escribir:

disolventemolessolutomoles

disolventemolessolutomolessolutomoles

xA ≈+

= Ec. 142

A

A

B

B

A

Mw

Mw

x = Ec. 143

donde wA y wB son las masas de disolvente y soluto respectivamente, y MA y MB son los pesos moleculares de disolvente y soluto respectivamente.

Aplicando la simplificación anterior a la ecuación de descenso crioscópico obtenemos:

mKwMw

MH

TR

MwMw

H

TRT f

AB

B

AAfusm

f

BA

AB

Afusm

f ⋅=⋅⋅

⋅∆⋅

⋅=

⋅⋅

⋅∆

⋅=∆

10001000 ,,

2*

,,

2*

Ec. 144

donde Kf es la constante de descenso molal o constante crioscópica, una constante para cada disolvente, ya que dependerá de su punto de fusión y de su calor latente de fusión. La magnitud m es la molalidad de la disolución.

Para el caso particular del agua, la expresión de la ecuación del descenso crioscópico queda:

mT ⋅=∆ 86.1 Ec. 145

CAPÍTULO 2 LA ÓSMOSIS

49


50

II. CAPÍTULO 2

LA ÓSMOSIS

II-1. DEFINICIÓN DE ÓSMOSIS. LAS MEMBRANAS SEMIPERMEABLES

1.1. LA ÓSMOSIS. LA PRESIÓN OSMÓTICA

El hecho de que la presencia de soluto modifica las propiedades del agua ha sido descrito anteriormente cuando hemos visto las propiedades coligativas. Conviene decir que que a partir de ahora nos vamos a referir siempre a soluciones acuosas.

Cuando una solución como por ejemplo de sacarosa en agua, es puesta en contacto con agua pura a través de una membrana adecuada, sucede un flujo espontáneo de agua, del lado del recipiente que contiene agua pura hacia el lado que contiene la disolución acuosa de sacarosa.

La propiedad que describe el flujo espontáneo de agua bajo las condiciones dadas anteriormente se denomina ósmosis.

La propiedad esencial de las membranas que las hace adecuadas para que se manifieste la ósmosis es que permiten el paso libre de agua pero no de las sustancias disueltas. Este tipo de membranas se denominan semipermeables.

Se define la presión osmótica como el exceso de presión que se debe aplicar a una disolución para impedir el paso a ella de disolvente puro cuando la disolución y el disolvente puro se encuentran separados por una membrana semipermeable perfecta.

La presión osmótica no es una propiedad tangible de las disoluciones, como lo puede ser su presión de vapor o su temperatura. Es una propiedad que sólo podemos considerar cuando la disolución se encuentra separada del disolvente puro por una membrana semipermeable.

Hemos también que decir que las membranas semipermeables perfectas son sólo una abstracción teórica. Así en el caso de membranas biológicas se permite el paso de ciertas sustancias disueltas. Un comportamiento más próximo a las membranas semipermeables perfectas son las membranas artificiales y en concreto la más selectiva es la de ferrocianuro cálcico (Cu2Fe(CN)6).


51

Por último hay que decir que siempre que la membrana sea completamente semipermeable, la presión osmótica desarrollada será independiente de la naturaleza de dicha membrana.

La presión osmótica es única para una disolución dada a una temperatura definida.

Por lo tanto en experimentos de laboratorio la presión osmótica que alcancemos dependerá de la naturaleza de la naturaleza de la membrana utilizada en las medidas.


52

1.2. CAUSA DE LA SEMIPERMEABILIDAD

Los mecanismos que permiten a una membrana actuar selectivamente sobre el disolvente y los solutos disueltos, desde el punto de vista del transporte de materia, permitiendo únicamente el paso de disolvente no son del todo conocidos.

Es por ello que existen varias teorías que tratan de explicar el fenómeno, no alcanzando ninguna de ellas a explicar completamente todos los fenómenos asociados a la semipermeabilidad.

Hasta la fecha, las teorías más importantes que se han formulado son tres:

1.2.1 TEORÍA DEL CRIBADO.

Esta teoría explica la selectividad de las membranas en función de la relación de tamaños entre los poros de la membrana y las moléculas que tratan de atravesarlos.

Así moléculas mayores que el tamaño de poro, no pasarán mientras que moléculas pequeñas no tendrán ningún problema en atravesar la membrana.

Sin embargo esta teoría por si sola no puede explicar todos los fenómenos de semipermeabilidad pues se ha establecido que hay membranas que son capaces de impedir el paso de las moléculas de soluto a pesar de que el diámetro de los poros de la membrana es mucho mayor que el diámetro de las moléculas de soluto.

1.2.2 TEORÍA DE LA SOLUBILIDAD SUPERFICIAL O ADSORCIÓN.

Como introducción previa para ilustrar el mecanismo de selectividad basado en esta teoría vamos a plantear el experimento siguiente.

Se colocan en un cilindro cloroformo, agua y éter en el orden dado, de manera que formen tres capas. Siendo el éter soluble en agua en un grado apreciable, podrá pasar a través de esta hasta la capa clorofórmica; pero el cloroformo debido a su insolubilidad en agua, no podrá alcanzar la capa etérea. El agua funciona así como una membrana semipermeable, permitiendo el paso de éter, pero no el de cloroformo, debido a que el éter es soluble en ella mientras el cloroformo no lo es.

Otro experimento que combina la idea anterior con la presencia física de una membrana que se interpone es el siguiente.

Se llena con éter y benceno un tubo ancho A cuyo extremo inferior va cerrado con una membrana semipermeable que se ha tenido previamente


53

sumergida en agua. Se cierra con un corcho que lleva un tubo de vidrio, y se coloca en un vaso B que contiene éter húmedo. Se observa que el nivel de líquido en el tubo de vidrio asciende gradualmente. La membrana se comporta aparentemente de una forma semipermeable, dejando pasar al éter que es soluble en el agua contenida en los poros de la membrana, de B a A; pero el benceno que es insoluble en agua, no podrá pasar en la dirección opuesta.

Según los experimentos descritos parece que la semipermeabilidad, en conexión con la ósmosis, se puede explicar suponiendo que el disolvente es soluble en la membrana mientras que el soluto es insoluble.

En los últimos años se ha desarrollado la idea de que el factor que determina la semipermeabilidad es la solubilidad superficial o adsorción. En apoyo de esta idea, por ejemplo se ha encontrado que las membranas de ferrocianuro de cobre toman agua con preferencia a la sacarosa en una disolución acuosa de esta sustancia. O sea el agua es adsorbida preferentemente y la sacarosa muestra lo que se denomina adsorción negativa.

En general se supone, a la luz de esta teoría, que una membrana es permeable a las moléculas que adsorbe positivamente, como por ejemplo el agua; pero es impermeable a aquellas que son adsorbidas negativamente, como por ejemplo la sacarosa.

De nuevo encontramos que esta teoría no es capaz por si sola de explicar todos los fenómenos de semipermeabilidad. Así se ha comprobado que el ferrocianuro de cobre y otras membranas inorgánicas están formadas por una red de partículas cristalinas con un diámetro medio de 1.5 · 10-6 metros. Las dimensiones de los poros en la membrana serán probablemente del mismo orden y en consecuencia demasiado grandes para que la membrana actúe simplemente como cedazo molecular.


54

No obstante hay alguna relación entre semipermeabilidad y tamaño de los poros, como se hace evidente por el hecho de que una membrana de ferrocianuro de cobre no puede impedir completamente el paso de las moléculas de soluto de bajo peso molecular, a menos que con anterioridad se rellenen los poros de la membrana parcialmente con una sustancia inerte como silicato magnésico. Esto explica el hecho que casi todas las medidas satisfactorias de presión osmótica hayan sido efectuadas con azúcares, cuyas moléculas son relativamente grandes.

El tamaño de poro por tanto interviene en la propiedad de semipermeabilidad, pero como factor secundario; los poros de la membrana deben ser suficientemente pequeños para quedar bajo la influencia completa de las fuerzas superficiales que son las responsables de la adsorción.

Una combinación de las teorías de la adsorción superficial y del cedazo molecular puede explicar satisfactoriamente la propiedad de semipermeabilidad en mucha de las membranas analizadas. Esta combinación de las teorías explicaría la semipermeabilidad de la siguiente manera. Si las partículas que constituyen la membrana se recubren con moléculas adsorbidas del disolvente se establecerá, a pesar de la red de pequeños cristales, una continuidad que permitirá el movimiento fácil del disolvente a través de la membrana.

Por otro lado las moléculas de soluto son incapaces de penetrar en la red compleja, especialmente porque la adsorción preferente de las moléculas de disolvente sobre la superficie hacen que los poros sean efectivamente de diámetro menor.

1.2.3 TEORÍA DE LA PRESIÓN DE VAPOR.

Como paso previo y a modo de introducción describiremos un fenómeno físico que servirá de punto de partida al planteamiento de esta teoría que trata de explicar la causa de la selectividad de las membranas.

La superficie de una disolución formada por un soluto completamente no volátil en un disolvente volátil, es una membrana semipermeable perfecta, ya que permite el paso libre de moléculas de disolvente del líquido al vapor, pero no las de soluto.

Sobre la base de este fenómeno se ha propuesto una teoría de la ósmosis que implica la idea del paso de vapor a través de capilares. Se considera que el material semipermeable está formado por un gran número de finos capilares no humedecidos por el disolvente líquido o la disolución, pero a cuyo través pueden pasar moléculas de vapor. Cuando a un lado se coloca disolvente puro y disolución en el otro, tiene lugar una destilación a través de los capilares desde la región de mayor presión de vapor (disolvente) a la de menor (disolución), resultando de aquí la ósmosis.


55

II-2. MECANISMOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

2.1. LEY DE LA PRESIÓN OSMÓTICA PARA DISOLUCIONES IDEALES.

Vamos a demostrar a continuación cómo las presiones osmóticas verifican una ley similar a la de los gases ideales y que se cumplirá exclusivamente para disoluciones diluidas ideales.

Dividiremos el desarrollo en tres etapas:

§ Etapa 1:Efecto de la presión osmótica sobre el potencial químico de la disolución.

Como ya se ha demostrado en el capítulo 1 de Fundamentos Termodinámicos, la variación del potencial químico de un componente genérico i en una disolución con la presión, es igual al volumen molar parcial de dicho componente en la disolución.

inT

i Vp

=∂∂

,

µ Ec. 146

Así el incremento de potencial químico de un disolvente A en una disolución provocado por la aplicación de una sobrepresión igual a la presión osmótica π, se obtendrá por integración de la ecuación anterior.

A

p

pAA VdpV ⋅=⋅=∆ ∫

+

πµπ0

0

Ec. 147

La aproximación de que el volumen molar parcial del disolvente es constante con la presión es bastante buena, debido a que los líquidos son prácticamente incompresibles.

§ Etapa 2: Efecto de la adición de soluto sobre el potencial químico de la disolución.

El descenso del potencial químico del disolvente por la adición de soluto puede ser calculado a partir del incremento de entropía que acompaña al proceso de mezcla.

A partir de consideraciones estadísticas ya descritas en el capítulo 1 de Fundamentos Termodinámicos llegamos a una expresión de la forma:

+⋅+

+⋅⋅=∆

B

BAB

A

BAA n

nnn

nnn

nRS lnln Ec. 148


56

donde nA es el número de moles de disolvente y nB es el de soluto.

La variación de entropía molar parcial del disolvente se obtiene derivando la ecuación anterior por el número de moles de disolvente manteniendo constante el número de moles de soluto.

BA

A

nAA nn

nR

nS

SB

+⋅−=

∂∆∂

=∆ ln Ec. 149

La variación del potencial químico del disolvente en el proceso de mezcla se puede escribir como:

AAA STH ∆⋅−∆=∆µ Ec. 150

Consideramos la hipótesis simplificatoria de que la variación de entalpía molar parcial es nula. Esto implica que no se producirán ni cambios de temperatura ni de volumen en la disolución durante el proceso de mezcla.

Por lo tanto la variación del potencial químico será:

BA

AA nn

nTR

+⋅⋅=∆ lnµ Ec. 151

§ Etapa 3: Obtención de la ley de las presiones osmóticas.

En el equilibrio osmótico que se establece entre la disolución y el disolvente puro a través de la membrana semipermeable, el incremento del potencial químico del disolvente en la disolución debido a la sobrepresión ejercida sobre la disolución es contrarrestado por el descenso del potencial químico del disolvente en la disolución por la adición del soluto al disolvente para la formación de la disolución inicial de partida.

∆µA (debido a la presión) + ∆µA (debido al soluto) = 0

Sustituyendo las ecuaciones que obtuvimos en las etapas 1 y 2, en la expresión anterior, obtenemos:

0ln =+

⋅⋅+⋅BA

AA n

nTRVπ Ec. 152

Si la disolución está muy diluida, entonces podemos hacer la siguiente aproximación:


57

A

B

BA

A

nn

nnn

−≈+

ln Ec. 153

La ecuación de balance de potencial químico finalmente queda:

TRnVnn

TRV BA

BA ⋅⋅=⋅⇒⋅⋅=⋅ ππ Ec. 154

Esta ecuación es conocida como la ecuación de van’t Hoff.

La determinación termodinámica de esta ley, nos permite ver lo limitado de su aplicación, por las numerosas simplificaciones que hemos tenido que efectuar. Esta ley sólo es aplicable, estrictamente hablando, a disoluciones diluidas ideales.

La ecuación de van’t Hoff llega a dos conclusiones fundamentales:

o La presión osmótica correspondiente a una disolución dada es directamente proporcional a la concentración de soluto en la disolución.

o La presión osmótica de una disolución es directamente proporcional a la temperatura absoluta.

La ecuación de van’t Hoff implica que la presión osmótica de una disolución diluida es igual a la presión que ejercería el mismo número de moléculas de soluto si se encontrasen en estado gaseoso ocupando un volumen igual al de la disolución.


58

2.2. EL COEFICIENTE OSMÓTICO

La ecuación de van’t Hoff, que nos permite relacionar la presión osmótica de una disolución con la concentración de soluto, sólo es aplicable al caso de disoluciones diluidas ideales.

Para poder utilizar esta ecuación en todo tipo de disoluciones, se introduce un factor de corrección empírico, denominado coeficiente osmótico, y que designamos por la letra φ.

La ecuación de van’t Hoff modificada resulta entonces

B

BA

mTRnTRV

⋅⋅⋅=⋅⋅⋅=⋅

φπφπ

Ec. 155

Existen tablas de coeficientes osmóticos para distintos tipos de solutos y disolventes.

Puesto que la concentración molar, en moles por litro es virtualmente la molalidad, moles de soluto por kilogramo de disolvente, para el caso de disoluciones acuosas no muy concentradas, φ es el llamado coeficiente osmótico molal.

Hay que indicar que el uso del coeficiente osmótico introduce las correcciones necesarias para tener en cuenta las interacciones entre las moléculas de soluto, y las interacciones entre las moléculas de soluto con las de disolvente, en el caso de un único tipo de soluto disuelto, en un disolvente específico.

Así la mayoría de los coeficientes osmóticos, están referidos a disoluciones acuosas.

Por lo tanto, es importante no olvidar que cuando más de un tipo de soluto está presente en una disolución, las interacciones que podrían ocurrir entre las moléculas de las distintas especies de soluto, no son tenidas en cuenta por los coeficientes osmóticos tabulados.

Así predicciones de la presión osmótica de disoluciones que tienen disueltos varios tipos de soluto, basadas en el coeficiente osmótico, son sólo aproximadas. Esto es especialmente aplicable a disoluciones que contienen sales y proteínas juntas.

Existen tres tipos principales de solutos en las disoluciones intracelulares que tienen sus correspondientes coeficientes osmóticos asociados:

o No electrolitos, como la glucosa. En concentraciones fisiológicas, es decir, en concentraciones usuales en las células, el coeficiente osmótico excede ligeramente la unidad.


59

o Electrolitos, como el ClNa. En concentraciones fisiológicas, el valor del coeficiente osmótico está ligeramente por debajo de la unidad. Así por ejemplo, para una concentración 0.15 M de ClNa, el valor de φ es igual a 0.93.

o Macromoléculas, como las proteínas. El valor de φ para este tipo de solutos excede con mucho la unidad. Así para la hemoglobina en una concentración de 33.5 gramos / 100 mililitros, φ vale 2.57.


60

2.3. TEORÍAS SOBRE EL ORIGEN DE LAS PRESIONES OSMÓTICAS

Se han formulado varias teorías que tratan de predecir el valor de la presión osmótica. Las más importantes son tres:

2.3.1 TEORÍA DEL BOMBARDEO DE LAS MOLÉCULAS DE SOLUTO.

La interpretación que hicimos de la ecuación de van’t Hoff, asumía que la presión osmótica de una disolución diluida era igual a la presión que ejercería el mismo número de moléculas de soluto, si se encontrasen en estado gaseoso, ocupando un volumen igual al de la disolución.

Esta semejanza entre el comportamiento de los gases y de las disoluciones nos lleva a pensar que la presión gaseosa y la presión osmótica tienen el mismo origen fundamental. En el primer caso se debe a los impactos de las moléculas del gas sobre las paredes de la vasija en que están contenidas, y en el último a los impactos de las moléculas de la sustancia disuelta sobre la membrana semipermeable.

Mediante un experimento que a continuación vamos a describir se mostró en el año 1894, esta analogía entre gases y disoluciones, que apoyaba la idea del bombardeo de moléculas de soluto como origen de la presión osmótica.

El experimento se basa en la capacidad del paladio caliente (aproximadamente a 300ºC ) de dejar pasar a su través hidrógeno con facilidad, pero no nitrógeno; así el paladio actúa como membrana semipermeable para una disolución de nitrógeno y hidrógeno.

El dispositivo del experimento consta de una ampolla de paladio que contiene en su interior una mezcla de hidrógeno y nitrógeno. Las presiones parciales de los gases en la mezcla son conocidas.

La ampolla se coloca dentro de una vasija, a cuyo través se hace pasar una corriente de hidrógeno a presión atmosférica.


61

Al calentar la ampolla pasará hidrógeno a su interior y cuando se alcanza el equilibrio, la presión en el interior de la ampolla será superior a la atmosférica en una cantidad igual a la presión parcial del nitrógeno.

Generalizando los resultados de este experimento para el caso de disoluciones, haciendo uso de la analogía entre disoluciones y mezclas de gases, podemos ver cómo la disolución contenida en una vasija semipermeable, rodeada por disolvente puro, estará en equilibrio con él, cuando la sobrepresión en el interior de la vasija sea igual a la presión osmótica, que podemos identificar con la presión parcial de la sustancia para la cual la membrana no es permeable, o sea el soluto.

El caso, es sin embargo que en una mezcla de gases se obedece la ley de Dalton de las presiones parciales, por lo menos aproximadamente, así que la presión de exceso debe de ser igual a la del nitrógeno; pero no se deduce necesariamente que se aplique el mismo argumento a la presión osmótica, excepto quizás a dilución infinita.

No hay duda de la semejanza entre la ecuación de van’t Hoff para una disolución diluida ideal, y la ecuación característica para un gas ideal, pero esta identidad no suministra información en lo que concierne al mecanismo de la presión osmótica.

La conclusión alcanzada es que únicamente a dilución infinita puede la presión osmótica ser igual a la presión de bombardeo de las moléculas de soluto.


62

2.3.2 TEORÍA DEL BOMBARDEO DE LAS MOLÉCULAS DE DISOLVENTE.

Consideramos el experimento descrito acerca del nitrógeno y hidrógeno: se observa que el hidrógeno entra en la ampolla de paladio hasta que se igualan las presiones interior y exterior. Cuando se pregunta por qué entra el hidrógeno en la ampolla, la respuesta es que se debe a que tiene una presión parcial menor en el interior que en el exterior y no meramente porque el nitrógeno de la ampolla esté ejerciendo una presión. Exactamente de la misma forma se puede decir que las moléculas del disolvente entran en la disolución a través de una membrana semipermeable debido a que su presión parcial, o su equivalente, es menor en la disolución que en el disolvente puro.

Cuando se planteo la teoría del bombardeo de las moléculas de soluto se supuso que los impactos de las moléculas de disolvente se podían despreciar, por ser iguales a ambos lados de la membrana, pero esto no es cierto en modo alguno.

Se puede ver fácilmente que habrá más moléculas de disolvente por unidad de volumen o por unidad de superficie de membrana en el disolvente que en la disolución; por consiguiente, los impactos sobre ambos lados de la membrana no serán los mismos.

En efecto, parece más lógico considerar que la presión osmótica se debe a la diferencia entre las presiones de bombardeo de las moléculas del disolvente en el disolvente puro y en la disolución, más bien que al bombardeo por las moléculas de soluto.

De esta manera se atribuyó una presión térmica a las moléculas del disolvente, y sería igual a la presión que ejercerían las moléculas de disolvente por bombardeo en el interior del líquido.

Se supone que la presión térmica tiene un valor menor en la disolución que en el disolvente, debido a un menor número de moléculas que hay en un volumen dado. Así cuando dos líquidos están separados por una membrana semipermeable, la diferencia en presión térmica producirá una corriente de disolvente desde la región de presión mayor a la de menor, es decir, tiene lugar la ósmosis.

2.3.3 TEORÍA DE LA PRESIÓN DE VAPOR.

Como se ha visto, con relación al estudio de las propiedades coligativas en el capítulo 1 de Fundamentos Termodinámicos, cuando aplicamos una presión exterior, se puede aumentar la presión de un líquido; por consiguiente aumentando la presión sobre una disolución se puede elevar su presión de vapor hasta que sea igual a la del disolvente puro.


63

La disolución estará entonces en equilibrio con el disolvente y será por tanto, termodinámicamente necesario que la presión que se ejerza sobre la disolución sea igual a la presión osmótica.

Análogamente la disminución de la presión sobre el disolvente, reducirá su presión de vapor, siendo la presión osmótica igual a la cantidad en que debe disminuir la presión sobre el disolvente para que éste, esté en equilibrio de vapor con la disolución.

Los tres puntos de vista principales relativos al origen de la presión osmótica, bombardeo de moléculas de soluto, bombardeo de moléculas de disolvente, y presión de vapor, pueden no ser independientes, pues es probable que sea el movimiento de las moléculas de soluto la causa de que la presión térmica y la presión de vapor sean menores en la disolución que en el disolvente.


64

2.4. MECANISMO DE EQUILIBRIO OSMÓTICO. EL POTENCIAL QUÍMICO.

Por alguna razón relacionada con la presencia de las moléculas de soluto, el potencial químico de una molécula de disolvente es menor en una disolución que en el líquido puro; es decir la transferencia de disolvente desde el disolvente puro a la disolución produce una disminución del potencial químico. Por tanto cuando se junten el disolvente y la disolución, tenderá siempre a producirse una transferencia de esta clase, y el proceso continuará hasta que se alcance el equilibrio.

Si se colocan dos líquidos, uno junto a otro en un espacio cerrado, conectados a través de una membrana semipermeable, la diferencia de potencial químico se manifestará por una destilación del disolvente a la disolución. Si se utilizan dos disoluciones de concentración diferente el proceso continuará hasta que ambas tengan el mismo potencial químico. Análogamente cuando el disolvente y la disolución están separados por una membrana semipermeable pasará disolvente a la disolución hasta que se alcance un equilibrio por la formación de una sobrepresión.

Se deduce por tanto que el establecimiento de una presión osmótica es el resultado inevitable de la introducción de una membrana semipermeable entre un disolvente y una disolución como consecuencia de la diferencia de los potenciales químicos entre las moléculas del disolvente.

La presión de vapor de la disolución, una vez alcanzado el equilibrio bajo la influencia de la presión osmótica, deberá ser entonces igual, por exigencia termodinámica, al valor normal del disolvente puro.


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II-3. LA PRESIÓN OSMÓTICA Y LA PRESIÓN DE VAPOR

De todo lo dicho anteriormente resulta evidente que debe haber una relación entre la presión osmótica de una disolución y el descenso de la presión de vapor.

Supongamos un disolvente y una disolución a temperatura constante, que se encuentran separados por una membrana semipermeable en un dispositivo como el indicado en el esquema adjunto.

El dispositivo consta de dos émbolos con los que podemos controlar la presión ejercida tanto sobre la disolución como sobre el disolvente puro.

Sean F1 y F2 las fuerzas ejercidas sobre los émbolos del disolvente y de la disolución respectivamente, para que se dé el equilibrio termodinámico a través de la membrana semipermeable; en estas condiciones no se observará flujo del disolvente hacia la disolución; hay equilibrio osmótico.

Como resultado de las fuerzas ejercidas, el disolvente puro y la disolución estarán sometidos a unas presiones P1 y P2 respectivamente. Como por definición la presión osmótica es la sobrepresión ejercida sobre el lado de la disolución para que exista equilibrio termodinámico, entonces P2−P1 es la presión osmótica π del sistema.

Estas presiones no son las presiones de vapor, es decir, presiones que verifican el equilibrio entre la fase líquida y la fase vapor; sólo son las presiones justamente necesarias para verificar el equilibrio entre el disolvente puro y la disolución a través de la membrana semipermeable.

Por lo tanto se cumplirán las siguientes relaciones:


66

),(),(

),(),(

),(),(),(

2,2,

1*

,1*

,

,1,2,1*

,2

1

PTPT

PTPT

dpVPTPTPT

gAlA

gAlA

P

P lAlAlAlA

µµ

µµ

µµµ

≠

≠

⋅+== ∫ Ec. 156

donde µ*A.l es el potencial químico del disolvente puro en estado líquido, a

una temperatura y presión dadas; µ*A.g es el potencial químico del disolvente

puro en estado vapor; µA,l es el potencial químico del disolvente en la disolución líquida; µA,g es el potencial químico de la disolución gaseosa y VA,l es el volumen molar parcial del disolvente en estado líquido.

Las presiones de vapor del disolvente puro y de la disolución cumplirán las siguientes relaciones:

),(),(

),(),(

,,

**,

**,

vgAvlA

vgAvlA

PTPT

PTPT

µµ

µµ

=

= Ec. 157

donde P*v y Pv son las presiones de vapor del disolvente puro y de la

disolución respectivamente a una temperatura determinada.

La variación del potencial químico de una sustancia i con la presión, a temperatura constante es igual al volumen molar parcial de la sustancia.

iT

i Vp

=∂∂µ

Ec. 158

Puesto que para los líquidos, el valor del volumen molar parcial es relativamente pequeño podemos despreciar el efecto de la presión en el potencial químico, cuando las variaciones de presión son moderadas.

Si aplicamos la simplificación anterior, podemos escribir las siguientes aproximaciones:

),(),(),(

),(),(),(

,,1,

**,

**,1

*,

vgAvlAlA

vgAvlAlA

PTPTPT

PTPTPT

µµµ

µµµ

=≈

=≈ Ec. 159

Suponiendo comportamiento de gas ideal, los potenciales químicos de la fase vapor podemos escribirlos como:

00

,

0

*0**

,

ln)(),(

ln)(),(

PP

TRTPT

PP

TRTPT

vAvgA

vAvgA

⋅⋅+=

⋅⋅+=

µµ

µµ Ec. 160


67

Aplicando a la igualdad de potencial químico entre el disolvente puro y la disolución en equilibrio osmótico, las simplificaciones descritas hasta ahora, tenemos:

∫

∫

⋅+⋅⋅+=⋅⋅+

⋅+==

2

1

2

1

,00

0

*0

,1,2,1*

,

ln)(ln)(

),(),(),(

P

P lAv

Av

A

P

P lAlAlAlA

dpVPP

TRTPP

TRT

dpVPTPTPT

µµ

µµµ Ec. 161

Operando resulta:

∫ ⋅=⋅⋅2

1,

*

lnP

P lAv

v dpVPP

TR Ec. 162

Si aplicamos la propiedad de que los líquidos son prácticamente incompresibles, entonces podemos considerar que el volumen molar parcial del disolvente es constante en el intervalo de presiones de P1 a P2.

Por lo tanto podemos escribir:

v

v

lA

lAlAv

v

PP

VTR

VPPVPP

TR

*

,

,12,

*

ln

)(ln

⋅⋅

=

⋅=−⋅=⋅⋅

π

π

Ec. 163

donde como ya hemos dicho antes P*v es la presión de vapor del disolvente

puro y Pv es la presión de vapor de la disolución, ambas a la temperatura del sistema.


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II-4. UNIDADES DE MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA EN SISTEMAS BIOLÓGICOS

Las unidades naturales de la presión osmótica son los milímetros de mercurio o bien las atmósferas.

Sin embargo la presión osmótica para una solución dada, tal como la hemos definido varía con la temperatura.

Teniendo en cuenta que los estados de equilibrio entre dos soluciones a través de la membrana semipermeable, es siempre a una única temperatura, es muy conveniente usar unas unidades de la presión osmótica que sean relativamente independientes de la temperatura.

Dicha unidad es el osmol, o como más frecuentemente se usa el miliosmol.

Desgraciadamente, sin embargo hay cierta confusión en el uso del término miliosmol. Éste ha sido con frecuencia definido simplemente en términos de concentraciones de solutos presentes, bajo la suposición de que la concentración es proporcional a la presión osmótica, como muestra la ecuación de van’t Hoff para disoluciones diluidas ideales.

Sin embargo, este uso del concepto miliosmol sólo es válido para el caso de disoluciones diluidas ideales, es decir, sólo se podría emplear como unidad de la presión osmótica cuando la disolución en contacto con el disolvente puro, a través de la membrana semipermeable, fuera una disolución diluida ideal.

Para que el término miliosmol pueda ser empleado correctamente como medida de la presión osmótica, debe incluir el coeficiente osmótico, además de la concentración de soluto.

Así los miliosmoles serán obtenidos como el producto de la concentración milimolal, con el coeficiente osmótico molal.

TRmosmolesosmóticaesión B ⋅

=⋅=π

φ)(Pr Ec. 164

Vemos como el efecto de la temperatura sobre la presión osmótica se contrarresta con la temperatura que aparece en el denominador, de forma que la expresión completa no depende tanto con la temperatura.

Con esta definición, un osmol es la presión osmótica de una disolución ideal con una concentración de soluto 1M.

Esta unidad expresa la presión osmótica de una disolución de manera bastante buena, pero no de forma exacta, por dos motivos:

o El coeficiente osmótico varía muy ligeramente con la temperatura.


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o En soluciones multicomponentes las interacciones entre los distintos tipos de soluto, no se tenían en cuenta en el coeficiente osmótico y por tanto provocan una pérdida de exactitud en la relación presión osmótica, concentración de soluto.

CAPÍTULO 3 INTRODUCCIÓN A LA CRIPOPRESERVACIÓN

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71

III. CAPÍTULO 3

INTRODUCCIÓN A LA CRIOPRESERVACIÓN

III-1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS

Los primeros estudios de investigación sobre la biología a bajas temperaturas fueron llevados a cabo por Sir Robert Boyle en 1693. Sin embargo no se produjeron avances significativos hacia el desarrollo de protocolos de criopreservación, que tuviesen moderado éxito, hasta mediados del siglo veinte. Fue entonces cuando se produjeron dos importantes acontecimientos:

Ø La aplicación en 1949 del glicerol, una sustancia química cuyas propiedades anticongelantes eran de sobra conocidas en automovilismo, al campo de la criopreservación de muestras biológicas. Se vio que al añadir esta sustancia a una muestra sometida a un proceso de criopreservación, mejoraba espectacularmente la tasa de supervivencia. En general las sustancias químicas capaces de mejorar la supervivencia de las células al proceso de criopreservación se denominan agentes crioprotectores o CPA (cryoprotective agent).

Ø La aplicación en 1963 de modelos matemáticos, para predecir el comportamiento de las células durante el proceso de criopreservación. Peter Mazur fue el primero en desarrollar modelos de este tipo.


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III-2. NECESIDAD DE MODELOS MATEMÁTICOS

Los procesos de criopreservación provocan cambios significativos en las condiciones térmicas, químicas y físicas de los tejidos, con el consiguiente riesgo de daños biológicos irreversibles.

Los cambios térmicos son debidos a la transferencia de calor impuesta por las condiciones de contorno del método de enfriamiento y calentamiento, pero también pueden ser debidos a el calor latente de fusión del hielo formado en los tejidos.

Las condiciones químicas del medio celular pueden ser modificadas antes del proceso de congelación por la adición de los agentes crioprotectores y durante el proceso de enfriamiento por la formación de hielo en el medio extracelular. El crecimiento de los cristales de hielo retira agua líquida de la solución extracelular, que aun permanece en estado líquido aumentando de esta manera la concentración de solutos en el medio.

La presencia de hielo extracelular además modifica las condiciones físicas en el tejido, provocando alteraciones en su estructura. Este hielo reduce el espacio disponible que tienen las células en el tejido, originando fuerzas mecánicas de compresión.

Para minimizar los daños en los tejidos originados por los procesos de criopreservación, los procedimientos para modificar las condiciones químicas y térmicas del sistema deben ser optimizados.

Las manipulaciones químicas están normalmente limitadas a la introducción de uno o varios agentes crioprotectores en el tejido antes de comenzar a enfriar la muestra, y a su eliminación tras calentar un tejido hasta la temperatura ambiente.

El tipo de agente crioprotector a emplear y la manera en la que va a ser introducido en el tejido, deben minimizar los daños que puedan causar al tejido.

Los protocolos para añadir y posteriormente eliminar los agentes crioprotectores, constan básicamente de una o varias etapas, donde sumergimos el tejido en un baño de crioprotector, de una composición determinada, durante un determinado periodo de tiempo, a una determinada temperatura. Vemos que para cada etapa del protocolo es necesario especificar tres parámetros:

Ø Composición del baño. Ø Temperatura del baño. Ø Duración del baño.

Los métodos para manipular las condiciones térmicas se describen en términos de perfiles de temperatura frente al tiempo, T(t), que van a ser impuestos en los contornos del tejido. El control que podamos tener de las condiciones térmicas dentro del tejido son muy limitadas.


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Los perfiles de temperatura pueden ser lineales o no lineales. Los protocolos de enfriamiento que se emplean hoy día, consisten en varias etapas de enfriamiento lineal, cada una de una duración determinada. Por lo tanto para tener definida cada etapa del protocolo de enfriamiento necesitamos especificar dos parámetros:

Ø La velocidad de enfriamiento. Ø La duración de la etapa.

Consideremos el desarrollo de un protocolo de criopreservación. Si tenemos n etapas en el protocolo de manipulación química y m etapas en el protocolo de manipulación térmica, habrá p = 3·n + 2·m parámetros que nos permitirán optimizar el protocolo de criopreservación.

Considerando que incluso en el caso más simple, de una única etapa para añadir crioprotectores, una única etapa para eliminarlos (n=2), una única etapa de enfriamiento y una única etapa de calentamiento (m=2), el número de experimentos requeridos para un optimización del protocolo resultan prohibitivos.

Por lo tanto, la obtención de protocolos de criopreservacvión que den buenos resultados, van a requerir el uso de modelos teóricos, y métodos de optimización asistidos por ordenador.

En este Proyecto Fin de Carrera, nos vamos a ceñir a modelos teóricos aplicables a células aisladas. El estudio del comportamiento de células aisladas durante el enfriamiento y posterior calentamiento, proporciona un punto de partida para el análisis de los daños en tejidos durante la criopreservación.

Si bien los daños originados en los tejidos durante la criopreservación, pueden tener múltiples causas, la minimización del daño a nivel de células debe ser la principal meta en el diseño de protocolos de enfriamiento y calentamiento, así como de los protocolos para añadir y eliminar los agentes crioprotectores.


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III-3. OBSERVACIONES EXPERIMENTALES

La repuesta de las células a los procesos de enfriamiento, pueden ser observados mediante el uso de criomicroscopios. Estos consisten en un microscopio convencional al que se le ha acoplado un equipo de enfriamiento criogénico. Además disponen de un sistema de control automático para regular la temperatura de la muestra e imponer así el perfil de temperatura deseado.

La respuesta de las células al enfriamiento, depende del método de enfriamiento. En particular la velocidad de enfriamiento es el parámetro crítico que determina los resultados del protocolo de criopreservación.

A continuación vamos a describir los procesos básicos que han sido observados, cuando se induce hielo en el medio extracelular, en función del perfil de enfriamiento aplicado.

El comienzo del proceso de formación de hielo es de naturaleza aleatoria. Así aunque la temperatura de un sistema sea inferior a la de cambio de fase, no tiene por qué formarse hielo. Cuanto mayor sea la diferencia entre la temperatura a la que comienza a formarse hielo y la temperatura de cambio de fase, mayor será la velocidad de crecimiento de los cristales de hielo. En el peor de los casos, puede ocurrir que la temperatura a la que comienza a formarse hielo sea tan baja, que la velocidad de crecimiento de los cristales resulta explosiva. En estas condiciones los cristales de hielo actúan como lanzas que atraviesan las células, destruyéndolas por completo.

Para evitar este problema, se induce la formación de hielo extracelular, para garantizar que cuando la temperatura del sistema sea la de cambio de fase, tengamos hielo. Existen numerosas maneras de inducir la formación de hielo. En el caso de muestras de células aisladas se toca la muestra con una aguja fría, a una temperatura inferior a la de cambio de fase.

La formación de hielo extracelular, origina una diferencia de potencial químico entre la disolución intracelular y extracelular, que rompe el equilibrio isotónico natural de la célula. Por equilibrio isotónico entendemos el equilibrio de potencial químico que se establece entre la célula y el entorno que la rodea, en el órgano o tejido del que forma parte, dentro de un organismo vivo.

La formación de hielo extracelular rompe el equilibrio isotónico por una única razón: el agua que forma parte del hielo no contiene los solutos que tenía disuelta cuando formaba parte de la disolución acuosa del medio extracelular. Por lo tanto, cuando comienza a formarse hielo fuera de las células, simultáneamente se está produciendo un aumento de la concentración de los solutos disueltos en el medio extracelular.

Como se describió anteriormente en el CAPÍTULO 1 de FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS, un aumento de la concentración de los solutos provoca una disminución del potencial químico del disolvente. Mientras tanto, en el interior de las células no se ha producido cambio alguno, permaneciendo el potencial químico inalterado, frente al del disolvente del medio extracelular, que ha


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disminuido. Debido a la naturaleza semipermeable de la membrana celular, este desequilibrio del potencial químico origina una sobrepresión del lado de la disolución que tiene una concentración de solutos menor, que desencadena un flujo de disolvente puro desde la región menos concentrada hacia la región de mayor concentración. Esta sobrepresión como se vio en el CAPÍTULO 2 de ÓSMOSIS se puede interpretar como la diferencia de presiones osmóticas que tienen las dos disoluciones.

Vemos por tanto que la formación de hielo extracelular, tiene como consecuencia la evacuación de agua desde el medio intracelular hacia el medio extracelular, en un proceso que llamaremos Deshidratación Celular.

Paradójicamente la formación de hielo extracelular, en principio podría evitar que se formase hielo dentro de la célula, ya que al aumentar la concentración de solutos en la región intracelular, la temperatura de cambio de fase disminuye, como se vio en el apartado de Propiedades Coligativas del Capítulo 1, al explicar el descenso crioscópico. Por lo tanto podemos tener una solución intracelular líquida a temperaturas muy inferiores a los cero grados centígrados, que es aproximadamente la temperatura de cambio de fase del medio intracelular original, cuando existía equilibrio isotónico natural.

En el párrafo anterior hemos empleado la expresión”podría evitar que se formase hielo” . la razón está en que hay dos factores que determinan la formación de hielo dentro de las células:

Ø Factor termodinámico: es el descenso crioscópico descrito anteriormente, que permite tener una disolución acuosa en estado líquido a temperaturas inferiores a los cero grados centígrados.

Ø Factor cinético: la membrana celular tiene una permeabilidad finita al paso del agua, que determina la velocidad a la que puede ser evacuada y el tiempo característico del la deshidratación celular.

Así si la velocidad de enfriamiento es lo suficientemente pequeña como para permitir, que la solución intracelular como para permitir, que la solución intracelular esté en equilibrio con el medio exterior, gracias al mecanismo de la ósmosis, la célula se deshidratará conforme disminuimos la temperatura del sistema. Esto se traduce en una reducción apreciable del volumen celular.

Podemos apreciarlo en el par de fotografías que se muestran a continuación, donde hepatocitos (células del hígado) de ratón, se han enfriado a –10ºC/min.


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Esta misma fotografía pero retocada para resaltar el contorno de las células se muestra a continuación.

En la fotografía A se muestran las células antes del proceso de enfriamiento, mientras que en la B, ya ha concluido. Vemos como el tamaño de las células en la fotografía B es significativamente menor que el de las células de la fotografía A.

Por otra parte si la velocidad de enfriamiento es demasiado rápida, podemos alcanzar muy bajas temperaturas sin que la concentración de solutos dentro de la célula se haya modificado significativamente.

La velocidad con la que la célula es capaz de evacuar agua es muy pequeña comparada con la velocidad con la que disminuye la temperatura. Al microscopio las células enfriadas de esta manera, no han modificado su tamaño, al no haberse producido una deshidratación apreciable, siendo la probabilidad de formar hielo muy alta.

En los criomicroscopios de luz visible, la formación de hielo intracelular aparece como un oscurecimiento del interior de las células, debido a la dispersión de la luz llevada a cabo por los cristales de hielo.


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Este oscurecimiento podemos apreciarlo claramente en el par de fotografías que se muestran a continuación, donde hepatocitos de ratón se han enfriado a –400ºC/min .

Esta misma fotografía pero retocada digitalmente para apreciar mejor los contornos de las células se muestra seguidamente.

Se observa como las células no han modificado su tamaño, siendo el único cambio apreciable el oscurecimiento anteriormente descrito, que delata la presencia de hielo dentro de la célula.

Como resumen el factor cinético establece una relación entre la velocidad de enfriamiento y la formación de hielo. Con bajas velocidades de enfriamiento, la probabilidad de formar hielo es muy baja, incluso a temperaturas muy inferiores a los cero grados centígrados, mientras que a altas velocidades de enfriamiento, la probabilidad de formar hielo es muy alta, incluso a temperaturas próximas a los cero grados centígrados.


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III-4. MUERTE CELULAR. HIPÓTESIS DE LOS DOS FACTORES

Observaciones experimentales muestran que cuando enfriamos muestras a altas velocidades, la supervivencia de las células al proceso de criopreservación disminuye conforme aumentamos la velocidad de enfriamiento.

Se sabe que las velocidades de enfriamiento para las cuales el 50% de las células sobreviven, coincide aproximadamente con las velocidades para las cuales el 50% de las células sufren la formación de hielo intracelular. Esta evidencia empírica establece una relación directa entre la formación de hielo dentro de las células y la supervivencia de las células al proceso de criopreservación.

Otras observaciones, muestran que cuando enfriamos muestras a muy bajas velocidades, la supervivencia de las células al proceso de criopreservación disminuye conforme disminuimos la velocidad de enfriamiento.

Basándonos en las evidencias experimentales descritas anteriormente, son dos las maneras en las que la velocidad de enfriamiento afecta a la tasa de supervivencia celular. Para tratar de explicar este doble comportamiento de la supervivencia frente a las velocidades de enfriamiento, se ha propuesto una teoría denominada Hipótesis de los Dos Factores. En ella se proponen dos mecanismos distintos como causa de los daños en las células, durante el protocolo de criopreservación.

Uno de los mecanismos es la formación de hielo intracelular. Es dominante a altas velocidades de enfriamiento. La manera en la que este hielo daña a la célula, no es del todo conocido, pero se piensa que es debido a una disfunción de origen mecánico de las propiedades de la membrana celular y de otras estructuras celulares suspendidas en su interior, como pueden ser orgánulos celulares o grandes macromoléculas de proteínas. Lo que si se sabe es que cuanto mayor sea la cantidad de hielo formado dentro de la célula, menor es la esperanza de que la célula sobreviva. Debido a la relación vista anteriormente entre la velocidad de enfriamiento y la formación de hielo dentro de la célula, podemos afirmar que cuanto mayor sea la velocidad de enfriamiento, menor es la esperanza de que las células sobrevivan.

Podríamos pensar, llegados a este punto que un buen protocolo de criopreservación sería aquel en el que la velocidad de enfriamiento fuera tan lenta que apenas formásemos hielo. Sin embargo existe otro mecanismo que provoca daños celulares y que precisamente actúa cuando las velocidades de enfriamiento son muy reducidas, lo que hace inviable este protocolo que acabamos de proponer.

Este mecanismo, activo a bajas velocidades de enfriamiento, está relacionado con la deformación mecánica de la célula, debida a la reducción de tamaño originada por el proceso de deshidratación tan intenso, y a la prolongada exposición de la célula a elevadas concentraciones de electrolitos y


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agentes crioprotectores. Este mecanismo se conoce como “Efecto de Solución”.

Como se muestra en la figura adjunta, que tiene un valor exclusivamente cualitativo, existe una velocidad de enfriamiento óptima, para la cual los dos mecanismos de daño celular se compensan, alcanzándose un máximo en la probabilidad de supervivencia de las células a la criopreservación.

El valor óptimo de otros posibles parámetros, como puede ser la duración de una etapa de enfriamiento, en un protocolo con varias etapas a distintas velocidades de enfriamiento, pueden ser también obtenidos en términos de alcanzar un máximo en la supervivencia, compensando el efecto de la formación de hielo, con el efecto de solución.


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A pesar de que se ha comprobado la validez universal de la hipótesis de los Dos Factores en todas las células estudiadas, el protocolo de criopreservación que optimiza la supervivencia no es universal, es decir, cada tipo de célula requiere su propio protocolo optimizado.

Esto se debe a que las propiedades biofísicas de las células, como pueden ser la permeabilidad de la membrana, o la actividad catalítica que se tiene dentro de la célula para iniciar la formación de hielo intracelular, afectan al proceso de deshidratación y a la probabilidad de formación de hielo dentro de la célula.

En este proyecto buscamos obtener unas ecuaciones que se puedan aplicar a cualquier tipo de célula y nos permita obtener un protocolo de criopreservación personalizado.

CAPÍTULO 4 LA DESHIDRATACIÓN CELULAR

81


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IV. CAPÍTULO 4

LA DESHIDRATACIÓN CELULAR

IV-1. INTRODUCCIÓN

En este capítulo vamos a estudiar cómo es el proceso de deshidratación celular mediante un modelo matemático ideal, conforme vamos reduciendo la temperatura del sistema por debajo de los cero grados centígrados.

Comenzaremos indicando en qué casos es posible aplicarlo. A continuación mostraremos sus limitaciones, así como las variables y parámetros más significativos, destacando entre todos ellos la permeabilidad de la membrana celular.

El desarrollo del modelo teórico ideal irá acompañado por su resolución numérica en ordenador, a través del software matemático MATLAB, mostrando los resultados gráficamente.

Con el objetivo de cuantificar el error que tiene el modelo ideal, plantearemos un modelo no ideal.


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IV-2. APLICABILIDAD DEL MODELO

El modelo de transporte de agua a través de la membrana celular, me va a permitir analizar el proceso de deshidratación celular durante el protocolo de enfriamiento.

Este modelo es aplicable en dos casos, células aisladas y tejidos con estructura celular muy regular.

2.1. CASO DE CÉLULAS AISLADAS

Las células se encuentran inmersas en una solución isotónica ; están como flotando en el medio sin entrar en contacto permanente unas células con otras. Las células no están sujetas por ningún tejido conjuntivo, formando parte de un órgano o tejido más complejo.

Las células que podemos estudiar pueden estar de forma natural en este estado aislado. Este es el caso de espermatozoides, óvulos, glóbulos rojos, etc.

También podemos estudiar el comportamiento de células que forman parte de tejidos, aunque previamente tenemos que separarlas y aislarlas de la estructura superior de la que forman parte.

2.2. CASO DE CÉLULAS EN TEJIDOS

Mediante el modelo de Krogh podremos aplicar el modelo de transporte de agua para estudiar la deshidratación de un tejido. Desafortunadamente el modelo de Krogh no es aplicable a un tejido cualquiera; sólo es válido para tejidos con una arquitectura interna muy regular, de forma que pueda visualizarse como la repetición de una celda unitaria, a nivel de células y capilares. Una analogía , a modo de ejemplo, sería la estructura cristalina del cloruro sódico, formada por la repetición de una celda unitaria.

Bajo las condiciones mencionadas anteriormente, el transporte de agua en un tejido podemos predecirlo con las mismas ecuaciones que en el caso de células aisladas, introduciendo cambios apropiados en la geometría.

El modelo de Krogh

El modelo de Krogh busca establecer una analogía geométrica entre un tejido y una célula aislada. De esta manera el comportamiento de una célula aislada sería análogo al comportamiento de un tejido, desde el punto de vista del transporte de agua.

Por esta razón, el objetivo del modelo de Krogh es buscar información geométrica de la estructura interna del tejido, para extrapolarla posteriormente a una célula aislada.


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El modelo de Krogh visualiza al órgano o tejido, desde el punto de vista geométrico, como una estructura que se construye a partir de una celda unitaria que se repite indefinidamente.

Esta celda unitaria se representa como un cubo en cuyo interior se encuentra localizado un cilindro, como se ve en la figura que se muestra en la siguiente página.

El cilindro que se encuentra en el interior del cubo, simula la parte del tejido formada por capilares y regiones intercelulares, mientras que la región del cubo, excluido el cilindro interior, simula la parte del tejido formado por células.


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Partimos de la suposición de que el transporte de agua entre células adyacentes es despreciable frente al transporte de agua que se establece entre las células y las regiones vasculares e intracelulares.

En estas condiciones el área del cilindro interior es el área disponible que tienen las células para intercambiar agua con el medio exterior, en este caso capilares y pequeñas regiones intercelulares.

Esta área de la célula aislada, cuyo comportamiento es análogo al del tejido, desde el punto de vista del transporte del agua sería el área del cilindro.

La región del cubo que excluye al cilindro interior representa el volumen de células que forman el tejido. El volumen total de la célula aislada cuyo comportamiento es análogo al del tejido, sería este volumen.

Las dimensiones geométricas del modelo de Krogh se obtienen experimentalmente, a través de un análisis visual de los tejidos.

La dimensión característica ?X es la media delas distancias que hay entre los vasos capilares (de centro a centro de vaso capilar). Un ejemplo de estas medidas se ven en la microfotografía adjunta:

Esta microfotografía muestra en tonos claros las secciones transversales de capilares, mientras que las regiones oscuras son hepatocitos, células del hígado.

La fotografía corresponde al hígado de la rana R.sylvatica .

La media de células que encontramos entre capilares es de 2 a 4 hepatocitos.

La fotografía ha sido tomada del artículo Liver Freezing Response of the Freeze-Tolerant Wood Frog, Rana Sylvatica in the Presence and Absence of Glucose de la revista Cryobiology número 38.

El radio del cilindro interior, rvo es el radio de los capilares. Para determinar este radio hay dos caminos:

o Empírico. Medimos este radio directamente en las microfotografias, utilizando un software adecuado para tratar las imágenes.

o Analítico. Mediante el estudio de las microfotografías podemos establecer cual es la proporción de células y capilares en el tejido, en términos de áreas, puesto que las fotografías son planas.

El radio rvo se puede calcular a partir de la siguiente ecuación:

p ·rvo2 = proporción de capilares · ?X2 Ec. 165


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La longitud característica L se determina imponiendo la condición de que las células que forman parte del tejido deben tener el mismo volumen total que esas mismas células tras haber sido aisladas previamente. La razón de esta imposición es que el único volumen conocido es el de las células aisladas.

El ejemplo clásico de aplicabilidad del modelo de Krogh es el hígado, cuya estructura interna es muy simple pues básicamente está constituido por una distribución regular de hepatocitos ( las células mayoritarias en el hígado ) y capilares. Las dimensiones características del modelo de Krogh para el caso del hígado de rana de los bosques R. sylvatica son:

o 74% del área de la fotografía lo ocupan los hepatocitos. o 26% del área de la fotografía lo ocupan los capilares. o ?X=64±17.9 µm o rvo = 12.2±5.3 µm (método empírico) o rvo = 18.4±5.2 µm (método analítico) o L=0.71 µm (volumen célula aislada es 2145 µm3 )


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IV-3. HIPÓTESIS SIMPLIFICATORIAS DEL MODELO IDEAL

Las hipótesis simplificatorias que vamos a aplicar a nuestro modelo de transporte para cuantificar la deshidratación celular serán:

1) La solución extracelular se asume de dimensiones infinitas, de manera que su composición no se verá afectada por el agua evacuada desde las células en su proceso de deshidratación.

2) La solución intracelular es considerada una solución diluida ideal. Esta hipótesis es muy útil pues simplifica mucho las ecuaciones. Recordamos que una disolución diluida ideal era aquella en la que las moléculas de soluto sólo interaccionaban con moléculas de disolvente. La elevada dilución de las soluciones que vamos a tratar apoya el uso de esta hipótesis. Sin embargo la naturaleza de electrolito fuerte del cloruro sódico, da origen a intensas fuerzas iónicas que tienen como consecuencia interacciones soluto-soluto considerables, incluso para diluciones muy altas. Por eso el modelo el modelo de disolución diluida ideal no es estrictamente válido para las disoluciones de electrolitos fuertes.

3) Las presiones parciales de los solutos disueltos tanto dentro como fuera de la célula serán despreciables. Esta hipótesis simplificatoria es muy razonable, dada la enorme volatilidad del agua líquida o del hielo, cuantificada a través de su presión de vapor, frente a la de los solutos que vamos a tener disueltos, como muestran los datos de sus presiones de vapor, ridículamente pequeños incluso a muy altas temperaturas:

Ø Presión de vapor del agua líquida a 0ºC es 5579 mmHg Ø Presión de vapor del ClNa a 825ºC es 1mmHg Ø Presión de vapor del glicerol a 125ºC es 1mmHg

4) El vapor en equilibrio con las soluciones, tanto intracelular como extracelular tienen comportamiento de gas ideal. Esta hipótesis simplificatoria es muy razonable pues trabajamos a presiones moderadas (1 atmósfera) y a temperaturas muy bajas.

5) La solución extracelular está permanentemente en equilibrio termodinámico con el hielo que se forma. Esta hipótesis asume que la


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velocidad con la que el agua se transforma en hielo es lo suficientemente rápida como para permitir que la composición de la disolución líquida aun existente sea la composición de equilibrio que corresponde a la temperatura del sistema. Los cambios de composición son capaces de seguir a los cambios de temperatura.

Esta hipótesis se basa en observaciones experimentales donde incluso a velocidades de enfriamiento de hasta 300000ºC/min, no se aprecia subenfriamiento en el medio extracelular una vez que existe hielo en él. [11]

Estas condiciones pueden no darse en la solución intracelular, cuando el causante del cambio de composición es el flujo osmótico. Si el fenómeno físico de la ósmosis no modifica la composición del sistema lo suficientemente deprisa, la composición del sistema no coincide con la composición de equilibrio para cada temperatura del sistema. La disolución intracelular estará por tanto subenfriada.

6) El calor latente de fusión del hielo se disipa lo suficientemente deprisa como para no interferir en el perfil de enfriamiento que queremos imponer al sistema. Esto significa que si imponemos un perfil de enfriamiento lineal, cada uno de los puntos del sistema van a seguir dicho perfil.

7) Como consecuencia de la hipótesis de disolución diluida ideal, el volumen molar parcial del disolvente coincide con el volumen molar del disolvente puro. Estamos aplicando la regla de Lewis-Randall al disolvente. La aplicación de esta regla lleva a asumir que las interacciones intermoleculares entre las moléculas de agua son las mismas en una disolución acuosa y en el caso de tener únicamente disolvente puro. Esta simplificación es muy razonable en disoluciones muy diluidas donde las moléculas de disolvente sólo interaccionan con otras moléculas de disolvente.

8) Otra consecuencia de la hipótesis de disolución diluida ideal es que el volumen molar parcial de los solutos coincide con su volumen molar a dilución infinita. El volumen molar del componente i a dilución infinita es el valor que tiene el volumen molar del componente i en el límite en el que la concentración de soluto tiende a cero. Se representa por Vi

8 .

9) La membrana celular permanece intacta durante el proceso de enfriamiento. Esta hipótesis se basa en experiencias de laboratorio, para un gran número de células en un extenso rango de protocolos de enfriamiento.[11]


89

10) La membrana celular se considera una membrana semipermeable perfecta que sólo permite el intercambio de agua. A pesar de no ser estrictamente cierta, esta simplificación no producirá errores apreciables en la mayoría de los casos. Esta simplificación se basa en el hecho de que la permeabilidad de las membranas celulares al agua, es mucho mayor que al mas permeable de los solutos. Consideremos por ejemplo el caso de glóbulos rojos de bovino. La permeabilidad al agua a 20ºC es 5·105 veces más grande que la permeabilidad al glicerol. El transporte de glicerol a través de la membrana es despreciable frente al transporte de agua, en las escalas temporales en las que nos movemos.[12]

11) El área de la membrana celular permanece constante durante el proceso de enfriamiento, para el caso de células pequeñas(<10-16 m3), y se mantiene proporcional al volumen para el caso de células grandes(>10-15 m3).

Mediante esta hipótesis simplificatoria estamos asumiendo que la célula no se pliega sobre si misma. Esto es más probable que suceda en el caso de células pequeñas como espermatozoides o glóbulos rojos; es más improbable en el caso de grandes células como óvulos. En la tabla adjunta se muestra el volumen de distintas células; cuanto mayor es su volumen, mayor es la probabilidad de que la célula se pliegue sobre si misma, conforme se deshidrata.

TIPO DE CÉLULA VOLUMEN/m3 Esperma de ratón 3.1629·10-17 Glóbulos rojos de bovino 4.1·10-17

Hepatocitos de ratón 240·10-17

Óvulos de ratón 18775.2·10-17

En el caso de grandes células parece razonable establecer una relación entre el área de la membrana y su volumen, para tener en cuenta el hecho de que la pliega sobre si misma.

Una relación empírica que buenos resultados es la mostrada a continuación donde Vcell es el volumen total de la célula:

A=(36·p)? ·V?cell Ec. 166


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91

IV-4. LAS VARIABLES Y PARÁMETROS DEL MODELO.

El enorme grado de complejidad que tiene la más simple de las células de un organismo vivo, hace necesario simplificar nuestra visión de dicha célula para poder establecer un modelo físico de su comportamiento.

Para nosotros una célula será simplemente una “bolsa” rellena de una solución salina.

La bolsa, es decir, la célula tendrá una geometría regular, bien esférica, bien cilíndrica.

El envoltorio de la bolsa, es decir, la membrana celular tendrá propiedades de membrana semipermeable perfecta, como ya se ha comentado anteriormente. Las dos características principales que van a definir el comportamiento de la membrana son:

o Tamaño. Es el área de membrana disponible para intercambiar agua con el medio exterior. Es muy fácil de calcular, debido a que hemos asignado una geometría regular a la célula.

o Permeabilidad. Este parámetro define la facilidad con la que el agua puede atravesar la membrana ante un gradiente de concentraciones. Su magnitud estará afectada por la temperatura y en menor medida por la concentración de solutos en la solución intracelular. Debido a la importancia de este parámetro lo desarrollaremos en otro apartado.

El contenido de la “bolsa”, es decir, el medio intracelular estará constituido por dos regiones:

o Volumen osmóticamente inactivo. En esta región incluimos orgánulos internos de la célula, el núcleo celular, macromoléculas como por ejemplo proteinas, etc. Son partes internas de la célula que no van a intervenir en el proceso del transporte del agua.

o Volumen osmóticamente activo. En esta región incluimos la solución intracelular en la que están flotando los orgánulos internos, el núcleo, etc.

La composición de esta solución intracelular es muy compleja, como para ser tratada con la teoría de la fisicoquímica. Para nosotros la solución intracelular va a estar constituida por los siguientes elementos:

§ Agua § Cloruro sódico § Crioprotectores permeables.

Los moles de cloruro sódico y de crioprotector se calcularán a partir de su concentración inicial y del volumen osmóticamente activo inicial.


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Debido a la hipótesis simplificatoria de que a través de la membrana sólo va a existir flujo de agua, los moles de soluto, es decir, de cloruro sódico y de crioprotectores van a permanecer constantes mientras dure la deshidratación celular, hasta que se alcancen las condiciones de saturación.

Por lo tanto un parámetro clave para poder resolver numéricamente el modelo es el conocimiento del volumen osmóticamente activo inicial.

El volumen osmóticamente inactivo inicial se calcula a partir de la construcción del gráfico de Boyle-van’t Hoff (BVH).[4]

En el eje vertical del gráfico BVH representamos la fracción de volumen total de la célula en un instante arbitrario con respecto al volumen total inicial de la célula. En el eje horizontal representamos los valores de la inversa de la molalidad de la disolución intracelular.

Un ejemplo de este tipo de gráficos se muestra en la figura adjunta, obtenido para el caso de tejido de tejido de hígado de rata:

El gráfico adjunto ha sido obtenido del artículo Quantitative Measurement and Prediction of Biophysical Response During Freezing in Tisúes publicado por John C. Bischof. [4]

Para poder dibujar el gráfico hay que seguir una serie de pasos:

§ Someter todas las muestras a una misma velocidad de enfriamiento conocida. Para obtener el gráfico anterior se impuso una velocidad de 5ºC/min. § Detener el enfriamiento de cada una de las muestras a una

temperatura diferente. Tendremos tantas muestras como puntos queramos tener en el gráfico. En el caso del ejemplo las temperaturas a las que se detuvo el proceso de enfriamiento estuvieron en el rango de -4ºC a -20ºC.


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§ Mantenemos las muestras a la temperatura constante final, el tiempo suficiente como para que el medio intracelular alcance el equilibrio con el medio exterior, eliminando así todo el subenfriamiento de la solución intracelular. § Sometemos a las muestras a un proceso de enfriamiento

súbito, sumergiéndolas en nitrógeno líquido. Con este procedimiento buscamos solidificar la muestra, bien con formación de hielo, bien por alcanzar condiciones de estado vítreo, deteniendo cualquier proceso de deshidratación. Esto me va a permitir analizar por microscopio cómo era el estado de deshidratación del sistema a la temperatura a la que se detuvo el proceso de enfriamiento a la velocidad de -5ºC/min. § Mediante esta inspección visual puedo conocer el volumen de

disolución que aun permanece dentro de la célula para cada una de las temperaturas a las que se detuvo el proceso de enfriamiento. Llegados a este punto conozco los pares de valores ( V / Vo ; T ). Ahora necesito información sobre la evolución de la concentración con la temperatura para poder dibujar el gráfico BVH. § Suponiendo que la disolución es diluida ideal y que va a

permanecer con bajo grado de subenfriamiento en todo el rango de temperaturas de estudio, puedo estimar la concentración a partir de la curva de descenso crioscópico; recordamos que esta ecuación relaciona la concentración de una disolución con su temperatura de solidificación, en un proceso de equilibrio. Para la obtención del gráfico del ejemplo se empleó la expresión simplificada del descenso crioscópico dada por la ecuación Ec145, como ya se ha visto previamente en el CAPÍTULO 1 de FUNDAMENTOS TERMODINÁMICOS y que tenía la siguiente expresión:

TTdondeTm

−=∆∆

= 273858.11

donde m es la molalidad del la disolución y T la temperatura del sistema, siendo ?T el descenso crioscópico.

§ Conociendo los pares de valores ( m, T ) y (V/Vo , T) puedo dibujar el gráfico BVH. Una extrapolación lineal del gráfico hasta una molalidad infinita (inverso de la molalidad igual a cero) me da la fracción del volumen celular que es osmóticamente inactivo. El corte de la curva BVH con el eje vertical me da la fracción de volumen osmóticamente inactivo. Esta extrapolación es razonable, pues cuando he expulsado todo el volumen que puede ser evacuado a través de la membrana celular( volumen osmóticamente activo), la concentración de solutos disueltos dentro de la célula sería infinito; en estas condiciones dentro de la célula únicamente permanece lo que hemos venido en llamar volumen osmóticamente inactivo.


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Como resumen podemos afirmar que para poder plantear el modelo físico de deshidratación celular necesito conocer:

Ø La permeabilidad de la membrana. Ø El volumen osmóticamente activo inicial. Ø La concentración inicial de solutos dentro de la célula. Ø El área de la membrana.


95

IV-5. EL COEFICIENTE DE PERMEABILIDAD O LA CONDUCTIVIDAD HIDRÁULICA DE LA MEMBRANA CELULAR

5.1. INTRODUCCIÓN

En los últimos años, se han llevado a cabo diversos estudios teóricos sobre la cinética del transporte de agua en las células sometidas a procesos de enfriamiento a temperaturas inferiores a los cero grados centígrados.

En todos estos modelos teóricos, las repuestas de las células a los sucesos termodinámicos asociados a los procesos de enfriamiento, se caracterizan mediante ciertos parámetros físicos asociados a la naturaleza de las células, como pueden ser su tamaño o la concentración natural de sales en su interior.

El más importante de todos estos parámetros físicos es la permeabilidad de la membrana celular, puesto que el comportamiento de la célula durante el enfriamiento, desde el punto de vista del transporte de agua, depende fundamentalmente de este parámetro.

La permeabilidad de una membrana a un cierto componente, el agua en nuestro caso, mide la facilidad con la que dicho componente fluye a través de la membrana ante un gradiente de presiones osmóticas. Así cuanto mayor sea el valor de la permeabilidad, mayor será el flujo de agua para un gradiente de presiones osmóticas dado.


96

-60-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANADE OVULOS DE RATÓN

Temperatura/ºC

Co

efi

cie

nte

de

pe

rme

ab

ilid

ad

/(m

icra

s/m

in a

tm)

-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

0.008

0.009

0.01

PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA DE ESPERMATOZOIDES DE RATÓN.

Temperatura/ºC

Co

efi

cie

nte

de

pe

rme

ab

ilid

ad

/ (m

icra

s/m

in a

tm)

5.2. LEY DE LA PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA CELULAR

La ley de permeabilidad que vamos a emplear en nuestro modelo, va a tener en cuenta la variación del valor de la conductividad hidráulica con la temperatura mediante una relación de Arrhenius:

−⋅−

⋅= g

Lg

TTR

E

PgP eLTL11

)( Ec. 167

donde LPg es la conductividad hidráulica a la temperatura de referencia Tg , y ELg es la energía de activación aparente para el transporte de agua a través de la membrana.

Existen otras expresiones que parece ser que se ajustan mejor a los datos experimentales. Introducir una ecuación diferente a la que vamos a emplear solo introduciría ligeras modificaciones en los resultados, siendo inmediato cambiar las ecuaciones del modelo de deshidratación.

Esta ley de comportamiento refleja el hecho empírico de que cuanto menor es la temperatura del sistema, menor es la permeabilidad de la membrana. De esta manera la membrana celular pierde su carácter semipermeable para pasar a tener un carácter impermeable, por debajo de una cierta temperatura crítica. Cuando enfriamos el sistema por debajo de dicha temperatura crítica, el proceso de deshidratación se detiene, aumentando indefinidamente el subenfriamiento de la solución intracelular; esto se traduce en un aumento de la probabilidad de formación de hielo intracelular.

A modo de ejemplo mostramos la evolución de los coeficientes de permeabilidad con la temperatura para los casos de espermatozoides[22] y óvulos[5] de ratón.

Figura 1

Del análisis de estos dos gráficos, observamos que la conductividad hidráulica de los óvulos de ratón es un orden de magnitud superior al de los espermatozoides. La temperatura crítica para la cual la membrana se vuelve


97

impermeable en el caso de los espermatozoides de ratón está entorno a los –30ºC, mientras que para el caso de óvulos de ratón está en torno a los –45ºC.

Experimentos de laboratorio muestran que la permeabilidad de la membrana celular, además de variar con la temperatura del sistema, también depende de la concentración de soluto en el medio extracelular[15].

Por ejemplo, la conductividad hidráulica Lp , de fibroblastos de hámster, se reduce a la mitad cuando tenemos una concentración 0.2 M de dimetil sulfóxido (DMSO), con respecto a la que tendríamos en una solución isotónica. Cuando continuamos aumentando la concentración de DMSO por encima de 0.2M, la permeabilidad no se reduce, permaneciendo aproximadamente constante[15].

Otro ejemplo lo encontramos en el caso de óvulos de hámster, para el que se ha deducido una ecuación empírica que relaciona la concentración de solutos en el medio extracelular, con la conductividad hidráulica de la membrana [15]:

−⋅−=

tP M

L1

3.01

154.0135.1 Ec. 168

donde Mt es la osmolalidad del medio exterior.

En la representación gráfica que se muestra a continuación se observa un comportamiento asintótico de LP hacia el valor de 0.63 µm/min atm , cuando la composición del medio está entre 1.5 y 3 osmolal.

Este valor de la permeabilidad representa aproximadamente el 50% del valor de la permeabilidad en un medio isotónico.

Figura 2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

COEFICIENTE DE PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA DE ÓVULOSDE HÁMSTER EN FUNCIÓN DE LA MOLALIDAD EXTRACELULAR

Molalidad /(moles/kg de disolvente)

Co

efi

cie

nte

de

pe

rme

ab

ilid

ad

/(m

icra

s/m

in a

tm)


98

-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0.006

0.007

0.008

0.009

0.01

PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA DE ESPERMATOZOIDES DE RATÓN

Temperatura/ºC

Co

efi

cie

nte

de

pe

rme

ab

ilid

ad

/(m

icra

s/m

in a

tm) sin crioprotector

con crioprotector

Puesto que la mayoría de las muestras tratadas con crioprotector tiene concentraciones superiores a 1.5÷3 osmolal, el efecto de las concentración de soluto afecta al valor del coeficiente de permeabilidad antes de comenzar el proceso de enfriamiento.

En base a lo expuesto, parece necesario introducir en el modelo de permeabilidad algún mecanismo que tenga en cuenta la presencia de agentes crioprotectores.

La manera que vamos a tener de contemplar, la presencia de crioprotectores en nuestro modelo, será la de reducir a la mitad el valor de la permeabilidad de referencia LPg , cuando en el sistema haya presente crioprotectores. Obviamente el valor de la permeabilidad de referencia se habrá determinado en ausencia de crioprotectores. Esta reducción del valor de la permeabilidad de referencia a la mitad, se traduce en una reducción de la permeabilidad de la membrana celular para todas las temperaturas. A modo de ejemplo, mostramos en la siguiente página, la evolución de la permeabilidad de la membrana de espermatozoides de ratón, con la temperatura para los casos de ausencia y presencia de crioprotectores en el medio.

Figura 3

Esta reducción de la permeabilidad para todas las temperaturas, genera una mayor dificultad de la célula para deshidratarse. Es de esperar, por tanto mayores retenciones de agua dentro de la célula, y en consecuencia mayores serán los subenfriamientos que se alcanzarán.


99

Como resumen podemos describir el modelo de permeabilidad como sigue:

Ø Sin crioprotector:

−⋅−

⋅= g

Lp

TTR

E

PgP eLL11

Ec. 169

Ø Con crioprotector:

−⋅−

⋅⋅= g

Lp

TTR

E

PgP eLL11

21

Ec. 170

No hay evidencias experimentales que establezcan una relación entre la concentración de soluto y la energía de activación ELpg.


100

5.3. DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DE LOS PARÁMETROS DEL MODELO DE PERMEABILIDAD

Los pasos fundamentales que hay que seguir, para poder conocer los valores numéricos de la permeabilidad de la membrana a una temperatura conocida y la energía de activación son:

1) Mediante ensayos de laboratorio, obtener datos sobre la deshidratación celular a distintas temperaturas para una velocidad de enfriamiento conocida.

2) Ajustar los datos experimentales a las ecuaciones teóricas, donde los únicos datos desconocidos son los parámetros de la permeabilidad: LPg y ELPg.

Las dos técnicas más importantes que hoy día se emplean para cuantificar la deshidratación celular son:

1) El método de las Dos etapas: es una técnica de análisis directo. Mediante una inspección visual de la muestra cuantificamos su deshidratación.

2) El método de la calorimetría de escaneo diferencial: es una técnica de análisis indirecto. Medimos el calor liberado en el cambio de fase de agua líquida a hielo durante el enfriamiento de la muestra.


101

5.3.1 MÉTODO DE LAS DOS ETAPAS (TWO – STEP)

El método de las Dos etapas es una técnica basada en el análisis visual directo de las muestras durante el proceso de deshidratación de las células, que tiene lugar cuando enfriamos el sistema por debajo de los cero grados centígrados.

La aplicabilidad de este método está limitada por la geometría de las células. La razón está en la simplificación que a continuación describimos: a partir del área proyectada por las células(información en dos dimensiones que obtenemos en las fotografías) podemos estimar el volumen de dichas células (información tridimensional). Esta extrapolación es razonable para células de geometrías aproximadamente esféricas, donde a partir de una fotografía puedo medir el diámetro y conocer así su volumen, pero es inapropiada para células con geometría arbitraria.

El desarrollo del método se lleva a cabo en dos pasos, de ahí su nombre:

PASO 1: Sometemos la muestra a una velocidad de enfriamiento baja que favorezca la deshidratación celular.

Cada muestra es enfriada a una temperatura diferente; cuanto más baja sea la temperatura a la que enfriemos más tiempo dura la etapa de deshidratación, y por tanto mayor será la cantidad de agua expulsada del medio intercelular. Es de esperar que cuanto más baja sea la temperatura mayor será la cantidad de hielo que se forme en el medio extracelular.

PASO 2: Una vez que la muestra es enfriada hasta su temperatura final, la introducimos en nitrógeno líquido. Esta etapa somete a la muestra a una velocidad de enfriamiento ultrarrápida. Este paso se denomina “criofijación”.

La razón de ser de esta etapa y de su nombre se basa en el hecho de que para muestras pequeñas (<1 mm3), como las que nos ocupan, el tiempo característico para el transporte del calor es varios órdenes de magnitud inferior al tiempo característico para el transporte de masas.

Matemáticamente queda expresado como:

∆⋅⋅

=<<

=

πα ALV

tL

tP

masatrasportecalortransporte0

2

Ec. 171

donde: V0 : volumen característico del sistema

Lp : permeabilidad de la membrana

A : área de la membrana


102

?p : incremento de presiones osmóticas a través de la membrana

Lp A ?p : velocidad característica de deshidratación

ttransporte masa: tiempo característico necesario para evacuar todo el agua de un sistema de volumen característico V0 .

L: longitud característica del sistema.

L2: área característica del sistema.

a : conductividad térmica

ttranspote calor : tiempo característico necesario para evacuar el calor necesario del sistema para reducir su temperatura la unidad.

Por lo tanto, cuando sometemos al sistema a un enfriamiento tan rápido, el agua retenida dentro de la célula no se modifica, alcanzándose las condiciones de solidificación (puede ser vitrificación, congelación, o las dos cosas, que es lo más probable), sin que se haya producido una deshidratación significativa.

Esta etapa lo que pretende es mantener indefinidamente el sistema en unas condiciones estables. Seguidamente se pasa a un laborioso proceso de tratamiento con resinas que aquí no vamos a describir.

Para poder cuantificar visualmente cuánto se han deshidratado las células, necesitamos una fotografía de referencia en la que las células de la muestra no se hayan deshidratado nada. Esta fotografía se obtiene no sometiendo la muestra a la primera etapa, pasando directamente al paso 2 (de criofijación).

Como ejemplo de método mostramos las microfotografías de muestras de hígado de ratón[4].

Las áreas oscuras, marcadas con asteriscos corresponden a las células del tejido, mientras que las áreas claras, marcadas con flechas corresponden a regiones extracelulares donde se ha formado hielo.


103

Figura 4

La fotografía A es la muestra de referencia en la que la muestra fue sometida a un enfriamiento súbito, sin que las células tuvieran tiempo de deshidratarse. En esta fotografía podremos observar cómo sería el tejido en su estado natural.

En la fotografía B el sistema fue enfriado hasta los –4ºC a la velocidad de –5ºC/min. Ahora la cantidad de hielo extracelular formado es mayor, puesto que además del agua del medio intercelular interviene el agua evacuada por las células.

En la fotografía C el sistema fue enfriado hasta los –8ºC a la misma velocidad, dando más tiempo para que las células se deshidraten. Por lo tanto es de esperar, y así lo muestra la fotografía, la cantidad de hielo formado en el exterior es mayor.

En la fotografía D el sistema fue enfriado hasta los –20ºC. Se aprecia una elevada formación de hielo, quedando las células aprisionadas en pequeños canales, donde sufren una enorme deformación, que puede dar origen a la rotura de la membrana celular y por tanto a la muerte de la célula.


104

5.3.2 MÉTODO DE LA CALORIMETRÍA DE ESCANEO DIFERENCIAL (DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY. DSC)

El fundamento físico en el que está basado esta técnica es que el calor liberado por el cambio de fase de agua líquida a hielo, en muestras con células osmóticamente activas, es mayor que el calor liberado en las mismas muestras, pero con las células osmóticamente inactivas.

La diferencia de calor evacuado entre los dos casos descritos, se puede relacionar con el volumen de agua retenido dentro de la célula:

)()(

)( 00 bVVqTq

VTV −⋅∆

∆−= Ec. 172

donde V(T) es el volumen de disolución retenida en la célula, Vo es el volumen inicial de la célula, Vb es el volumen osmóticamente inactivo, ?q es la diferencia total de calor, y ?q(T) es la diferencia de calor para cada temperatura.

Esta técnica no tiene la limitación de la geometría celular, como la que tenía la de las Dos Etapas.

Una breve descripción del método DSC se muestra a continuación, para el caso particular de hepatocitos de ratón:

Paso 1: la muestra es enfriada a una velocidad pequeña, en nuestro caso 5ºC/min , hasta que empieza a formarse hielo en el medio extracelular, a unos –2.5ºC.

Paso 2: calentamos la muestra hasta la temperatura de cambio de fase, que para el caso del hígado de ratón, es de –0.53ºC. La muestra en estas condiciones aun contiene algo de hielo en el medio extracelular. Este hielo servirá como agente nucleante para la formación de hielo cuando enfriemos por debajo de la temperatura de cambio de fase,-0.53ºC para los hepatocitos de ratón.

Paso 3: la muestra es enfriada hasta –50ºC a una velocidad pequeña, -5ºC/min . Medimos el calor liberado durante el cambio de fase originado en el medio extracelular con las células osmóticamente activas.

Paso 4: calentamos la muestra hasta –0.53ºC a una velocidad de 100ºC/min.


105

Paso 5: para diferenciar entre el calor liberado durante el cambio de fase en el medio extracelular, del liberado por el agua del medio intracelular que ha sido evacuada al medio extracelular, sometemos la muestra a un proceso de enfriamiento rápido(200ºC/min) hasta los –50ºC. Este enfriamiento súbito provoca que las células se vuelvan osmóticamente inactivas.

Paso 6: calentamos la muestra hasta –0.53ºC a una velocidad de 100ºC/min. Como resultado del paso 5, el agua intracelular así como sus proteinas y sales estarán mezcladas con el medio extracelular, es decir, en el paso 5 hemos provocado la rotura de la membrana celular.

Paso 7: la muestra es enfriada hasta –50ºC a una velocidad pequeña de –5ºC/min. Medimos el calor liberado por el medio, donde no existen membranas que regulen la evacuación de agua del interior de las células, no estando la formación de hielo limitada por este mecanismo. Por tanto el calor liberado en esta etapa, debe ser mayor que en caso donde el agua disponible para congelarse estaba limitada por la regulación ejercida por la membrana. Esta regulación no existe y todo el agua está disponible para cambiar de fase.

Un ejemplo de la evolución de los calores liberados viene en la figura adjunta.

Figura 5


106

IV-6. MODELO TEÓRICO IDEAL

6.1. INTRODUCCIÓN

En este apartado vamos a desarrollar las ecuaciones del modelo teórico, que nos permitirán cuantificar cómo se va deshidratando la célula conforme enfriamos el sistema, para el caso de soluciones diluidas ideales.

En ninguna de las ecuaciones se tendrá en cuenta la presencia de agentes crioprotectores.

Primeramente obtendremos las ecuaciones, sin especificar ningún tipo concreto de perfil de enfriamiento, para posteriormente particularizarlas para un perfil lineal, un perfil cuadrático, y un perfil exponencial de enfriamiento.

También desarrollaremos las ecuaciones que nos permitirán cuantificar la deshidratación celular en el caso de mantener la temperatura del sistema constante.

Introduciremos el concepto de “Curva de Equilibrio”, que nos permitirá cuantificar el subenfriamiento del medio intracelular en función de la velocidad de enfriamiento y de la temperatura del sistema.


107

6.2. EL MODELO TEÓRICO IDEAL PARA UN PERFIL DE ENFRIAMIENTO ARBITRARIO

En el capítulo de ÓSMOSIS hemos visto que cuando hay una membrana semipermeable que separa dos disoluciones, se produce un flujo espontáneo de disolvente puro, desde la disolución menos concentrada hacia la más concentrada.

Para el caso de soluciones diluidas ideales, la ecuación de van’t Hoff relacionaba la concentración de soluto con la presión osmótica.

TRCB ⋅⋅=π Ec. 173

donde CB es la concentración en moles / litro de la disolución.

Por lo tanto se producirá un flujo espontáneo de disolvente puro, desde la región de MENOR presión osmótica hacia la región de MAYOR presión osmótica.

El caudal de agua evacuado por la célula, será proporcional a la diferencia de presiones osmóticas entre el medio intracelular y extracelular, cuyo origen es el desequilibrio de potenciales químicos. Consideraremos caudal positivo, al caudal que sale de la célula.

Con este criterio de signos, el caudal evacuado (positivo), será proporcional a la fuerza impulsora , es decir, la presión osmótica en el exterior menos la presión osmótica en el interior.

El caudal de agua evacuado es a su vez igual a la variación del volumen de disolvente de la célula(volumen osmóticamente activo), cambiado de signo, puesto que conforme evacuamos caudal (positivo), disminuye el volumen de la célula.

evacuadoCaudaldtdV

−= Ec. 174

Introduciendo la proporcionalidad entre caudal evacuado y diferencia de presiones osmóticas podemos escribir:

( ) ( )exininex

dtdV

dtdV

ππππ −∝⇒−−∝ Ec. 175

donde p in y p ex son las presiones osmóticas en el interior y en el exterior de la célula respectivamente.

La constante de proporcionalidad es el Coeficiente de Permeabilidad o Conductividad Hidráulica , que como vimos en el apartado 5.1 del capítulo 4 nos informaba de la facilidad con la que se produce el flujo de fluido a través de una membrana.


108

Para el caso concreto que estamos tratando, vamos a definir la permeabilidad como la magnitud de caudal que atravesaría la unidad de área de membrana, ante una diferencia de presiones osmóticas unitaria.

Con esta definición la ecuación de proporcionalidad pasa a ser una igualdad de la forma:

( )exinp ATL

dtdV

ππ −⋅⋅= )( Ec. 176

donde V es el volumen de disolución intracelular, Lp(T) es el coeficiente de permeabilidad, que como ya vimos dependía fuertemente de la temperatura. Las unidades de la permeabilidad serán m3/(min·m2·atm). El parámetro A es el área de membrana, por donde tiene lugar el flujo de agua.

Las presiones osmóticas de las disoluciones, podemos expresarlas en función de las presiones de vapor, como ya vimos en el capítulo de Ósmosis.

exlA

A

ex

inlA

A

in

PP

VTR

P

P

VTR

*,

*,

ln

ln

⋅⋅

=

⋅⋅

=

π

π

Ec. 177

donde VA es el volumen molar parcial del disolvente, P*A,l es la presión de

vapor del disolvente puro, y Pin, Pex son las presiones de vapor de la solución intracelular y extracelular respectivamente.

Aplicando estas relaciones a la ecuación de deshidratación y teniendo en cuenta la hipótesis simplificatoria 7 (apartado IV-3), que decía que el volumen molar parcial del disolvente es aproximadamente igual al volumen molar del disolvente puro, podemos escribir:

in

ex

A

g

PP

V

TRATL

dtdV

ln)(

* ⋅⋅⋅⋅

= Ec. 178

donde V*A es el volumen molar del disolvente puro.

A continuación vamos a desarrollar el cociente de las presiones de vapor:

Ø solución intracelular : aplicando la ley de Raoult ideal tenemos.

inBB

inAlA

in xTPxTPP ⋅+⋅= )()( **, Ec. 179

donde P*A,l y P*

B son las presiones de vapor del agua líquida y de la sal y xin

A y xinB son las fracciones molares de agua y sal respectivamente.


109

)(*, TPP sA

ex ≈

Aplicando la hipótesis simplificatoria 3 (apartado IV-3), que desprecia las presiones de vapor de los solutos frente a la del disolvente, y teniendo en cuenta además que xin

A>>xinB , al tratarse de una disolución diluida,

podemos escribir:

Ec. 180

Ø solución extracelular : vamos a demostrar que la presión de vapor del medio extracelular, donde tenemos una disolución líquida en equilibrio con hielo, es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo puro:

Ec. 181

Consideramos un recipiente cerrado, en el que tenemos una disolución líquida en equilibrio con hielo, al igual que ocurre en el medio extracelular.

Supongamos que en la interfase entre la disolución y el vapor con el que está en equilibrio no hay hielo. Por lo tanto la presión de vapor será únicamente la del disolvente líquido y la del soluto.

El potencial químico del disolvente en la disolución será igual que el potencial químico del disolvente en el vapor, por estar el vapor en equilibrio termodinámico con la disolución.

inAlA

in xTPP ⋅≈ )(*,


110

)()( ,, TT gAlA µµ = Ec. 182

El potencial químico del disolvente en la fase vapor, aplicando la hipótesis 4 (apartado IV-3) de que el vapor tiene comportamiento de gas ideal será:

0,0

, ln)(P

PTRT lA

AgA ⋅⋅+= µµ Ec. 183

Por lo tanto podemos escribir:

0,0

, ln)(P

PTRT lA

AlA ⋅⋅+= µµ Ec. 184

Consideremos ahora un recipiente cerrado en el que tenemos hielo. Una vez alcanzadas las condiciones de equilibrio termodinámico, la presión de vapor del gas en equilibrio con el hielo, será la presión de vapor del hielo.

Aplicando, al igual que antes, la igualdad de potenciales químicos y la hipótesis de gas ideal, podemos escribir:

0

*,0*

,*

, ln)()(P

PTRTT sA

AgAsA ⋅⋅+== µµµ Ec. 185

Puesto que en el medio extracelular la disolución acuosa líquida está permanentemente en equilibrio con el hielo formado, se cumplirá la igualdad de potenciales químicos:

)()( *,, TT sAlA µµ = Ec. 186

Sustituyendo Ec.184 y Ec.185, en Ec.186:

0

*,0

0,0 lnln

P

PTR

P

PTR sA

AlA

A ⋅⋅+=⋅⋅+ µµ Ec. 187


111

De esta última igualdad se deduce que la contribución de la disolución líquida a la presión de vapor es igual a la presión de vapor del hielo:

ex

BlAex

Bex

lAex PPPPP +≈+= *

,, Ec. 188

Aplicando la hipótesis simplificatoria 3 (apartado IV-3), de despreciar la presión de vapor de los solutos frente a la de el disolvente, llegamos a la expresión deseada, que identificamos como Ec.181:

)(*, TPP sA

ex ≈ Ec. 189

Tras las simplificaciones efectuadas a las expresiones de las presiones de vapor de las disoluciones intracelular y extracelular podemos obtener el cociente de presiones de vapor de Ec.180 y Ec.189:

inAlA

sAin

ex

xTP

TP

PP 1

)(

)(*,

*, ⋅≈ Ec. 190

sustituyendo Ec.190 en Ec.178, la ecuación de deshidratación queda:

−⋅

⋅⋅⋅= in

AlA

sA

A

g xTPTP

V

TRATL

dtdV

ln)()(

ln)(

*,

*,

* Ec. 191

Seguidamente emplearemos la ecuación de Clausius-Clapeyron para calcular las presiones de vapor de las sustancias puras en función de la temperatura:

( ) ( ) 2*,2

*,

)(ln

)(ln

TRTL

PdTd

TRTL

PdTd S

sAV

lA ⋅=

⋅= Ec. 192

donde LV(T),LS(T) son los calores latentes de vaporización y sublimación respectivamente.

Integrando ambas ecuaciones en función de la temperatura:

⋅⋅=

⋅⋅=

∫

∫T

T

SsAsA

T

T

VlAlA

dTTRTL

TPTP

dTTRTL

TPTP

0

0

20*,

*,

20*,

*,

)(exp)()(

)(exp)()(

Ec. 193


112

El cociente de presiones de vapor aplicando los resultados de integrar la ecuación de Clausius-Clapeyron, Ec.193, quedará:

⋅⋅=

⋅−

⋅=

⋅−

⋅⋅=

∫

∫∫∫T

T

F

sA

lA

sA

lA

T

T

VS

sA

lAT

T

VT

T

S

sA

lA

sA

lA

dTTRTL

TP

TP

TP

TP

dTTR

TLTLTP

TPdT

TRTL

dTTRTL

TP

TP

TP

TP

0

000

20

*,

0*,

*,

*,

20

*,

0*,

220

*,

0*,

*,

*,

)(exp

)(

)(

)(

)(

)()(exp

)(

)()()(exp

)(

)(

)(

)(

Ec. 194

donde LF(T) es el calor latente de fusión.

Sustituyendo en la ecuación Ec.191:

−

⋅+⋅

⋅⋅⋅= ∫

T

TA

F

lA

sA

A

g xdTTRTL

TPTP

V

TRATL

dtdV

0

ln)(

)()(

ln)(

20

*,

0*,

* Ec. 195

Tomando T0 = 273.15 K, la presión de vapor del hielo y del agua líquida pura coinciden y por tanto la ecuación queda:

−

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫

T

AF

A

g xdTTRTL

V

TRATL

dtdV

15.2732* ln)()(

Ec. 196

En la ecuación de deshidratación la única variable dependiente que vamos a considerar es el volumen de disolución osmóticamente activo, en el interior de la célula, y la única variable independiente a tener en cuenta va a ser la temperatura del sistema.

Por ello la variación del volumen con el tiempo debemos expresarlo en función de la temperatura:

dTdV

TFdtdT

dTdV

dtdV

⋅=⋅= )( Ec. 197

donde F(T) es una función de la temperatura particular de cada perfil de enfriamiento.

Por la misma razón, la fracción molar de disolvente debemos expresarla en función del volumen de disolución intracelular y en función de la temperatura del sistema:

BBA

AA nn

nx

⋅+=

ν Ec. 198

donde nA , nB son los moles de disolvente(agua) y de soluto(ClNa) respectivamente, y ?B es el coeficiente de disociación de la sal.


113

Si multiplicamos y dividimos por el volumen molar del agua pura, nada cambia:

**

*

ABBAA

AAA VnVn

Vnx

⋅⋅+⋅⋅

=ν

Ec. 199

El volumen de disolución intracelular es:

BBAA VnVnV ⋅+⋅= Ec. 200

donde VA y VB son los volúmenes molares parciales del agua y la sal respectivamente.

Aplicando las hipótesis simplificatorias 7 (apartado IV-3), de aproximar el volumen molar parcial del disolvente al volumen molar del disolvente puro, y 8, de aproximar el volumen molar parcial de los solutos al volumen molar a dilución infinita, podemos escribir:

∞⋅+⋅≈ BBAA VnVnV * Ec. 201

donde V*A es el volumen molar del disolvente puro, y V8

B es el volumen molar a dilución infinita del soluto.

Por lo tanto la fracción molar de disolvente queda:

*ABBBB

BBA VnVnV

VnVx

⋅⋅+⋅−⋅−

= ∞

∞

ν Ec. 202

Finalmente la ecuación de deshidratación celular queda:

⋅⋅+⋅−⋅−

−⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∞

∞

∫ *15.273

2* ln)(

)(

)(

ABBBB

BBT

F

A

g

VnVnVVnV

dTTRTL

TFV

TRATL

dTdV

ν Ec. 203

Vamos a emplear una ecuación semiempírica que relaciona el calor latente de fusión del agua pura, con la temperatura[11]. Esta expresión es de la forma:

32 )()()()( ααα −⋅+−⋅−−⋅+= TdTcTbaTLF Ec. 204

donde

a=6004.8 J / mol b=38.016 J / mol·K c=0.11088 J / mol·K2 d=0.00090432 J / mol·K3 a=273.15 K


114

Mediante la representación gráfica que mostramos a continuación del calor latente de vaporización, vemos que va disminuyendo con la temperatura.

-40-35-30-25-20-15-10-50

4200

4400

4600

4800

5000

5200

5400

5600

5800

6000

6200CALOR LATENTE DE FUSIÓN DEL AGUA

Temperatura/ºC

En

talp

ía d

e F

usió

n/(J

/mol

)

Nos interesa la integración de la ecuación Ec.204, para sustituirla en la ecuación Ec.203. Esta será:

( )20

20

0

2

0

32

2

2)(

3

ln3211)(

0

TTR

dTT

Rdc

TT

Rdcb

TTRdcba

dTTRTLT

T

F

−⋅⋅

+−⋅⋅⋅⋅+

−

−⋅⋅⋅+⋅⋅+

+

−⋅

⋅−⋅−⋅−=

⋅∫α

ααααα

Ec. 205


115

6.3. LA CURVA DE EQUILIBRIO. EL SUBENFRIAMIENTO

6.3.1 INTERPRETACIÓN FÍSICA

En el apartado IV-3 de Hipótesis Simplificatorias vimos que la solución extracelular estaba permanentemente en equilibrio termodinámico con el hielo formado, gracias a que la velocidad con la que el agua se transformaba en hielo era lo suficientemente alta como para que en cada instante la composición del medio extracelular fuera la composición de equilibrio, marcada por la temperatura del sistema.

Sin embargo, el medio intracelular no corre la misma suerte. La composición de la solución intracelular no coincide con la composición de equilibrio, que es la composición del medio extracelular, por estar éste permanentemente en equilibrio.

Es de especial interés para este proyecto cuantificar el alejamiento del equilibrio con el que evoluciona el medio intracelular, pues su conocimiento nos permitirá cuantificar la probabilidad de formación de hielo.

Para poder cuantificar esta probabilidad necesitamos conocer el desequilibrio en términos de temperaturas. La temperatura, para cada instante de tiempo, de un sistema que evoluciona por sucesivos estados de equilibrio, es diferente a la temperatura de ese mismo sistema pero cuando no evoluciona por estados de equilibrio. Esto significa que cuando la composición de un sistema es una determinada, su temperatura es diferente, según haya evolucionado por estados de equilibrio o no.

A la diferencia entre la temperatura de un sistema y a la que tendría si evolucionara por sucesivos estados de equilibrio se denomina subenfriamiento. Este va a ser el parámetro que cuantificará el alejamiento del equilibrio. Así cuanto mayor sea el subenfriamiento, mayor será el alejamiento del equilibrio.

Lo que pretendemos en la siguiente pregunta es determinar la ecuación que relaciona la temperatura con la composición del sistema, cuando este evoluciona por sucesivos estados de equilibrio. Esta relación se cumple en el medio extracelular. Por lo tanto la ecuación de Equilibrio describe la evolución del medio extracelular, mientras que la ecuación de Deshidratación que hemos deducido anteriormente describe la evolución del medio intracelular.


116

6.3.2 LA ECUACIÓN DE LA CURVA DE EQUILIBRIO

Cuando una célula se encuentra en equilibrio termodinámico con el medio que le rodea, deben darse simultáneamente tres tipos de equilibrio:

Ø Equilibrio mecánico: la presión del medio intracelular debe estar compensada con el estado tensional de la membrana y con la presión del medio extracelular. Supondremos que este equilibrio es instantáneo y se da en todo momento.

Ø Equilibrio difusivo: para que el sistema se encuentre en equilibrio difusivo, no deben producirse transportes de materia dentro de la célula, ni entre la célula y el medio exterior.

El equilibrio difusivo interno, es decir, la ausencia de transporte de materia dentro de la célula, está garantizado debido a que las reducidas dimensiones de las células evita la existencia de fuertes gradientes de concentración.

Para que exista equilibrio difusivo entre la célula y el medio extracelular, los cambios de composición dentro de la célula, causados por la ósmosis, y que la deshidrata, deben de ser lo suficientemente rápidos como para seguir a la composición de equilibrio que viene determinada por la temperatura del sistema, y que es igual a la composición del medio exterior.

Los flujos de agua, deben de ser instantáneos, para que en cada instante de tiempo exista equilibrio difusivo entre la célula y el medio exterior. Salvo en ese instante infinitesimal de evacuación de agua instantánea, en el resto del tiempo característico de cambio de la temperatura del sistema, no hay evacuación de agua.

Este equilibrio difusivo instantáneo, es decir, la ausencia de evacuación de agua, se garantiza imponiendo que la presión osmótica a ambos lados de la membrana celular sea igual.

Aplicando la relación entre la presión osmótica y la presión de vapor, la igualdad de presiones osmóticas se transforma en una igualdad de presiones de vapor.

Ø Equilibrio térmico: supondremos que la temperatura dentro de la célula es uniforme e igual a la del medio extracelular que la rodea. Los gradientes de temperatura en el sistema son muy pequeños debido a las reducidas dimensiones que tiene. Por tanto el equilibrio térmico está garantizado en todo momento.

Esto no será cierto cuando estemos considerando tejidos. En este caso la temperatura del sistema no será uniforme y necesitaremos plantear ecuaciones de equilibrio térmico, que habría que resolver simultáneamente junto con las ecuaciones de deshidratación celular.


117

Como conclusión llegamos a que para imponer una condición de equilibrio termodinámico, tan sólo necesitamos imponer una condición de equilibrio difusivo, puesto que el equilibrio mecánico, y térmico se satisfacen en todo momento.

El equilibrio difusivo lo imponemos mediante la igualdad de presiones de vapor:

)()( TPTP inex = Ec. 206

donde Pex(T) es la presión de vapor del medio extracelular, y Pin (T) es la presión de vapor del medio intracelular.

Como ya justificamos anteriormente, la presión de vapor de la solución extracelular es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo que se ha formado:

)()( *, TPTP sA

ex ≈ Ec. 207

La presión de vapor de la solución intracelular es aproximadamente igual a la presión de vapor del agua en la solución, multiplicada por la fracción molar del agua en la solución intracelular:

AlAin xTPTP ⋅≈ )()( *

, Ec. 208

Aplicando Clausius-Clapeyron calculo las variaciones de la presión de vapor del hielo y del agua líquida con la temperatura:

⋅⋅=

⋅⋅=

∫

∫T

T

SsAsA

T

T

VlAlA

dTTRTL

TPTP

dTTRTL

TPTP

0

0

20*,

*,

20*,

*,

)(exp)()(

)(exp)()(

Ec. 209

Sustituyendo las ecuaciones Ec.206 y Ec.207, en la ecuación Ec.208:

)()(

*,

*,

TPTP

xlA

sAA = Ec. 210

Sustituyendo las ecuaciones Ec.209 en la ecuación Ec.210:

⋅⋅= ∫

T

T

F

lA

sAA dT

TRTL

TPTP

x0

20

*,

0*, )(

exp)()(

Ec. 211



118

Si elegimos T0 = 273.15K (a esa temperatura se cumple la igualdad de presiones de vapor del hielo y del agua líquida pura), entonces:

⋅= ∫

TF

A dTTRTL

x15.273

2

)(exp Ec. 212

Por último expresando la fracción molar de disolvente en función del volumen de disolución dentro de la célula, al igual que hicimos al desarrollar el modelo teórico de deshidratación, llegamos a la ecuación de Equilibrio:

⋅=

⋅⋅+⋅−⋅−

∫∞

∞ TF

ABBBB

BB dTTRTL

VnVnVVnV

15.2732*

)(exp

ν Ec. 213


119

6.4. PARTICULARIZACIÓN DE LAS ECUACIONES DEL MODELO

6.4.1 INTRODUCCIÓN

Cuando planteábamos la ecuación diferencial que describía el proceso de deshidratación celular, al someter el sistema a un proceso de enfriamiento, la forma de éste se introducía en la ecuación mediante la función F(T), siendo F(T), la derivada primera con respecto al tiempo de la ley de enfriamiento T(t).

dtdT

TF =)( Ec. 214

Para que la ecuación Ec.214 sea cierta, la derivada a la derecha de la igualdad debe ser una función de la temperatura. Sin embargo, cuando calculamos dicha derivada obtenemos una función del tiempo. Para expresar la derivada en función de la temperatura, despejamos de la ley de enfriamiento el tiempo en función de la temperatura, sustituyendo dicha relación en la expresión de la derivada.

En este apartado vamos a obtener expresiones de la función F(T), para distintas leyes de enfriamiento. Aunque se pueden plantear infinidad de estas leyes, nosotros sólo vamos a contemplar tres:

Ø Ley de enfriamiento lineal Ø Ley de enfriamiento cuadrática Ø Ley de enfriamiento exponencial


120

6.4.2 LEY DE ENFRIAMIENTO LINEAL

El perfil de enfriamiento lineal es, con diferencia, la ley de enfriamiento más empleada en criopreservación, lo que, como veremos, no significa que sea la mejor.

La expresión matemática de un enfriamiento lineal es de la forma:

0)( TtBtT +⋅−= Ec. 215

donde T0 es la temperatura inicial del sistema, que en nuestro caso son 273K, y B es una constante positiva, que permite parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento lineales.

La interpretación física del parámetro B la vemos calculando la derivada primera de la temperatura con el tiempo:

BdtdT

−= Ec. 216

Efectivamente, B es la velocidad de enfriamiento del sistema, y tiene dimensiones de °C ⁄ min.

En un perfil lineal de enfriamiento, la velocidad con la que se reduce la temperatura es constante.

La función F(T) será:

BdtdT

TF −==)( Ec. 217

Sustituyendo Ec.217 en Ec.203, la ecuación diferencial de la deshidratación celular, obtenemos:

⋅⋅+⋅−⋅−

−⋅

⋅−⋅

⋅⋅⋅= ∞

∞

∫ *15.273

2* ln)(

)(

)(

ABBBB

BBT

F

A

g

VnVnVVnV

dTTRTL

BV

TRATL

dTdV

ν Ec. 218


121

6.4.3 LEY DE ENFRIAMIENTO CUADRÁTICA

La expresión matemática que vamos a emplear para un perfil de enfriamiento cuadrático, será de la forma:

2210 2

1)( tktkTtT ⋅−⋅−= Ec. 219

donde T0 es la temperatura inicial del sistema, que como en el caso anterior es 273K , y k1,k2 son unas constantes positivas, que al igual que en el caso lineal, permiten parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento cuadráticos.

La interpretación física de los parámetros k1 y k2 , la obtenemos calculando las derivadas primera y segunda de la ecuación Ec.219 con respecto al tiempo:

22

2

21

kdt

Td

tkkdtdT

−=

⋅−−= Ec. 220

Podemos ver como k1 es la velocidad de enfriamiento en el instante inicial (t=0), y k2 es la aceleración con la que se produce la disminución de la temperatura. Por lo tanto las dimensiones de k1 serán ºC ⁄ min, mientras que las de k2 serán °C ⁄ min2 .

Las características principales de este enfriamiento cuadrático son:

Ø la velocidad de enfriamiento es creciente, es decir, cuanto mas baja es la temperatura del sistema, mas rápidamente disminuye la temperatura.

Ø La aceleración del enfriamiento es negativa y constante.

Para obtener el valor de la función F(T) , calcularemos la derivada primera de la temperatura con respecto al tiempo y después la expresaremos en función de la temperatura:

1) Calculo la derivada primera de Ec.219.

tkkTdtdT

TF ⋅−−== 21)()( Ec. 221

2) Expreso la variable tiempo, en función de la temperatura. Despejaremos el tiempo de la ley de enfriamiento (Ec.219):


122

2

022

11

012

2

)(2

0)(21

kTTkkk

t

TTtktk

−⋅⋅+±−=

=−−⋅+⋅

Ec. 222

La variable t debe ser real y positiva. Se garantiza que es real porque el radicando es positivo, por ser una suma de números positivos, ya que k1

2>0, k2>0 , y T0-T>0.

Para que t sea positivo es necesario, además de tomar la solución que suma la raíz, que se cumpla la siguiente desigualdad:

)(2

0)(2

022

12

1

022

11

TTkkk

TTkkk

−⋅⋅+<

>−⋅⋅++− Ec. 223

Al ser k2>0 y T0-T>0, vemos que la desigualdad se cumple. Por lo tanto la ecuación que relaciona la variable tiempo con la temperatura del sistema es:

2

022

11 )(2

k

TTkkkt

−⋅⋅++−= Ec. 224

La función F(T) la obtendremos, sustituyendo Ec.224 en Ec.221:

)(2)(

)(2)()(

022

1

2

022

1121

TTkkTF

k

TTkkkkkT

dtdT

TF

−⋅⋅+−=

−⋅⋅++−⋅−−==

Ec. 225

Finalmente sustituyendo Ec.225 en Ec.203, tendremos la ecuación de la deshidratación celular cuando el sistema está sometido a un enfriamiento cuadrático.

⋅⋅+⋅−⋅−

−⋅

⋅−⋅⋅+−⋅

⋅⋅⋅= ∞

∞

∫ *15.273

202

21

*ln

)(

))(2(

)(

ABBBB

BBT

F

A

g

VnVnVVnV

dTTRTL

TTkkV

TRATL

dTdV

ν

Ec. 226


123

6.4.4 LEY DE ENFRIAMIENTO EXPONENCIAL

La expresión matemática de un enfriamiento exponencial es de la forma:

⋅−⋅=

00 exp)(

Tt

kTtT Ec. 227

donde T0 es la temperatura del sistema, que es 273K, y k es una constante positiva, que permite parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento exponenciales.

Para poder interpretar esta constante, calculamos la derivada primera de la temperatura con el tiempo:

⋅−⋅⋅−=

000 exp

Tt

kTk

TdtdT

Ec. 228

kdtdT

t

−==0

Ec. 229

El parámetro k es por tanto la velocidad con la que comienza a enfriarse el sistema, y por tanto tiene dimensiones de °C ⁄ min.

Las principales características de este perfil de enfriamiento exponencial son:

Ø la velocidad de enfriamiento es decreciente, es decir, cuanto mas baja es la temperatura del sistema, mas lentamente disminuye la temperatura.

Ø La aceleración del enfriamiento es positiva y decreciente con el tiempo:

20

2

00

2

2

2

expTT

kTt

kTk

dtTd

⋅=

⋅−⋅= Ec. 230

Como la temperatura disminuye con el tiempo, también lo hará la aceleración.

Para obtener la expresión de F(T), calcularemos la derivada primera de la temperatura con el tiempo, y a continuación la expresaremos en función de la temperatura:

1) La derivada primera viene dada por Ec.228.

⋅−⋅−==

0

exp)()(Tt

kkTdtdT

TF Ec. 231


124

2) Expresando la variable tiempo en función de la temperatura.

0000 expexp

TT

Tt

kTt

kTT =

⋅−⇒

⋅−⋅= Ec. 232

Sustituyendo Ec.232 en Ec.231, obtenemos el valor de la función F(T):

0

)(TT

kdtdT

TF ⋅−== Ec. 233

Finalmente sustituyendo esta expresión en la ecuación Ec.203, obtendremos:

⋅⋅+⋅−⋅−

−⋅

⋅⋅−⋅

⋅⋅⋅= ∞

∞

∫ *15.273

2

0

*ln

)(

)(

)(

ABBBB

BBT

F

A

g

VnVnVVnV

dTTRTL

TT

kV

TRATL

dTdV

ν Ec. 234


125

6.5. MODELO DE DESHIDRATACIÓN PARA UN PERFIL DE ENFRIAMIENTO NULO

6.5.1 INTRODUCCIÓN

Es una práctica extendida en los protocolos de criopreservación, someter las muestras a temperatura constante durante un periodo de tiempo más o menos largo. En este apartado vamos a obtener la ecuación diferencial que permite modelar la deshidratación celular en este caso.

Cuando resolvamos la ecuación, analizaremos qué efecto tiene el mantenimiento de la temperatura constante sobre el alejamiento de la condiciones de equilibrio de la solución intracelular.


126

6.5.2 PLANTEAMIENTO DE LAS ECUACIONES

La ecuación que va a describir la deshidratación celular en una etapa a temperatura constante va a ser igual a la que empleábamos para describir la deshidratación durante un enfriamiento,( Ec.203) salvo que ahora la variable independiente no va a ser la temperatura, puesto que va a permanecer constante, sino el tiempo.

⋅⋅+⋅−⋅−

−⋅

⋅⋅⋅⋅

= ∞

∞

∫ *15.273

2* )()(

ln)()(

ABBBBCTE

BBCTET

F

A

CTECTEg

VnVnTVVnTV

dTTRTL

V

TRATL

dtdV CTE

ν

Ec. 235

En esta ecuación la temperatura no es una variable, sino una constante, la temperatura constante a la cual mantenemos la muestra durante un cierto periodo de tiempo.

CAPITULO 4 LA DESHIDRATACIÓN CELULAR

127

IV-7. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO IDEAL

7.1. INTRODUCCIÓN

En este apartado vamos a resolver las ecuaciones diferenciales de la deshidratación celular, que planteamos en el apartado anterior, mostrando las soluciones en forma de gráficos.

Calcularemos las soluciones, para dos tipos de células:

Ø Espermatozoides de ratón. Ø Óvulos de ratón.

Esta diversidad de tamaños me permitirá analizar qué efecto tiene el tamaño de las células sobre el proceso de deshidratación celular.

Para cada tipo de célula, ensayamos tres tipos diferentes de perfiles de enfriamiento: lineal, cuadrático, y exponencial. Para poder comparar unos perfiles con otros, escogeremos adecuadamente los parámetros de los perfiles.

La resolución de las ecuaciones diferenciales las hemos llevado a cabo en un ordenador, mediante el programa MATLAB, en su versión 5.3.

Para integrar las ecuaciones diferenciales hemos recurrido a la herramienta de calculo ode (ordinary differential ecuation), disponible en MATLAB.

La herramienta ode maneja diferentes tipos de algoritmos numéricos de resolución. Nosotros en este proyecto hemos empleado dos:

1) Ode45: Esta herramienta informática emplea el método Runge-Kutta de cuarto y quinto orden. Es un método de un paso, es decir, para calcular la solución en un instante de tiempo t, tan sólo necesito conocer la solución en el instante de tiempo justamente anterior.

2) Ode15s: Esta otra herramienta emplea un método de orden variable, basado en fórmulas de diferenciación numérica (numerical differentiation formula, NDF). Este algoritmo lo hemos tenido que emplear porque el que empleaba ode45 no daba buenos resultados, dado que introducía al ordenador en un proceso de cálculo infinito.

A estas herramientas de integración debemos de pasarles las ecuaciones a integrar. Por ello para la resolución de una ecuación, necesitamos desarrollar dos programas:

1) Programa que contenga el código de la ecuación diferencial que queremos resolver. En este programa no se especifican los valores


128

numéricos de los parámetros físicos de las células, por lo que estos programas son validos para cualquier tipo de célula.

2) Programa que realice la integración de la ecuación contenida en el programa, anteriormente comentado, mediante las herramientas ode45 o bien ode15s. En este programa si se especifica el valor numérico de los parámetros de las células, por lo que necesitaremos tantos programas de este tipo, como tipos de células tengamos.


129

7.2. LOS PERFILES DE ENFRIAMIENTO

Cuando particularizamos las ecuaciones de deshidratación para unos perfiles de enfriamiento lineal, cuadrático, y exponencial, estos quedaban en función de unos parámetros que había que especificar. Las expresiones matemáticas de los perfiles de enfriamiento eran:

Ø perfil lineal : tBTT ⋅−= 0

Ø perfil cuadrático: 2210 2

1tktkTT ⋅⋅−⋅−=

Ø perfil exponencial:

−⋅=

00 exp

Tt

kTT

La razón de contemplar varios perfiles de enfriamiento, es la de poder elegir el que de unos mejores resultados en el proceso de deshidratación, si es que alguno es mejor que los demás.

Para ello debemos comparar los efectos de los perfiles de enfriamiento. Para poder comparar los tres perfiles entre si, debemos buscar expresiones que relacionen los parámetros de los tres modelos, entre si.

Nosotros vamos a relacionar los parámetros del perfil cuadrático y exponencial, con el parámetro del modelo lineal, que nos va a servir de referencia. La razón de esta elección es que, como se ha dicho, los protocolos de criopreservación actuales emplean casi exclusivamente perfiles lineales de enfriamiento.

El parámetro k del perfil exponencial lo calculo imponiendo que la velocidad inicial de enfriamiento, coincida con la velocidad de enfriamiento constante del perfil lineal.

Ø Perfil lineal :

BdtdT

−= Ec. 236

Ø Perfil exponencial:

kdtdT

Tt

kkdtdT

t

−=⇒

−⋅−=

=00

exp Ec. 237

La igualdad de la velocidad de enfriamiento inicial del perfil exponencial, con la velocidad del perfil lineal nos lleva al valor de k:

Bk = Ec. 238


130

El parámetro k1 del perfil cuadrático lo determino, imponiendo de nuevo que la velocidad inicial del enfriamiento, coincida con la velocidad de enfriamiento constante del perfil lineal.

Ø Perfil lineal:

BdtdT

−= Ec. 239

Ø Perfil cuadrático:

10

21 kdtdT

tkkdtdT

t

−=⇒⋅−−==

Ec. 240

Por lo tanto el valor de k1 será:

Bk =1 Ec. 241

El parámetro k2 del perfil cuadrático lo determino, imponiendo que la aceleración constante del enfriamiento cuadrático, coincida con la aceleración inicial del enfriamiento exponencial, en valor absoluto, pues recordamos que el perfil cuadrático tenía una aceleración negativa, mientras que el exponencial tenía una aceleración positiva.


0

2

02

2

00

2

2

2

expTk

dtTd

Tt

kTk

dtTd

t

=⇒

−⋅=

=

Ec. 242


22

2

22

2

kdt

Tdk

dtTd

=⇒−= Ec. 243

Igualando ambas expresiones obtenemos el valor de k2 :

0

2

2 Tk

k = Ec. 244

Sustituyendo el valor de k en función de B tenemos:


131

0

2

2 TB

k = Ec. 245

Con estas relaciones entre los parámetros de los perfiles de enfriamiento, sus expresiones matemáticas quedan:

Ø Perfil lineal :

tBTT ⋅−= 0 Ec. 246


2

0

2

0 2t

TB

tBTT ⋅⋅

−⋅−= Ec. 247


−⋅=

00 exp

Tt

BTT Ec. 248

Una representación grafica de las velocidades de enfriamiento frente a la temperatura, con un valor del parámetro B=100°C ⁄ min se muestra a continuación:


132

-90-80-70-60-50-40-30-20-100-130

-120

-110

-100

-90

-80

-70

-60

COMPARATIVA DEVELOCIDADES DE ENFRIAMIENTO

Temperatura/oC

Ve

loci

da

d d

e e

nfr

iam

ient

o/(o

C/m

in)

perfil exponencial

perfil lineal

perfil cuadratico

Figura 6

Vemos como un perfil lineal, siempre tiene la misma velocidad de enfriamiento, un perfil cuadrático tiene una velocidad de enfriamiento creciente, mientras que uno exponencial tiene la velocidad de enfriamiento decreciente.


133


134

7.3. CURVAS DE DESHIDRATACIÓN PARA ESPERMATOZOIDES DE RATÓN

7.3.1 DATOS FÍSICOS

Para poder resolver las ecuaciones de deshidratación y de equilibrio, necesitamos conocer una serie de datos físicos referentes a la célula que estemos considerando, en nuestro caso, espermatozoides de ratón.

La ecuación de deshidratación que pretendemos resolver, con el programa MATLAB es:

⋅⋅+⋅−⋅−

−⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∞

∞

∫ *15.273

2* ln)(

)(

)(

ABBBB

BBT

F

A

g

VnVnVVnV

dTTRTL

TFV

TRATL

dTdV

ν Ec. 249

Los datos físicos necesarios, referentes a la célula son:

Ø Permeabilidad de la membrana, Lg(T): Su expresión en función de la temperatura era:

−⋅−

⋅= g

Lp

TTR

E

PgP eLL11

Ec. 250

Necesitaremos conocer, la permeabilidad de referencia Lpg , la energía de activación ELp y la temperatura de referencia Tg.

Ø Área de la membrana celular, A. Ø Numero de moles de sal dentro de la célula, nB: Este dato lo

obtendremos a partir de la concentración inicial de sales dentro de la célula y del volumen de disolución inicial dentro de la célula.

Ø Volumen de disolución inicial dentro de la célula, V0 : Este dato lo obtendremos a partir del volumen inicial de la célula, y de la fracción de volumen osmóticamente inactivo, que recordamos se obtenía a partir del grafico de Boyle-van’t Hoff. (BVH),como se vió en el apartado IV-4.

Como tenemos una derivada primera del volumen de disolución intracelular con respecto a la temperatura, necesitaremos conocer el volumen y la temperatura en el instante inicial:


135

Ø El volumen en el instante inicial, es el volumen osmóticamente activo, V0, en el instante inicial.

Ø La temperatura inicial, no es la temperatura a la que comenzamos a enfriar al sistema, sino la temperatura a la que comienza el proceso de deshidratación, que no comienza hasta que en el medio extracelular, comienza a formarse hielo. Esta temperatura es por tanto, la de cambio de fase sólido-liquido, cuando la solución intracelular tiene su concentración inicial, igual a la del medio extracelular. Esta temperatura no será 0°C sino algo menor, debido al efecto del descenso crioscópico de la sal disuelta.

Los valores numéricos de los parámetros físicos, anteriormente descritos, para el caso particular de espermatozoides de ratón [22]son:

Ø Permeabilidad de la membrana o Permeabilidad de referencia: LPg=0.01 µm ⁄ (min atm) o Energía de activación: ELp=94.1 KJ ⁄ mol o Temperatura de referencia: Tg=273.15 K

Las dimensiones de Lp serán por tanto µm ⁄ (min⋅atm). Sin embargo nosotros necesitamos que tenga las dimensiones m4 ⁄ (min⋅J), para lo cual debemos dividir la expresión de la permeabilidad por la constante de proporcionalidad 1.01325×105.

Ø Área de la membrana: La calculo asumiendo que el espermatozoide, es un cilindro de 0.46 µm de radio, y de 122 µm de altura[22]:

21022 105394.394.35312246.02)46.0(2 mmA −⋅==⋅⋅+⋅= µππ Ec. 251

Ø Volumen de disolución inicial. o Fracción de volumen celular osmóticamente inactivo: 61% o Volumen celular: Lo calculo asumiendo que el espermatozoide

es un cilindro con las dimensiones dadas anteriormente:

320, 1.81122)46.0( mVcell µπ =⋅⋅= Ec. 252

Por lo tanto el volumen de disolución intracelular en el instante inicial es:

31730 101629.3629.311.81)61.01( mmV −⋅==⋅−= µ Ec. 253


136

Ø Numero de moles de sal dentro de la célula. o Concentración inicial de la sal: 0.285 M o Volumen de disolución inicial: V0=3.1629×10-17 m3.

Por lo tanto el numero de moles de soluto, será el producto de la concentración molar, por el volumen de disolución intracelular:

molesmlitros

mlitro

molesnB

153

317 10014.91

1000101629.3285.0 −− ⋅=×⋅×= Ec. 254

Ø La temperatura inicial, justo antes de comenzar el proceso de deshidratación calcula internamente el programa de MATLAB.

Además de estos datos físicos, específicos de las células de espermatozoides, necesitamos conocer otros datos físicos:

Ø Volumen molar del agua pura: VA*=18×10-6 m3 ⁄ moles.

Ø Volumen molar a dilución infinita de la sal: VB∞=1.66×10-5 m3 ⁄ mol.


137

7.3.2 PROGRAMACIÓN EN MALTAB DE LAS ECUACIONES DIFERENCIALES

En este apartado vamos a describir brevemente, como hemos programado en MATLAB las ecuaciones diferenciales, tanto de la curva de deshidratación, como de la curva de equilibrio, para posteriormente ser integradas.

El programa que describe en lenguaje MATLAB la ecuación de deshidratación, por ejemplo para el caso de un perfil de enfriamiento lineal es:

function varargout=enfr_id_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa) if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0; end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lp=Lpg*exp(-E_Lg/R*(1/t-1/Tg))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos: sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. F=B;%perfil de enfriamiento lineal aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F)); dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))]; function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);


138

La primera línea de comandos, nos indica que el archivo cuyo nombre es enfr_id_lineal es una función, que recibe una serie de parámetros, que son las variables que se encuentran entre paréntesis, y devuelve un valor, en la variable varargout, un nombre predeterminado de MATLAB, que permite devolver uno o varios datos a la vez, según sea necesario.

varargout=enfr_id_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa)

Las variables de entrada son:

Ø t: Es la temperatura absoluta. Ø y: Es el volumen de disolución intracelular en m3. Ø flag: Es una variable de control interno de MATLAB. Nosotros no

tenemos control sobre ella Ø B: Es la velocidad de enfriamiento lineal, en función de la cual

habíamos expresado los parámetros del resto de perfiles de enfriamiento; sus dimensiones son °C ⁄ min.

Ø Vi: Es el volumen de disolución intracelular inicial, en m3. Ø n2: Es el numero de moles de sal disuelta en la solucion intracelular. Ø A: Es el área de la membrana celular, en m2. Ø Lpg: Es la permeabilidad de referencia, en µm ⁄ min⋅atm. Ø E_Lg: Es la energía de activación en J ⁄ mol. Ø Tg: Es la temperatura de referencia de la permeabilidad de la

membrana. Ø ncpa: Es el numero de moles de crioprotector, que aun no vamos a

considerar. Ø Vmcpa: Es el volumen molar a dilución infinita del crioprotector.

Las siguientes líneas de código, dan unos valores por defecto al numero de moles de crioprotector, y al volumen molar a dilución infinita del mismo.

if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0; end

Por defecto no considero la presencia de crioprotector. El crioprotector que vamos a considerar, cuando consideremos su presencia, por defecto es el glicerol.


139

Las siguientes líneas de código, permiten estructurar el archivo en subfunciones, según la casuística:

switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end

Si en la variable de control interno no hay nada, entonces el programa llama a la subfunción f que contiene el código de la ecuación diferencial.

Si en la variable de control interno esta el valor 'init' entonces el programa llama a la subfunción init.

La siguiente parte del código, corresponde a la subfunción f que contiene la representación en el lenguaje de programación de MATLAB a la ecuación diferencial de deshidratación:

function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lg,Tg,ncpa,Vmcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lp=Lpg*exp(-E_Lg/R*(1/t-1/Tg))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos: sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. F=B;%perfil de enfriamiento lineal aux=(Lp*A*R*t/(VmA*F)); dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))];

En esta parte podemos comentar que la expresión de la integral del calor latente de fusión del hielo, queda oculta, por estar desarrollada en otro archivo, llamado integralLf al que le pasamos como parámetro la temperatura del sistema y devuelve el valor de la integral en la variable SLf.

Por otra parte aparecen una serie de variables que pasamos a comentar a continuación:

Ø MA: Es el peso molecular de agua, en gramos por mol. Ø v2: Es la constante de disociación de la sal. Ø Vm2: Es el volumen molar a dilución infinita de la sal, VB

∞. Ø nsol: Es una variable en la que incluimos los moles de sal, y de

crioprotector.


140

Ø Vsol: Es una variable en la que incluimos el volumen ocupado por la sal y el crioprotector.

Por ultimo tenemos el desarrollo de la subfunción init,en la que se detallan el intervalo de integración en la variable tspan, el valor inicial de la variable dependiente, es decir, el volumen inicial de disolución intracelular, en la variable y0. La ultima línea contiene información sobre los decimales que va a contemplar el programa de integración.

function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

La programación de la curva de equilibrio se muestra a continuación:

function [t,y]=DescCrio_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa) if nargin<4 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5; end if nargin<3 | isempty(ncpa) ncpa=0; end R=8.3143; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; VmA=18*1e-6; Vsol=n2*Vm2+ncpa*Vmcpa; nsol=(v2*n2+ncpa); a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273; fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R; fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R; fact3=(c+3*d*z)/R; fact4=d/(2*R); T=[190:1:272.99]; To=273; integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2-To^2); Q=exp(integralLf); V_eq=Vsol+(Q./(1-Q))*nsol*VmA; t=T; y=V_eq;

Recordamos que la expresión de la curva de equilibrio era de la forma:


141

⋅=

⋅⋅+⋅−⋅−

∫∞

∞ TF

ABBBB

BB dTTRTL

VnVnVVnV

15.2732*

)(exp

ν Ec. 255

El código de programación, tras las explicaciones dadas anteriormente, no merece ningún comentario.

Por último mostramos el código del archivo que contiene la expresión de la integral de el calor latente de fusión del hielo:

function y=integralLf(T) a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273; R=8.3143; fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R; fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R; fact3=(c+3*d*z)/R; fact4=d/(2*R); To=273; y=fact1*(1/To-1/T)+fact2*log(T/To)-fact3*(T-To)+fact4*(T^2-To^2);


142


143

7.3.3 REPRESENTACIÓN GRAFICA DE LA DESHIDRATACION

7.3.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación diferencial de la deshidratación celular

En este apartado vamos a describir brevemente como hemos programado en MATLAB, la integración de las ecuaciones diferenciales de deshidratación, mediante la herramienta ode, que permite resolver ecuaciones diferenciales ordinarias.

El código para la integración de la ecuación de deshidratación del esperma de ratón, que habíamos almacenado en el archivo enfr_id_lineal es:

Vi=3.1629*1e-17;% DATO n2=9.014*1e-15;% DATO A=3.5394*1e-10;% DATO options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); if ncpa==0 Lpg=0.01*1e-6;%DATO E_Lpg=94.1*1e3;%DATO else Lpg=.004*1e-6;%DATO E_Lpg=63.6*1e3;%DATO end Tg=273.15;%DATO [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; plot(t0-273,V0,'r--') Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-5 -15 -50 -1000] tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lpg, Tg,ncpa,[]); V1=y1./Vi; plot(t1-273,V1,'LineWidth',1) axis([-55 0 0 1]); hold on; end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');

En las primeras líneas de código, asignamos los valores numéricos de los parámetros físicos de los espermatozoides. En Vi introducimos el volumen inicial osmóticamente activo de la célula, expresado en m3. En la variable n2 introducimos el número de moles que hay dentro de la célula, en cualquier instante, y que son iguales a los moles iniciales, por ser la membrana


144

impermeable a dicho componente. En A introducimos el área de la membrana celular.

En la siguiente línea de código introducimos en la variable options parámetros de cálculo que le indican al integrador con que precisión debe trabajar para buscar la solución.

options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4);

Las siguientes líneas de código son sentencias condicionales que asignan valor a los parámetros de permeabilidad de la membrana, según tengamos o no crioprotector en el medio intracelular.

En la siguiente línea de comandos generamos la curva de equilibrio.

[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa);

Mediante la llamada al archivo DescCrio_id_integrado vamos generando pares de valores de la curva de equilibrio, que almacenamos en la matriz [t0,y0], donde t0 es la columna que contiene las temperaturas, e y0 contiene los volúmenes en m3 de la célula.

A continuación dibujamos la curva de equilibrio, representando la temperatura en ºC, en el eje horizontal, y la fracción del volumen de disolución intracelular con respecto al que había en el instante inicial, en el eje vertical.

En la siguiente línea de código, calculamos cual es la temperatura de cambio de fase líquido-sólido, para la disolución intracelular en el instante inicial.

Ti=interp1(V0,t0,1);

Su determinación se lleva a cabo, mediante una interpolación lineal, en puntos de la curva de equilibrio. Dicha temperatura será la que tenga el sistema, cuando evolucionando por sucesivos estados de equilibrio, tenga una concentración igual a la que tiene el medio intracelular, cuando el volumen de la célula es el volumen inicial, por tanto la fracción de volumen inicial sea la unidad.

A continuación nos encontramos con un bucle, que va a repetir la integración de la ecuación de deshidratación, para distintas velocidades de enfriamiento, como son 5, 15, 50, y 1000ºC/min.

Dentro del bucle, primeramente indicamos en intervalo de integración, para posteriormente pasar a la integración propiamente dicha, mediante el comando ode15s.


145

tspan=[Ti,190] [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lpg,E_Lpg,Tg,ncpa,[]);

Al comando ode15s le pasamos como parámetros: el nombre del archivo que contiene la ecuación diferencial a integrar, en nuestro caso 'enfr_id_lineal' , el intervalo de integración tspan, el volumen inicial de la célula Vi, parámetros para indicar la precisión de cálculo, ocultos en la variable options , la velocidad de enfriamiento B, el volumen inicial de la célula Vi, el número de moles del medio intracelular n2, en área de la membrana A, la permeabilidad de referencia Lpg, la energía de activación E_Lpg, la temperatura de referencia de la permeabilidad Tg, el número de moles de crioprotector, ncpa y por último el volumen molar del crioprotector empleado, que como está en blanco, se tomará el valor por defecto que es para el glicerol.

Los resultados de la integración son devueltos en una matriz, cuya primera fila, t1 contiene los valores de las temperaturas, y cuya segunda fila y1, contiene los valores de los volúmenes de solución intracelular, en m3.

Finalmente dibujamos las curvas, mediante el comando plot.


146

7.3.3.2 Representación gráfica de la deshidratación.

Primeramente vamos a mostrar cuál es la solución de la ecuación de deshidratación que obtendríamos, si en vez de considerar como intervalo de integración la temperatura que va desde el punto de cambio de fase de agua líquida a hielo, hasta los 253K, considerásemos el intervalo de temperaturas que va desde la temperatura inicial del sistema, 273K hasta los 253K.

Para el caso de una deshidratación lineal, con una velocidad de enfriamiento de 15ºC/min tenemos:

Figura 7

El programa que permite calcular este gráfico se encuentra en el anexo PROGRAMAS en el apartado 1.

En la solución gráfica de la ecuación de deshidratación vemos cómo la célula toma agua del medio exterior mientras no se alcance la temperatura de cambio de fase, que viene marcada por la intersección de la curva de equilibrio, con la horizontal que pasa por la fracción del volumen inicial uno. Esta temperatura la calcula internamente el programa, y en este caso es 271.8852K es decir, -1.1148ºC.


147

Este hinchamiento de la célula no tiene sentido, pues mientras no se alcancen las condiciones para formar hielo en el medio exterior, no hay nada que rompa el equilibrio isotónico de la célula con el medio exterior, y por tanto el volumen celular permanece invariable.

Por lo tanto la solución gráfica es la que se muestra en la Figura 8:

Figura 8

Este gráfico se obtiene a partir del programa del apartado 7.3.3.1 pero teniendo en cuenta una única velocidad de enfriamiento, la de 15ºC/min.

La integración de la curva de equilibrio sólo se lleva a cabo en el intervalo de temperaturas que va desde los 271.8852K hasta la temperatura final de enfriamiento, por lo que el software no dibuja la evolución desde los 273K hasta los 271.8852K. Sin embargo para una mejor comprensión del gráfico, hemos dibujado, con un color diferente, el tramo horizontal correspondiente a esa región, que el programa no es capaz de mostrar.

Sobre este gráfico resulta muy fácil observar el fenómeno del subenfriamiento de la solución intracelular, y la diferente composición del medio intracelular con respecto al medio extracelular.


148

Recordamos que la curva de equilibrio nos mostraba cuál era la nueva temperatura de cambio de fase líquido-sólido, cuando añadíamos al sistema soluto. Esta nueva temperatura era inferior a los 0ºC para el caso del agua, fenómeno que denominábamos Descenso Crioscópico. En el gráfico, vemos cómo conforme la solución intracelular va perdiendo agua, y por tanto va aumentando la concentración de los solutos disueltos, la temperatura de cambio de fase es cada vez menor, es decir, para formar hielo ya no basta con llegar a los 0ºC sino que hay que ir a temperaturas más bajas.

El medio intracelular, cuya evolución viene dada por la curva de deshidratación, de color azul, siempre tiene una temperatura inferior a la de cambio de fase.

Figura 9

En la figura 9 podemos apreciar cómo por ejemplo la temperatura T1= 271.5074K es la de cambio de fase cuando la fracción del volumen de la célula con respecto al inicial es 0.8, mientras que para esa misma deshidratación la temperatura en el interior de la célula es de T2=269.1881K. Vemos, por tanto, cómo la temperatura intracelular está por debajo de la de cambio de fase. A la diferencia es a lo que se llama SUBENFRIAMIENTO que en nuestro caso es de 2.3193ºC.

Para poder calcular estas temperaturas intermedias hemos introducido en el listado del programa del apartado 7.3.3.1 las siguientes líneas de código:


149

T1=interp1(V0,t0,.8) T2=interp1(V1,t1,.8)

Como ya hemos comentado anteriormente, la formación de hielo es de naturaleza probabilística, es decir, que aunque estemos por debajo de la temperatura de cambio de fase no tiene porqué formarse hielo. La formación de hielo es más probable cuanto más alejados estemos de dicha temperatura de cambio de fase o lo que es lo mismo, cuanto mayor sea el subenfriamiento del medio intracelular.

La curva de equilibrio, además de indicar el descenso crioscópico de la solución intracelular, también mostraba la evolución de la concentración de solutos en el medio extracelular, por evolucionar ésta por sucesivos estados de equilibrio.

Por lo tanto, para una determinada temperatura del sistema, la concentración de solutos en el medio intracelular vendrá dada por la curva de deshidratación, mientras que la concentración de solutos en el medio extracelular vendrá dada por la curva de equilibrio.

Figura 10

Cuando la temperatura del sistema, es de –4ºC, la composición del medio extracelular es la correspondiente a la que tendría el medio intracelular cuando, evolucionando por sucesivos estados de equilibrio (un enfriamiento infinitamente


150

lento), su volumen fuese el 26.68% del que tenía en el instante inicial. Esto se traduce en una concentración de soluto igual a 1.068M. Por otra parte la composición del medio intracelular es la asociada a un volumen que es el 77.75% del que tenía en el instante inicial, es decir, 0.3665M. Recordamos que la concentración de moles de soluto, tanto en el medio intracelular, como en el extracelular era de 0.285M.

Para poder calcular los volúmenes relativos a la temperatura de –4ºC hemos introducido en el listado del programa del apartado 7.3.3.1 las siguientes líneas de código:

V01=interp1(t0,V0,269) V02=interp1(t1,V1,269)

Vemos que el medio extracelular está en todo momento más concentrado, que el medio intracelular. Esta diferencia de concentración se traduce en un flujo de agua, que sale de la célula, y cuyo objetivo es aumentar la concentración de la solución dentro de la célula, para así igualarse con la del medio exterior. Este fenómeno ya fue descrito en el capítulo 2 , y se le denomina Flujo Osmótico.


151

7.3.3.3 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre la deshidratación

A continuación vamos a mostrar cómo son las curvas de deshidratación para distintas velocidades de enfriamiento. Dichas curvas serán mostradas simultáneamente en un mismo gráfico, para poder así estudiar el efecto que tiene la velocidad de enfriamiento sobre la deshidratación celular.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1ESPERMATOZOIDE DE RATÓN

TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

-1000ºC/min

-100ºC/min

-50ºC/min

-15ºC/min

-5ºC/min

Figura 11

El programa empleado para obtener este gráfico es el que se explicó en el apartado 7.3.3.1.

Lo primero que podemos comentar de la figura 11 es que el rango de temperatura que estamos contemplando es muy superior al de los gráficos anteriores. Aquí llegamos hasta –55ºC mientras que antes sólo habíamos llegado hasta –20ºC. La razón de ampliar el rango de temperaturas es que por debajo de –20ºC suceden cosas interesantes.

Lo más destacado de este gráfico es que cuanto más elevada es la velocidad de enfriamiento, menor es la deshidratación sufrida por la célula, para cada temperatura del sistema.


152

Por ejemplo, si enfriamos el sistema a una velocidad de 15ºC/min, cuando la temperatura del sistema es de –10ºC, la fracción del volumen celular con respecto al inicial es del 13.55%, lo que significa que hemos evacuado el 86.45% del agua disponible, muy próximo al límite teórico, marcado por la curva de equilibrio a esa temperatura, igual a una evacuación del 89.19% del agua disponible.

Sin embargo, si elevamos la velocidad de enfriamiento hasta los 50ºC/min, la fracción de volumen con respecto al inicial, a los –10ºC es del 64.90%, es decir, que sólo hemos evacuado el 35.10% del agua disponible.

Para obtener estos resultados numéricos deberíamos añadir las siguientes líneas de código al programa dado en el apartado 7.3.3.1:

V01=interp1(t0,V0,263) V02=interp1(t1,V1,263)

Figura 12

La razón de esta aparente pérdida de capacidad para deshidratarse, que manifiesta la célula a altas velocidades de enfriamiento, es que mientras la velocidad de enfriamiento puede ser todo lo alta que deseemos, la velocidad de deshidratación está limitada por la permeabilidad de la membrana, a un rango de


153

valores típicos, que originan una descompensación entre la velocidad a la que cambia la temperatura y la velocidad a la que se evacua agua, cuando la velocidad de enfriamiento es demasiado alta.

Es de esperar que cuanto mayor sea la permeabilidad de la membrana, mayores serán los valores típicos de velocidad de deshidratación. Por ello necesitaremos mayores velocidades de enfriamiento para descompensar la tasa de enfriamiento con la de deshidratación, y así poner de manifiesto un pérdida en la capacidad de la célula para deshidratarse. Para comprobar esto supongamos que la permeabilidad de la membrana la multiplicamos por 5, manteniendo constantes el resto de parámetros físicos.

Los resultados que obtenemos se muestran en la figura 13.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

-50ºC/min

-15ºC/min

Figura 13

Este gráfico se obtiene sustituyendo el valor de la permeabilidad dado en el programa del apartado 7.3.3.1, por otra permeabilidad cinco veces superior.

Observamos cómo ahora la deshidratación alcanzada, para ambas velocidades de enfriamiento, es igual a la marcada por el límite teórico de la curva de equilibrio.


154

Otro fenómeno que podemos observar cuando analizamos el gráfico donde se muestran las deshidrataciones para distintas velocidades de enfriamiento, es que independientemente de que el sistema haya sido enfriado lenta o rápidamente, la deshidratación se detiene por debajo de una cierta temperatura. En el caso que nos ocupa, del espermatozoide de ratón, esta temperatura está en torno a los –35ºC.

Para verlo más claramente, hemos vuelto a dibujar el gráfico, marcando la región, donde ya no hay deshidratación celular, en la figura 14.

Figura 14

La razón de este fenómeno, se discutió en el apartado 5 de EL COEFICIENTE DE PERMEABILIDAD O LA CONDUCTIVIDAD HIDRÁULICA DE LA MEMBRANA CELULAR del Capítulo 4. Se explicó, que cuanto más baja era la temperatura, menor era la permeabilidad de la membrana, hasta que llegábamos a una temperatura, para la cual la membrana se hacía impermeable. En el caso de espermatozoides de ratón esta temperatura estaba en torno a los –35ºC. Por debajo de esta temperatura la membrana es impermeable, impidiéndose el flujo osmótico de agua, deteniéndose de esta manera el proceso de deshidratación.

La evolución de la deshidratación celular en función del tiempo, para varias velocidades de enfriamiento, se muestra en la figura 15:


155

0 0.5 1 1.5 2 2.5 30

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TIEMPO/minutos

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

-100ºC/min

-50ºC/min

-15ºC/min

Figura 15

Los programas que permiten obtener este gráfico, se muestran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 2.

En este gráfico, además de las conclusiones obtenidas anteriormente, podemos ver también que, cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento, menor es el tiempo necesario para que la célula finalice el proceso de deshidratación.

Vemos también que el instante en el que comienza la deshidratación es ligeramente diferente, para cada velocidad de enfriamiento. Esto era de esperar pues, cuanto mayor sea la velocidad de enfriamiento, antes se alcanzarán los –1.1148ºC, que recordamos era la temperatura a la que comenzaba a formarse hielo en el medio extracelular.


156

7.3.3.4 Deshidratación para perfiles de enfriamiento no lineales

A continuación vamos a mostrar la evolución de la deshidratación, cuando el perfil de enfriamiento no es lineal. Plantearemos el caso de un perfil cuadrático y uno exponencial.

Para poner de manifiesto las posibles ventajas e inconvenientes de estos perfiles, trazaremos las curvas de deshidratación juntas en un mismo gráfico. Trazaremos las curvas, para el caso de perfiles de enfriamiento lineales con velocidades de enfriamiento de 15, 50 y 1000ºC/min. Los perfiles no lineales tendrán unas velocidades de enfriamiento iniciales, siguiendo las prescripciones del apartado 6.4 del capítulo 4.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

perfil lineal

perfil cuadrático

perfil exponencial

-15ºC/min

-50ºC/min

-1000ºC/min

Figura 16

Los programas que permiten obtener este gráfico, se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 3.

Analizando los resultados dados por el gráfico, vemos que cuando la velocidad de enfriamiento es o muy alta o muy baja, no se observa ninguna diferencia en el proceso de deshidratación celular, superponiéndose las curvas.


157

Sin embargo, para velocidades de enfriamiento intermedias, se observan diferencias. Cuando enfriamos mediante un perfil cuadrático, la célula se deshidrata menos que con un perfil lineal. Por otra parte, cuando enfriamos con un perfil exponencial, la célula se deshidrata más que con un perfil lineal.

Puesto que lo que nos interesa es alcanzar la máxima deshidratación posible, para así tener grandes descensos crioscópicos, el mejor perfil de enfriamiento es uno exponencial.

Las mismas conclusiones se obtienen si analizamos la evolución de la deshidratación en función del tiempo.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 30

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TIEMPO/minutos

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

Perfil lineal Perfil cuadrático

Perfil exponencial

100ºC/min

50ºC/min

15ºC/min

Figura 17

Los programas que hemos empleado para obtener este gráfico, se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 4.

Generalizando, interesan perfiles con velocidades de enfriamiento decrecientes, como es el caso del perfil exponencial, frente a perfiles con velocidades de enfriamiento constantes, como es el caso del perfil lineal, o velocidades crecientes, como es el caso del perfil cuadrático.


158


159

7.3.4 REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL SUBENFRIAMIENTO

7.3.4.1 Programación en MATLAB del subenfriamiento

Para analizar la evolución del subenfriamiento de la solución intracelular, con respecto a la temperatura del sistema, hemos desarrollado el siguiente programa.

Vi=3.1629*1e-17;%DATO n2=9.014*1e-15;%DATO A=3.5394*1e-10;%DATO ncpa=0 if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO E_Lgo=94.1*1e3;%DATO else Lgo=.004*1e-6;%DATO E_Lgo=63.6*1e3;%DATO end Tgo=273.15;%DATO [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-5 -15 -50] Tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lg o,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; t02=interp1(y0,t0,y1); if ncpa==0 plot(t1-273,t02-t1) else plot(t1-273,t02-t1,'g') end hold on; axis([-55 0 0 30]); end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR');

Para calcular el subenfriamiento, primero calculamos la curva de equilibrio, cuya solución viene dada por el par de vectores columna t0,y0. A continuación calculamos la curva de deshidratación, cuyo resultado se almacena en t1,y1.

El subenfriamiento se obtendría calculando la diferencia de temperatura que hay entre la curva de equilibrio y la de deshidratación para una composición dada. Si tomamos como composición de referencia la proporcionada por la integración de la curva de deshidratación, es decir, el vector columna y1,


160

entonces necesitamos conocer las correspondientes temperaturas de la curva de equilibrio que tienen asociadas dichas composiciones.

Interpolando las composiciones de la curva de la curva de deshidratación y1, en la curva de equilibrio t0,y0, obtendremos las temperaturas de la curva de equilibrio que tienen una composición igual a las composiciones del medio intracelular, dadas por la resolución de la curva de deshidratación.

En el programa esta interpolación se hace mediante el comando interp1 :

t02=interp1(y0,t0,y1);

Por lo tanto la curva de equilibrio tiene ahora dos formas de ser expresada:

• Forma 1: t0,y0, constituida por 83 pares de puntos. • Forma 2: t02,y1, constituida por 46 pares de puntos.

La curva de deshidratación tiene una única representación, dada por t1,y1, formada por 46 pares de puntos.


161

7.3.4.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el subenfriamiento

A continuación vamos a mostrar los resultados que se obtienen al ejecutar el programa anterior.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

5

10

15

20

25


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR

-50ºC/min

-30ºC/min

-5ºC/min -15ºC/min

-35ºC/min

Figura 18

En el eje vertical de la figura 18 representamos el subenfriamiento del medio intracelular, medido en grados centígrados, mientras que en el eje horizontal, mostramos la temperatura del sistema.

En la representación gráfica observamos una evolución en el comportamiento del subenfriamiento, conforme vamos aumentando la velocidad de enfriamiento del sistema.

Para bajas velocidades de enfriamiento, el subenfriamiento aumenta hasta alcanzar un máximo local, posteriormente disminuye para aumentar luego indefinidamente. Cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento, mayor es el valor del máximo local y menor es la temperatura a la que se produce. En la tabla adjunta se muestran los máximos locales cuando estos se producen.

VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO /( ºC/min)

SUBENFRIAMIENTO/ºC TEMPERATURA DEL SISTEMA/ ºC

-5 1.6749 -3.7219 -15 4.1653 -7.4918 -30 9.2192 -14.1716


162

Para poder obtener los valores numéricos de los máximos locales del subenfriamiento, hemos tenido que modificar el programa dado en el apartado 7.3.4.1,añadiendo nuevas líneas de código. El programa modificado, se muestra en el anexo PROGRAMAS , en el apartado 5.

Para altas velocidades de enfriamiento no se observa la presencia de ningún máximo local, siendo la evolución del subenfriamiento monótonamente creciente.

La velocidad crítica que limita estos dos modos de comportamiento del subenfriamiento está en torno a los 35ºC/min. A esta velocidad de enfriamiento, el subenfriamiento presenta un punto de inflexión, a los –25ºC aproximadamente.

Para poder comprender por qué el subenfriamiento evoluciona según se ha descrito anteriormente, tenemos que conocer cuales son los factores que le afectan.

Fundamentalmente hay dos factores que determinan el subenfriamiento del sistema:

1) La permeabilidad de la membrana.

1.a) Cuanto menor sea el valor de la permeabilidad, mayores serán los subenfriamientos del sistema para cada temperatura.

Esta afirmación es fácil de comprender. El subenfriamiento es la diferencia de temperatura que existe entre dos soluciones intracelulares de la misma composición, es decir, con la misma fracción de volumen con respecto al inicial, siendo el enfriamiento en una de ellas infinitamente lento (curva de equilibrio), y finito en la otra.

Cuando se enfría infinitamente despacio, el flujo osmótico originado por la formación de hielo en el medio extracelular, es capaz de mantener la solución intracelular en equilibrio con el medio exterior, sin importar el valor de la permeabilidad de la membrana. El hecho de que la permeabilidad sea muy baja, es decir, exista una gran dificultad para evacuar agua, no impide que el flujo osmótico permita mantener el equilibrio entre el medio intracelular y extracelular. Esto es debido a que los cambios de temperatura son tan lentos que los cambios de composición en el medio extracelular por la formación del hielo son prácticamente inapreciables, y por lo tanto con flujos osmóticos infinitesimales logramos equilibrar el medio intracelular con el extracelular.

Sin embargo cuando la velocidad de enfriamiento es finita, los cambios de composición en el medio extracelular, se producen a una velocidad apreciable. Así para mantener el equilibrio entre el interior y el exterior de la célula, ya no basta con flujos osmóticos infinitesimales, sino que se requieren caudales de deshidratación de una cierta magnitud.


163

Cuanto menor sea la permeabilidad, mayor será la dificultad para evacuar agua, y por tanto menor será el caudal del flujo osmótico.

Cuanto mayor sea la discrepancia entre el caudal osmótico requerido para mantener el equilibrio, y el caudal que realmente existe, mayores serán las diferencias entre el caso de velocidad de enfriamiento lento, donde siempre tenemos equilibrio, y el caso de enfriamiento finito. Esta discrepancia se traduce en un mayor subenfriamiento.

La conclusión es que cuanto menor sea la permeabilidad, mayor es el subenfriamiento.

Esto lo podemos comprobar gráficamente, mostrando el subenfriamiento a una velocidad de enfriamiento de 15ºC/min, para el caso de espermatozoides de ratón y para el caso de que multipliquemos el valor de la permeabilidad de la membrana por 2.

-20-18-16-14-12-10-8-6-4-200

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR

permeabilidad original

permeabilidad doble de laoriginal

Figura 19

El programa necesario para poder dibujar este gráfico, se encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 6.

Vemos como efectivamente, a mayor permeabilidad, tenemos un menor subenfriamiento.


164

1.b) El valor de la permeabilidad de la membrana celular es función de la temperatura. Cuanto menor es la temperatura del sistema, menor es el valor de la permeabilidad.

Por lo descrito anteriormente, podemos afirmar que cuanto menor es la temperatura del sistema, mayor debería ser el subenfriamiento por ser cada vez menor la permeabilidad.

Esto se observa en el comienzo del proceso de enfriamiento, para velocidades de enfriamiento lentas, y en su totalidad cuando la velocidad de enfriamiento es alta.

2) El gradiente de concentraciones.

Por lo que hemos explicado hasta ahora, queda claro que el origen último del subenfriamiento es la magnitud del caudal del flujo osmótico. Una reducción del valor de la permeabilidad de la membrana celular, para un gradiente de concentración dado, reduce el flujo osmótico aumentando de esta manera el subenfriamiento.

Sin embargo al cambiar el valor de la permeabilidad, el gradiente de concentración no permanece constante. Cuando se reduce la permeabilidad al disminuir la temperatura, mayor es la dificultad para evacuar agua. El efecto primario o principal que esto tiene es el de reducir el flujo osmótico. Pero al reducirse el flujo osmótico, la diferencia de concentración entre el medio intracelular y extracelular aumenta.

Puesto que el flujo osmótico es directamente proporcional al gradiente de concentración, la reducción de la permeabilidad de la membrana tiene un efecto secundario de disminuir el subenfriamiento.

La conclusión es que al disminuir la temperatura el gradiente de concentración entre el medio intracelular y extracelular aumenta, reduciéndose el subenfriamiento.

Vemos por tanto que existen dos efectos contrapuestos: la reducción de la permeabilidad que hace aumentar el subenfriamiento, y el aumento del gradiente de concentración que hace disminuir el subenfriamiento.

Para altas velocidades de enfriamiento, el efecto de la reducción de la permeabilidad es dominante frente al efecto del aumento del gradiente de concentración, siendo la respuesta del sistema la de un aumento indefinido del subenfriamiento.

Para bajas velocidades de enfriamiento se distinguen tres etapas en la evolución del subenfriamiento:

• Etapa 1: El efecto de la reducción de la permeabilidad es dominante frente al del aumento del aumento del gradiente de concentración, resultando un aumento del subenfriamiento.


165

• Etapa 2: El efecto del aumento del gradiente de concentración es dominante frente al de reducción de la permeabilidad, resultando una disminución en el subenfriamiento.

• Etapa 3: Finalmente el efecto de la reducción de la permeabilidad se hace definitivamente dominante, resultando un aumento indefinido del subenfriamiento.

Como resumen mostramos gráficamente las tres etapas, para una velocidad de enfriamiento de 15ºC/min:

-45-40-35-30-25-20-15-10-500

1

2

3

4

5

6

7

8

9


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

Figura 20


166

7.3.4.3 El subenfriamiento para perfiles de enfriamiento no lineales

Vamos a mostrar cómo son los subenfriamientos cuando sometemos el sistema a perfiles de enfriamiento lineales, cuadráticos y exponenciales.

Los mostraremos en un único gráfico para tratar de justificar cuál es el mejor perfil de enfriamiento. Para poder comparar los diferentes perfiles, tomaremos los parámetros de los distintos perfiles de enfriamiento tal como se explicaron en el apartado 7.2 .

La resolución gráfica de los subenfriamientos para los distintos perfiles es la que se muestra a continuación:

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

5

10

15

20

25


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR

-50ºC/min

-35ºC/min

-30ºC/min

-15ºC/min

-5ºC/min

Lineal

Cuadrático

Exponencial

Figura 21

El programa necesario para obtener este gráfico, se encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 7.

Analizando el gráfico, vemos que para bajas y para altas velocidades de enfriamiento, las diferencias en el subenfriamiento son muy pequeñas. Igualmente hay pocas diferencias a temperaturas próximas a los cero grados centígrados.

Para velocidades de enfriamiento intermedias y también a muy bajas temperaturas se aprecian diferencias notables. Los perfiles de enfriamiento


167

exponenciales dan subenfriamientos menores que los lineales, mientras que en los cuadráticos es al contrario.

Puesto que cuanto mayor es el subenfriamiento, mayor es la probabilidad de formación de hielo, el mejor perfil de enfriamiento es el exponencial.


168

7.3.5 REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL FLUJO OSMÓTICO

7.3.5.1 Programa en MATLAB del flujo osmótico

Para analizar la evolución del flujo osmótico, con respecto a la temperatura del sistema, hemos desarrollado el siguiente programa.

Vi=3.1629*1e-17;%DATO n2=9.014*1e-15;%DATO A=3.5394*1e-10;%DATO ncpa=0;%DATO if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO E_Lgo=94.1*1e3;%DATO else Lgo=.004*1e-6;%DATO E_Lgo=63.6*1e3;%DATO end Tgo=273.15;%DATO [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[ -15 ] tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2, A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; n=size(y1); for i=1:1:n(1,1) Q(i)=-B*1e18*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo, E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); end plot(t1-273,Q,'b','LineWidth',1) axis([-55 0 0 70]); title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)'); clear Q; end

Este programa se emplearía para calcular el flujo osmótico, cuando la célula se enfría con un perfil lineal, a una velocidad de 15ºC/min.

Para calcular el caudal evacuado por la célula, aplicamos un sencillo balance de masas. La masa de agua evacuada por la célula es igual a la reducción de masa dentro de la célula. Como la densidad del agua permanece


169

prácticamente constante, el balance de masas se transforma en un balance de volúmenes:

dtdT

dTdV

dtdV

Q ⋅==

La derivada del volumen de la célula, con respecto a la temperatura del sistema es precisamente la expresión de la ecuación diferencial que pretendo resolver, y que está codificada en lenguaje MATLAB en el archivo 'enfr_id_lineal'. Por ello el caudal de agua evacuada para cada temperatura del sistema, se programa del siguiente modo:

El resto de variables son análogas al de los otros programas.

Q(i)=-*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]);


170

7.3.5.2 Efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el caudal de flujo osmótico

A continuación vamos a aplicar el programa anteriormente descrito para mostrar cual es la evolución del caudal de agua evacuado por la célula, en el proceso de deshidratación.

Representamos los caudales de deshidratación para distintas velocidades de enfriamiento, en función de la temperatura del sistema en la figura 22.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

10

20

30

40

50

60

70


TEMPERATURA/ºC

FL

UJO

VO

LU

ME

NT

RIC

O D

E A

GU

A(m

icra

s3 /m

in)

-5ºC/min

-15ºC/min

-30ºC/min

-50ºC/min

-1000ºC/min

Figura 22

En el eje vertical del gráfico de la figura 22 mostramos el caudal de agua evacuada por la célula, expresado en micras cúbicas por minutos, mientras que en el eje horizontal mostramos la temperatura del sistema, en grados Celsius.

Lo primero que hay que hacer notar del gráfico, es que el caudal inicial de deshidratación no es nulo. En nuestro caso, cuando alcanzamos la temperatura de cambio de fase , que recordamos era –1.1148ºC, el caudal evacuado por la célula es de 1.8921 µm3 ⁄ min, independientemente de la velocidad de enfriamiento. Este valor numérico del caudal en el instante inicial se obtiene del primer elemento del vector Q , que contiene el valor de los caudales.

Para explicar el comportamiento de la evolución del caudal osmótico, recurriremos a los conceptos que empleamos para explicar la evolución del subenfriamiento.


171

El caudal osmótico, dependía de dos factores, cuyos efectos eran opuestos:

• La permeabilidad de la membrana. Conforme disminuye la temperatura, la membrana reduce su permeabilidad. Este efecto tiende a reducir el valor del caudal osmótico.

• El gradiente de concentraciones. Conforme disminuye la temperatura, la diferencia de concentración entre el medio intracelular y extracelular va aumentando, como consecuencia de la impermeabilización de la membrana. Este efecto tiende a aumentar el valor del caudal osmótico.

En el inicio del enfriamiento, a temperaturas elevadas el valor de la permeabilidad es bastante alto, y por tanto el efecto del gradiente de concentraciones es dominante frente al de la permeabilidad. Sin embargo llega un momento en que ambos efectos se contrarrestan, alcanzándose un máximo en la evolución del caudal, para posteriormente disminuir, y tender asintóticamente al caudal nulo, al ser dominante el efecto de la reducción de la permeabilidad de la membrana.

Sin embargo, hay algo en el gráfico que no tiene sentido. El gráfico nos muestra que cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento, mayor es el caudal de deshidratación, a cualquier temperatura. Por otra parte, cuando estudiábamos los gráficos de deshidratación, vimos que cuanto mayor era la velocidad de enfriamiento, menor era la deshidratación que sufría la célula, por lo que los caudales deberían ser mayores conforme disminuyésemos la velocidad de enfriamiento, por sufrir estas células una mayor deshidratación.

Para resolver esta aparente contradicción hay que tener en cuenta que aunque los caudales para cada temperatura sean mayores, a altas velocidades de enfriamiento, el tiempo durante el que están actuando es menor, siendo por tanto el caudal acumulado menor, que en el caso de tener menores caudales pero actuando durante más tiempo.

Efectivamente, si dibujamos la evolución del caudal de deshidratación en función del tiempo, para una velocidad de enfriamiento alta, y para otra baja, tenemos el gráfico que mostramos en la figura 23.


172

0 0.5 1 1.5 2 2.5 30

10

20

30

40

50

60

70


TIEMPO/MIN

FL

UJO

VO

LU

ME

NT

RIC

O D

E A

GU

A(m

icra

s3 /m

in)

-5ºC/min

-50ºC/min

Figura 23

El programa empleado para poder dibujar este gráfico, se muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 8.

Vemos como efectivamente, a pesar de tener un caudal mayor, en promedio, durante el enfriamiento rápido, la deshidratación dura menos tiempo. El caudal medio evacuado por una célula durante un enfriamiento a 15ºC/min es de 7.1949 µ3⁄min, mientras que el caudal medio para un enfriamiento de 50ºC/min es de 25.43 µ3 ⁄ min.

Si calculamos el área bajo estas curvas, llegaremos a la conclusión de que durante el enfriamiento lento el caudal acumulado, durante el proceso de deshidratación es mayor, que en el caso del enfriamiento rápido. Para el caso de un enfriamiento a 15ºC/min, el caudal acumulado, es decir, el caudal total evacuado es de 30.7070 µm3, mientras que para un enfriamiento de 50ºC/min es de 23.673 µm3.

Para obtener los valores numéricos, tanto de la media de los caudales evacuados, como del área bajo la curva de caudal, hemos de introducir nuevas líneas de código, sobre el programa que me permitió dibujar la evolución del caudal osmótico con respecto al tiempo. Estas modificaciones se muestran en el anexo PROGRAMAS en el apartado 9.


173

La contradicción queda por tanto resuelta. Tan sólo queda encontrar la razón por la cual a altas velocidades de enfriamiento se dan mayores máximos en el caudal de deshidratación.

La razón de nuevo la encontramos analizando los factores que afectan al valor del caudal de deshidratación. Puesto que la velocidad de enfriamiento afecta por igual al valor de la permeabilidad, es decir, la permeabilidad depende de la temperatura, pero no de cómo se modifica ésta. Por lo tanto el causante del elevado caudal para altas velocidades de enfriamiento debe ser el gradiente de concentración. Si representamos gráficamente la evolución de la concentración de soluto dentro de la célula, y fuera de ella obtenemos el siguiente gráfico:

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

/(m

ol/

m3

)

ESPERMATOZOIDE DE RATÓN

TEMPERATURA/ºC

-15ºC/min

-30ºC/min

-35ºC/min

-50ºC/min

medio extracelular medio intracelular

Figura 24

El programa necesario para poder dibujar este gráfico, se encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 9.

Vemos cómo, para altas velocidades de enfriamiento, la diferencia de concentración entre la solución intracelular y extracelular es mayor ,para cada temperatura. Puesto que el flujo osmótico es directamente proporcional a dicho gradiente de concentración, es una consecuencia lógica que tengamos mayores caudales, en promedio, para un enfriamiento rápido, frente a uno más lento.


174

Es conveniente hacer un comentario adicional, acerca de la evolución de los caudales del flujo osmótico en función del tiempo. Hemos visto como cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento, mayor es el máximo de caudal, y mayor es en promedio el caudal evacuado. Un mayor caudal saliendo por los poros de la membrana celular, supone una mayor presión ejercida sobre la paredes de los poros de la membrana. Si el pico de caudal es demasiado elevado, puede dar lugar a la rotura del poro, y en consecuencia, a la rotura de la membrana.

Por lo tanto, velocidades de enfriamiento demasiado elevadas, pueden dar lugar a la muerte celular, por rotura de la membrana.


175

7.3.5.3 Curvas de flujo osmótico para perfiles de enfriamiento no lineales

A continuación vamos a mostrar la evolución del caudal evacuado por la célula, cuando la sometemos a enfriamientos que siguen un perfil no lineal. Para poder comparar con el caso lineal, representaremos simultáneamente el flujo osmótico, para un perfil lineal, uno cuadrático, y otro exponencial.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

10

20

30

40

50

60

70


TEMPERATURA/ºC

CA

UD

AL

DE

AG

UA

(mic

ras3 /m

in)

lineal cuadrático exponenc ial

-50ºC/min

-30ºC/min

-15ºC/min

-5ºC/min

Figura 25

El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 10.

Al analizar este resultado gráfico, vemos como no hay diferencias apreciables en la evolución del caudal evacuado por la célula, entre los distintos perfiles de enfriamiento.

Recordamos que las velocidades que aparecen indicadas en el gráfico, son las velocidades iniciales de los perfiles cuadrático y exponencial.


176

7.3.6 REPRESENTACIÓN GRÁFICA A TEMPERATURA CONSTANTE

7.3.6.1 Introducción

En los protocolos de criopreservación que se han desarrollado hasta la fecha, es una práctica habitual mantener las muestras a temperatura constante durante un cierto periodo de tiempo[10, 15, 17].

En este apartado vamos a analizar qué efecto tiene sobre una célula, que ha sido enfriada siguiendo un determinado perfil de enfriamiento, el hecho que detengamos el proceso de enfriamiento, y mantengamos la temperatura del sistema constante.

Primeramente, vamos a razonar que fenómenos físicos se pueden esperar que sucedan en la célula cuando en un instante determinado del subenfriamiento mantenemos la temperatura constante. A continuación determinaremos numéricamente la evolución de la deshidratación durante el periodo de temperatura constante, si es que existe deshidratación, y así comprobar los razonamientos hechos anteriormente. Por último simularemos un protocolo de enfriamiento, que intercale periodos de temperatura constante, entre etapas de enfriamiento lineal.

Comenzaremos pues razonando que es lo que podemos esperar que suceda cuando la célula, tras ser sometida a un perfil de enfriamiento, se mantiene a temperatura constante.

Hasta ahora, hemos visto que cuando enfriamos a una célula a una velocidad de enfriamiento finita, sin importar el tipo de perfil, la temperatura en el interior de la célula está por debajo de la temperatura de cambio de fase, es decir, el sistema está subenfriado. El subenfriamiento es tanto mayor cuanto mayor sea la velocidad del enfriamiento. El subenfriamiento es un fenómeno indeseable pues cuanto mayor es, mayor es la probabilidad de que se forme hielo en el interior de la célula.

La razón que encontramos para explicar este fenómeno fue que la velocidad con la que debía aumentar la concentración de la solución intracelular para no tener subenfriamiento, es decir, para estar en equilibrio con la composición del medio extracelular, requería una velocidad de evacuación de agua desde el interior de la célula, que el mecanismo de la ósmosis era incapaz de proporcionar.

Sin embargo, si mantenemos la temperatura del sistema constante, el medio extracelular ya no modificará su composición. El medio intracelular estará más diluido debido al subenfriamiento que padece, pero mientras persista la situación de temperatura constante, la ósmosis va igualando las


177

composiciones, hasta que finalmente desaparece el subenfriamiento, y con él la probabilidad de que se forme hielo.

Vemos por tanto que mantener el sistema a temperatura constante, lo estabiliza, reduciendo o eliminando el subenfriamiento acumulado durante etapas anteriores de enfriamiento.

A continuación vamos a calcular la evolución de esta deshidratación, y ver así cuanto tiempo es necesario para reducir el subenfriamiento hasta un valor razonable.


178

7.3.6.2 Programación en MATLAB de la deshidratación a temperatura constante.

Los programas que hemos desarrollado para ver como evoluciona la deshidratación de la célula con respecto al tiempo son dos. El primero contiene la ecuación diferencial que modela la deshidratación a temperatura constante, mientras que el segundo programa se encarga de integrar la ecuación dada por el primer programa.

El programa que contiene la ecuación diferencial de la deshidratación en el caso de un periodo a temperatura constante es:

function varargout=Tcte_id(t,y,flag,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiempoTcte,to,ncpa,Vmcpa) if nargin<14 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;% CASO GLICEROL. end if nargin<13 | isempty(ncpa) ncpa=0;%por defecto no hay crioprotector. end if nargin<12 | isempty(to) to=0;%el tiempo cuenta a partir de cero end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init(to,tiempoTcte); case 'events' [varargout{1:3}]=events(t,y,Vi,n2,A,ncpa); otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(Tcte); Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/Tcte-1/Tgo))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. aux=(Lg*A*R*Tcte/VmA); sum=log((y-Vsol)/((y-Vsol)+VmA*nsol)); dydt=[aux*(SLf-sum)]; function [tspan,y0,options]=init(to,tiempoTcte) tspan=[to to+tiempoTcte]; y0=[3.1629*1e-17]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

Las únicas variables nuevas, con respecto a las que hemos estado viendo hasta ahora son Tcte y tiempoTcte. La primera le muestra al programa cual es la temperatura constante a la que sometemos el sistema. La segunda le indica al programa cuanto tiempo dura esta etapa.


179

El programa que contiene la integración de la ecuación anterior es :

Vi=3.1629*1e-17; n2=9.014*1e-15; A=3.5394*1e-10; Tcte=268;%TEMPERATURA A LA QUE SE LLEVA A CABO LA DESHIDRATACIÓN. tiempoTcte=1;%DURACIÓN DE ETAPA A T CTE EN MINUTOS. options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); for ncpa=[0] if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6; E_Lgo=94.1*1e3; else Lgo=.004*1e-6; E_Lgo=63.6*1e3; end Tgo=273.15; [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); Veq=interp1(t0,y0,Tcte); for B=[-5 -15 -30 -50] Tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); Vo=interp1(t1,y1,Tcte); [t2,y2]=ode45('Tcte_id',[],Vo,options,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiempoTcte,[],ncpa,[]); V2=y2./Vi; if ncpa==0 plot(t2,V2,'b','LineWidth',1) else plot(t2,V2,'g','LineWidth',1) end hold on; n=size(t2); Vfinal=y2(n(1,1)); plot(t2,t2.*Veq./(Vi*t2),'r:') hold on; end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TIEMPO/MIN'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA'); clear all;

Este programa se emplearía para estudiar la deshidratación a una temperatura constante de 268K durante un periodo de tiempo de un minuto.

En la primera parte del programa introducimos los parámetros físicos de la célula. A continuación determinamos cual es el volumen mínimo que podría


180

alcanzar la célula si la mantenemos indefinidamente a temperatura constante, es decir, calculamos el volumen de equilibrio para esa temperatura.

[t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); Veq=interp1(t0,y0,Tcte);

A continuación calculamos cual es el volumen de la célula, cuando la temperatura alcanza los 268K.

[t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); Vo=interp1(t1,y1,Tcte);

Por último calculamos la deshidratación a temperatura constante, y dibujamos el gráfico.

El programa está preparado para comparar la deshidratación con y sin crioprotector de ahí que exista un bucle con respecto a la variable ncpa que contiene los moles disueltos de crioprotector en el interior de la célula.


181

7.3.6.3 Resolución numérica y representación gráfica de la deshidratación a temperatura constante

A continuación vamos a mostrar gráficamente cómo se va deshidratando la célula cuando, tras ser enfriada a una velocidad de 50ºC/min, se mantiene su temperatura constante cuando alcanza los 268K (-5ºC).

Primero vamos a mostrar la deshidratación durante el enfriamiento lineal a 50ºC/min. Esto se muestra en la figura 26.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

Punto en el que comienzala etapa a temperaturaconstante.

-50ºC/min

curva de equilibrio

Figura 26

Cuando la etapa de temperatura constante comienza, el volumen de la célula es un 88.64% del que tenía inicialmente. La máxima deshidratación que podemos alcanzar para esa temperatura viene dada por la curva de equilibrio, y es igual a 21.39% del volumen inicial.

La evolución de la deshidratación con el tiempo, a partir del instante en el que el sistema alcanza los –5ºC se muestra en la figura 27.


182

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TIEMPO/MIN

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

Volumen de la célula cuando comienza laetapa de temepraturaconstante

Volumen de la célula en el equilibrio a la temperatura de -5ºC

Figura 27

Vemos cómo en menos de un minuto, el medio intracelular ha alcanzado las condiciones de equilibrio.


183

7.3.6.4 Aplicación de la etapa de deshidratación a temperatura constante para la optimización de protocolos de enfriamiento

En el apartado anterior 7.3.6.3, hemos mostrado cómo en una etapa a temperatura constante, el subenfriamiento se reduce.

Estas etapas de temperatura constante podemos intercalarlas entre etapas de enfriamiento, para ir recortando el subenfriamiento, que el enfriamiento finito induce en el interior de la célula.

A modo de ejemplo vamos a analizar un protocolo en el que el subenfriamiento nunca sea superior a los 5ºC. Cada vez que alcancemos esta cota, dejaremos de enfriar, manteniendo el sistema a temperatura constante el tiempo necesario, para que el volumen celular sea al menos un 99% del máximo alcanzable para esa temperatura, es decir, un 99% del volumen de equilibrio.

El número de etapas no conviene que sea demasiado elevado. En el ejemplo que proponemos a continuación, una célula será sometida a una velocidad de enfriamiento de 30ºC/min, aplicando 4 etapas de temperatura constante. La resolución del sistema muestra que la cota de 5ºC de subenfriamiento se da en este caso a los –6ºC, -31ºC, -36ºC, y 42ºC aproximadamente. La evolución del subenfriamiento se muestra en la figura 28.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NTO

Enfriam iento l ineal a 30ºC/m in

Temperatura cte

Figura 28


184

Aquí podemos apreciar lo poderosa que es esta herramienta, para no incurrir en elevados valores de subenfriamiento, manteniendo de este modo controlado la posible formación de hielo. Para poder apreciar mejor la bondad de este método podemos superponer la evolución del subenfriamiento, si no intercalamos etapas a temperatura constante. Esto se muestra en la figura 29

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

1

2

3

4

5

6

7

8

9


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O

Enfriamientolineal a 30ºC/m in

Etapa detemperatura cons tante

Enfriam ientolineal a 30ºC/m incontinuo

Figura 29

El programa necesario para poder dibujar los dos gráficos anteriores se encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 11.

La evolución de la deshidratación con la temperatura, cuando intercalamos estas etapas de temperatura constante se muestra en la figura 30.


185

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIO

N V

OL

UM

EN

IN

ICIA

L

Curva de equilibrio

Enfriamiento lineala 30ºC/min a tramos Temperatura constante

Enfriamiento lineala 30ºC/min continuo

Figura 30

El programa necesario para poder obtener el gráfico anterior se muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 12.

Podemos ver cómo tras la primera etapa de temperatura constante, las deshidrataciones sucesivas para reducir el subenfriamiento son muy pequeñas, pero por encontrarse cerca del equilibrio es más costoso en tiempo aproximar la curva a la de equilibrio. Además en el tramo final de deshidratación donde la curva se hace muy horizontal, los subenfriamientos crecen muy deprisa requiriéndose con una mayor frecuencia el uso de etapas a temperatura constante, para mantener controlado el subenfriamiento.

En estos gráficos, donde estamos representando frente a la temperatura, las etapas de enfriamiento, parecen predominar (ocupan la mayor parte del gráfico), frente a las de temperatura constante. Sin embargo sucede todo lo contrario como vemos en el gráfico de la figura 31 donde mostramos la deshidratación con respecto al tiempo.


186

0 1 2 3 4 5 6 70

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TIEMPO/min

FR

AC

CIO

N V

OL

UM

EN

IN

ICIA

L

Enfriamiento lineal a 30ºC/min

Temperatura cte

Enfriamiento lineal a 30ºC/mins in etapas de temperaturaconstante

Figura 31

El programa necesario para poder obtener el gráfico anterior se muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 13.

Vemos cómo efectivamente, las etapas de temperatura constante, son las que consumen la mayor parte del tiempo del protocolo.

También hemos dibujado cómo sería la evolución del protocolo si no aplicásemos ninguna etapa de temperatura constante, para controlar el subenfriamiento. Aparentemente son muy parecidas, sin embargo esto es engañoso.Vemos que la curva a trazos que representa la evolución de la deshidratación sin etapas a temperatura constante, finaliza antes de los tres minutos. En el programa esta curva de dibuja hasta que llega a los 190K, es decir, los –83ºC. Sin embargo la curva con tramos a colores rojo y verde que representa la deshidratación con etapas de temperatura constante, cuando finaliza la última etapa de temperatura constante, en torno a los seis minutos, tan sólo ha alcanzado los –42ºC aproximadamente.

De esto se deduce que la evolución de la deshidratación es muy diferente.

A continuación mostramos una tabla que contiene la duración de cada una de las etapas en segundos, así como la temperatura final de la etapa de enfriamiento lineal, que es la misma que la de temperatura constante, y el tiempo acumulado del protocolo, es decir lo que va durando el protocolo.


187

Etapa

Duración de la etapa de

enfriamiento lineal/s


temperatura constante/s

Temperatura final de la etapa a temperatura constante/ºC

Duración del protocolo/min

1 12.6259 28.5938 -6.3129 0.6870 2 49.3260 33.0584 -30.9759 2.0601 3 11.2512 73.4934 -36.6016 3.4725 4 10.2177 153.1938 -41.7104 6.1960

El programa que se encarga de dibujar la evolución de la deshidratación con el tiempo, nos proporciona también los valores numéricos de esta tabla.

Si fuéramos más exigentes a la hora de controlar el subenfriamiento, podríamos establecer que este alcanzara un valor máximo de 2ºC, por ejemplo. Esto se traducirá en un protocolo más seguro, puesto que tenemos menos probabilidades de formar hielo dentro de la célula, pero también sería un protocolo más largo y complicado pues el número de etapas a temperatura constante deben aumentar. Efectivamente, si establecemos como subenfriamiento límite los 2ºC, necesitaríamos 10 etapas de temperatura constante, para poder alcanzar los –35ºC. Esto se ve en la figura 32.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NTO


Temperatura cte

Figura 32


188

El programa necesario para poder dibujar este gráfico es el mismo que el del caso anterior, salvo que el número de etapas es ahora 10, y el subenfriamiento máximo admisible es 2ºC..

En la figura 32, vemos lo complicado que se hace controlar el subenfriamiento, por debajo de los –20ºC, necesitándose un elevado número de etapas a temperatura constante.

La evolución de la deshidratación con la temperatura la mostramos en la figura 33.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIO

N V

OL

UM

EN

IN

ICIA

L


Temperatura cte

Curva de equilibrio

Figura 33

Finalmente la evolución de la deshidratación con el tiempo se muestra en la figura 34.


189

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TIEMPO/min

FR

AC

CIO

N V

OL

UM

EN

IN

ICIA

L


Temperatura cte

Enfriamiento lineal a 30ºC/min s in etapas de temperatura constante

Figura 34

Es importante no equivocarse al decir que este protocolo dura menos que el descrito en la figura 31, a pesar de que tiene más etapas. En el protocolo el sistema llegaba hasta los –42ºC aproximadamente, mientras que este, solo alcaza los –35ºC.

La tabla que muestra las evoluciones del protocolo se muestra a continuación.

Etapa







1 6.2520 50.6662 -3.1260 0.9486 2 4.7825 15.1855 -5.5172 1.2814 3 30.9070 8.6828 -20.9708 1.9413 4 6.1542 11.2664 -24.0479 2.2316 5 4.5987 12.1529 -26.3472 2.5108 6 3.7804 16.2405 -28.2375 2.8445 7 4.2298 18.9547 -30.3524 3.2309 8 3.9272 27.4238 -32.3159 3.7534 9 3.3347 29.8253 -33.9833 4.3061 10 2.5324 33.6247 -35.2495 4.9087


190

Como conclusión podemos decir, que el emplear etapas de temperatura constante como herramienta para controlar el subenfriamiento del sistema es menos interesante de lo que al principio imaginábamos, debido a que se requieren un elevado número de ellas a bajas temperaturas para mantener el subenfriamiento dentro de unos límites razonables.

Esto se traduce en una mayor duración del protocolo, con lo que podemos causar daños a la célula, por mantenerla demasiado tiempo en contacto con altas concentraciones de electrolitos y de crioprotector en caso de añadirlo.

Por lo tanto si queremos emplear esta herramienta, que se ha mostrado muy eficaz para controlar los subenfriamientos, debemos optimizar la frecuencia de su aplicación para preservar la integridad de la célula, manteniendo controlado lo más posible el subenfriamiento, pero no prolongando excesivamente en el tiempo la exposición a altas concentraciones de electrolitos.

El objetivo fundamental de un protocolo de criopreservación es llevar el sistema hasta una temperatura segura, en un tiempo razonable para evitar daños asociados a la alta concentración de solutos disueltos, habiendo generado la mínima cantidad de hielo intracelular, tanto en el medio intracelular, como en el extracelular.

El tiempo razonable se controlaría, limitando el número de etapas en la que la temperatura permaneciera constante, así como la duración de dicha etapa, mientras que minimizar la cantidad de hielo formado se controlaría con el máximo subenfriamiento admisible.

Ambos objetivos se contraponen, puesto que cuanto menor sea el subenfriamiento máximo, mayor será el número de etapas a temperatura constante que necesitaremos para alcanzar una temperatura fija.

Para mostrar estas ideas podemos preparar un programa similar a los que hemos empleado para dibujar los protocolos descritos hasta ahora, pero en el que el número de etapas de temperatura constante no sea fijado por el programador, sino que venga determinado en función de alguna condición. En el apartado 14 del anexo PROGRAMAS, se muestra el programa que dibuja el subenfriamiento en función del tiempo, con la condición de que el número de etapas sea tal que la temperatura del sistema sea de –40ºC, siempre que el número de etapas sea inferior a 20. Esto significa que si el sistema necesita más de 20 etapas para alcanzar los –40ºC, no llegará a esa temperatura, para no alargar excesivamente la duración del protocolo.

Al aplicar este programa al caso de un subenfriamiento límite de 2ºC, el número de etapas necesarias para alcanzar los –40ºC es de 14. La evolución de este protocolo se muestra en la tabla adjunta.


191

Etapa







1 6.2520 50.6662 -3.1260 0.9486 2 4.7825 15.1855 -5.5172 1.2814 3 30.9070 8.6828 -20.9708 1.9413 4 6.1542 11.2664 -24.0479 2.2316 5 4.5987 12.1529 -26.3472 2.5108 6 3.7804 16.2405 -28.2375 2.8445 7 4.2298 18.9547 -30.3524 3.2309 8 3.9272 27.4238 -32.3159 3.7534 9 3.3347 29.8253 -33.9833 4.3061 10 2.5324 33.6247 -35.2495 4.9087 11 2.7781 37.9019 -36.6386 5.5867 12 3.1217 55.2292 -38.1994 6.5592 13 1.9001 45.4131 -39.1495 7.3478 14 2.0895 54.8505 -40.1942 8.2968

La evolución gráfica del subenfriamiento con el tiempo se muestra en la figura 35.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

1

2

3

4

5

6

7

8

9


TIEMPO/min

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O

Subenfriam iento duranteenfriam iento lineal continuo. Etapa de enfriam iento l ineal

Etapa de temperatura cons tante

Límite de subenfriamiento

Figura 35


192

Hasta ahora los protocolos se han llevado a cabo a una única velocidad de enfriamiento lineal, de 30ºC/min. ¿Qué efecto tiene sobre el protocolo la modificación de dicha velocidad?

En la figura 36 mostramos simultáneamente dos protocolos de enfriamiento donde el subenfriamiento máximo admisible es de 5ºC, pero en uno la velocidad de enfriamiento lineal es de 30ºC/min, y en el otro es de 90ºC/min.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

5

10

15

20

25


TIEMPO/min

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O

Enfriamiento lineal continuo a 30ºC/min

Enfriamiento lineal continuo a 90ºC/min

Enfriamiento lineal a tramos a 30ºC/min

Enfriamiento lineal a tramos a 90ºC/min

Límite del subenfriamiento

Figura 36

Se ve cómo una mayor velocidad de enfriamiento se traduce en un mayor número de etapas para llegar a una temperatura determinada, que establecimos en –40ºC, y en una mayor duración del protocolo. Pasamos de 4 etapas que duran aproximadamente seis minutos durante el enfriamiento a 30ºC/min, a 8 etapas y nueve minutos durante el enfriamiento a 90ºC/min.

En el caso de que la velocidad de enfriamiento sea menor de los 30ºC/min, se tiene en cuenta en la figura 37.


193

0 1 2 3 4 5 6 7 80

5

10

15

20

25


TIEMPO/min

SU

BE

NF

RIA

MIE

NTO

Enfriamiento continuolineal a 30ºC/min

Enfriamiento continuolineal a 15ºC/min

Enfriamiento a tramoslineal a 15ºC/min

Enfriamiento a tramoslineal a 30ºC/min

Límite de subenfriamiento

Figura 37

El número de etapas necesarias se reduce drásticamente a dos, pero esto se debe fundamentalmente a que a tan baja velocidad de enfriamiento no se requiere la introducción de una etapa a enfriamiento constante hasta los dos minutos y medio aproximadamente. Por el contrario la duración del protocolo es superior, al ser la velocidad de enfriamiento menor.

Etapa







1 150.2700 84.0262 -37.5675 3.9049 2 21.5173 180.0000 -42.9468 7.2636

Llegamos a la conclusión de que cuanto mayor sea la velocidad de enfriamiento, más rápidamente crece inicialmente el subenfriamiento, y por tanto antes se requiere la ejecución de etapas de temperatura constante. Esto se traduce en un mayor número de ellas. Por lo tanto el menor tiempo que duran las etapas de enfriamiento se compensa con el mayor número de etapas de enfriamiento constante necesarias. Esto constituye un problema de optimización que se escapa a los objetivos de este proyecto y que resultaría interesante abordar en un futuro.


194

7.4. ANÁLISIS TEÓRICO DEL EFECTO DE LOS PARÁMETROS FÍSICOS DE LAS CÉLULAS SOBRE LA DESHIDRATACIÓN

7.4.1 INTRODUCCIÓN

Hasta ahora hemos estudiado el proceso de deshidratación con un único tipo de célula, el espermatozoide de ratón. Hemos calculado los subenfriamientos típicos, así como los flujos osmóticos para diversas velocidades de enfriamiento.

Si aplicamos los mismos perfiles de enfriamiento a otro tipo de células, ¿tendremos los mismos subenfriamientos y flujos osmóticos? Si la respuesta fuera afirmativa, un único protocolo de enfriamiento, optimizado para un tipo de célula particular como por ejemplo esperma de ratón, serviría para criopreservar cualquier otro tipo de célula. Esto sería muy deseable pues podrían desarrollarse protocolos altamente optimizados, mediante un gran número de ensayos de laboratorio, para conservar esperma humano o cualquier otro tipo de célula humana, empleando células de otros animales en los ensayos. Por el contrario, si los subenfriamientos y flujos osmóticos varían de un tipo a otro de célula, cuando aplicamos un mismo perfil de enfriamiento, debemos buscar para cada tipo de célula su propio protocolo particular.

A continuación comprobaremos estudiando la deshidratación de un óvulo de ratón no fertilizado, que el protocolo de criopreservación universal no existe, es decir, cada tipo de célula tiene su propio protocolo.

Por último discutiremos el efecto que tiene sobre la deshidratación dos parámetros físicos de la célula:

• La permeabilidad de la membrana celular. • El ratio Área de la membrana / Volumen de la célula.


195

7.4.2 EL ÓVULO DE RATÓN NO FERTILIZADO

7.4.2.1 Parámetros físicos

Para poder resolver las ecuaciones de deshidratación y de equilibrio, necesitamos conocer una serie de datos físicos, referentes a la célula que estemos considerando, en nuestro caso, óvulos de ratón no fertilizados.

Los datos físicos necesarios para desarrollar el modelo matemático son exactamente los mismos que los que necesitamos para el caso del espermatozoide de ratón.

Los valores numéricos de los parámetros físicos, anteriormente descritos, para el caso particular de espermatozoides de ratón son:

Ø Permeabilidad de la membrana o Permeabilidad de referencia: LPg=0.43 µm ⁄ (min atm) o Energía de activación: ELp=58.6152 KJ ⁄ mol o Temperatura de referencia: Tg=293 K

Ø Área de la membrana: La calculo asumiendo que el óvulo es una esfera de 38.26 µm de radio:

21022 1018418400)26.38(4 mmA −⋅==⋅⋅= µπ

Ø Volumen de disolución inicial. o Fracción de volumen celular osmóticamente inactivo: 20% o Volumen celular: Lo calculo asumiendo que el óvulo es una

esfera con las dimensiones dadas anteriormente:

330, 234690)26.38(

34

mVcell µπ =⋅=

Por lo tanto el volumen de disolución intracelular en el instante inicial es:

31730 102.18775187752234690)20.01( mmV −⋅==⋅−= µ

Ø Numero de moles de sal dentro de la célula. o Concentración inicial de la sal: 0.376 M o Volumen de disolución inicial: V0=18775.2×10-17 m3.

Por lo tanto el numero de moles de soluto, será el producto de la concentración molar, por el volumen de disolución intracelular:

molesmlitros

mlitro

molesnB

153

317 10705951

1000102.18775376.0 −− ⋅=×⋅×=


196

7.4.2.2 Comparativa de la deshidratación celular

Haciendo uso de los mismos programas que empleamos para obtener la evolución de la deshidratación en espermatozoides de ratón, pero utilizando los parámetros físicos propios de los óvulos de ratón no fertilizados, vamos a estudiar el proceso de deshidratación así como la evolución de los subenfriamientos.

En la figura 38 mostramos simultáneamente la evolución de la deshidratación en espermatozoides y óvulos no fertilizados de ratón, cuando son sometidos a una misma velocidad de enfriamiento lineal de 30ºC/min:

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

DESHIDRATACIÓN CELULAR

Óvulo de ratón

Esperma de ratón

Figura 38

Se ve cómo para una misma velocidad de enfriamiento los óvulos de ratón han sufrido una menor deshidratación. Hay por tanto una mayor tendencia a retener agua dentro de la célula, para cada temperatura.

Si estudiamos la evolución del subenfriamiento de la solución intracelular, obtendremos los resultados que se muestran en la figura 39.


197

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30

TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR

SUBENFRIAMIENTO INTRACELULAR

Óvulo de ratónenfriado a 30ºC/min

Esperma de ratónenfriado a 30ºC/min

Figura 39

Para cada temperatura los subenfriamientos sufridos por los óvulos de ratón, son mayores que en los espermatozoides. Por lo tanto la probabilidad de que se forme hielo en el interior de la célula es mayor.

Para optimizar el protocolo de criopreservación de los óvulos de ratón debemos emplear velocidades de enfriamiento menores.

Si efectivamente empleamos velocidades de enfriamiento menores, la evolución del subenfriamiento se muestra en la figura 40, mientras que la evolución de la deshidratación celular se muestra en la figura 41.


198

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30

TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR

SUBENFRIAMIENTO INTRACELULAR

esperma

óvulo

-50ºC/min

-5ºC/min

-30ºC/min

-3ºC/min

-10 -1

Figura 40

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

DESHIDRATACIÓN CELULAR

esperma

óvulo

-50ºC/min

-5ºC/min

-30ºC/min

-3ºC/min -10

-1

Figura 41


199

Del análisis de los resultados obtenidos, las velocidades de enfriamiento características para un óvulo de ratón no fertilizado son de un orden de magnitud inferior al compararlas con las velocidades aplicadas a espermatozoides de ratón.

La conclusión final a la que llegamos es que cada célula necesita un protocolo de criopreservación a la medida. La razón de esta necesidad de particularizar el protocolo a cada célula, vamos a comprobar que se debe a los parámetros físicos de la célula, como la permeabilidad de su membrana, o el tamaño de la célula entre otros. Nosotros sólo estudiaremos dos factores: la permeabilidad, y un parámetro que caracteriza dos propiedades de la célula, su tamaño y su forma, el ratio Área de la membrana/ Volumen de la célula.


200

7.4.3 PARÁMETROS FÍSICOS DE LAS CÉLULAS QUE AFECTAN AL PROCESO DE DESHIDRATACIÓN

7.4.3.1 La permeabilidad de la membrana celular

La permeabilidad de la membrana fue modelada en el apartado 5.2 del capítulo 4 mediante la ley de Arrhenius.

−⋅−

⋅= g

Lg

TTR

E

PgP eLTL11

)(

donde LPg es la conductividad hidráulica a la temperatura de referencia Tg , y ELg es la energía de activación aparente para el transporte de agua a través de la membrana.

Si la temperatura de referencia es la misma, y aumentamos la permeabilidad de referencia y/o disminuimos la energía de activación, la permeabilidad de la membrana aumenta. Para estudiar el efecto de la permeabilidad sobre la deshidratación, modificaremos los parámetros del espermatozoide de ratón. Si incrementamos la permeabilidad, aumentando por ejemplo la permeabilidad de referencia al triple de su valor, los resultados que se obtienen se muestran en la figura 42.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA


Permeabilidad natural

Permeabilidad triple

Figura 42


201

El proceso de deshidratación se ha llevado en ambos casos siguiendo un perfil de enfriamiento lineal a 30ºC/min.

Al incrementar la permeabilidad, la célula pierde agua con mayor facilidad, siendo la extensión de la deshidratación más acusada, para todas las temperaturas. Es de esperar que el subenfriamiento sea menor cuanto mayor sea la permeabilidad de la membrana. Para comprobarlo mostramos la evolución del subenfriamiento, en la figura 43.

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30

TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR


Permeabilidad natural

Permeabilidad triple

Figura 43

Por lo tanto, cuanto mayor es la permeabilidad de la membrana celular, menores son los subenfriamientos, para una velocidad de enfriamiento dada, y por tanto menor es la probabilidad de formación de hielo intracelular. También podríamos decir, que cuanto mayor es la permeabilidad de la membrana, mayores son las velocidades de enfriamiento que podemos aplicar, sin que el subenfriamiento supere ciertos límites.


202

7.4.3.2 Ratio Área membrana / Volumen celular

Para una forma geométrica dada, cuanto mayor es el volumen de la célula, menor es el ratio Área / Volumen:

• Esferas: r

Ratio3

= ,donde r es el radio de la esfera.

• Cilindros:r

Ratio2

≈ ,donde r es el radio de la base del cilindro.

En el caso del cilindro hemos despreciado el área de las bases. Vemos como efectivamente al aumentar el tamaño, el ratio disminuye. Además podemos comprobar cómo el ratio de la esfera es mayor que el del cilindro.

Para ver el efecto que tiene el tamaño de la célula en el proceso de deshidratación, triplicaremos el radio de la base del cilindro con el que hemos modelado la geometría de un espermatozoide., y lo compararemos con la deshidratación sufrida por la célula de tamaño natural, habiendo aplicado un mismo perfil de enfriamiento lineal de 30ºC/min. Esto se ve en la figura 44.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA


Tamaño original

Tamaño con radio triple

Figura 44

El ratio del espermatozoide original es de 11.19 µm-1, mientras que el del espermatozoide con un radio triple al del original es de 3.7581 µm-1. Por lo tanto cuanto mayor es el tamaño de la célula, y por tanto menor es su ratio ,mayor es la dificultad que presenta la célula para deshidratarse, para una


203

velocidad de enfriamiento dada, y una geometría constante. Desde otro punto de vista podríamos decir que cuanto mayor es el tamaño de la célula, menores deben ser las velocidades de enfriamiento para alcanzar una cierta deshidratación a una determinada temperatura.

El análisis del subenfriamiento del medio intracelular se muestra en la figura 45.

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30

TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR


Célula con radio triple del original

Célula con radio original

Figura 45

El subenfriamiento, y por tanto la probabilidad de formación de hielo intracelular es mayor, cuanto mayor es la célula, para una geometría, y una velocidad de enfriamiento dada.

Como conclusión de este análisis podemos afirmar que cuanto mayor sea el tamaño de una célula, menores deben de ser las velocidades típicas de enfriamiento, para mantener el nivel de subenfriamiento en niveles aceptables, y lograr elevadas deshidrataciones. Esto concuerda con lo visto al analizar la deshidratación de los óvulos de ratón. El tamaño de un óvulo es muy superior al de un espermatozoide, requiriéndose velocidades de enfriamiento de un orden de magnitud inferior a las requeridas para enfriar espermatozoides.

También podemos sacar otra conclusión, con respecto a la geometría de la célula. Es bien sabido que dado un volumen fijo, la geometría esférica es la que presenta una menor superficie. Supongamos que tenemos dos células de aproximadamente el mismo tamaño. La primera tiene una geometría muy


204

esférica, mientras que la segunda no. Si aplicamos el mismo perfil de enfriamiento a los dos tipos de células, es de esperar que en la célula esférica el subenfriamiento sea mayor que en el observado en la célula no esférica, debido al menor ratio que presenta la célula esférica.

Por lo tanto células de geometría aproximadamente esférica requieren perfiles de enfriamiento menores que células, que teniendo el mismo volumen tienen una geometría no esférica.


205

IV-8. MODELO TEÓRICO NO IDEAL

8.1. REVISIÓN DE LAS HIPÓTESIS SIMPLIFICATORIAS

Las ecuaciones diferenciales que describen la deshidratación celular, bien durante un enfriamiento, bien durante un periodo a temperatura constante, obtenidas hasta este momento, sólo son aplicables para el caso en que la solución intracelular tenga comportamiento de solución diluida ideal.

Como ya se comentó en el apartado 3 de Hipótesis Simplificatorias del Modelo Ideal, la consideración de solución diluida es razonable, pero la de considerar la solución como ideal, no tanto. Esto era debido a la naturaleza de electrolito fuerte del cloruro sódico, que daba origen a intensas fuerzas iónicas. Estas fuerzas tenían como consecuencia interacciones soluto-soluto considerables, incluso para diluciones muy altas.

Por esta razón, vamos a replantear las ecuaciones del modelo de deshidratación, para que tengan en cuenta el hecho de que la solución no tiene comportamiento ideal.

Aplicaremos la teoría de Debye-Huckel para caracterizar el comportamiento de la solución no ideal. Recordamos que esta teoría era aplicable al caso de soluciones diluidas de electrolitos fuertes, como el caso que nos ocupa.

Como seguimos asumiendo que la solución permanece diluida, el resto de hipótesis simplificatorias que adoptamos para el modelo ideal son aplicables al modelo no ideal.

Las ecuaciones que desarrollaremos, al igual que en el caso ideal, no van a tener en cuenta, por ahora, la presencia de agentes crioprotectores.

En este apartado también desarrollaremos la ecuación de la curva de equilibrio y particularizaremos las ecuaciones del modelo de deshidratación para perfiles de enfriamiento lineal, cuadrático, y exponencial.

Por último deduciremos las ecuaciones del modelo ideal, como caso límite de las ecuaciones del modelo no ideal, para comprobar la validez del modelo no ideal.


206

8.2. EL MODELO TEÓRICO NO IDEAL PARA UN PERFIL DE ENFRIAMIENTO ARBITRARIO

La ecuación que describía el proceso de deshidratación celular en términos de presiones osmóticas, para el caso del modelo ideal era

( )exinp ATL

dtdV

ππ −⋅⋅= )( Ec. 256

donde V es el volumen de la disolución intracelular, Lp(T) es el coeficiente de permeabilidad, A es el área de la membrana, y p in, pex son las presiones osmóticas en el interior y el exterior de la célula respectivamente.

Sin embargo, para llegar a esta ecuación Ec.256 no se tuvo en cuenta en ningún momento que la solución fuese diluida ideal, salvo cuando planteamos la ecuación de Van’t Hoff, que relacionaba la presión osmótica con la concentración de soluto.

TRCB ⋅⋅=π Ec. 257

donde p es la presión osmótica y CB es la concentración de soluto en moles / litro . Esta ecuación es sólo aproximadamente válida en el caso de soluciones diluidas no ideales, lo cual no afecta para nada a la obtención de la ecuación de deshidratación.

Por lo tanto la ecuación de deshidratación en función de las presiones osmóticas es aplicable al caso de soluciones diluidas no ideales.

El paso siguiente que se dio para obtener la ecuación de deshidratación en el modelo ideal, fue relacionar las presiones osmóticas con las presiones de vapor, a través de unas ecuaciones que fueron deducidas en el Capítulo 2, de ÓSMOSIS.

exlA

A

ex

inlA

A

in

P

P

VTR

P

P

VTR

*,

*,

ln

ln

⋅⋅

=

⋅⋅

=

π

π Ec. 258

donde VA es el volumen molar parcial del disolvente, P*A,l es la presión de

vapor del disolvente puro, y Pin, Pex son las presiones de vapor de la solución intracelular y extracelular respectivamente.

Para la deducción de estas ecuaciones no se tiene en cuenta, en ningún momento, la hipótesis de solución diluida ideal. Por lo tanto la ecuación de deshidratación en función de las presiones de vapor de la solución intracelular y extracelular, son válidas para el caso de soluciones diluidas no ideales:


207

in

ex

A

g

PP

V

TRATL

dtdV

ln)(

* ⋅⋅⋅⋅

= Ec. 259

El siguiente paso que dimos en la obtención de la ecuación del modelo teórico ideal, fue desarrollar las expresiones de la presión de vapor.

Ø Solución intracelular: aquí se produce una diferencia notable. En el caso del modelo teórico ideal, aplicábamos la ley de Raoult ideal.

inBB

inAlA

in xTPxTPP ⋅+⋅= )()( **, Ec. 260

donde P*A,l y P*

B son las presiones de vapor del agua líquida y de la sal y xin

A y xinB son las fracciones molares de agua y sal respectivamente.

Sin embargo en el caso que nos ocupa, del modelo teórico no ideal, aplicaremos la ley de Raoult no ideal:

inBB

inAlA

in aTPaTPP ⋅+⋅= )()( **, Ec. 261

donde aAin y aB

in son las actividades del agua y de la sal respectivamente.

Despreciando la presión de vapor de la sal frente a la de disolvente, tenemos:

inA

inAlA

inAlA

in xTPaTPP ⋅⋅=⋅≈ γ)()( *,

*, Ec. 262

donde ?Ain es el coeficiente de actividad del disolvente en la solución

intracelular y xAin es la fracción molar del disolvente.

Ø Solución extracelular: al igual que en el caso del modelo teórico ideal, la presión de vapor del medio extracelular es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo puro.

)(*, TPP sA

ex ≈ Ec. 263

Esto es así porque para la deducción de la relación anterior, no se tuvo en cuenta la hipótesis de solución diluida ideal.

El cociente de las presiones de vapor tras los desarrollos anteriores queda:

inAlA

sAin

ex

aTP

TP

PP 1

)(

)(*,

*, ⋅≈ Ec. 264


208

La ecuación de deshidratación queda:

−⋅

⋅⋅⋅= in

AlA

sA

A

g aTP

TP

V

TRATL

dtdV

ln)(

)(ln

)(*,

*,

* Ec. 265

Aplicando la ecuación de Clausius-Clapeyron, el cociente de las presiones de vapor de las sustancias puras será:

⋅⋅= ∫

T

T

F

sA

lA

sA

lA dTTRTL

TP

TP

TP

TP

0

20

*,

0*,

*,

*, )(

exp)(

)(

)(

)( Ec. 266

donde LF(T) es el calor latente de fusión. Tomando T0= 273.15 K, la presión de vapor del hielo y del agua líquida pura, coinciden. Teniendo esto en cuenta y sustituyendo Ec265 en Ec266 se tiene:

−

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫

T

AF

A

g adTTRTL

V

TRATL

dtdV

15.2732* ln)()(

Ec. 267

Expresando las variaciones del volumen en función de la temperatura(Ec197), la ecuación de deshidratación queda:

−

⋅⋅

⋅

⋅⋅⋅= ∫

T

AF

A

g adTTRTL

TFV

TRATL

dTdV

15.2732* ln)(

)(

)( Ec. 268

donde F(T), recordamos que era la variación de la temperatura del sistema con respecto al tiempo:

dtdT

TF =)( Ec. 269

A partir de aquí es donde se produce la diferencia fundamental entre el modelo teórico ideal y no ideal. En el modelo teórico ideal, expresábamos la fracción molar del disolvente, xA

in en función del volumen de la disolución intracelular V:

*ABBBB

BBA VnVnV

VnVx

⋅⋅+⋅−⋅−

= ∞

∞

ν Ec. 270

donde VA* es el volumen molar del disolvente puro, y VB

8 es el volumen molar a dilución infinita de el soluto.

En el modelo teórico no ideal, buscamos expresar la actividad del disolvente aA

in en función del volumen de la disolución intracelular.


209

Para obtener la ecuación del modelo no ideal vamos a seguir los siguientes pasos:

Ø Paso 1: relacionamos la actividad del disolvente aAin , con la

concentración de soluto y el coeficiente de actividad del soluto.

Aplicamos la ecuación de Gibbs-Duhem a temperatura y presión constante a la solución intracelular:

0=⋅+⋅ BBAA dndn µµ Ec. 271

donde nA y nB son los moles de agua y de sal (ClNa) repectivamente, y µA y µB son los potenciales químicos del agua y de la sal respectivamente.

El potencial químico del disolvente es:

AAA aTR ln* ⋅⋅+= µµ Ec. 272

Una variación infinitesimal de µA a temperatura y presión constante es:

AA adTRd ln⋅⋅=µ Ec. 273

El potencial químico de la sal, considerando que es un electrolito fuerte es:

BBBBBB mTRTRTR lnlnln* ⋅⋅⋅+⋅⋅⋅+⋅⋅⋅+= ±± νγνννµµ Ec. 274

donde ?B es la constante de disociación de la sal, ?± es un coeficiente de disociación iónico medio, ?± es el coeficiente iónico medio de la sal, y mB es la molalidad de la sal.

Una variación infinitesimal de µB a temperatura y presión constantes es:

( )BBB mddTRd lnln +⋅⋅⋅= ±γνµ Ec. 275

Antes de sustituir las expresiones de las variaciones de los potenciales químicos, vamos a manipular la ecuación de Gibbs-Duhem:

a) Dividimos la ecuación de Gibbs-Duhem entre el número de moles de disolvente nA:

0=⋅+ BA

BA d

nn

d µµ Ec. 276


210

b) Expresamos el cociente nB / nA en función de la molalidad de la sal mB:

10001000

AB

A

B

AA

B

A

BB

Mm

nn

Mn

nWn

m ⋅=⇒⋅

== Ec. 277

donde nA , nB son los moles de agua y sal (ClNa) respectivamente, MA es el peso molecular del agua y WA es la masa de agua expresada en kilogramos.

c) Sustituimos en la ecuación de Gibbs-Duhem:

01000

=⋅⋅+ BA

BA dM

md µµ Ec. 278

Ahora sustituimos los valores de las variaciones infinitesimales de los potenciales químicos:

( )

( )BBBA

A

BBA

BA

mddmM

ad

mddTRM

madTR

lnln1000

ln

lnln1000

ln0

+⋅⋅⋅

−=

+⋅⋅⋅⋅⋅+⋅⋅=

±

±

γν

γν Ec. 279

Ø Paso 2: integramos la actividad del disolvente.

( ) CTEmdmdmM

a BBBBA

A ++⋅⋅

−= ∫ ∫± lnln1000

ln γν

Ec. 280

o Resolución de la integral ∫ ±⋅ γlndmB

∫∫ ∫ ∫ ±±±±± −⋅=−⋅=⋅ BBBBB dmmdmmddm γγγγγ lnlnln)ln(ln Ec. 281

Para resolver la integral de ln?±·dmB debemos expresar el coeficiente de actividad de la sal (ClNa), en función de la molalidad de la sal.

Es ahora cuando aplicamos la teoría de Debye-Huckel, que me permite relacionar el coeficiente de actividad de un electrolito fuerte con la temperatura del sistema y su molalidad:

21

21

)(1

)(ln

m

m

ITBa

ITAzz

⋅⋅+

⋅⋅⋅−= −+±γ Ec. 282


211

donde z+ es la carga del ión positivo de la sal, z- es la carga del ión negativo, A(T) y B(T) son parámetros del modelo que dependen de la naturaleza del disolvente, en nuestro caso agua, y de la temperatura del sistema, a es el diámetro iónico medio de la sal, y Im es la fuerza iónica en la escala de molalidades, cuya expresión es:

∑ ⋅= 2

21

iim zmI Ec. 283

donde mi es la molalidad de las especies disueltas, y zi es la carga eléctrica de las especies disueltas.

Vamos a particularizar la ecuación del modelo de Debye-Huckel para el caso de una disolución acuosa de cloruro sódico.

El cloruro sódico se disocia por completo en disolución, para dar únicamente iones sodio, e iones cloro, es decir, no se forman pares iónicos:

+− +⇒ NaClClNa

Por lo tanto, los parámetros del modelo de la teoría de Debye-Huckel quedan:

BClNaClNammmm

z

z

=====

−+

−

+

1

1

Ec. 284

Sustituyendo Ec284 en Ec283, la fuerza iónica será:

( ) ( )∑ =⋅+⋅=⋅+⋅=⋅= −−++ BBBClClNaNaiim mmmzmzmzmI 22222 1121

21

21

Ec. 285

Llevando Ec285 a Ec282 tenemos que el coeficiente de actividad de la sal es:

B

B

mTBa

mTA

⋅⋅+

⋅−=±

)(1

)(lnγ Ec. 286

Ahora tan sólo queda obtener los valores de a, A(T), B(T):


212

1) Diámetro iónico medio a.

ma

NaIónicoRadioClIónicoRadioa

MedioIónicoRadioa

121027676.238.122

95.081.12

22

2

−

+−

⋅=Α=Α⋅=Α+Α

⋅=

+⋅=

⋅=

oooo

Ec. 287

( ) 23

23

,0

22

1

42)(

−⋅=

⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅= T

Tke

NTAAr

AA αεεπ

ρπ Ec. 288

21

23

21

23

232

12

2219

21

3323

3147.6057

1038066.138.781085.84

)10602.1(

101

10022.62

mol

KKg

KJ

mJC

C

mKg

mol

⋅=

=

⋅⋅⋅⋅

⋅⋅

⋅⋅

⋅

⋅⋅⋅=

−−

−

π

πα

Ec. 289

21

21

,0

2)(

−⋅=

⋅⋅⋅⋅⋅

⋅= TTk

NeTB

Ar

AA βεε

ρ Ec. 290

mmol

KKg

KJ

mJC

mKg

molC

⋅

⋅⋅=

=

⋅⋅⋅⋅

⋅

⋅⋅⋅⋅⋅=

−−

−

21

21

21

9

21

232

12

3323

19

108107.56

1038066.138.781085.8

101

10022.6210602.1β

Ec. 291

Aplicando los resultados obtenidos a partir de la teoría de Debye-Huckel la integral del segundo miembro de Ec281 queda:

∫ ∫ ⋅⋅+

⋅−=⋅± B

B

BB dm

mTBa

mTAdm

)(1

)(lnγ Ec. 292

Las variables T y mB son termodinámicamente independientes, es decir, a partir de la temperatura no puedo conocer la concentración de la sal en mi sistema, y viceversa.


213

Por lo tanto, en la integral, la temperatura actúa como un parámetro de integración:

Aplicamos un cambio de variable en Ec292:

BmTBau ⋅⋅+= )(1 Ec. 293

Tomando la diferencial de Ec293, teniendo en cuenta que la temperatura es un parámetro:

BmdTBadu ⋅⋅= )( Ec. 294

Sustituyendo en la expresión Ec292 tengo:

∫ ∫∫ +⋅⋅

−=⋅

⋅⋅

+⋅

⋅−=⋅± duu

uTBa

TAdu

TBau

uTBa

u

TAdmB 1)()(2

)(2

1)(

)(ln2

3322γ

Ec. 295

Para resolver la integral en Ec295 aplicamos la integración por partes:

)1ln(1

11

2

uuyu

duudy

dudxux

uduu

uduu

u

+−=⇒+⋅

=

=⇒=

+⋅

⋅=+∫ ∫

Ec. 296

Sustituyendo:

( ) ( )

( )

)1()1ln(2

)1()1ln()1(2

)1ln(

)1ln()1ln(

)1ln()1ln(1

2

22

2

2

uuu

uuuu

uuu

duuduuuuu

duuuuuuduu

u

+−++=

=+−+⋅++−+⋅−=

=++⋅−+⋅−=

=+−−+−⋅=+

∫∫

∫∫

Ec. 297

Deshaciendo el cambio de variables Ec292 queda:


214

( ) ( )( )

∫

+−

−++⋅⋅

⋅⋅⋅

−=±

B

BB

B

mTaB

mTaBmTBa

TBaTA

dm

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

ln

2

33γ Ec. 298

Finalmente, la integral que estábamos calculando(Ec281), queda:

( )

( )( )

⋅⋅+−

−⋅⋅++

+⋅⋅

⋅⋅

−−

−

⋅+

−⋅=∫ ±

B

B

B

B

BBB

mTBa

mTBa

mTBa

TBaTA

mTBa

mTAmdm

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

)(1

)(ln

2

33

γ

Ec. 299

o Resolución de la integral ∫ BB mdm ln

∫∫ == BB

BBBB m

mdm

mmdm ln Ec. 300

Ø Paso 3: la expresión final de la actividad del disolvente es:

( )

CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTBa

mmTA

Ma

B

B

B

B

B

BB

BAA +

+

+

+−

−++

+

+

+⋅+

−

⋅−=

))(1(

))(1ln(2)(

)()(2

)(1

)(

1000ln

2

33

ν Ec. 301

Ø Paso 4: determinación de la constante de integración CTE.

Si particularizamos la ecuación de la actividad del disolvente (Ec301)a una temperatura conocida Tref entonces, tanto la actividad aA del disolvente, como la molalidad del soluto mB, quedan definidas:


215

( )∞

∞

∞

−=

+−

−=

⋅=⋅=

BBrefA

BrefB

ABBBBref

BBrefrefA

refArefArefArefArefA

VnTVn

m

VnVnTV

VnTVx

Txxa

)(

)(

)(

)(

,

*,

,,,,

ρ

ν

γγ

Ec. 302

El valor de la constante de integración será:

( )

+

+

+−

−++

+

+

+⋅+

−

⋅+=

refB

refBref

refBref

refBref

ref

ref

refBref

refBrefBref

BArefA

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBa

TA

mTBa

mmTA

MaCTE

,

,

,

2

,

33

,

,,

,

))(1(

))(1ln(2

)(

)(

)(2

)(1

)(

1000ln

ν Ec. 303

El valor del coeficiente de actividad a la temperatura de referencia en Ec303 lo determinaremos a partir de la expresión de la curva de descenso crioscópico. La expresión de la curva de descenso crioscópico, para el caso particular del agua, era de la forma

( ) dTTR

THx

TAfusm

AA ∫ ⋅

∆=⋅

273

*,, )(

ln γ Ec. 304

Despejando el coeficiente de actividad, y particularizándolo para la temperatura de referencia Tref tenemos:

∫ ⋅

∆=

refTAfusm

refArefA dT

TR

TH

xT

273

*,,

,

)(1)(γ Ec. 305

siendo Tref la temperatura a la cual conozco el descenso crioscópico ?Tref =273-Tref .

La expresión del calor latente de fusión del hielo que vamos a emplear es el que aplicamos en el caso del modelo teórico ideal, que recordamos (Ec204) que era de la forma:


216

32*,, )()()()( ααα −⋅+−⋅−−⋅+=∆ TdTcTbaTH Afusm Ec. 306

donde

a=6004.8 J / mol b=38.016 J / mol·K c=0.11088 J / mol·K2 d=0.00090432 J / mol·K3

a=273.15 K

Integrando Ec306 y sustituyendo en Ec305 obtenemos el valor de el coeficiente de actividad a la temperatura de referencia Tref:

( )

−⋅⋅

+−⋅⋅⋅⋅+

−

−⋅⋅⋅+⋅⋅+

+

+

−⋅

⋅−⋅−⋅−

=

22

2

32

2732

)273(3

273ln

32

12731

)(1

)(

refref

ref

ref

refArefA

TR

dT

Rdc

T

Rdcb

TRdcba

TxT

α

αα

ααα

γ Ec. 307

Ø Paso 5: sustituyendo Ec307 en Ec303 y ésta en Ec301 finalmente la expresión de la ecuación que describe la deshidratación celular en el caso de considerar a la solución intracelular una solución diluida no ideal resulta ser:

( )

( )( )

−

+

+

+−

−++

+

⋅+

++

−

⋅⋅

+⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫ CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTaB

mmTA

MdT

TRTL

TFV

TRATL

dTdV

B

B

B

B

B

BB

BAT

F

A

g

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

)(1

)(

1000)(

)(

)(

2

3315.273

2*

ν

Ec. 308

Para poder resolver la ecuación Ec308 necesitaremos expresar las molalidades en función del volumen de disolución dentro de la célula:


217

( )∞⋅−⋅=

BBA

BB VnTV

nm

)(ρ Ec. 309

donde nB es el número de moles de sal presentes en la solución intracelular, ?A es la densidad másica del agua, V(T) es el volumen de disolución dentro de la célula, y VB

8 es el volumen molar a dilución infinita de la sal.


218

8.3. LA CURVA DE EQUILIBRIO NO IDEAL

Al igual que en el caso del modelo teórico ideal, la curva de Equilibrio describe la evolución de la composición del medio intracelular, cuando es enfriado a una velocidad infinitamente lenta. De esta manera el medio intracelular evolucionaría por sucesivos estados de equilibrio.

A la diferencia entre la temperatura del medio intracelular y a la que tendría si evolucionara por sucesivos estados de equilibrio, se denomina subenfriamiento.

La ecuación de la curva de equilibrio describe la evolución del medio extracelular, mientras que la ecuación de Deshidratación no ideal que hemos deducido anteriormente describe la evolución del medio intracelular.

Al igual que en el caso del modelo teórico ideal, para imponer la condición de equilibrio termodinámico entre el medio extracelular e intracelular, tan sólo necesitamos imponer una condición de equilibrio difusivo, puesto que el equilibrio mecánico y térmico se satisfacen en todo momento.

El equilibrio difusivo lo imponemos mediante la igualdad de presiones de vapor:

)()( TPTP inex = Ec. 310

donde Pex(T) es la presión de vapor del medio extracelular, y Pin (T) es la presión de vapor del medio intracelular.

Como ya justificamos anteriormente, la presión de vapor de la solución extracelular es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo que se ha formado:

)()( *, TPTP sA

ex ≈ Ec. 311

La presión de vapor de la solución intracelular es aproximadamente igual a la presión de vapor del agua en la solución, multiplicada por la actividad del agua en la solución intracelular:

AlAin aTPTP ⋅≈ )()( *

, Ec. 312

Aplicando Clausius-Clapeyron calculo las variaciones de la presión de vapor del hielo y del agua líquida con la temperatura:


219

⋅⋅=

⋅⋅=

∫

∫T

T

SsAsA

T

T

VlAlA

dTTRTL

TPTP

dTTRTL

TPTP

0

0

20*,

*,

20*,

*,

)(exp)()(

)(exp)()(

Ec. 313

La igualdad de presiones de vapor toma la forma:

⋅⋅== ∫

T

T

F

lA

sA

lA

sAA dT

TRTL

TP

TP

TP

TPa

0

20

*,

0*,

*,

*, )(

exp)(

)(

)(

)( Ec. 314


Elegimos T0 = 273.15K ( esa temperatura cumple la igualdad de presiones de vapor del hielo y del agua líquida pura), quedando la expresión de la actividad como sigue:

⋅= ∫

TF

A dTTRTL

a15.273

2

)(exp Ec. 315

Tomando logaritmos neperianos a ambos lados de la igualdad tenemos:

∫ ⋅=

TF

A dTTRTL

a15.273

2

)(ln Ec. 316

Sustituyendo la expresión de la actividad del disolvente (Ec301) tenemos la ecuación de la Curva de Equilibrio en función de la molalidad del soluto:

( )

∫ ⋅=+

+

+

+−

−++

+

+

+⋅+

−

⋅−

TF

B

B

B

B

B

BB

BA dTTRTL

CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTBa

mmTA

M

15.2732

2

33

)(

))(1(

))(1ln(2

)(

)()(2

)(1

)(

1000ν

Ec. 317


220

Para obtener la expresión de la curva de equilibrio en función de el volumen de disolución dentro de la célula, tengo que relacionar la molalidad de soluto con dicha variable:

( )∞⋅−⋅=

BBA

BB VnTV

nm

)(ρ Ec. 318




221

8.4. PARTICULARIZACIÓN DE LAS ECUACIONES DEL MODELO NO IDEAL

8.4.1 INTRODUCCIÓN

Al igual que cuando planteábamos la ecuación de deshidratación del modelo ideal, cuando aquí planteamos la ecuación de deshidratación del modelo no ideal, la ley de enfriamiento quedó definida de forma arbitraria, mediante la función F(T). Esta función, recordamos que era la derivada primera con respecto al tiempo, de la ley de enfriamiento.

dtdT

TF =)( Ec. 319

En este apartado vamos a obtener expresiones de la función F(T), para distintas leyes de enfriamiento. Aunque se pueden plantear infinidad de estas leyes, nosotros sólo vamos a contemplar tres:

Ø Ley de enfriamiento lineal Ø Ley de enfriamiento cuadrática Ø Ley de enfriamiento exponencial


222

8.4.2 LEY DE ENFRIAMIENTO LINEAL

El perfil de enfriamiento lineal, es con diferencia la ley de enfriamiento más empleada en criopreservación.

La expresión matemática de un enfriamiento lineal es de la forma(apartado 6.4.2):

0)( TtBtT +⋅−= Ec. 320

donde T0 es la temperatura inicial del sistema, que al igual que en el caso ideal es 273K, y B es una constante que permite parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento lineales.

La función F(T) es:

BdtdT

TF −==)( Ec. 321

Sustituyendo esta expresión en la ecuación diferencial de la deshidratación celular(Ec308), obtenemos:

( )

( )( )

−

+

+

+−

−++

+

⋅+

++

−

⋅⋅

+⋅

⋅−⋅

⋅⋅⋅= ∫ CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTaB

mmTA

MdT

TRTL

BV

TRATL

dTdV

B

B

B

B

B

BB

BAT

F

A

g

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

)(1

)(

1000)(

)(

)(

2

3315.273

2*

ν

Ec. 322


223

8.4.3 LEY DE ENFRIAMIENTO CUADRÁTICA

La expresión matemática de un enfriamiento cuadrático es de la forma(apartado 6.4.3):

2210 2

1)( tktkTtT ⋅−⋅−= Ec. 323

donde T0 es la temperatura inicial del sistema, igual a 273K, k1 recordamos que, al igual que en el caso ideal, era la velocidad inicial de enfriamiento, y k2 era la aceleración constante con la que se produce la disminución de la temperatura del sistema.

La función F(T) es :

)(2)( 022

1 TTkkTF −⋅⋅+−= Ec. 324

La ecuación de la deshidratación celular, cuando el sistema está sometido a un enfriamiento cuadrático, se obtiene sustituyendo Ec324 en Ec308:

( )

( )( )

−

+

+

+−

−++

+

⋅+

++

−

⋅⋅

+⋅

⋅−⋅+−⋅

⋅⋅⋅= ∫ CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTaB

mmTA

MdT

TRTL

TTkkV

TRATL

dTdV

B

B

B

B

B

BB

BAT

F

A

g

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

)(1

)(

1000)(

))((

)(

2

3315.273

202

21

*

ν

Ec. 325


224

8.4.4 LEY DE ENFRIAMIENTO EXPONENCIAL

La expresión matemática de un enfriamiento exponencial es (apartado 6.4.4):

⋅−⋅=

00 exp)(

Tt

kTtT Ec. 326

donde T0 es la temperatura del sistema, igual a 273K, y k es una constante que permite parametrizar la familia de perfiles de enfriamiento exponenciales.

La función F(T) es:

0

)(TT

kdtdT

TF ⋅−== Ec. 327

Sustituyendo la Ec327 en la ecuación Ec308 obtenemos:

( )

( )( )

−

+

+

+−

−++

+

⋅+

++

−

⋅⋅

+⋅

⋅⋅−⋅

⋅⋅⋅= ∫ CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTaB

mmTA

MdT

TRTL

TT

kV

TRATL

dTdV

B

B

B

B

B

BB

BAT

F

A

g

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

)(1

)(

1000)(

)(

)(

2

3315.273

2

0

*

ν

Ec. 328


225

8.5. MODELO DE DESHIDRATACIÓN A TEMPERATURA CONSTANTE

Como ya se ha comentado anteriormente es una práctica habitual en los protocolos de criopreservación el mantener las muestras a temperatura constante durante un cierto periodo de tiempo, para a continuación continuar enfriando el sistema.

Lo que pretendemos en este apartado es obtener la ecuación diferencial que permita modelar la deshidratación celular cuando sometemos la muestra a un periodo de temperatura constante.

La ecuación que va a describir la deshidratación celular en una etapa a temperatura constante va a ser igual a la que empleábamos para describir la deshidratación durante un enfriamiento(Ec308), salvo que ahora la variable independiente no va a ser la temperatura, puesto que va a permanecer constante, sino el tiempo.

( )

( )( )

−

+

+

+−

−++

+

⋅+

++

−

⋅⋅

+⋅

⋅⋅⋅⋅

= ∫ CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTaB

mmTA

MdT

TRTL

V

TRATL

dtdV

B

BCTE

BCTE

BCTE

CTE

CTE

BCTE

BBCTE

BAT

F

A

CTECTEgCTE

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

)(1

)(

1000)()(

2

3315.273

2*

ν

Ec. 329

En esta ecuación la temperatura no es una variable, sino una constante, la temperatura constante a la cual mantenemos la muestra durante un cierto periodo de tiempo.

Para expresar la ecuación de deshidratación en función del volumen de disolución intracelular empleamos la siguiente ecuación que relaciona la molalidad del soluto con el volumen de disolución intracelular:

( )∞⋅−⋅=

BBA

BB VnTV

nm

)(ρ Ec. 330




226

8.6. OBTENCIÓN DE LAS LEYES IDEALES A PARTIR DE LAS NO IDEALES

8.6.1 INTRODUCCIÓN

Las ecuaciones que hemos obtenido para el modelo no ideal de deshidratación deben servir para describir el proceso de deshidratación ideal, puesto que este es un caso particular de aquel.

Por lo tanto una manera de comprobar que las ecuaciones del modelo no ideal son correctas, es que a partir de ellas, podamos deducir las ecuaciones clásicas del modelo de deshidratación ideal, imponiendo alguna condición de idealidad.

Los pasos que vamos a seguir para comprobar la validez de las ecuaciones del modelo no ideal serán:

Ø Determinación de la condición de idealidad. Ø Sustitución de la condición de idealidad en la ecuación del modelo

no ideal. Ø Comparación de la ecuación del modelo no ideal( con la condición

de idealidad), con las ecuaciones del modelo ideal.


227

8.6.2 DETERMINACIÓN DE LA CONDICIÓN DE IDEALIDAD

Para intentar obtener una condición de idealidad, vamos primero a comparar las ecuaciones del modelo ideal y no ideal.

IdealNoModeloadTTRTL

V

TRATL

dtdV

IdealModeloxdTTRTL

V

TRATL

dtdV

A

TF

A

g

A

TF

A

g

−

⋅⋅

⋅⋅⋅=

−

⋅⋅

⋅⋅⋅=

∫

∫

ln)()(

ln)()(

15.2732*

15.2732*

Ec. 331

donde xA es la fracción molar de soluto en la solución intracelular, y aA es la actividad del soluto en la solución intracelular.

Puesto que aA=γA·xA , haciendo γA=1, obtengo la ley ideal a partir de la ley no ideal. La ley de deshidratación no ideal la tengo expresada en función de los parámetros de la teoría de Debye-Huckel, A(T), y B(T). ¿Cómo afecta el que γA=1 a los parámetros de la teoría de Debye-Huckel?

Si a la disolución no ideal le aplicamos la ecuación de Gibbs-Duhem, a temperatura y presión constante tenemos:

( )BBBA

A mddmM

ad lnln1000

ln +⋅⋅⋅

−= ±γν

Ec. 332

Si a la disolución ideal, le aplicamos la misma ecuación, tenemos:

( )BBBA

A mdmM

xd ln1000

ln ⋅⋅⋅

−=ν

Ec. 333

Comparando ambas ecuaciones, vemos que haciendo γ± =1 entonces la

actividad coincide con la fracción molar de disolvente en la disolución intracelular, es decir, que se cumple que γA=1.

Por lo tanto imponer que γA=1 es análogo a imponer que γ± =1.

¿Cómo afecta el que γ± =1 a los parámetros de la teoría de Debye-Huckel?

La expresión de el coeficiente de actividad iónico medio, obtenido a partir de la teoría de Debye-Huckel era de la forma(apartado I-7):

B

B

mTBa

mTA

⋅⋅+

⋅−=±

)(1

)(lnγ Ec. 334

Si imponemos que γ± =1 en la expresión anterior, llegamos a que A(T)=0.


228

Por lo tanto, la condición de idealidad que me permitiría obtener la ley de deshidratación ideal, a partir de la no ideal, es imponer que el parámetro del modelo de Debye-Huckel A(T), sea nulo para todas las temperaturas.


229

8.6.3 SUSTITUCIÓN DE LA CONDICIÓN DE IDEALIDAD EN LA ECUACIÓN DEL MODELO NO IDEAL

La expresión de la ecuación de deshidratación del modelo no ideal, era de la forma(Ec308)

( )

( )( )

−

+

+

+−

−++

+

⋅+

++

−

⋅⋅

+⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫ CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTaB

mmTA

MdT

TRTL

TFV

TRATL

dTdV

B

B

B

B

B

BB

BAT

F

A

g

)(1

)(1ln2)(

)()(2

)(1

)(

1000)(

)(

)(

2

3315.273

2*

ν

Ec. 335

donde la expresión de la constante de integración tenía la forma(Ec303):

( )

+

+

+−

−++

+

+

+⋅+

−

⋅+=

refB

refBref

refBref

refBref

ref

ref

refBref

refBrefBref

BArefA

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBa

TA

mTBa

mmTA

MaCTE

,

,

,

2

,

33

,

,,

,

))(1(

))(1ln(2

)(

)(

)(2

)(1

)(

1000ln

ν

Ec. 336

Si imponemos la condición de idealidad, de hacer nulo el parámetro A(T) deberíamos obtener las ecuaciones del modelo de deshidratación no ideal. Si sustituimos A(T)=0 en Ec335:

[ ]

−⋅⋅

+⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫ 0

15.2732* 1000)(

)(

)(CTEm

MdT

TRTL

TFV

TRATL

dTdV

BBA

TF

A

g ν Ec. 337

donde CTE0 es el valor de la constante de integración, imponiéndole la condición de idealidad(sustituimos A(T)=0 en Ec336):


230

[ ]refBBA

refA mM

aCTE ,,0

1000ln

ν⋅+= Ec. 338


231

8.6.4 COMPARACIÓN DE LAS ECUACIONES DEL MODELO IDEAL, CON LA CONDICIÓN DE IDEALIDAD, CON LAS ECUACIONES DEL MODELO IDEAL

Para poder comparar las ecuaciones del modelo no ideal, con las del modelo ideal, una vez que se ha aplicado la condición de idealidad, primero debemos expresar la ecuación del modelo no ideal, en función del volumen de la disolución intracelular.

La expresión de la ecuación del modelo no ideal, con la condición de idealidad es de la forma:

[ ]

−⋅⋅

+⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫ 0

15.2732* 1000)(

)(

)(CTEm

MdT

TRTL

TFV

TRATL

dTdV

BBA

TF

A

g ν Ec. 339

La ecuación que relaciona la molalidad del soluto disuelto en la disolución intracelular, mB, con el volumen de disolución intracelular es de la forma:

( )∞⋅−⋅=

BBA

BB VnTV

nm

)(ρ Ec. 340



Sustituyendo la expresión de la molalidad en la ecuación de deshidratación, y teniendo en cuenta que 1 ⁄ρA=V*

A·(1000 / MA) , donde ρA es la densidad del disolvente en Kg ⁄ m3, V*

A es el volumen molar del disolvente en m3 ⁄ mol, y MA es el peso molecular del disolvente en gramos ⁄ mol, tenemos:

−⋅−

⋅⋅+

⋅⋅

⋅

⋅⋅⋅=

∞∫ 0*

15.2732* )()(

)(

)(CTE

VnTVVn

dTTRTL

TFV

TRATL

dTdV

BB

ABBT

F

A

g ν Ec. 341

Haciendo lo mismo con la expresión de la constante de integración tenemos:

∞⋅−⋅⋅

+=BBref

ABBrefA VnTV

VnaCTE

)(ln

*

,0 ν

Ec. 342

La expresión de la ley de deshidratación ideal, era de la forma:

⋅⋅+⋅−⋅−

−⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∞

∞

∫ *15.273

2* ln)(

)(

)(

ABBBB

BBT

F

A

g

VnVnVVnV

dTTRTL

TFV

TRATL

dTdV

ν Ec. 343


232

Una primera impresión nos dice que no hemos podido deducir la ley ideal, a partir de la no ideal. Sin embargo vamos a demostrar que esto no es así, y para ello vamos a hacer uso de la hipótesis simplificatoria, que asumía que la disolución estaba diluida.

Antes de aplicar esta hipótesis vamos a rescribir la expresión de la fracción molar del disolvente(Ec202):

⋅−⋅⋅

+−=⋅⋅+⋅−

⋅−= ∞∞

∞

BB

ABB

ABBBB

BBA VnV

VnVnVnV

VnVx

*

* 1lnlnlnν

ν Ec. 344

Si la solución está diluida entonces:

1*

<<⋅−⋅⋅

∞BB

ABB

VnVVnν

Ec. 345

y entonces podemos escribir:

∞∞ ⋅−⋅⋅

≈

⋅−⋅⋅

+=−BB

ABB

BB

ABBA VnV

VnVnVVn

x**

1lnlnνν

Ec. 346

Sustituyendo esta aproximación en la ley de deshidratación ideal(Ec343), tenemos:

⋅−⋅⋅

+⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∞∫

BB

ABBT

F

A

g

VnVVn

dTTRTL

TFV

TRATL

dTdV *

15.2732*

)()(

)( ν Ec. 347

Esta ley tan solo difiere en una constante, con respecto a la ley obtenida a partir de la ley de comportamiento no ideal.

Vamos a comprobar que la constante CTE0 es nula, cuando le aplicamos la hipótesis de disolución diluida:

0lnln)(lnln)(

ln ,,,

*

,0 =+=+=

⋅−⋅⋅

+= ∞ refArefArefArefA

diluidasolucion

BBref

ABBrefA xxTxx

VnTVVn

xCTEν

Ec. 348

Por lo tanto llegamos a la conclusión, de que la ley de deshidratación no ideal permite estudiar el caso ideal, siempre bajo la condición de disolución diluida.


233

IV-9. RESOLUCIÓN NUMÉRICA DE LAS ECUACIONES DEL MODELO NO IDEAL

9.1. INTRODUCCIÓN

En este apartado vamos a resolver las ecuaciones diferenciales de la deshidratación celular, que planteamos en el apartado anterior, mostrando las soluciones en forma de gráficos.

En este apartado, sin embargo el fin último de calcular la solución numérica de las ecuaciones no ideales, no va a ser dibujar la evolución gráfica de la deshidratación, sino comparar las soluciones del modelo ideal, con las soluciones del modelo no ideal.

Si las soluciones difieren mucho entonces debemos volver a trazar todos los gráficos que obtuvimos en el apartado 7 de Resolución Numérica de las Ecuaciones del Modelo Ideal, incluían además de la deshidratación, la evolución del subenfriamiento, el flujo osmótico, etc.

Por el contrario si las soluciones son razonablemente parecidas, no se volverán a calcular todos los gráficos del apartado 7, pero empleando las ecuaciones no ideales, y además todos los puntos nuevos que desarrollemos a partir de ese momento, se llevarán a cabo empleando las ecuaciones del modelo ideal, por la mayor comodidad que tiene manejar unas ecuaciones más sencillas.

Los perfiles de enfriamiento que empleemos serán análogos a los empleados en el apartado 7 de Resolución Numérica de las Ecuaciones del Modelo Ideal.


234

9.2. CURVAS DE DESHIDRATACIÓN PARA ESPERMATOZOIDES DE RATÓN

9.2.1 DATOS FÍSICOS

Para poder resolver las ecuaciones de deshidratación y de equilibrio, necesitamos conocer una serie de datos físicos, referentes a la célula que estemos considerando, en nuestro caso, espermatozoides de ratón.

La ecuación de deshidratación que pretendemos resolver, con el programa MATLAB es:

( )

( )( )

−

+

+

+−

−++

+

⋅+

++

−

⋅⋅

+⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫ CTE

m

mTaB

mTaB

mTaB

TBaTA

mTaB

mmTA

MdT

TRTL

TFV

TRATL

dTdV

B

B

B

B

B

BB

BAT

F

A

g

)(1

)(1ln2

)(

)()(2

)(1

)(

1000)(

)(

)(

2

3315.273

2*

ν

Si analizamos la ecuación anterior, comprobaremos que no se requieren datos físicos adicionales referentes a la célula, con respecto a los ya proporcionados en el apartado 7.3.1 , para poder abordar la resolución numérica de la ecuación no ideal.

La única información adicional que es necesario conocer, con respecto al caso ideal, son los parámetros del modelo de Debye-Huckel, a, A(T) y B(T), que ya fueron obtenidos en el apartado 8.2, y que son válidos para cualquier tipo de célula, siempre y cuando la sal que consideremos sea cloruro sódico.


235

9.2.2 PROGRAMACIÓN EN MATLAB DE LAS ECUACIONES DIFERENCIALES

En este apartado tan sólo vamos a mostrar el programa que describe la ecuación diferencial de la deshidratación del modelo no ideal. Con la descripción que se hizo del programa que modelaba la ecuación diferencial de la deshidratación del modelo ideal, en el apartado 7.3.2, es suficiente para comprender este programa.

El programa que describe en lenguaje MATLAB la ecuación de deshidratación, por ejemplo para el caso de un perfil de enfriamiento lineal es:

function varargout=enfr_NOid_integrado(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL. end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; case 'events' [varargout{1:3}]=events(t,y,Vi); otherwise error(['Unknown flag']); end function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17];%CASO MOUSE SPERM options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5); function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) MA=18; R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lg=(Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5)); VmA=18*1e-6; v2=2; Vm2=2.69611*1e-5; Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa); roA=1000; a=276*1e-12; alfa=6057.3147; beta=56.81071417*1e9; AT=alfa*t^(-1.5); BT=beta*t^(-.5); m2=n2/(roA*(y-Vsol)); mcpa=ncpa/(roA*(y-Vsol)); aux=(1+a*BT*sqrt(m2)); aux0=(Lg*A*R*t/(VmA*B)); sum1=(-AT*m2*sqrt(m2)/aux); sum2=(2*AT/(a^3*BT^3))*(.5*(aux-1)^2+log(aux)-aux); CTE=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa); dydt=[aux0*(SLf+.001*MA*v2*(sum1+sum2+m2+mcpa/v2)-CTE)];


236

El programa CTEintegrar que modela el valor de la constante de integración de la ecuación de deshidratación del modelo no ideal, es:

function y=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa) if nargin<8 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL. end if nargin<7 | isempty(ncpa) ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector end VmA=18*1e-6;roA=1000;MA=18; v2=2; Vm2=2.69611*1e-5; Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa); a=276*1e-12; alfa=6057.3147; beta=56.81071417*1e9; Vref=Vi; [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa); V0=y0./Vi; Tref=interp1(V0,t0,1); xAref=(Vref-Vsol)/(Vref-Vsol+VmA*(v2*n2+ncpa)); SLfref=integralLf(Tref); gammaref=1/xAref*exp(SLfref); aAref=xAref*gammaref; m2ref=n2/(roA*(Vref-Vsol)); mcparef=ncpa/(roA*(Vref-Vsol)); ATref=alfa*Tref^(-1.5); BTref=beta*Tref^(-.5); auxref=(1+a*BTref*sqrt(m2ref)); sum1ref=(-ATref*m2ref*sqrt(m2ref)/auxref); sum2ref=(2*ATref/(a^3*BTref^3))*(.5*(auxref-1)^2+log(auxref)-auxref); y=log(aAref)+.001*MA*v2*(sum1ref+sum2ref+m2ref+mcparef/v2);

Por último comentar que el programa integralLf , que calcula la integral del calor latente de fusión del hielo, es el mismo que en el caso ideal.


237

9.2.3 REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA DESHIDRATACIÓN

9.2.3.1 Programación en MATLAB de la integración de la ecuación diferencial de la deshidratación celular

Al igual que en el apartado anterior, aquí tan solo vamos a mostrar el programa que permite integrar la ecuación diferencial de la deshidratación no ideal, cuya programación en MATLAB se describió en el apartado anterior.

La herramienta que emplearemos al igual que en el caso ideal, será la herramienta ode.

Con las orientaciones dadas en el apartado 7.3.3.1 sobre el funcionamiento del programa en el caso ideal, es suficiente para poder comprender este programa.

Vi=3.1629*1e-17;%DATO n2=9.014*1e-15;%DATO A=3.5394*1e-10;%DATO ncpa=0; if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO E_Lgo=94.1*1e3;%DATO else Lgo=.004*1e-6;%DATO E_Lgo=63.6*1e3;%DATO end Tgo=273.15;%DATO options00=odeset('Events','on','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t00,y00,TE,YE,IE]=ode15s('enfr_NOid_integrado',[],Vi,options00,-.00001,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V00=y00/Vi; Ti=min(TE); plot(t00-273,V00,'r:') hold on; for B=[-5 -15 -50 -1000] tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t2,y2]=ode15s('enfr_NOid_integrado',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo ,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V2=y2./Vi; if ncpa==0 plot(t2-273,V2,'b') else plot(t2-273,V2,'g') end axis([-55 0 0 1]); hold on; end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');


238

9.2.3.2 Representación gráfica de la deshidratación

Al igual que en el caso ideal, la integración de la curva de equilibrio solo se lleva a cabo, en el intervalo de temperaturas que va desde los 271.8852K hasta la temperatura final de enfriamiento, por lo que el software no dibuja la evolución desde los 273K hasta los 271.8852K. Las razones de esta limitación ya fueron expuestas en el apartado 7.3.3.2.

A continuación mostraremos la evolución de la deshidratación de espermatozoides de ratón para distintas velocidades de enfriamiento lineal, empleando las ecuaciones del modelo no ideal.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

-1000ºC/min

-50ºC/min

-15ºC/min

-5ºC/min

Figura 46

El programa que permite obtener el gráfico de la figura 46 es el mostrado en el apartado 9.2.3.1.

Como ya comentamos en la introducción, la obtención de este gráfico es tan sólo un paso previo necesario, para ahora poder comparar la solución dada por las ecuaciones ideales frente a esta solución.

Si representamos la evolución de la deshidratación ideal, y simultáneamente trazamos mediante puntos la evolución de la deshidratación no ideal, obtenemos una medida de lo buena que es la hipótesis de solución diluida ideal, que hicimos al desarrollar las ecuaciones del modelo ideal. El gráfico lo mostramos en la figura 47.


239

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

-1000ºC/min

-50ºC/min

-15ºC/min

-5ºC/min

Deshidratación no ideal

Deshidratación ideal

Descenso crioscópico ideal

Descenso crioscópico no ideal

Figura 47

En el gráfico anterior, los círculos negros marcan la evolución de la deshidratación celular empleando las ecuaciones del modelo no ideal, mientras que las líneas azules, marcan la evolución de la deshidratación, cuando empleamos las ecuaciones del modelo ideal.

El programa que permite calcular este gráfico se encuentra en el anexo Programas en el apartado 15.

Esta solución gráfica, nos lleva a pensar que la hipótesis de solución diluida ideal, es muy razonable, pues los resultados que proporciona son prácticamente idénticos, a los obtenidos cuando consideramos que la solución es diluida, pero no ideal.

Hay que hacer hincapié aquí, en el hecho de que tan sólo hemos puesto en tela de juicio la hipótesis de idealidad de las soluciones intra y extracelular, pero no hemos puesto en tela de juicio el carácter de solución diluida. Esto significa que si trato de modelar la solución intracelular, la manera más precisa sería empleando las ecuaciones del modelo no ideal, pero acabamos de ver que si empleamos las ecuaciones del modelo ideal, los errores que cometemos son muy pequeños, y no vale la pena emplear la formulación más compleja del modelo no ideal.

Sin embargo, tanto en el caso ideal como no ideal trabajamos con la hipótesis de solución diluida. Esta hipótesis debería ser revisada, al igual


240

que hemos hecho con la hipótesis de idealidad, debido a que en el proceso de deshidratación la solución tanto intracelular como extracelular, aumentan su concentración en sales, y puede que en algún instante la hipótesis de solución diluida no sea correcta, aunque puede ocurrir que los resultados de un modelo que contemplen esta posibilidad sean muy parecidos a los resultados del modelo que aquí estamos desarrollando, y que no tienen en cuenta la posibilidad de que en algún momento la hipótesis de solución diluida no sea cierta, al igual que nos ha ocurrido con la hipótesis de idealidad.

A continuación vamos a mostrar numéricamente cual es la desviación máxima que presenta el comportamiento ideal, frente al no ideal, para cada una de las velocidades de enfriamiento, así como la temperatura a la que se produce dicho máximo.

Velocidad de enfriamiento/ºC/min Error relativo máximo Temperatura/ºC

-5 13.8428% -6.0996 -10 14.6054% -8.2910 -15 15.0762% -10.9022 -20 15.2829% -12.6966 -25 15.5559% -16.2375 -30 16.5138% -18.5490 -35 17.9140% -62.3133 -40 8.1526% -66.8282 -45 2.5174% -47.2994 -50 0.9224% -43.0053 -55 0.4073% -10.1218 -60 0.3883% -10.3766

El error relativo, lo hemos calculado mediante la siguiente expresión:

100Re ⋅−

=IdealNOUnitarioVolumen

IdealNOUnitarioVolumenIdealUnitarioVolumenlativoError

Ec. 349

Los valores de la tabla se obtienen con el mismo programa que se ha empleado para dibujar el gráfico de la figura 47.

En la tabla adjunta, se observa cómo para bajas velocidades de enfriamiento, el error relativo que cometemos al tomar la evolución del modelo ideal, frente al del modelo no ideal, aunque no es bajo, es un error aceptable. Para altas velocidades de enfriamiento, por el contrario el error es insignificante, siendo el máximo menor, cuanto mayor es la velocidad de enfriamiento.

Vamos a comprobar a continuación si esta pauta de comportamiento se sigue con otros perfiles de enfriamiento y con otros tipos de células.


241

Para el caso de un perfil de enfriamiento exponencial, los errores relativos máximos se muestran en la tabla adjunta:

Velocidad de enfriamiento inicial/ºC/min Error relativo máximo Temperatura/ºC

-5 13.7403% -6.2542 -10 14.6196% -8.1832 -15 15.0465% -10.2680 -20 15.1915% -12.7900 -25 15.7050% -15.5842 -30 15.8304% -19.6434 -35 16.5189% -28.0313 -40 12.5283% -83.0000 -45 4.0886% -62.6293 -50 1.4984% -40.3483 -55 0.6754% -41.1572 -60 0.3902% -10.4491

El comportamiento es análogo, salvo que para tener errores relativos muy pequeños debemos tener velocidades de enfriamiento mayores.

El programa que permite calcular los valores de esta tabla se muestran en el anexo de Programas en el apartado 16.

Todos estos resultados nos llevan a la conclusión de que el error que cometemos al emplear el modelo de solución diluida ideal, en vez del modelo de disolución diluida, es tanto mayor, cuanto menor sea la velocidad de enfriamiento. Así para estudiar el comportamiento de la deshidratación celular a bajas velocidades de enfriamiento, es más conveniente emplear el modelo de disolución diluida, mientras que para el estudio de la deshidratación a altas velocidades de enfriamiento los resultados que obtenemos con este modelo son prácticamente idénticos a los que proporciona el modelo de disolución diluida ideal (el error es menor del 1%).

CAPÍTULO 5 LOS CRIOPROTECTORES

242


243

V. CAPÍTULO 5

LOS CRIOPROTECTORES

V-1. INTRODUCCIÓN

En 1949, Polge y sus colaboradores descubrieron que al añadir glicerol a una muestra de espermatozoides, antes de comenzar el proceso de criopreservación, el número de células que sobrevivían al llevarlas de nuevo a temperatura ambiente era muy superior al que se había observado hasta entonces. Debido a esta propiedad del glicerol de proteger a las células durante la criopreservación y posterior descongelación, se le denominó AGENTE CRIOPROTECTOR, cuyas siglas en inglés son CPA (crioprotective agent). Desde entonces se han descubierto una gran cantidad de sustancias con propiedades crioprotectoras.

Los agentes crioprotectores se clasifican en dos categorías:

• Agentes crioprotectores permeables: Son aquellos que atraviesan la membrana celular y ejercen su acción crioprotectora desde el interior de la célula. A este grupo pertenecen los agentes crioprotectores más usados hoy en día, como son el glicerol, el dimetil sulfoxido (DMSO), o el 1-2 propanodiol. Todos estos compuestos tienen en común que sus moléculas son pequeñas, es decir, tienen un peso molecular relativamente bajo; así el glicerol tiene 92.09 de peso molecular, lo que le permite atravesar la membrana celular.

• Agentes crioprotectores no permeables: Son aquellos que no pueden atravesar la membrana celular, por el excesivo tamaño de sus moléculas, ejerciendo la acción crioprotectora desde el exterior de la célula. A este grupo pertenecen azúcares como la glucosa, sacarosa, fructosa, y polímeros, como el polivinil pirrolidón. El tamaño de estas moléculas es muy superior a las del grupo anterior. Así por ejemplo, el peso molecular de la sacarosa es 342.

A pesar del uso de estas sustancias en los protocolos de criopreservación es una práctica habitual, los mecanismos de protección no son del todo conocidos. Los mecanismos que con certeza se saben que actúan a favor de la supervivencia celular son mecanismos físicos:

• Dilución de los electrolitos: La alta concentración de los electrolitos en las últimas etapas de la deshidratación celular, fue señalado como uno de los mecanismos causantes de la muerte celular. Al añadir


244

crioprotector disminuimos la concentración de los electrolitos, y por tanto reducimos el riesgo de muerte.

• Disminución de la concentración de agua: El otro mecanismo que causaba muerte celular era la formación de hielo intracelular. Al introducir en el medio más moléculas (de crioprotector), los cristales de hielo en crecimiento tienen una mayor dificultad para encontrar moléculas de agua y seguir así creciendo, reduciendo de esta manera el riesgo de muerte celular.

• Aumento de la viscosidad: Al añadir sustancias crioprotectoras al medio intracelular, la viscosidad de éste aumenta. Esto reduce la movilidad de las moléculas en su seno, por lo que la formación de cristales de hielo se ve menguada, aumentando de esta manera la probabilidad de supervivencia.

Otros mecanismos de naturaleza bioquímica, se sospecha que son también causantes de la elevada tasa de supervivencia que se alcanza al añadir agentes crioprotectores. Estos mecanismos escapan al tratamiento matemático y por tanto a las posibilidades de este proyecto. Tan sólo comentaremos a modo de ejemplo, que agentes crioprotectores polares, como el DMSO, podrían estabilizar la membrana celular mediante interacciones electrostáticas.

Además de los mecanismos físicos descritos anteriormente, y cuyo efecto beneficioso es bastante evidente, hay otro mecanismo físico. Éste es el efecto coligativo, es decir, la adición del soluto al disolvente, cuyo efecto beneficioso no está del todo claro. En el apartado 3 de este capítulo nos encargaremos de analizar estos efectos.

A pesar de los bien conocidos efectos beneficiosos de los agentes crioprotectores, éstos pueden ser muy dañinos, especialmente cuando son empleados en altas concentraciones. Los principales efectos dañinos son dos:

• Toxicidad: Los agentes crioprotectores son sustancias químicas que en condiciones normales no se encuentran en el interior de las células. Por ello, cuando atraviesan la membrana celular y se difunden por el medio intracelular, lo que realmente estamos haciendo es envenenar a la célula. Sin embargo como el metabolismo celular está muy ralentizado, la acción tóxica de los crioprotectores se ve muy disminuida, salvo que empleemos muy altas concentraciones a temperaturas relativamente altas (en el entorno de los 0ºC).

• Ósmosis: Los agentes crioprotectores se añaden al medio extracelular y desde ahí se difunden hasta las proximidades de la célula. En ese momento tenemos un medio extracelular con una concentración de solutos superior a la que hay en el medio intracelular. Como consecuencia de este desequilibrio la célula comienza a deshidratarse. Puesto que la velocidad con la que los crioprotectores atraviesan la membrana celular es mucho más pequeña que la velocidad con la que


245

el agua es evacuada, la extensión de la deshidratación es muy grande y muy rápida, fenómeno que se ha comprobado ser dañino para la célula. En este capítulo, también pretendemos modelar este fenómeno para tener así herramientas con las que diseñar protocolos de adición de crioprotectores, que minimicen estos daños.


246

V-2. PROTOCOLO DE ADICIÓN DE AGENTES CRIOPROTECTORES

2.1. INTRODUCCIÓN

En este apartado vamos a desarrollar un modelo matemático que nos permita conocer la evolución del volumen celular, cuando añadimos al medio extracelular agentes crioprotectores, tanto permeables como no permeables.

La repuesta celular, cuando añadimos crioprotectores al medio, se divide en dos etapas:

• Deshidratación rápida e intensa. • Rehidratación de la célula, más pausada.

La naturaleza de esta respuesta se debe a la diferente permeabilidad que presenta la membrana celular frente al agua, y los crioprotectores permeables. Por ejemplo, para el caso de glóbulos rojos de bovino la permeabilidad de la membrana al agua es 5×105 veces superior que la que presenta frente al glicerol. ¿cuáles son las consecuencias de esta discrepancia? Cuando introducimos una célula en un medio con una concentración de solutos superior a la isotónica, debido a la presencia de agentes crioprotectores, se desencadenan una serie de mecanismos para devolver el equilibrio entre la célula y el medio extracelular:

• Mecanismo A: El agua del medio intracelular sale de la célula para incrementar la concentración de solutos en su interior.

• Mecanismo B: Los agentes crioprotectores del medio extracelular penetran en el interior de la célula, para incrementar la concentración de solutos en su interior.

Puesto que el mecanismo A, de evacuación de agua, es mucho más efectivo que el mecanismo B, el primer efecto es una deshidratación rápida e intensa de la célula. Sin embargo puesto que la concentración de crioprotector en el interior de la célula no para de crecer, llega un momento en que la concentración de solutos en el interior de la célula es superior a la existente en el medio extracelular, por lo que comienza a entrar agua en el interior de la célula. Esta rehidratación de la célula prosigue hasta que la concentración de crioprotector en el interior de la célula se iguala con la que hay en el medio extracelular.


247

2.2. MODELO MATEMÁTICO

2.2.1 DESHIDRATACIÓN INICIAL POR LA PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES EN EL MEDIO EXTRACELULAR.

Partiremos de la ecuación de deshidratación que hemos venido empleando hasta este momento(Ec178):

in

ex

A

g

PP

V

TRATL

dtdV

ln)(

* ⋅⋅⋅⋅

= Ec. 350

Aplicando en la ecuación Ec350 la ley de Raoult (apartado 3.2 del capítulo 1), tanto a la presión del medio intracelular como del medio extracelular, y despreciando la presión parcial ejercida por los solutos :

in

ex

A

g

xx

V

TRATL

dtdV

ln)(

* ⋅⋅⋅⋅

= Ec. 351

donde xex y xin son las fracciones molares del disolvente en el medio extracelular e intracelular respectivamente.

Suponiendo que no entra crioprotector en todo el proceso de deshidratación, la fracción molar de disolvente en el medio intracelular (Ec202) queda:

*mABBmBB

mBBin

VnVnVVnV

x⋅⋅+⋅−

⋅−= ∞

∞

ν Ec. 352

Si consideramos que la concentración de sales y crioprotectores no cambia en el medio extracelular, la fracción molar de disolvente no se modificará a lo largo de todo el proceso de deshidratación, siendo por tanto igual a la que había inicialmente :

exCPAnp

exCPAp

exB

ex xxxx −−−= 1 Ec. 353

donde xBex es la fracción molar de sal en el medio extracelular, xCPAp

ex es la fracción molar de crioprotector permeable en el medio extracelular, y xCPAnp

ex es la fracción molar de crioprotector no permeable en el medio extracelular.

Sustituyendo en la ecuación Ec350, llegamos a la ecuación deseada:

⋅⋅+⋅−

⋅−−

⋅⋅⋅= ∞

∞

** ln)ln()(

mABBmBB

mBBex

mA

p

VnVnVVnV

xV

TRATL

dtdV

ν Ec. 354


248

2.2.2 REHIDRATACIÓN PROGRESIVA DE LA CÉLULA DEBIDO A LA ENTRADA DE CRIOPROTECTORES PERMEABLES

Puesto que la permeabilidad de las membranas celulares al agua es muy superior que la permeabilidad a cualquier crioprotector permeable, supondremos que la transferencia del crioprotector al interior de la célula se produce en condiciones de equilibrio osmótico. Para entenderlo mejor, el sistema está evolucionando por sucesivos estados de equilibrio pues al ser tan lenta la velocidad de transferencia de moles de crioprotector al interior de la célula, respecto de la velocidad tan elevada con la que se transfiere agua, que es la velocidad con la que se alcanza el equilibrio, el sistema nunca abandona el estado de equilibrio.

Por lo tanto a lo largo de todo el proceso de rehidratación se cumplirá la igualdad de presiones osmóticas(apartado 2.4 del capítulo 2):

exin ππ = Ec. 355

Aplicando la ecuación de van’t Hoff,(apartado 2.1 del capítulo 2) que relacionaba la presión osmótica con la temperatura, para el caso de soluciones diluidas ideales, tenemos:

∑∑ ⋅⋅=⋅⋅ exin mTRmTR Ec. 356

donde min y mex son las molalidades de los solutos en el medio intracelular y extracelular respectivamente.

Suponiendo que la concentración de solutos en el medio extracelular no cambia, la suma de molalidades de solutos en el medio extracelular es conocida e igual a las concentraciones iniciales.

La suma de molalidades del medio intracelular será:

∑⋅

+⋅

⋅=

10001000A

A

CPAp

AA

BBin

Mn

nM

n

nm

ν Ec. 357

El volumen de la disolución intracelular podemos expresarlo como se muestra en la ecuación Ec358:

∞∞ ⋅+⋅+⋅≈ mCPApCPApmBBmAA VnVnVnV * Ec. 358

Despejando el número de moles de disolvente nA, en la Ec358 y sustituyéndolo en la ecuación Ec357, tenemos:


249

*1000)(

mA

AmCPApCPApmBB

CPApBBin

VM

VnVnV

nnm

⋅⋅⋅−⋅−

+⋅=

∞∞∑

ν Ec. 359

Aplicando Ec356 a la ecuación Ec359 y despejando el volumen de disolución intracelular:

∞∞ ⋅+⋅+⋅

⋅

+⋅=

∑mCPApCPApmBB

ex

mA

A

CPApBB VnVnm

VM

nnV

*1000

ν Ec. 360

Para poder conocer la evolución del volumen de la disolución intracelular durante el proceso de rehidratación, dada por la ecuación Ec360, necesitamos conocer cómo se va modificando el número de moles de crioprotector presentes en el medio intracelular. Esta evolución la obtenemos planteando una ecuación de balance de materia similar a la que planteamos en su momento para modelar la deshidratación celular durante el enfriamiento(Ec 176):

( )inCPAp

exCPApCPAp

CPAp mmAPdt

dn−⋅⋅= Ec. 361

donde PCPAp es la permeabilidad de la membrana celular al crioprotector permeable, A es el área de la membrana, y mCPAp

ex y mCPApin son las molalidades

del crioprotector permeable en el medio extracelular e intracelular respectivamente. La molalidad del crioprotector en el medio extracelular es conocida, mientras que la del medio intracelular es de la forma:

*1000)(

1000 mA

AmCPAp

inCPApmBB

inCPAp

AA

inCPApin

CPAp

VM

VnVnV

nM

n

nm

⋅⋅⋅−⋅−

=⋅

=∞∞

Ec. 362

Sustituyendo Ec360, en la ecuación Ec362:

∑⋅+⋅= ex

inCPApBB

inCPApin

CPAp mnn

nm

ν Ec. 363

Sustituyendo Ec363 en Ec361:

+⋅−⋅⋅⋅= in

CPApBB

inCPApex

CPApACPApCPAp

nn

nmAP

dt

dn

νρ Ec. 364


250

El sistema de ecuaciones constituido por la ecuación del volumen de disolución intracelular(Ec360), y la ecuación Ec364, nos permite calcular la evolución del volumen de disolución intracelular y también la evolución de la concentración del crioprotector en el interior de la célula.

A continuación vamos a aplicar las ecuaciones aquí deducidas para obtener la evolución gráfica de la deshidratación de óvulos de ratón, en presencia de glicerol como crioprotector permeable, y de sacarosa como crioprotector no permeable.


251

2.3. RESOLUCIÓN NUMÉRICA PARA ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS

2.3.1 DATOS NUMÉRICOS

Los datos físicos de los óvulos de ratón no fertilizados fueron expuestos en el apartado 7.4.2.1 del capítulo 2 de LA DESHIDRATACIÓN CELULAR. Todos estos datos son de aplicación en el modelo matemático de la deshidratación ante la presencia de crioprotectores en el medio, pero necesitamos un dato más, la permeabilidad de la membrana celular frente al crioprotector permeable. En relación con este parámetro disponemos del dato de la permeabilidad al glicerol a 20ºC.

Pglicerol=6×10-6 m/min

Probablemente la permeabilidad de la membrana al glicerol será una función de la temperatura, al igual que la permeabilidad al agua. Sin embargo debido a la ausencia de datos físicos, no podemos obtener esta relación. No obstante debido a que la adición de crioprotectores se realiza en un rango de temperaturas muy estrecho, comparado con el rango de temperaturas en el que nos movemos cuando enfriamos a las células, y puesto que el valor de la permeabilidad es muy pequeño, podemos emplear este valor de la permeabilidad para temperaturas distintas a los 20ºC, pudiendo incluso emplearla hasta una temperatura de 0ºC.


252

2.3.2 ADICIÓN DE CRIOPROTECTORES EN UNA SOLA ETAPA

En este apartado vamos a discutir los fenómenos que ocurren en una célula cuando la sumergimos en un medio que tiene las concentraciones finales de crioprotectores. En la figura adjunta tenemos la evolución del volumen celular respecto del inicial cuando sumergimos a la célula en un medio que tiene una concentración de glicerol (crioprotector permeable) 3M, y una concentración de sacarosa (crioprotector no permeable) 0.3M, a una temperatura de 20ºC.

0 5 10 150

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS

Tiempo/min

Fra

cció

n d

el

volu

me

n i

nic

ial

Figura 48

Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 48, se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 17.

En la evolución del volumen celular observamos dos etapas. Una primera etapa de deshidratación muy rápida, dura 36 segundos, y muy intensa, se llega a una deshidratación del 92.39%, y una segunda etapa de rehidratación que tarda aproximadamente 15 minutos en alcanzar el valor de equilibrio, que no es el volumen inicial de la célula sino el 53.2% del volumen inicial, debido a la presencia de crioprotectores no permeables. Efectivamente si no añadimos sacarosa al medio, la evolución del volumen celular es como se indica en la figura 49:


253

0 5 10 15 20 25 300

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


Tiempo/min

Fra

cció

n d

el

volu

me

n i

nic

ial

Figura 49

Ahora la primera etapa de deshidratación dura 45 segundos, llegándose a una deshidratación máxima del 91%. El volumen celular transcurridos 30 minutos es del 96.74% del volumen inicial, y si dejamos evolucionar el sistema 10 minutos más, llegamos hasta el 98.63% del volumen inicial.

Por lo tanto el efecto de la adición de crioprotector no permeable es el de inducir una deshidratación permanente en la célula antes del proceso de enfriamiento celular:


254

0 5 10 15 20 25 300

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


Tiempo/min

Fra

cció

n d

el

volu

me

n i

nic

ial

1M

0.5M

0.4M

0.3M

0.2M

0.1M

0M

Figura 50

La duración y la deshidratación máxima de la primera etapa también varía según la concentración de sacarosa, según podemos ver en la figura 50:

Concentración molar de sacarosa

Duración de la etapa de deshidratación / segundos Volumen relativo al inicial

0M 45.3248 8.99% 0.1M 41.8839 8.51% 0.2M 39.2249 8.05% 0.3M 36.6463 7.61% 0.4M 34.2371 7.20% 0.5M 31.8886 6.81% 1M 22.2703 5.15%

En la tabla anterior vemos como al aumentar la concentración de sacarosa en el medio, la deshidratación final es cada vez mayor, y el tiempo empleado para ello es cada vez menor.

A continuación en la figura 51 vamos a mostrar cual es el efecto que tiene la mayor o menor concentración de crioprotector permeable sobre el volumen celular.


255

0 5 10 15 20 25 300

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


Tiempo/min

Fra

cció

n d

el

volu

me

n i

nic

ial

1M

3M

5M

Figura 51

En el gráfico observamos que al aumentar la concentración de crioprotector permeable en el medio, la extensión de la deshidratación máxima es mayor y se alcanza en menor tiempo, siendo además más lenta la rehidratación.

Concentración de glicerol

Duración etapa de deshidratación

/segundos

Volumen relativo mínimo

Volumen relativo a los 30 minutos

1M 192.7904 25.59% 99.94% 3M 45.3248 8.99% 98.63% 5M 20.1395 4.74% 97.11%

Como comentario final podemos decir que la adición de sacarosa, o de cualquier otro tipo de crioprotector no permeable, tiene unos efectos que en principio son muy deseables, pues permite deshidratar a la célula antes de que comencemos a enfriar el sistema, y por lo tanto antes de que el agua pueda formar hielo. Sin embargo la rapidez con la que se produce esta deshidratación es dañina para las células, por lo que interesaría alargar el tiempo en el que se produce la deshidratación. Con este objetivo, en el apartado siguiente analizaremos las evoluciones del volumen celular cuando añadimos los crioprotectores poco a poco.


256

2.3.3 ADICIÓN DE CRIOPROTECTORES EN VARIAS ETAPAS

A continuación vamos a mostrar cómo evoluciona el volumen celular cuando vamos añadiendo poco a poco los crioprotectores. Nosotros vamos a proponer un protocolo en el que primero añadimos el crioprotector no permeable (sacarosa) que suele tener una toxicidad baja al ser productos químicos que de forma natural se encuentran en el cuerpo, y además permanecen fuera de la célula, para posteriormente añadir el crioprotector permeable, que tiene mayor toxicidad por ser productos químicos que no se encuentran de forma natural en los organismos vivos.

En el programa que hemos diseñado, la concentración final de crioprotector se divide entre el número de etapas que deseamos, incrementándose en cada etapa la concentración una cantidad fija, hasta alcanzar la concentración final. La duración de cada etapa viene dada por el tiempo que tarda el sistema en alcanzar el valor de equilibrio.

En el gráfico de la figura 52 mostramos un protocolo de adición de sacarosa primero y de glicerol después, en tres etapas cada uno, hasta alcanzar la concentración final de 0.3M para la sacarosa y de 3M para el glicerol, todo ello a una temperatura de 20ºC.

0 5 10 15 20 25 300

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

PROTOCOLO DE ADICICIÓN DE CRIOPROTECTORESEN ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS

Tiempo/minutos

Fra

cció

n d

el

volu

me

n i

nic

ial

Adición de sacarosa

Adición de glicerol

Figura 52


257

Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico, se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 18.

En este gráfico de la figura 52 apreciamos la enorme diferencia que existe entre un protocolo con etapas frente a uno sin etapas. Si sometemos la muestra a las concentraciones finales de crioprotector la deshidratación se lleva a cabo en escasos segundos, mientras que en un protocolo donde la concentración de los crioprotectores aumenta progresivamente, el tiempo requerido para la deshidratación máxima es del orden de unos pocos minutos. En la tabla adjunta se muestra la duración de las etapas de deshidratación, tanto las debidas a la sacarosa, como las debidas al glicerol.

Concentración final de

sacarosa

Concentración final de glicerol

Duración de la etapa /minutos

Duración del protocolo /minutos

Volumen relativo

V/Vi 0.1M 0M 7.0668 7.0668 0.7744 0.2M 0M 4.2108 11.2776 0.6268 0.3M 0M 2.8195 14.0971 0.5224 0.3M 1M 1.5513 15.6484 0.1960 0.3M 2M 0.3969 16.0453 0.1137 0.3M 3M 0.1598 16.2051 0.0761

El intento de alargar la duración de la etapa de deshidratación al añadir sacarosa, ha sido un éxito, durando 14 minutos, no así con la etapa de deshidratación debida al glicerol, que ha durado tan sólo 2 minutos. Podríamos aumentar el número de etapas para añadir el glicerol, como se muestra en la figura 53, pero la exactitud de los datos es dudosa, pues el modelo se basa el la rápida deshidratación que permite hacer la simplificación de que nada de glicerol entra mientras la célula se deshidrata. Esto es estrictamente falso cuando la duración de la etapa de deshidratación debida al glicerol se alarga.


258

0 5 10 15 20 25 300

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

PROTOCOLO DE ADICICIÓN DE CRIOPROTECTORESEN ÓVULOS DE RATÓN NO FERTILIZADOS

Tiempo/minutos

Fra

cció

n d

el

volu

me

n i

nic

ial

Adición de sacarosa

Adición de glicerol

Figura 53

Ahora el número de etapas de adición del glicerol se ha incrementado hasta diez, logrando de esta manera aumentar la duración de la etapa de deshidratación.

Concentración final de

sacarosa

Concentración final de glicerol

Duración de la etapa

Duración del protocolo /minutos

Volumen relativo

V/Vi 0.1 M 0 M 7.0668 min 7.0668 0.7744 0.2 M 0 M 4.2108 min 11.2776 0.6268 0.3 M 0 M 2.8195 min 14.0971 0.5224 0.3 M 0.3 M 3.4427 min 17.5398 0.3541 0.3 M 0.6 M 1.7447 min 19.2845 0.2651 0.3 M 0.9 M 59.67 seg 20.2790 0.2101 0.3 M 1.2 M 39 seg 20.9288 0.1725 0.3 M 1.5 M 26.72 seg 21.3741 0.1454 0.3 M 1.8 M 18.87 seg 21.6886 0.1248 0.3 M 2.1 M 13.64 seg 21.9159 0.1087 0.3 M 2.4 M 10.58 seg 22.0923 0.0957 0.3 M 2.7 M 7.77 seg 22.2218 0.0851 0.3 M 3 M 6.23 seg 22.3256 0.0761


259

Ahora la duración de la etapa de deshidratación a causa del glicerol es de 8 minutos.


260

V-3. EFECTOS COLIGATIVOS DE LOS CRIOPROTECTORES PERMEABLES

3.1. INTRODUCCIÓN

En este apartado vamos a desarrollar un modelo matemático de deshidratación celular, asociado a los procesos de enfriamiento, que tenga en cuenta la presencia de agentes crioprotectores en el medio intracelular, es decir, solo tendremos en cuenta la existencia de agentes crioprotectores permeables. Este modelo tendrá en cuenta la presencia de agentes crioprotectores, desde un punto de vista coligativo, es decir, el único que efecto que tendrá la presencia de crioprotectores permeables vendrá asociada a que simplemente tendremos una mayor cantidad de moles de soluto en el medio intracelular.

En los modelos matemáticos de deshidratación que estamos empleando, el único efecto que podrá tener la presencia de crioprotectores no permeables será la de comenzar el proceso de deshidratación celular asociado al enfriamiento, sobre una célula previamente deshidratada.

Una vez planteado el modelo matemático, lo programaremos en lenguaje MATLAB para su resolución numérica y compararemos los resultados con el caso de ausencia de crioprotector. De esta manera podremos deducir los posibles efectos beneficiosos de la adición de crioprotectores desde el punto de vista de los efectos coligativos.


261

)(*, TPP sA

ex ≈

3.2. MODELO MATEMÁTICO

Para obtener el modelo matemático de deshidratación asociado a los procesos de enfriamiento, partiremos de la ecuación Ec178 de balance de agua, en función del cociente de presiones de vapor, entre el medio intracelular y extracelular, pues hasta ese momento, en ningún momento se comenta nada acerca de la composición del medio:

in

ex

A

g

PP

V

TRATL

dtdV

ln)(

* ⋅⋅⋅⋅

= Ec. 365

donde V*A es el volumen molar del disolvente puro, Lg(T) es el coeficiente de

permeabilidad, A es el área de la membrana, R es la constante universal de los gases, T es la temperatura del sistema, y Pin, Pex son las presiones de vapor de la solución intracelular y extracelular respectivamente.

A continuación vamos a desarrollar el cociente de las presiones de vapor, donde ya si que tenemos que tener en cuenta la composición del medio intracelular:

Ø Solución intracelular : aplicando la ley de Raoult ideal tenemos.

inCPACPA

inBB

inAlA

in xTPxTPxTPP ⋅+⋅+⋅= )()()( ***, Ec. 366

donde P*A,l , P*

B , y P*CPA son las presiones de vapor del agua líquida ,

de la sal y del crioprotector y xinA , xin

B ,y xinCPA son las fracciones molares

de agua , sal, y crioprotector respectivamente.

Aplicando la hipótesis simplificatoria 3 (apartado IV-3), que desprecia las presiones de vapor de los solutos frente a la del disolvente, y teniendo en cuenta además que xin

A>>xinB ,y que xin

A>>xinCPA al tratarse de una

disolución diluida, podemos escribir:

Ec. 367

Ø Solución extracelular : como ya se demostró en el apartado 6.2 del capítulo 4 de DESHIDRATACIÓN CELULAR, la presión de vapor del medio extracelular, donde tenemos una disolución líquida en equilibrio con hielo, es aproximadamente igual a la presión de vapor del hielo puro:

Ec. 368

inAlA

in xTPP ⋅≈ )(*,


262

Por lo tanto la ecuación de deshidratación, en función de la composición del medio intracelular, es idéntica a la que obtuvimos en el caso de ausencia de crioprotectores(Ec191):

−⋅

⋅⋅⋅= in

AlA

sA

A

g xTP

TP

V

TRATL

dtdV

ln)(

)(ln

)(*,

*,

* Ec. 369

Aplicando las ecuaciones de Clausius-Clapeyron que relacionaban las presiones de vapor con la temperatura, y tomando como temperatura de referencia T=273.15K, la ecuación de deshidratación queda:

−

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫

T

AF

A

g xdTTRTL

V

TRATL

dtdV

15.2732* ln)()(

Ec. 370

En la ecuación de deshidratación la única variable dependiente que vamos a considerar es el volumen de disolución osmóticamente activo, en el interior de la célula, y la única variable independiente a tener en cuenta va a ser la temperatura del sistema.

Por ello la variación del volumen con el tiempo debemos expresarlo en función de la temperatura:

dTdV

TFdtdT

dTdV

dtdV

⋅=⋅= )( Ec. 371

donde F(T) es una función de la temperatura particular de cada perfil de enfriamiento, que son las funciones que desarrollamos en el apartado 6.4 del capítulo 4 de DESHIDRATACIÓN CELULAR.

Por la misma razón, la fracción molar de disolvente debemos expresarla en función del volumen de disolución intracelular y en función de la temperatura del sistema, y es aquí donde reside la diferencia entre el modelo sin crioprotector y el modelo con crioprotector:

CPABBA

AA nnn

nx

+⋅+=

ν Ec. 372

donde nA , nB y nCPA son los moles de disolvente(agua) ,de sal(ClNa) y de crioprotector respectivamente, y ?B es el coeficiente de disociación de la sal.

Si multiplicamos y dividimos por el volumen molar del agua pura, nada cambia:


263

***

*

ACPAABBAA

AAA VnVnVn

Vnx

⋅+⋅⋅+⋅⋅

=ν

Ec. 373

El volumen de disolución intracelular es:

CPACPABBAA VnVnVnV ⋅+⋅+⋅= Ec. 374

donde VA , VB y VCPA son los volúmenes molares parciales del agua, sal, y crioprotector respectivamente.

Aplicando las hipótesis simplificatorias 7 de aproximar el volumen molar parcial del disolvente al volumen molar del disolvente puro, y 8 de aproximar el volumen molar parcial de los solutos al volumen molar a dilución infinita, podemos escribir:

∞∞ ⋅+⋅+⋅≈ CPACPABBAA VnVnVnV * Ec. 375

donde V*A es el volumen molar del disolvente puro, V8

B es el volumen molar a dilución infinita de la sal, y V∞

CPA es el volumen molar a dilución infinita del crioprotector.

Por lo tanto la fracción molar de disolvente queda:

*)( ACPABBCPACPABB

CPACPABBA VnnVnVnV

VnVnVx

⋅+⋅+⋅−⋅−⋅−⋅−

= ∞∞

∞∞

ν Ec. 376

Para simplificar la notación de la expresión anterior, definimos las siguientes variables:

• Volumen ocupado por los solutos: ∞∞ ⋅+⋅= CPACPABBsol VnVnV • Moles de soluto disueltos: CPABBsol nnn +⋅=ν

Aplicando estas definiciones a la Ec376 tenemos:

*Asolsol

solA VnVV

VVx

⋅+−−

= Ec. 377

Finalmente la ecuación de deshidratación celular cuando tiene en cuenta la presencia de agentes crioprotectores queda:

⋅+−−

−⋅

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫ *

15.2732* ln)(

)(

)(

Asolsol

solT

F

A

g

VnVVVV

dTTRTL

TFV

TRATL

dTdV

Ec. 378


264

La ecuación de la curva de descenso crioscópico, cuando tiene en cuenta la presencia de agentes crioprotectores queda:

⋅=

⋅+−−

∫T

F

Asolsol

sol dTTRTL

VnVVVV

15.2732*

)(exp Ec. 379

La ecuación que describe la deshidratación celular, cuando la temperatura del sistema permanece constante, cuando tenemos en cuenta la presencia de crioprotectores en la solución intracelular queda:

⋅+−−

−⋅

⋅⋅⋅⋅

= ∫ *15.273

2* )()(

ln)()(

AsolsolCTE

solCTET

F

A

CTECTEg

VnVTVVTV

dTTRTL

V

TRATL

dtdV CTE

Ec. 380


265

3.3. ANÁLISIS DEL EFECTO DE LA PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES PERMEABLES EN EL MEDIO INTRACELULAR

3.3.1 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE DESHIDRATACIÓN

A continuación vamos a mostrar la evolución de la deshidratación celular en espermatozoides de ratón para una única velocidad de enfriamiento de 30ºC/min , variando la concentración de glicerol en el interior de la célula:

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TEMPERATURA/ºC

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

Descenso crioscópicosin crioprotectores

Descenso crioscópicocon crioprotectores

Deshidrataciónsin crioprotectores

Deshidrataciónsin crioprotectores

2M

1M

0.5M

Figura 54

Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 54 son los mismos que los que empleamos para calcular la deshidratación en ausencia de crioprotectores.

Claramente se ve que el efecto que tiene la adición de crioprotectores permeables, es una menor deshidratación celular. Así por ejemplo en ausencia de crioprotectores el volumen celular es un 7.8512% del inicial a los –20ºC, mientras que cuando tenemos una concentración 1M de glicerol, el volumen celular es tan solo del 50.4903% a la misma temperatura. Sin embargo como la deshidratación máxima admisible, marcada por la curva de descenso crioscópico, varía con la concentración de crioprotector, debemos emplear un parámetro de deshidratación


266

relativo a esa deshidratación máxima. Definimos la tasa de deshidratación relativa como:

TaocrioscopicdescensodecurvaladerelativoVolumenTatemperaturlaainicialalrelativocelularVolumen

TTDR−

−=

11

)( Ec. 381

En la tabla adjunta, mostramos la evolución de la tasa de deshidratación relativa en función de la concentración de crioprotector:

Concentración de glicerol

Volumen relativo al inicial/%v

Volumen relativo en curva descenso

crioscópico/%v TDR(-20ºC)

0M 7.8512 5.2393 97.2438% 0.5M 39.5545 13.0630 69.5279% 1M 50.4903 20.8867 62.5807% 2M 68.2149 36.5340 50.0820%

Los datos de la tasa de deshidratación relativa si son comparables, y vemos como mientras en ausencia de glicerol, cuando la célula alcanza los –20ºC, el 97% del agua total disponible para ser evacuada, a sido expulsada de la célula, mientras que cuando tengo glicerol con una concentración 1M, tan sólo he expulsado el 69.5% del agua que es posible evacuar.

Vemos por tanto que cuanto mayor es la concentración de crioprotector, menor es la cantidad de agua evacuada para cada temperatura, siendo también menor la cantidad máxima de agua que es posible expulsar fuera de la célula. Este valor que denominamos ADD(T), (Agua Disponible para Deshidratación), se define de la siguiente forma:

100)1()( ⋅−= TaocrioscopicdescensodecurvalaenrelativocelularVolumenTADD

Ec. 382

En la tabla adjunta se muestran los valores del ADD para el espermatozoide de ratón a los –20ºC:

Concentración de glicerol ADD(-20ºC) 0M 94.7607%

0.5M 86.9370% 1M 79.1133% 2M 63.4660%

Vemos como efectivamente al aumentar la concentración de glicerol, la cantidad de agua máxima que podríamos evacuar es cada vez menor. Cuando no tengo glicerol, el 94.7% del agua del interior de la célula puede ser expulsada por


267

deshidratación, mientras que cuando tengo glicerol con una concentración 1M, tan solo el 79% del agua del interior de la célula se podría expulsar.

Esta disminución de la deshidratación celular es en principio perjudicial, pues tenemos más agua en el interior de la célula para formar hielo. Al formarse más hielo, mayores serán los daños producidos en el interior de la célula.


268

3.3.2 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE DESHIDRATACIÓN A TEMPERATURA CONSTANTE

En este apartado vamos a estudiar la evolución de la deshidratación celular para una temperatura constante y una única velocidad de enfriamiento, modificando la concentración intracelular de crioprotector permeable. Los resultados para el caso de espermatozoides de ratón, a una temperatura de –10ºC, y a una velocidad de –30ºC/min, se muestran en la figura 55.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TIEMPO/MIN

FR

AC

CIÓ

N D

EL

VO

LU

ME

N I

NIC

IAL

DE

AG

UA

s in crioprotector

con crioprotector

2M

1M

0.5M

Figura 55


La consecuencia más evidente de la adición de crioprotector es la disminución de la deshidratación celular, debido al mayor volumen relativo que presentan las células a lo largo de la curva de descenso crioscópico, para cada temperatura, como se pudo apreciar en el apartado anterior. Recordamos que la deshidratación a temperatura constante tiene una evolución asintótica hacia el valor marcado por la curva de descenso crioscópico a la temperatura constante a la que se produce la deshidratación.

Otra consecuencia importante de la presencia de crioprotectores es el incremento del tiempo necesario para llegar al valor final de deshidratación. Esto


269

en principio no era de esperar puesto que la tasa de deshidratación a alcanzar es menor. Esta ralentización del proceso de deshidratación a temperatura constante es indeseable. Esto es debido a que las etapas de evolución a temperatura constante se intercalaban entre etapas de enfriamiento para estabilizar el sistema, es decir, reducir el subenfriamiento a valores muy bajos, y por lo tanto una mayor duración de estas etapas se traducirá en una mayor duración del protocolo, aumentando los riesgos de muerte celular por mantenerse el medio intracelular en contacto con concentraciones salinas demasiado altas, durante demasiado tiempo.

Para comprobar estas sospechas, en la figura 56 mostramos un protocolo de enfriamiento por etapas a 30ºC/min en ausencia de crioprotectores, y a continuación el mismo protocolo pero con una concentración 1M, 2M y 5M de glicerol. El objetivo del protocolo es llegar a los –40ºC siempre y cuando el número de etapas requeridas sea inferior a 20. por una etapa del protocolo se entiende un periodo de enfriamiento y un periodo de temperatura constante.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9


TIEMPO/min

FR

AC

CIO

N V

OL

UM

EN

IN

ICIA

L

Etapas de temperaturaconstante

Etapas de enfriamientoa 30ºC/min

0M

1M

2M

5M

Figura 56

Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 56 se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 20.


270

En la siguiente tabla mostramos las duraciones de las etapas de temperatura constante, así como la duración total de los protocolos para las distintas concentraciones de crioprotector:

Molaridad Glicerol

Duración de la

Etapa 1 /segundos

Duración de la

Etapa 2 /segundos

Duración de la

Etapa 3 /segundos

Duración de la

Etapa 4 /segundos

Duración de la

Etapa 5 /segundos

Duración de la

Etapa 6 /segundos

Duración de la

Etapa 7 /segundos

Duración total del

protocolo /minutos

0M 30.2 38.1 93.1 187.5 7.2 1M 76.7 34.9 34.0 47.0 62.2 90.0 7.1 2M 86.1 57.9 54.6 61.7 85.4 112.5 142.5 11.4 5M 108.4 112.5 135.0 172.5 217.5 277.5 18.4

Analizando los resultados de esta tabla, observamos como efectivamente al aumentar la concentración de glicerol, la duración del protocolo aumenta, excepto cuando tenemos concentraciones 1M de glicerol. En ese caso la duración del protocolo es aproximadamente igual.

Podemos observar también, como al avanzar en las etapas del protocolo la duración de la etapa a temperatura constante es también mayor.

En la primera columna podemos ver también como al aumentar la concentración de glicerol, la duración de la etapa a temperatura constante es cada vez mayor. Este comportamiento se repite en las otras columnas cuando excluimos la primera fila que corresponde al caso de ausencia de crioprotectores. La razón de esta discrepancia solo cabe explicarse por la diferencia de comportamiento que presenta la deshidratación celular, con y sin crioprotectores.

En la figura 57 mostramos las evoluciones de los subenfriamientos para cada concentración de glicerol, en los protocolos que hemos visto en la figura 56.


271

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

5


0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200

5

Tiempo/minutos

0M de glicerol

1M de glicerol

2M de glicerol

5M de glicerol

Figura 57


En estos gráficos se observa más claramente la evolución de la duración de cada una de las etapas del protocolo, confirmándose de nuevo la mayor duración del protocolo, cuanto mayor es la concentración de glicerol.


272

3.3.3 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE SUBENFRIAMIENTO

En este apartado vamos a estudiar la evolución del subenfriamiento celular para una única velocidad de enfriamiento, modificando la concentración intracelular de crioprotector permeable. Los resultados para el caso de espermatozoides de ratón, y una velocidad de –30ºC/min, se muestran a continuación.

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

5

10

15

20

25


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR S in crioprotector

Con glicerol

1M 2M 3M 5M

Figura 58

Los programas necesarios para poder dibujar el gráfico de la figura 58 se encuentran en el anexo Programas, en el apartado 5.

Podemos observar dos etapas en la evolución del subenfriamiento, para el caso de presencia de crioprotectores. Una primera etapa donde el subenfriamiento con crioprotector es menor que en el caso de su ausencia, y otra etapa donde el ocurre lo contrario.

Cuanto mayor es la concentración del glicerol, menor es el subenfriamiento para cada temperatura, y más baja es la temperatura a la cual se igualan el subenfriamiento con y sin crioprotector.


273

Para el caso de una velocidad de enfriamiento alta de 50ºC/min obtenemos el gráfico de la figura 59:

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

5

10

15

20

25


TEMPERATURA/ºC

SU

BE

NF

RIA

MIE

NT

O D

EL

ME

DIO

IN

TR

AC

EL

UL

AR

1M

2M

3M

5M

Sin crioprotector

Con glicerol

Figura 59

A altas velocidades de enfriamiento donde el subenfriamiento en células sin crioprotector es monótonamente creciente, la presencia de agentes crioprotectores reduce el subenfriamiento para todas las temperaturas. No se distinguen dos etapas como en el caso anterior. En este caso la adición de crioprotector es muy beneficiosa pues reduce el subenfriamiento a cualquier temperatura.

Como conclusión podemos decir que el efecto de añadir crioprotector a una muestra depende de la velocidad de enfriamiento:

• si la velocidad de enfriamiento es baja, la presencia de crioprotector es beneficiosa a altas temperaturas pues reduce el subenfriamiento con respecto al caso de no añadir crioprotector. Sin embargo es perjudicial a bajas temperaturas por ser el subenfriamiento mayor.

• Si la velocidad de enfriamiento es alta, la presencia de crioprotector es beneficiosa para todas las temperaturas al reducirse el subenfriamiento con respecto al caso de no añadir crioprotector.


274

3.3.4 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE FLUJO OSMÓTICO

En este apartado vamos a estudiar el efecto que la concentración de crioprotectores tiene sobre el caudal del flujo osmótico. Para ello obtenemos, en la figura 60 la evolución del caudal osmótico en espermatozoides de ratón, en función del tiempo, para una única velocidad de enfriamiento de 30ºC/min, modificado la concentración de glicerol en el interior de la célula:

0 0.5 1 1.5 2 2.5 30

10

20

30

40

50

60


TIEMPO/MIN

FL

UJO

VO

LU

ME

NT

RIC

O D

E A

GU

A(m

icra

s3 /m

in) s in crioprotector

con glicerol

1M

2M

5M

Figura 60

Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico se encuentran en el anexo Programas, en el apartado 8.

En el gráfico de la figura 60 podemos distinguir dos etapas en la evolución del caudal de agua evacuada, cuando hay presente crioprotectores. Una primera etapa donde el caudal osmótico es menor cuando hemos añadido glicerol al medio, y una segunda etapa donde ocurre todo lo contrario. También observamos que cuanto mayor sea la concentración de crioprotector, menor es el caudal para cada instante de tiempo. Esto conecta con la idea de la menor deshidratación al añadir crioprotector al medio, que vimos en el apartado 3.3.1.

Como conclusión podemos decir que la presencia de agentes crioprotectores en el medio intracelular, hace que el caudal de agua evacuado sea más uniforme


275

con el tiempo. Las puntas de caudal pueden dañar a la célula, puesto que cuanto mayor es el caudal, mayor es la presión ejercida sobre las paredes del poro, siendo mayor el riesgo de rotura de la membrana celular.


276

3.3.5 ESTUDIO DE LAS CURVAS DE CONCENTRACIÓN DE CLORURO SÓDICO

En este apartado vamos a estudiar el efecto que la concentración de crioprotectores tiene sobre la concentración de cloruro sódico en el medio intracelular. Para ello obtenemos en la figura 61 la evolución de la concentración en espermatozoides de ratón, en función de la temperatura, para una única velocidad de enfriamiento de 30ºC/min, modificado la concentración de glicerol en el interior de la célula:

-55-50-45-40-35-30-25-20-15-10-500

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

CO

NC

EN

TR

AC

IÓN

/(m

ol/

m3

)


TEMPERATURA/ºC

sin crioprotector

con glicerol

1M 2M

5M

Figura 61

Los programas necesarios para poder dibujar este gráfico, se encuentran en el anexo Programas, en el apartado 9.

En el gráfico de la figura 61 podemos observar la drástica reducción de la concentración de cloruro sódico, al añadir crioprotector. Este efecto se debe fundamentalmente a dos factores:

• Efecto de dilución del glicerol. • La menor deshidratación celular al añadir crioprotector.

Este efecto del crioprotector es enormemente beneficioso, ya que según vimos al analizar las causas de la muerte celular, las altas concentraciones de cloruro


277

sódico en el interior de la célula, eran uno de los dos factores que llevaban a la muerte de la célula. Como al añadir crioprotector, la concentración de cloruro sódico se mantiene aproximadamente constante, eliminamos este factor como causante de la muerte celular, quedando como único factor dominante la formación de hielo intracelular.

CAPÍTULO 6 EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD

278


279

VI. CAPÍTULO 6

EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD

VI-1. INTRODUCCIÓN

El proceso de deshidratación celular, permite aumentar la concentración de los solutos disueltos, tanto de la sal como del crioprotector, en el medio intracelular. Este fenómeno se debe a la naturaleza semipermeable de la membrana celular, que tan sólo permite el paso de agua pero no de los solutos disueltos en ella. Así ante un aumento de la concentración del medio extracelular, la célula responde expulsando agua, pero no los solutos disueltos en ella, lo que permite aumentar la concentración de la solución intracelular y alcanzar así un equilibrio con el medio exterior.

El medio extracelular está igualmente sometido a un proceso de aumento de la concentración de las sales, en él disueltas. Este fenómeno se debe a la ausencia de los solutos disueltos en agua, en la fase hielo. Por lo tanto conforme aumenta la proporción de agua que está en forma de hielo, aumenta la concentración de los solutos disueltos, en la fracción de agua que aun permanece en fase líquida.

El proceso de aumento de concentración de las disoluciones es deseable puesto que, permite mantener en estado líquido disoluciones acuosas a temperaturas muy por debajo de los de los 0ºC, gracias al fenómeno del descenso crioscópico, es decir, la reducción de la temperatura del punto de cambio de fase sólido-líquido, debido a la presencia de solutos disueltos.

Para simplificar el planteamiento del problema, supondremos que las especies químicas disueltas en el medio intracelular, son iguales a las del medio extracelular.

El proceso de concentración de las disoluciones, tanto intracelular, como extracelular, no puede mantenerse de manera indefinida. Al final, se alcanzarán las condiciones de saturación de los distintos solutos disueltos. Cuando se alcanzan las condiciones de saturación de un determinado soluto, su concentración en la disolución no podrá seguir aumentando, permaneciendo constante, e igual a la concentración de saturación. Sin embargo el proceso de deshidratación celular, en el medio intracelular, y la formación de hielo en el medio extracelular, tienden a concentrar la solución, pero como esto no es posible, precipitan parte de las sales disueltas.

Por lo tanto mientras no se alcancen las condiciones de saturación, la cantidad de moles de solutos disueltos, permanecerá constante; no así su concentración, que irá aumentando. Cuando la solución esté saturada, el


280

número de moles disueltos disminuye para mantener constante la concentración.

Es decir, hay una primera etapa donde la concentración de los solutos disueltos va aumentando con el tiempo, con la condición de que el número total de moles de soluto disueltos permanece constante. Esta etapa continúa mientras no se alcancen las condiciones de saturación. La segunda etapa comienza cuando se alcanzan las condiciones de saturación de uno de los solutos disueltos. Conforme enfriamos, la concentración de dicho soluto permanece constante, e igual al valor de saturación, mientras que la cantidad de moles disueltos de dicho soluto va disminuyendo con el tiempo, debido al proceso de precipitación. Las otras especies químicas, que constituyen el soluto y que aun no han alcanzado las condiciones de saturación, continúan aumentando su concentración y manteniendo constante la cantidad de moles disueltos, es decir, aun no han comenzado a precipitar.

Para poder visualizar gráficamente los procesos que hemos descrito, emplearemos diagramas de fases, introduciendo el concepto del punto Eutéctico.

Basándonos en los diagramas de fases, y en el análisis de los grados de libertad, estudiaremos los fenómenos que acontecen, tanto en el medio intracelular, como extracelular.

Por último plantearemos un modelo de deshidratación celular que tenga en cuenta el hecho de que las soluciones quedan saturadas en sal.

Haremos este estudio, primero en el caso de ausencia de crioprotectores, para posteriormente tenerlos en cuenta. Sólo tendremos en cuenta crioprotectores permeables.


281

VI-2. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD SIN PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES

2.1. DIAGRAMAS DE FASES. LOS SISTEMAS EUTÉCTICOS SIMPLES

2.1.1 INTERPRETACIÓN DEL DIAGRAMA DE FASES

El diagrama de equilibrio de un sistema de dos componentes miscibles en estado líquido, pero inmiscibles en estado sólido, y que se denomina sistema eutéctico simple, se muestra en la figura 62.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5

0DIAGRAMA DE FASES DEL CLORURO SÓDICO

Fracción en peso de la sal(% )

Tem

pe

ratu

ra/º

C

A

B

C D E

Figura 62

El programa necesario para poder obtener este gráfico se encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 21.

En el diagrama podemos distinguir cuatro regiones limitadas por tres curvas.

La curva AC es la curva de congelación y representa estados en los que el disolvente sólido puro, está en equilibrio con la disolución líquida. La curva BC es la curva de solubilidad y representa estados en los que la sal pura o solvatada precipitada y la disolución líquida están en equilibrio.


282

La curva AC o curva de congelación es una curva de descenso crioscópico, que nos va marcando el descenso del punto de congelación del agua, cuando se añade la sal, viniendo dada la relación entre la cantidad de sustancia añadida y el punto de congelación, por la ecuación que se muestra a continuación, supuesta la disolución diluida ideal.

0

0,ln

A

AAfA TT

TTR

Hx

⋅−

⋅∆

= Ec. 383

donde xA es la fracción molar de disolvente puro en la disolución, TA0 es el

punto de congelación del disolvente puro, T es el nuevo punto de congelación debido al aumento de la concentración del soluto disuelto, y ∆Hf,A es el calor latente de fusión del disolvente puro.

Esta ecuación ya fue deducida teóricamente en el Capítulo 1 de Fundamentos Termodinámicos, en el apartado 14.2 Descenso del Punto de Congelación.

La curva BC se obtiene por los mismos razonamientos termodinámicos que la curva AC, cambiando los papeles del soluto y el disolvente. Sin embargo, vamos obtener teóricamente la ecuación de solubilidad, pues la que hemos empleado en el programa para dibujar el gráfico, es ligeramente diferente a la que obtendríamos de sustituir los papeles del soluto y disolvente en la ecuación del descenso crioscópico.

2.1.1.1 Curva de solubilidad

En el caso de la solubilidad de un sólido en un líquido, la sustancia que está en las dos fases es el soluto; por tanto en el equilibrio podemos escribir:

lB

sB µµ = Ec. 384

donde µBs es el potencial químico del soluto sólido puro, y µB

l es el potencial químico del soluto en la disolución.

El potencial químico del soluto es:

BBlB xRT ln* += µµ Ec. 385

donde µB* es el potencial químico del soluto puro, en fase líquida, y xB es la

fracción molar del soluto en la disolución saturada.

Operando resulta:

RT

G

RTx f

sBB

B

∆=

−=−

µµ *

ln Ec. 386


283

donde ∆Gf es la variación de la energía libre de un proceso de fusión.

Considerando un proceso infinitesimal, y que el sistema tiene dos grados de libertad, podemos escribir:

dTRT

HdT

T

G

TR

dpT

G

pdT

T

G

TRT

Gd

Rxd

fHelmholtzGibbs

f

CTEPfff

B

2

1

11ln

∆=

∆

∂∂

⋅−=

=

∆

∂∂

+

∆

∂∂

⋅−=

∆⋅−=

−

=

Ec. 387

donde ∆Hf es el calor latente de fusión del soluto puro.

Integramos entre unas condiciones de saturación conocidas, y unas condiciones arbitrarias:

−

∆=⇒

∆=∫ ∫ TTR

H

xx

dTRT

Hxd f

B

Bx

x

T

T

fB

B

B

11lnln

002

0 0

Ec. 388

donde xB0 y T0 son unas condiciones de saturación de la solución conocidas, y xB y T son unas condiciones arbitrarias de saturación.

Por tanto la ecuación que expresa la solubilidad ideal de los solutos sólidos en soluciones líquidas es:

−⋅

∆⋅=

TTR

Hxx f

BB11

exp0

0 Ec. 389

Esta misma relación se cumple para fracciones en peso, puesto que la fracción molar y la fracción en peso son directamente proporcionales.


284

2.1.2 ANÁLISIS DE GRADOS DE LIBERTAD

La regla de las fases nos indica cual es el número de variables termodinámicas, que son necesarias para especificar el estado del sistema, a falta de conocer la masa total del sistema.

La forma más común de formular la regla de las fases es:

2+−= FCGL Ec. 390

donde GL es el número de grados de libertad, C es el número de componentes presentes en el sistema, y F es el número de fases del sistema.

Vamos a hacer un análisis de los grados de libertad de todas las regiones de las que consta el diagrama de fases que nos ocupa.

Por encima de la curva de congelación (curva AC) y de la curva de solubilidad (curva BC) el sistema está constituido por una única fase, una disolución líquida de disolvente puro(agua), y de soluto puro(sal). Por lo tanto el número de grados de libertad del sistema será:

C=2 agua y cloruro sódico F=1 disolución líquida GL=2-1+2=3

El sistema tiene tres grados de libertad. Si mantenemos constante la presión, el sistema resulta entonces bivariante, es decir, necesitamos dos variables termodinámicas para especificar el estado del sistema. Esto significa que si especificamos su temperatura, no tendremos definido un sistema concreto, pues disoluciones con distinta composición pueden tener la misma temperatura. Necesitamos especificar otra variable del sistema, por ejemplo la fracción en peso del soluto en la disolución.

Por lo tanto fijando la temperatura y la fracción en peso del soluto, el sistema queda totalmente definido, es decir, podemos representarlo en el diagrama de fases con un punto.


285

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5


Fracción en peso de la sal(%)

Tem

pe

ratu

ra/º

C

A

B

C D E

Temperatura del s is tem a

Composición de ladisolución líquida

* Disolución líquida

Figura 63

La región que queda limitada por las curvas AC, CD, y DA representa un sistema formado por dos fases, disolvente sólido puro(hielo), en equilibrio con la disolución líquida. El número de grados de libertad de este sistema será:

C=2 agua y cloruro sódico F=2 hielo y disolución líquida GL=2-2+2=2

El sistema tiene dos grados de libertad. Si mantenemos constante la presión del sistema, entonces resulta monovariante, es decir, tan sólo necesitamos conocer una única variable termodinámica para especificar el estado del sistema.

Si fijamos la temperatura del sistema, existe una única composición de la disolución líquida, que esté en equilibrio con el hielo a esa temperatura. Dicha composición viene dada por la curva de descenso crioscópico (curva AC). Análogamente si fijamos la composición de la disolución líquida en equilibrio con el hielo, la temperatura a la cual este equilibrio es posible, es única, viniendo dada por la curva de descenso crioscópico.

Por tanto, fijando bien la temperatura del sistema bien la composición de la disolución líquida, el sistema queda totalmente definido, es decir, podemos representar cada fase del sistema, por medio de un punto en el diagrama de


286

fases. Como el sistema está constituido por dos fases, el sistema estará definido por dos puntos, uno sobre la curva de descenso crioscópico, que representa a la disolución líquida, y otro sobre el eje vertical izquierdo, que representa al disolvente sólido puro(hielo).

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5



Tem

pe

ratu

ra/º

CA

B

C D E

* * Temperatura del s is tem a

Composic ión de la disolución líquida

Disolución líquida Hielo

Figura 64

La región que queda limitada por las curvas BC, CE, y EB representa un sistema formado por dos fases, soluto sólido puro o solvatado (sal precipitada) en equilibrio con la disolución líquida. El número de grados de libertad del sistema será por tanto:

C=2 agua y cloruro sódico F=2 soluto sólido puro, disolución líquida GL=2-2+2=2

El sistema tiene dos grados de libertad. Si mantenemos constante la presión del sistema, éste resulta entonces con un único grado de libertad. Necesitamos conocer una única variable para especificar el estado del sistema.

Si fijamos la temperatura del sistema, existe una única composición de la disolución que está en equilibrio con el soluto sólido puro o solvatado (sal precipitada), a esa temperatura, y que viene dada por la curva de solubilidad.

Por tanto fijando bien la temperatura del sistema bien la composición de la disolución líquida, el sistema queda totalmente definido, pudiéndose


287

representar por dos puntos en el diagrama de fases. La disolución líquida sobre la curva de solubilidad, y el soluto sólido sobre el eje vertical derecho. Sin embargo en los gráficos que hemos manejado hasta ahora, la afirmación anterior no es del todo correcta, pues el eje vertical derecho está sobre un 35% en peso de sal en la solución, y para poder dibujar el punto que representa a la sal precipitada, debería estar sobre el 100%.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5



Tem

pe

ratu

ra/º

C

A

B

C D E

Temperatura del s is tem a

Composición de la disolución líquida

* Disolución líquida * Sal 100%

Figura 65

La región del diagrama de fases que queda por debajo de la curva DCE representa un sistema formado por dos fases, soluto sólido puro o solvatado (sal precipitada), en equilibrio con el disolvente sólido puro(hielo). El número de grado de libertad de este sistema será:

C=2 agua y cloruro sódico F=2 soluto sólido puro o solvatado, disolvente sólido puro GL=2-2+2=2

El sistema tiene dos grados de libertad. Si mantenemos constante la presión, entonces nos quedamos con un único grado de libertad. Necesitamos conocer una variable para especificar el estado del sistema.

Si fijamos la temperatura del sistema, éste queda totalmente definido, pues podemos identificar los puntos que representan a las dos fases del sistema sobre el diagrama, uno sobre el eje vertical derecho (soluto sólido puro o solvatado) y otro sobre el eje vertical izquierdo (disolvente sólido puro).


288

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5



Tem

pe

ratu

ra/º

C

A

B

C D E

Temperatura del sistem a

* * Hielo Sal

precipitada

100%

Figura 66

Para finalizar vamos a analizar los grados de libertad del punto eutéctico. El punto eutéctico es el punto donde se cortan las curvas AC, y BC, y representa un sistema en el que coexisten tres fases, soluto sólido puro o solvatado (sal precipitada), disolvente sólido puro (hielo), y disolución líquida. El número de grados de libertad de este sistema será:

C=2 agua, cloruro sódico F=3 soluto sólido puro, disolvente sólido puro, disolución líquida GL=2-3+1=1

El sistema en dicho punto tiene un único grado de libertad. Si mantenemos la presión constante, el sistema resulta invariante, es decir, con cero grados de libertad. El estado eutéctico viene determinado por una única temperatura y una única composición.

Para el caso de soluciones acuosas de cloruro sódico el punto eutéctico se da a una temperatura de –21.2ºC y con una concentración del cloruro sódico del 22.5% en peso. Estos valores son ligeramente diferentes a los que marcan la gráfica.

El sistema no modificará ni su temperatura ni su composición, mientras no se modifique el número de fases presentes.


289

2.1.3 EJEMPLO

Veamos qué sucede cuando una disolución líquida de composición k, se enfría a lo largo de la línea kp, a presión constante.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5



Tem

pe

ratu

ra/º

CA

B

C D E

*

*

*

* *

*

*

k

PE *

l

m n ñ

ll

p

Figura 67

En el punto k, el sistema está constituido por una disolución líquida. Cuando enfriamos esta disolución y alcanzamos el punto l, comienza a separarse disolvente sólido puro, es decir, comienza a formarse hielo; el sistema está ahora constituido por dos fases, la disolución líquida en equilibrio con el hielo formado.

Esta formación de hielo deja a la disolución líquida cada vez más concentrada en el soluto, es decir, el cloruro sódico, con la consiguiente disminución de la temperatura de equilibrio, que se desplaza a lo largo de la curva AC, lo que nos permite tener una disolución acuosa líquida a temperaturas inferiores a los cero grados centígrados.

El punto m del diagrama, representa un sistema en el que coexisten una disolución líquida, representada por el punto n, y disolvente sólido puro(hielo), representado por el punto ñ. El conocimiento de la posición del punto m, suministra información adicional; podemos conocer la proporción que hay entre las dos fases en equilibrio, a través de la regla de la palanca.


290

A medida que se forma más hielo, se alcanza un punto en el que la solución se satura de sal(cloruro sódico), comenzando a precipitar la sal como un sólido puro o solvatado. Esta situación está representada en el diagrama de fases por el punto ll. Este punto representa un estado en el que coexisten tres fases, disolvente sólido puro(hielo), soluto sólido puro o solvatado(sal precipitada), y disolución líquida con la composición del eutéctico.

En este momento el sistema se hace invariante, a una presión fija. Si seguimos enfriando el sistema, se formará más hielo, y precipitará más sal, pero sin modificarse ni la temperatura del sistema, ni la composición de la disolución líquida que aun existe, y que es la composición del eutéctico. Esta situación se prolonga mientras exista disolución líquida. Cuando desaparece todo el líquido, el sistema estará compuesto por dos fases sólidas, hielo y sal precipitada. La temperatura de este sistema ahora si disminuye, conforme lo enfriamos, hasta que llegamos al punto final p.


291

2.2. EFECTO DE LA SOLUBILIDAD EN EL PROCESO DE DESHIDRATACIÓN

A continuación vamos a describir los procesos que acontecen tanto en el medio intracelular como extracelular, ayudándonos del diagrama de fases y de un análisis de los grados de libertad del sistema, que se vieron en la pregunta anterior.

En el proceso de deshidratación celular, podemos distinguir dos etapas, cuando consideramos el hecho de que el cloruro sódico no puede aumentar su concentración indefinidamente.

La primera etapa de deshidratación tiene lugar mientras en el medio extracelular no se alcancen las condiciones del punto eutéctico. La segunda etapa comienza cuando el medio extracelular alcanza a dicho punto eutéctico.

2.2.1 PRIMERA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN

El medio extracelular, a partir de la temperatura de cambio de fase sólido-líquido, igual a –1.1148ºC, correspondiente al punto 1 del gráfico, comienza a formar hielo, concentrando la solución extracelular en sales. Este proceso de formación de hielo y de concentración del medio extracelular prosigue hasta que no alcancemos las condiciones del punto eutéctico.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5

0EVOLUCIÓN DEL MEDIO EXTRACELULAR

Fracción en peso de sal(% )

Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2

Curva de descenso crioscópico

Curva de solubilidad

Punto Eutéctico

*

*

Figura 68


292

La evolución del medio extracelular se lleva a cabo sobre la curva de descenso crioscópico, debido a que éste evoluciona por sucesivos estados de equilibrio. El análisis de los grados de libertad del medio extracelular es:

C=2 Agua, cloruro sódico F=2 Hielo, disolución líquida GL=2-2+2=2

Si consideramos que la presión del medio extracelular es constante y conocida, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema monovariante. Fijando la temperatura del sistema, su composición es dada. A partir de ahora consideraremos siempre la hipótesis de presión constante.

Mientras, el medio intracelular comienza a deshidratarse en respuesta al aumento de concentración del medio extracelular. Esta deshidratación modelada mediante la ecuación deducida en el apartado 6.4.2 Ley de Enfriamiento Lineal, del capítulo de Deshidratación Celular, continúa hasta alcanzar la temperatura del punto eutéctico (punto A).

En el gráfico de la figura 69, dibujamos la evolución de la deshidratación de células de espermatozoides de ratón, cuando son enfriadas mediante un perfil de enfriamiento lineal, de 30ºC/min.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5

0DESHIDRATACIÓN DE ESPERMA DE RATÓN

Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2

A

*

* Temperaturadel eutéctico

Curva de descensocrioscópico


Puntoeutéctico

Figura 69


293

El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 22.

El análisis de los grados de libertad del medio intracelular es:

C=2 Agua, cloruro sódico F=1 disolución líquida GL=2-1+1=2

Como podemos ver, el sistema resulta bivariante.

2.2.2 SEGUNDA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN

Cuando el medio extracelular alcanza las condiciones del punto eutéctico, el sistema extracelular en su conjunto no puede disminuir su temperatura, y la disolución líquida extracelular en particular no puede seguir aumentando su concentración.

La razón de este comportamiento está en que el medio extracelular tiene cero grados de libertad, como consecuencia de la aparición de una nueva fase, la sal sólida pura o solvatada que ha precipitado.

C=2 Agua, cloruro sódico F=3 Hielo, solución líquida saturada, sal precipitada GL=2-3+1=0

La razón de que aparezca una nueva fase reside en la imposibilidad de seguir aumentando la concentración de la disolución líquida extracelular. Cuando alcanzamos el punto eutéctico, parte del agua que forma la disolución líquida saturada forma hielo. Este proceso tendería a incrementar la concentración de la sal en la disolución líquida saturada, lo cual es imposible, por lo que parte de la sal precipita.

Esta situación de inmovilismo térmico y de concentración persistirá mientras no se reduzca en uno, el número de fases presentes en el sistema, según se puede ver en el análisis de grados de libertad que se hizo anteriormente. Esto significa que, mientras no desaparezca la última gota de solución líquida saturada, para dar hielo y sal precipitada, el medio extracelular permanecerá en las condiciones del punto eutéctico.

Por otra parte la evolución de la deshidratación de la célula, va a depender de la velocidad con la que se produzca esta transformación de la solución líquida saturada, en hielo y sal precipitada.

Vamos a considerar dos casos extremos.

• En el primero la velocidad con la que se produce la transformación de la solución líquida saturada, en hielo y sal precipitada es lo suficientemente pequeña, como para permitir que el medio intracelular alcance el equilibrio con el medio


294

extracelular, alcanzando la composición del punto eutéctico, y aun permanezca solución líquida saturada en el medio extracelular.

• En el segundo la velocidad con la que se produce la trasformación a hielo y sal precipitada, es infinita, es decir, el tiempo necesario para que la solución líquida saturada desaparezca es infinitamente pequeño. El sistema extracelular permanece en las condiciones del punto eutéctico un instante infinitesimal.

Una deshidratación real de una célula se encontrará entre ambos casos extremos.

A continuación vamos a describir cómo sería la evolución de la deshidratación celular en cada caso.


295

2.2.2.1 Caso 1: La solución líquida saturada extracelular desaparece después de alcanzar el equilibrio con el medio intracelular

Cuando el sistema extracelular alcanza las condiciones del punto eutéctico (punto 2), el medio intracelular llega a la temperatura de dicho punto eutéctico, pero con una concentración en sales menor (punto A).

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5


Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2

A

*




Puntoeutéctico

Figura 70

Puesto que el medio extracelular tiene cero grados de libertad, su temperatura no cambia a pesar de seguir enfriando al sistema. La energía retirada del sistema se invierte en transformar la disolución líquida saturada extracelular, en hielo y sal precipitada.

Como la temperatura del medio intracelular viene impuesta por las condiciones del medio extracelular, la temperatura del interior de la célula también permanecerá constante. Por lo tanto el sistema intracelular continúa deshidratándose, pero bajo una condición de temperatura impuesta constante.

El análisis de grados de libertad del medio intracelular en esta situación es:

C=2 Agua, cloruro sódico F=1 Disolución líquida GL=2-1+1=2


296

Como tenemos una condición de temperatura impuesta, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema monovariante. Esto es coherente con lo que acabamos de explicar, pues independientemente de la composición de la solución intracelular, su temperatura es constante y conocida.

La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones, hasta que llega al punto eutéctico (punto 2). Una vez que el medio intracelular alcanza los parámetros del punto eutéctico, la deshidratación se detiene, por encontrarse el interior de la célula en equilibrio con el exterior.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5


Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2 A

*

*

Primera etapade deshidratación

Segunda etapa de deshidratac ióna temperatura constante

Medio extracelular

Medio intracelular

Figura 71

El número de grados de libertad del medio intracelular, en el punto eutéctico es:

C=2 Agua, cloruro sódico F=1 Disolución líquida GL=2-1+1=2

La condición de temperatura impuesta reduce en uno el número de grados de libertad. La condición de flujo osmótico nulo, es decir, la ausencia de deshidratación, reduce de nuevo en uno los grados de libertad, por lo que al final el sistema intracelular, al igual que el medio extracelular resulta invariante.


297

El sistema en estas condiciones permanece como paralizado, pues no modifica ni su temperatura ni su composición. Esta situación de inmovilismo concluye cuando la última gota de solución líquida saturada extracelular se transforma en hielo y sal precipitada, momento en el cual la temperatura del sistema comienza de nuevo a disminuir, al tener tanto el sistema intracelular como extracelular un grado de libertad.

Análisis de los grados de libertad del medio extracelular.

C=2 Agua, cloruro sódico F=2 Hielo, sal precipitada GL=2-2+1=1

Análisis de los grados de libertad del medio intracelular.

C=2 Agua, cloruro sódico F=1 Disolución líquida saturada GL=2-1+1=2

Como la condición de flujo osmótico nulo permanece, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema monovariante.

A partir de este momento el subenfriamiento del sistema intracelular crece indefinidamente, puesto que la temperatura del sistema es monótonamente decreciente, y la temperatura de equilibrio para la composición del sistema, es la temperatura del eutéctico, de manera que por cada grado centígrado que disminuya la temperatura del sistema, el subenfriamiento aumenta en un grado centígrado.

Si consideramos que justamente cuando el medio intracelular alcanza las condiciones del punto eutéctico, en el medio extracelular la última gota de disolución líquida saturada desaparece, la evolución del subenfriamiento es la indicada en la figura 72.


298

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30

Temperatura/ºC

Su

be

nfr

iam

ien

to/º

C

SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR

-30ºC/min

Figura 72

El programa necesario para poder dibujar este gráfico se muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 23.

Observamos como al llegar a la temperatura del eutéctico el subenfriamiento se reduce a cero, para posteriormente crecer indefinidamente de forma lineal. La línea a trazos indica cual hubiera sido la evolución del subenfriamiento de no existir la condición de temperatura impuesta desde el medio extracelular.

Llegaremos a una temperatura en la que sea imposible evitar la formación de hielo intracelular. Cuando aparezca hielo dentro de la célula el número de grados de libertad se reduce a cero.

La temperatura interior de la célula permanecerá constante mientras exista solución líquida saturada intracelular. En el momento en que sólo tengamos hielo y sal precipitada dentro de la célula, el sistema volverá a ser monovariante, es decir, volverá a reducirse la temperatura.

Debido al desequilibrio térmico entre el interior y el exterior de la célula, el medio intracelular se enfriará más deprisa que el extracelular, hasta que finalmente ambos tengan la misma temperatura.

Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento, consideramos varias velocidades de enfriamiento lineal.


299

La evolución de la concentración de la sal con respecto a la temperatura del sistema se muestra en la figura 73:

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR

-10ºC/min

-25 -30 -40 -60

Deshidratación a temperatura constante

Figura 73

La evolución del subenfriamiento para distintas velocidades de enfriamiento se muestra en la figura 74.


300

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30

Temperatura/ºC

Su

be

nfr

iam

ien

to/º

C


-10

-25

-30

-40ºC/min

-60ºC/min

Figura 74


301

2.2.2.2 Caso 2: La solución líquida saturada extracelular desaparece instantáneamente

Cuando el sistema extracelular alcanza las condiciones del punto eutéctico (punto 2), el medio intracelular llega a la temperatura de dicho punto eutéctico, pero con una concentración en sales menor (punto A).

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5


Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2

A

*




Puntoeutéctico

Figura 75

Como el medio intracelular deja de ser invariante instantáneamente, la temperatura del sistema no permanece constante en ningún momento. En esta situación tenemos un medio extracelular formado exclusivamente por hielo y sal precipitada, y un medio intracelular constituido por una solución líquida.

Este medio intracelular continuará deshidratándose, y disminuyendo su temperatura. Sin embargo la ley de deshidratación que seguirá, será distinta, pues ahora en el medio extracelular tan solo tenemos hielo y sal precipitada. No obstante, para poder modelar matemáticamente la deshidratación de la célula en esta nueva etapa, vamos a suponer que alrededor de cada célula existe una delgada capa de solución líquida saturada, de composición constante e igual a la del eutéctico. Esta hipótesis, que denominamos Hipótesis de la Capa Líquida Saturada se explica más detalladamente en el siguiente apartado, junto con el desarrollo del modelo matemático de la deshidratación.


302

La evolución gráfica de la deshidratación se muestra en la gráfica de la figura 76, donde mostramos el caso de un enfriamiento lineal a 30ºC/min.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5

0DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR

Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2 A

B

Temperaturadel eutéctico

1ª etapa dedeshidratación




Figura 76

Los programas necesarios para poder obtener este gráfico, se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 24.

La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones, hasta el punto de corte con la curva de solubilidad, punto B. En este punto, el medio intracelular alcanza las condiciones de saturación. Un análisis de los grados de libertad se muestra a continuación.

C=2 Agua, cloruro sódico F=2 Disolución líquida saturada, sal precipitada GL=2-2+1=1

En esta nueva situación, conforme enfriamos el sistema, la temperatura, tanto del medio intracelular, como del extracelular disminuyen.

Bajo la hipótesis de la Capa Líquida Saturada, alrededor de la célula hay una delgada capa de disolución líquida con la composición del eutéctico. Puesto que la composición del medio intracelular, que está saturado, tiene una concentración inferior a la del eutéctico, la célula


303

tiende a seguir deshidratándose, y puesto que la concentración no puede aumentar, comienza a precipitar sal en el interior de la célula. Teóricamente continuaríamos hasta tener en el interior de la célula únicamente sal. Sin embargo, probablemente debido a problemas para transportar agua hacia la membrana, en su interior siempre quedará solución líquida saturada. En el momento en que se deshidrata por completo la célula, la capa de líquido saturado alrededor de la célula desaparece. La evolución del sistema es por tanto una vertical.

0 5 10 15 20 25 30 35-30

-25

-20

-15

-10

-5


Fracción másica de sal/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C


Curva de solubilidad Temperatura

del eutéctico

1ª etapa de deshidratación



1

2 A

B

Figura 77

A partir de este momento el sistema estará constituido por un medio extracelular formado por hielo y sal precipitada, y un medio intracelular formado por sal precipitada, y algo de solución líquida saturada. La temperatura del sistema en estas condiciones se reduce indefinidamente.

El subenfriamiento de este proceso de deshidratación crece indefinidamente, sin excluir la existencia de máximos locales al comienzo del subenfriamiento. A partir del punto de corte con la curva de solubilidad, punto B, por cada grado centígrado que disminuye la temperatura del sistema, el subenfriamiento aumenta un grado centígrado, es decir, todo el descenso de temperatura se invierte en el subenfriamiento.


304

La evolución gráfica del subenfriamiento, para el caso de espermatozoides de ratón, enfriados mediante un perfil lineal de –30ºC/min se muestra en la figura 78:

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR

Temperatura/ºC

Su

be

nfr

iam

ien

to/º

C

1ª etapa

2ª etapa

3ª etapa

Figura 78

El programa necesario para poder obtener el gráfico anterior, se muestra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 25.

Para comparar con los subenfriamientos que se producirían si no tuviésemos límites de solubilidad, hemos dibujado la línea a trazos.

Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el fenómeno de la solubilidad, calculamos las curvas de deshidratación y subenfriamiento con respecto a la temperatura para varias velocidades de enfriamiento lineal en la figura 79 y 80 respectivamente.


305

0 5 10 15 20 25 30 35-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5


Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C-10ºC/min

-25 -30

-40 -60

Figura 79

-55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 00

5

10

15

20

25

30

Temperatura/ºC

Su

be

nfr

iam

ien

to/º

C


*

* *

*

*

-10ºC/min

-25

-30

-40

-60

Figura 80


306

Como último punto queremos comentar la evolución del sistema intracelular a partir del punto A. Teóricamente el medio intracelular debería tender asintóticamente a la composición del eutéctico. Sin embargo, según observamos siguiendo las líneas a trazos verdes, esto sólo sucede cuando la velocidad de enfriamiento es suficientemente pequeña.

¿Qué está sucediendo?. La respuesta es muy simple. La permeabilidad de la membrana se reduce a cero antes de poder alcanzar el equilibrio con el medio exterior.

Recordamos que en el caso de las membranas de espermatozoides de ratón, la permeabilidad se hacía nula en torno a los –35ºC. Vemos cómo efectivamente en el gráfico, las evoluciones verticales(flujo osmótico nulo) arrancan desde esa temperatura.

0 5 10 15 20 25 30 35-60

-50

-40

-30

-20

-10


Fracción másica/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

Figura 81


307

2.3. MODELOS TEÓRICOS DE DESHIDRATACIÓN CON DISOLUCIONES SATURADAS

2.3.1 MODELO DE DESHIDRATACIÓN CELULAR CON EL MEDIO EXTRACELULAR CON COMPOSICIÓN CONSTANTE

2.3.1.1 Hipótesis de la Capa Líquida Saturada

En el instante en el que el medio extracelular solo tuviéramos hielo y sal precipitada, las ecuaciones de deshidratación que hemos planteado, no serían aplicables. Al plantear estas ecuaciones, supusimos que el medio extracelular era una solución líquida en equilibrio con el hielo formado.

Podemos suponer que en el instante en que el medio extracelular sólo tiene hielo y sal precipitada, la evacuación de agua por parte de la célula genera, alrededor de ésta, una capa delgada de solución líquida.

Es muy probable que en las regiones adyacentes a la membrana celular, tengamos sal precipitada. Debido a la pequeña cantidad de masa de esta película alrededor de la célula, con una pequeña fracción de esa sal precipitada conseguiríamos alcanzar las condiciones de saturación.

Por lo tanto con estas hipótesis, mientras exista deshidratación celular, existirá la capa de solución líquida saturada alrededor de cada célula.


308

2.3.1.2 Modelo matemático de la deshidratación

La ecuación para modelar la deshidratación, va a ser Ec178, que fue obtenida en el apartado 6.2 del capítulo 4.

in

ex

A

g

PP

V

TRATL

dtdV

ln)(

* ⋅⋅⋅⋅

= Ec. 391

Para un proceso de enfriamiento, la temperatura T, y la variable tiempo t, están relacionadas. Para un perfil de enfriamiento lineal esta relación es de la forma:

BdtdT

−= Ec. 392

Sustituyendo esta expresión en la ecuación Ec391 tenemos:

in

ex

A

g

PP

BV

TRATL

dTdV

ln)(

* ⋅⋅

⋅⋅⋅= Ec. 393

A continuación calcularemos las expresiones de las presiones Pex y Pin. Cuando se dedujo la ecuación de deshidratación en el apartado 6.2 del capítulo 4, que ahora hemos visto que sólo es válida antes de que alcancemos las condiciones del punto eutéctico en el medio extracelular, dichas presiones fueron obtenidas del siguiente modo:

• Presión intracelular Pin. Aplicando la ley de Raoult y despreciando la contribución a la presión total de los solutos, llegábamos a la siguiente expresión:

inAlA

in xTPP ⋅= )(*, Ec. 394

Esta expresión será la que también empleemos en este modelo.

• Presión extracelular Pex. Aplicando principios de equilibrio termodinámico entre fases, y despreciando la contribución a la presión de los solutos, llegábamos a la siguiente expresión:

)(*, TPP sA

ex = Ec. 395

Sin embargo ahora que conocemos la composición del medio extracelular, no vamos a emplear dicha expresión, sino que aplicaremos una análoga a la empleada en el medio intracelular, aplicando las mismas hipótesis simplificatorias. Por tanto la expresión de la presión extracelular es de la forma:


309

exAlA

ex xTPP ⋅= )(*, Ec. 396

Sustituyendo en la ecuación Ec393 las ecuaciones Ec394 y Ec396 tenemos:

inA

exA

A

g

xx

BV

TRATL

dTdV

ln)(

* ⋅⋅

⋅⋅⋅= Ec. 397

Recordamos que la expresión de la fracción molar de disolvente, en función del volumen celular era de la forma(apartado 6.2 del capítulo 4):

( )( ) ( ) *

,,

,,

ACPABBCPAmCPABmB

CPAmCPABmBinA VnnVnVnV

VnVnVx

⋅+⋅+⋅+⋅−⋅+⋅−

= ∞∞

∞∞

ν Ec. 398

Sustituyendo Ec398 en Ec397, finalmente la expresión de la deshidratación celular es:

CPABBsol

CPAmCPABmBsol

Asolsol

solexA

A

g

nnn

VnVnV

VnVVVV

xBV

TRATL

dTdV

+⋅=

⋅+⋅=

⋅+−

−−⋅

⋅

⋅⋅⋅=

∞∞

ν,,

** lnln)(

Ec. 399

La composición del medio extracelular, la conocemos en términos de fracción másica. Sin embargo en la ecuación anterior lo que tenemos es la fracción molar de disolvente. Para poder pasar de fracción másica a fracción molar, vamos a hacer una suposición. Supongamos que tenemos una célula hipotética cuya composición es idéntica a la composición del medio extracelular de mi problema. Supongamos además que el número de moles dentro de esta célula hipotética son los mismos que los de la célula de mi problema. En ese caso podemos escribir:

*ABBBB

BBexA VnVnV

VnVx

⋅⋅+⋅−⋅−

= ∞

∞

ν Ec. 400

La expresión de la fracción másica, en función del volumen de esta célula hipotética es:

CPACPABBsol

CPAmCPABmBsol

A

Amsolsol

A

BAmB

exA

MnMnm

VnVnV

MVmVV

MMVn

y

⋅+⋅=

⋅+⋅=

⋅+−

⋅⋅=

∞∞,,

*,

*,

Ec. 401


310

Sustituyendo en esta expresión, el valor de la composición del eutéctico, y el número de moles de sal, puesto que el de crioprotector es nulo, obtenemos un volumen que llamaremos Veut, que sustituido en la expresión de la fracción molar, nos da la composición del eutéctico, en términos de fracción molar.

Por lo tanto la expresión final de la ecuación de deshidratación será:

CPABBsol

CPAmCPABmBsol

Asolsol

sol

Asolsoleut

soleut

A

g

nnn

VnVnV

VnVVVV

VnVVVV

BV

TRATL

dTdV

+⋅=

⋅+⋅=

⋅+−

−−

⋅+−−

⋅⋅

⋅⋅⋅=

∞∞

ν,,

*** lnln)(

Ec. 402


311

VI-3. ANÁLISIS DEL LÍMITE DE SOLUBILIDAD CON PRESENCIA DE CRIOPROTECTORES PERMEABLES

3.1. DIAGRAMAS TERNARIOS

3.1.1 INTERPRETACIÓN DEL DIAGRAMA DE FASES TERNARIO TRIDIMENSIONAL

Un diagrama de fases ternario tridimensional se muestra esquemáticamente en la siguiente figura:

Figura 82

Cada uno de los sistemas binarios A-B, A-C, B-C se asume que son sistemas eutécticos simples, como el que forma el cloruro sódico con el agua y que fue descrito en el apartado 2.1 Diagrama de Fases. Los Sistemas Eutécticos Simples. Estos diagramas binarios los podemos ver en cada uno de las tres caras verticales del prisma sobre el que está construido este diagrama. Así, sobre la cara vertical que se apoya en el lado A-C de la base del prisma, podemos ver claramente un clásico diagrama de fases de un sistema eutéctico simple. El punto eutéctico del sistema binario A-C sería el punto E3. La línea TA-E3 es la curva de descenso crioscópico de A al ir


312

añadiendo componente C, mientras que la línea TC-E3 es la curva de solubilidad de la componente C en A.

Este punto eutéctico, recordamos que representaba el límite hasta el que podíamos reducir la temperatura de cambio de fase sólido-líquido de un componente puro por adición de otro componente.

Recordamos también, que una disolución líquida con la composición del eutéctico solidifica a temperatura constante, formando dos fases sólidas simultáneamente siendo este proceso denominado reacción eutéctica. En el caso de la mezcla de cloruro sódico y agua, la reacción eutéctica consistía en la transformación de la disolución líquida con la composición del eutéctico, en hielo y sal precipitada. El hecho de que esta transformación se produjera a temperatura constante se debía a que el sistema tenía cero grados de libertad.

La adición de un tercer componente a cada uno de los sistemas Eutécticos simples va a reducir los puntos de reacción eutéctica desde E1,E2 y E3 hasta el eutéctico ternario E4. En este punto eutéctico ternario, la disolución líquida de componente E4 solidificará a temperatura constante formando tres fases sólidas simultáneas; el sistema en este punto permanece invariante.

La superficie TAE3E4E1 está generada por una familia de curvas de descenso crioscópico que parten de la curva TAE1, que es la curva de descenso crioscópico del sistema binario A-B, y se van modificando conforme añadimos componente C. Por lo tanto, un punto sobre esta superficie representa un sistema formado por componente A en fase sólida y una disolución líquida formada por A, B y C.


313

Figura 83

Para poder comprender mejor este diagrama podemos suponer que el componente A es agua, el componente B es cloruro sódico y el componente C es crioprotector. Por lo tanto, los puntos de la superficie que acabamos de describir corresponden a sistemas en los que una disolución acuosa de sal y crioprotector están en equilibrio con hielo.

El análisis de los grados de libertad del sistema es el siguiente:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=2 Hielo, solución líquida GL=3-2-+1=2

En un sistema que cumpla estas características , tan sólo necesito conocer la temperatura del sistema y la concentración de uno de los componentes, para tener totalmente definida la composición de la disolución líquida.

La superficie TCE3E4E2 está formada por una familia de curvas de solubilidad que parten de la curva TCE3, que es la curva de solubilidad de solubilidad del crioprotector (C) en agua (A), y que se van modificando conforme añadimos cloruro sódico (B). Por lo tanto, un punto sobre esta superficie representa un sistema formado por una disolución líquida de


314

cloruro sódico y crioprotector saturada en crioprotector, en equilibrio con crioprotector precipitado.

Figura 84

Los grados de libertad del sistema son:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=2 Disolución líquida saturada en crioprotector, crioprotector

precipitado GL=3-2+1=2

La intersección de esta superficie con la descenso crioscópico genera una curva formada por una familia de puntos eutécticos binarios, que parten del punto E3 -punto eutéctico del sistema agua-crioprotector- y que se van modificando conforme añadimos sal (B). Un punto sobre esta línea representa un sistema formado por una disolución líquida de sal y crioprotector, saturada en crioprotector y en equilibrio con hielo y crioprotector precipitado.


C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=3 Disolución líquida saturada en crioprotector, hielo, crioprotector

precipitado.


315

GL=3-3+1=1

En un sistema que cumpla estas características, tan sólo necesitamos conocer la temperatura del sistema para tener totalmente definida la composición de la disolución líquida.

La superficie TBE2E4E1 está formada por una familia de curvas de solubilidad que parten de la curva TBE1, que es la curva de solubilidad del cloruro sódico (B) en agua (A), y que se va modificando conforme añadimos crioprotector (C). Por lo tanto, un punto sobre esta superficie representa un sistema formado por una disolución líquida de cloruro sódico y crioprotector, saturada en sal y en equilibrio con sal precipitada.

Figura 85


C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=2 Disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado GL=3-2+1=2

La intersección de estas dos superficies genera una curva formada por una familia de puntos Eutécticos binarios, que parten del punto E1 –punto eutéctico del sistema agua-sal (-21ºC, 22.5%p ClNa)- y que se va modificando conforme añadimos crioprotector (C). Un punto sobre esta línea


316

representa un sistema formado por una disolución líquida de sal y crioprotector, saturada en sal y en equilibrio con hielo y sal precipitada.


C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=3 Disolución líquida saturada en ClNa, hielo, ClNa precipitado.

GL=3-3+1=1

La intersección de las dos curvas de puntos eutécticos binarios dan lugar al punto eutéctico ternario E4. Este punto representa un sistema formado por una disolución líquida acuosa de sal u crioprotector. Saturada en sal y crioprotector y en equilibrio con hielo, sal precipitada y crioprotector precipitado.

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=4 Hielo, disolución líquida saturada en sal y crioprotector, ClNa

precipitado, crioprotector precipitado. GL=3-4+1=0

El sistema en el punto E4 resulta invariante al igual que ocurría con los puntos Eutécticos en los sistemas binarios.

El sistema eutéctico ternario viene determinado por una única temperatura y una única composición. El sistema no modificará ni su temperatura ni su composición mientras no se modifique el número de fases presentes. Esto en la práctica significa que hasta que todas la disolución líquida saturada se transforme en hielo y en precipitado de sal y crioprotector la temperatura del sistema no se reducirá.


317

3.1.2 DIAGRAMA DE FASES BIDIMENSIONAL

3.1.2.1 Interpretación del diagrama

Trabajar con el diagrama de fases tridimensional es muy poco práctico, por lo complicado de su manejo. En la práctica, a la hora de caracterizar un sistema ternario se emplean diagramas bidimensionales, en los que se pierden la información de la temperatura del sistema, y lo único que aparece reflejado es la composición de la disolución líquida que forma parte del sistema.

Un diagrama de este tipo se obtiene proyectando la intersecciones de las superficies de descenso crioscópico y solubilidad sobre la base del prisma, como se muestra en la figura 86.

Figura 86

Vemos como los puntos eutécticos simples E1, E2 y E3 quedan representados por sus respectivas proyecciones E’1,E’2 y E’3. El punto eutéctico ternario E4 queda representado por su proyección E’4. Igualmente, vemos como la curva de puntos eutécticos bifásicos E1E4 al proyectarla queda representada por la curva E’1E’4. Una representación bidimensional de este sistema ternario se muestra en la figura 87:


318

Figura 87

Los vértices del triángulo equilátero representan componentes puros. Los puntos que pertenecen a los lados del triángulo representan mezclas bifásicas mientras que puntos en el interior del triángulo representan mezclas de tres componentes.


319

3.1.2.2 Propiedades de los diagramas bidimensionales

3.1.2.2.1 Coordenadas de un punto del interior del diagrama

Hasta ahora tan solo hemos presentado cuál es la procedencia de un diagrama de fases bidimensional de un sistema ternario. A continuación mostraremos como manejar estos diagramas, es decir, dado un punto dentro del diagrama conocer la composición de la disolución líquida del sistema.

Para conocer la composición de un punto del interior del diagrama aplicaremos semejanza de triángulos. Consideremos una disolución de tres componentes representada en el diagrama por el punto M. Si trazamos por dicho punto paralelas a los tres lados del triángulo obtendremos tres triángulos interiores semejantes (dibujados en rojo).

Figura 88

Pues bien, la fracción de cada componente en la mezcla se obtiene como el cociente de las alturas de los triángulos interiores entre la altura del triángulo del diagrama.

CDMa

AdeFracción = Ec. 403

CDMb

BdeFracción = Ec. 404

CDMc

CdeFracción = Ec. 405


320

A continuación vamos a mostrar una forma más sencilla de conocer la composición de un punto del diagrama sin tener que trazar los triángulos interiores y calcular el cociente de altura.

Vamos a fijarnos en el triángulo interior de altura Mc:

Figura 89

Por semejanza de triángulos podemos decir que: el cociente entre la longitud de un lado del triángulo (Mg, AC) y la altura del triángulo (Mc, CD) se mantiene constante. Por lo tanto, podemos escribir:

ACAm

CDMc

= Ec. 406

Puesto que el primer miembro de la igualdad representa la fracción de componente C en la mezcla, dicha composición viene dada directamente sobre el lado del triángulo, cuando éste tiene longitud unitaria (AC=1).

Aplicando los mismos conceptos a los otros dos triángulos interiores vemos que podemos conocer directamente la composición del sistema mirando en los lados del triángulo.


321

Figura 90

En el ejemplo del gráfico anterior, el sistema representado por el punto M tiene un 20% en peso de glicerol, un 40% en peso de agua, y un 40% en peso de sal.


322

3.1.2.2.2 Isoplectas

Definimos una isoplecta como la línea recta que parte de un vértice del diagrama de fase ternario, y cuyo puntos tienen la propiedad de que la proporción de dos de los componentes de la mezcla permanece cte.

Figura 91

En el gráfico de la figura 91 se muestran isoplectas donde la proporción de componente B con respecto del C es constante para cada una de las rectas.

Si como supusimos A es agua, B es cloruro sódico y C es crioprotector, cada una de estas líneas representan soluciones acuosas de sal y crioprotector, donde la proporción de sal y crioprotector permanece constante.


323

3.1.2.3 Ejemplo

A continuación vamos a explicar como evolucionaría una disolución acuosa de sal y crioprotector al ser enfriada, sobre un diagrama ternario bidimensional.

Un sistema ternario agua-sal-crioprotector podríamos visualizarlo a modo de ejemplo mediante el siguiente diagrama de fase ficticio:

Figura 92

El punto M representa el sistema en el instante inicial. Cuando comenzamos a enfriar el sistema la célula comienza a deshidratarse pero puesto que a través de la membrana no pasa ni moléculas de sal ni de crioprotector, la proporción entre dichos solutos permanece constante. Por lo tanto, la evolución del sistema en esta primera etapa de deshidratación se produce a lo largo de una isoplecta, según se muestra en la figura 93:


324

Figura 93


325

En el diagrama bidimensional quedaría:

Figura 94

Este proceso de deshidratación continúa hasta que alcanzamos el punto N. Cuando es sistema alcanza dicho punto la disolución líquida queda saturado en sal. El sistema estará constituido por una disolución líquida saturada en sal en equilibrio con hielo.

Si continuamos enfriando el sistema la célula seguirá deshidratándose a lo largo de la curva E’1E’4. El sistema a lo largo de este proceso estará formado por hielo, solución líquida saturada en sal y sal precipitada.

Esta deshidratación continúa hasta que alcanzamos el punto eutéctico ternario E’4. En ese momento el sistema estará formado por hielo, solución líquida saturada en sal y crioprotector, sal precipitada y crioprotector precipitado. El sistema permanece a temperatura y composición constante mientras no desaparezca la disolución líquida, al igual que sucedía con el punto eutéctico de los sistemas binarios.


326

3.1.3 DIAGRAMA DE FASES BIDIMENSONAL DEL SISTEMA TERNARIO AGUA-CLNA-GLICEROL

A continuación vamos a mostrar cómo sería el diagrama de fases, del sistema ternario formado por agua, cloruro sódico, y el glicerol.

Este tipo de diagramas se obtiene de forma experimental. En el caso particular que nos ocupa se ha empleado un análisis termal diferencial de baja temperatura (DTA). Cada muestra fue inicialmente enfriada hasta los –196ºC a una velocidad de enfriamiento lineal de 25ºC/min. Posteriormente, las muestras fueron calentadas hasta los 25ºC a una velocidad constante igual a 10ºC/min.

Los resultados de tales experimentos se muestran en la figura 95:

Figura 95

El punto eutéctico ternario ha sido obtenido por extrapolación y tiene las siguientes características:


327

Temperatura:-80ºC Composición:28%p Agua 63%p Glicerol 9%p Cloruro sódico

En la figura 96 se muestran diferentes isoplectas sobre el diagrama ternario.

Figura 96

El ratio que aparece en gráfico es la proporción de glicerol, frente a la cantidad de sal. Así un ratio R=70/30 significa que tenemos 70 partes de glicerol frente a tan sólo 30 partes de sal. Estos número pueden ser gramos, moles, tanto por ciento en peso, tanto por ciento en moles, etc. Si consideramos que son tantos por cientos en peso, podemos relacionar este ratio con la molaridad inicial de la disolución:


328

GlicerolinicialMolaridadSódicoCloruroMolecularPeso

disolucióninicialVolumenGlicerolMolecularPesoRatio ×

×=

Ec. 407

Particularizando los datos numéricos para el caso de espermatozoides de ratón, la expresión anterior queda:

GlicerolinicialMolaridadRatio ×= 52835.5 Ec. 408

El ratio aparece expresado en el diagrama como un cociente de la forma:

XX

Ratio−

=100

Ec. 409

Vamos a determinar cual es la molaridad inicial de glicerol para una isoplecta 70/30. Si sustituimos X=70 en la expresión anterior, obtenemos un ratio igual a 2.21134. Si este valor del ratio lo sustituimos en la ecuación que relacionaba el ratio con la molaridad, obtenemos que la molaridad inicial de Glicerol es 0.4 M.

Como conclusión podemos decir que un espermatozoide de ratón con una concentración inicial 0.4M de glicerol, no quedará saturada en sal hasta alcanzar los –35ºC, con una concentración en sal del 15% en peso, y del 36% en peso de glicerol. Si seguimos enfriando la muestra quedará saturada en Glicerol, a los –80ºC, cuando la composición de la disolución sea un 9% en peso de sal, y un 63% en peso en glicerol.


329

3.1.4 SIMPLIFICACIÓN DE LA REPRESENTACIÓN BIDIMENSIONAL DE UN SISTEMA TERNARIO

Cuando el sistema ternario agua-ClNa-crioprotector, evolucionando a lo largo de una isoplecta, alcanza las condiciones de saturación de la sal, continúa modificando su concentración de sal disuelta conforme progresa la deshidratación celular , a lo largo de la línea N-T4, como se indica en la figura 97.

Figura 97

Esto se ve claramente comparando la concentración de la sal en el instante en que la solución alcanza las condiciones de saturación (intersección de la curva MN, con la curva E1E4), que recordamos era aproximadamente del 15% en peso de sal, y el instante en que la solución alcanza las condiciones del punto eutéctico ternario, que recordamos era aproximadamente del 9% en peso de sal.

Vemos como efectivamente la solución saturada va reduciendo el valor de la saturación desde el 15% hasta el 9% a lo largo de la deshidratación.

Para simplificar el problema vamos a suponer que la solución intracelular saturada en cloruro sódico, no va a modificar su composición con respecto a la concentración de sal, es decir, que desde el instante en que alcanzamos las condiciones de saturación de la sal, hasta el instante en que alcanzamos


330

el punto eutéctico ternario, la concentración de sal va a ser en todo momento del 15%.

Para simplificar un poco más el problema, vamos a suponer además que las leyes de solubilidad de un componente en agua son las mismas que las de dicho componente en una solución ternaria. Lo que diferenciará a las dos leyes de solubilidad será el punto de referencia. Esto significa que si la ley de solubilidad del cloruro sódico en agua es :

−⋅

∆−⋅= ref

ClNafusrefClNaClNa TTR

HXX

11exp ,

Ec. 410

donde XrefClNa es aproximadamente el 22% y Tref es aproximadamente

–21ºC, entonces la ley de solubilidad del cloruro sódico en agua y glicerol será la misma, salvo que la saturación comienza a distinta temperatura y con una concentración diferente:

−⋅

∆−⋅= 2

,2 11exp ref

ClNafusrefClNaClNa TTR

HXX Ec. 411

donde Xref2ClNa es aproximadamente el 15% y Tref2 es aproximadamente

–35ºC.

Para seguir las evoluciones de la deshidratación celular del sistema ternario vamos a emplear una representación gráfica bidimensional sobre un diagrama rectangular. En el eje vertical representaremos la temperatura del sistema, mientras que en el eje horizontal representaremos la fracción másica del soluto, es decir, la de la sal más el crioprotector.

En una representación de este tipo, no tiene sentido dibujar las curvas de solubilidad que hemos deducido en apartados anteriores, puesto que son curvas de un solo componente en agua. Por tanto la representación gráfica de estas curvas serán sobre un diagrama Temperatura-Concentración de un soluto y no de la suma de concentraciones de dos solutos como tenemos ahora.

Así la curva de solubilidad del cloruro sódico sólo tiene sentido dibujarla en un diagrama Temperatura-Fracción másica de ClNa, y la curva de solubilidad del glicerol sólo tiene sentido dibujarla en el diagrama Temperatura-Fracción másica de glicerol. Sin embargo para poder visualizar en un mismo gráfico las distintas fases por las que atraviesa la célula en su deshidratación, teniendo delimitadas gráficamente las distintas regiones, vamos a dibujar una curvas de solubilidad “ficticias”. La curva de solubilidad ficticia del cloruro sódico la calculamos del siguiente modo: la composición de un sistema ternario que acaba de saturarse en sal es 15% en peso de sal, y 36% en peso de glicerol, cuando la concentración inicial de glicerol era 0.4M. la concentración de los solutos en esta solución será la suma de las concentraciones de sal y glicerol, es decir, un 51% en peso. Esta suma ficticia, pues sumamos concentraciones de especies químicas diferentes,


331

será la concentración de referencia para la curva de solubilidad ficticia del cloruro sódico.

Curva de solubilidad real del cloruro sódico en el sistema ternario.

−⋅

∆−⋅=

23811

exp15.0 ,

TR

HX ClNafus

ClNa Ec. 412

Curva de solubilidad ficticia del cloruro sódico en el sistema ternario.

−⋅

∆−⋅=

23811

exp51.0 ,

TR

HX ClNafus

ClNa Ec. 413

De igual forma se procede para dibujar la curva de solubilidad ficticia del glicerol, donde debemos tener en cuenta que la concentración del cloruro sódico permanece constante en todo momento.

Es importante hacer la aclaración de que a la hora de calcular numéricamente la composición del sistema intracelular cuando se satura, no empleamos las curvas de solubilidad ficticias, sino las reales. Por ejemplo para calcular el momento en que el sistema intracelular queda saturado en sal, lo que haremos será comprobar el momento en que la concentración másica del cloruro sódico coincida con la concentración másica de saturación del ClNa. Esto significa que calcularemos la intersección de la curva de deshidratación y de solubilidad pero en los ejes Temperatura-Fracción másica de ClNa.

Con estos datos, las curvas de descenso crioscópico y de solubilidad se muestran en la figura 98.


332

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

Fracción másica de soluto/%

Tem

pe

ratu

ra/º

C

DIAGRAMA DE FASES TERNARIO BIDIMENSIONAL

1ª etapa de la curvade descenso crioscópico

2ª etapa de la curvade descenso crioscópico

Curva de solubilidad ficticia del cloruro sódico

Curva de solubilidad ficticia del glicerol

Puntoeutécticoternario

*

Figura 98

El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 26.

Hay dos cosas importantes a comentar en este diagrama. La primera es que ahora la solución no queda saturada en sal hasta que no alcanzamos los –35ºC, mientras que cuando no había crioprotectores presentes estaba en torno a los –20ºC. La segunda es que en ausencia de crioprotectores la solución quedaba saturada en sal con una concentración del 22% en peso aproximadamente, mientras que ahora la concentración necesaria de sal para que la solución quede saturada es del 15% en peso aproximadamente.

La ley de descenso crioscópico con la solución saturada en cloruro sódico se muestra en el apartado 3.3 de este mismo capítulo.


333

3.2. EFECTO DE LA SOLUBILIDAD EN EL PROCESO DE DESHIDRATACIÓN

En el proceso de deshidratación celular podemos distinguir cuatro etapas, cuando consideramos el hecho de que tanto el cloruro sódico, como el crioprotector no pueden aumentar indefinidamente su concentración.

La primera etapa de la deshidratación tiene lugar desde el instante inicial del enfriamiento, hasta que en el medio extracelular alcanzamos las condiciones de saturación del cloruro sódico.

La segunda etapa de deshidratación tiene lugar desde el instante en que el medio extracelular queda saturado en cloruro sódico, hasta el instante en que el medio intracelular queda también saturado en cloruro sódico.

La tercera etapa de deshidratación tiene lugar desde el instante en que el medio intracelular queda saturado en cloruro sódico, hasta que en el medio extracelular alcanzamos las condiciones de saturación del crioprotector.

La última etapa de deshidratación es la que tiene lugar desde el instante en que el medio extracelular alcanzamos las condiciones de saturación del crioprotector, hasta que en el medio intracelular se alcanzan también las condiciones de saturación del crioprotector.

3.2.1 PRIMERA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN

El medio extracelular, a partir de la temperatura de cambio de fase sólido-líquido, que depende de la concentración de crioprotector para una célula dada, comienza a formar hielo, concentrando la solución extracelular, en cloruro sódico y crioprotector.

Este proceso de formación de hielo y de concentración del medio extracelular prosigue mientras no alcancemos las condiciones de saturación del cloruro sódico.

El análisis de los grados de libertad del medio extracelular en esta etapa de deshidratación es:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=3 Hielo, disolución líquida GL=3-2+2=3

Si consideramos que la presión del medio extracelular es constante y conocida, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema bivariante. Fijando la composición del sistema (fracción molar de sal y de crioprotector), la temperatura es conocida.

A partir de este momento siempre consideraremos que la presión del medio extracelular es constante y conocida.


334

Mientras tanto el medio intracelular comienza la deshidratación en respuesta al aumento de concentración del medio extracelular. Esta deshidratación, modelada mediante la ecuación deducida en el apartado 2.2 del capítulo Los Crioprotectores, continúa hasta alcanzar la temperatura a la cual el medio extracelular queda saturado en cloruro sódico. La temperatura del sistema cuando alcanzamos dicho punto es de –33.95ºC.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAREN UN SISTEMA AGUA-ClNa-GLICEROL

Fracción másica de soluto/% p

Tem

pe

ratu

ra/º

C

Concentración del medio intracelular

Concentración del medio extracelular

Figura 99

Los programas necesarios para poder dibujar esta gráfica se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el aparatado 27.

Hay que hacer notar, que en esta representación gráfica, en el eje horizontal tenemos la fracción másica de soluto, es decir, la fracción másica del cloruro sódico, más la fracción másica del crioprotector.

El análisis de los grados de libertad del medio intracelular, en esta primera etapa de deshidratación es:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=1 Disolución líquida GL=3-1+2=4


335

Si consideramos que la presión en el medio intracelular es constante y conocida, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema con tres grados de libertad. Fijando la composición del sistema (fracción másica de cloruro sódico y crioprotector), y la velocidad de enfriamiento , la temperatura es conocida.

A partir de este momento siempre consideraremos que la presión del medio intracelular es constante y conocida.

Resumiendo, la célula se deshidrata bajo estas condiciones:

Medio extracelular: No está saturado en cloruro sódico. No está saturado en crioprotector. Medio intracelular: No está saturado en cloruro sódico.

No está saturado en crioprotector.


336

3.2.2 SEGUNDA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN

En esta segunda etapa, en el medio extracelular continúa formándose hielo, y por tanto se tiende a aumentar la concentración de los solutos disueltos en la solución líquida aun existente. Sin embargo al haber alcanzado las condiciones de saturación del cloruro sódico, éste no puede seguir aumentando su concentración, por lo que parte de los moles disueltos precipitarán. Por el contrario el crioprotector sigue aumentando su concentración.

El análisis de los grados de libertad del medio extracelular, en esta segunda etapa de deshidratación es:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=3 Hielo, disolución líquida saturada en ClNa, ClNa precipitado GL=3-3+1=1

Mientras tanto el medio intracelular continúa la deshidratación, pero siguiendo una ley de deshidratación diferente a la de la etapa anterior, puesto que el medio exterior está saturado en sal.

Puesto que sólo conocemos evoluciona parcialmente la concentración del medio extracelular, puesto que sabemos que la fracción másica de cloruro sódico es constante pero no sabemos nada acerca de la evolución de la concentración del crioprotector, no podemos aplicar la ley de Raoult al medio exterior.

Sin embargo puesto que la concentración de crioprotector, suele ser en el instante inicial del proceso de enfriamiento, como mínimo del orden de tres veces la concentración del cloruro sódico, y puesto que esta etapa la concentración de sal permanece constante, mientras la del crioprotector crece, la composición del medio extracelular vendrá dada fundamentalmente por la concentración del crioprotector.

Podemos suponer que el comportamiento del medio extracelular se ve levemente afectado por la saturación en cloruro sódico, y por lo tanto la ley de deshidratación de la célula en esta etapa será la misma que la de la etapa anterior.

Esta simplificación, tendrá tanto menos error, cuanto mayor sea la proporción de crioprotector frente a la sal en el instante inicial, para que así el efecto de la sal sobre el comportamiento del medio extracelular sea pequeño.


337

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0


Tem

pe

ratu

ra/º

C

DESHIDRATACIÓN DEL MEDIO INTRACELULAREN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL

1

2 A

B

3



Figura 100

Los programas necesarios para poder dibujar esta gráfica se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 28.

El análisis de los grados de libertad del medio intracelular en esta segunda etapa de deshidratación es:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=1 Disolución líquida GL=3-1+1=3

Resumiendo, la célula se deshidrata en esta segunda etapa bajo estas condiciones:

Medio intracelular: Si está saturado en cloruro sódico. No está saturado en crioprotector. Medio intracelular: No está saturado en cloruro sódico. No está saturado en crioprotector. La temperatura final de esta segunda etapa es de –41.14ºC.


338

3.2.3 TERCERA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN

En esta nueva etapa, en el medio extracelular continúa formándose hielo, mientras precipitan mas moles de sal, y aumenta la concentración de crioprotector.

El análisis de lo grados de libertad del medio extracelular en esta tercera etapa son los mismos que en la etapa anterior.

En el medio intracelular comienza a precipitar cloruro sódico, al estar la solución saturada, mientras aumenta la concentración de crioprotector, conforme se va deshidratando la célula.

La ley de deshidratación será diferente a la de la etapa anterior, a pesar de seguir bajo la hipótesis de que la evolución del medio extracelular no se ve significativamente afectada por estar saturado en sal. La razón está en que la concentración de moles de sal permanece constante durante toda la etapa.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0


Tem

pe

ratu

ra/º

C


1

2 A

B

3



C


Figura 101

Los programas necesarios para poder dibujar esta gráfica se encuentran en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 29.

El análisis de los grados de libertad del medio intracelular en esta tercera etapa de deshidratación es:


339


Fijando la composición del sistema (fracción molar de crioprotector) y la velocidad de enfriamiento, la temperatura es conocida.

En el gráfico de la figura 101 se puede observar que la deshidratación en esta etapa es escasa debido a la pérdida de permeabilidad de la membrana.


340

3.2.4 CUARTA ETAPA DE DESHIDRATACIÓN

Esta última etapa de deshidratación celular comienza cuando el medio extracelular queda saturado en crioprotector, además de en cloruro sódico. Para ver cual será el comportamiento del medio extracelular en estas condiciones, calculamos el número de grados de libertad:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=4 Hielo, solución líquida saturada en ClNa y crioprotector, ClNa

precipitado, crioprotector precipitado GL=3-4+1=0

Vemos como el medio extracelular tiene cero grados de libertad. Por lo tanto el sistema extracelular en su conjunto no puede disminuir su temperatura, y la disolución líquida en particular no puede seguir aumentando su concentración, ni en cloruro sódico, ni en crioprotector.

El único proceso que tiene lugar es la reducción del volumen de disolución líquida saturada extracelular, para formar hielo y precipitar sal y crioprotector.

La evolución de la deshidratación celular va a depender de la velocidad con la que se produzca esta transformación de la disolución líquida saturada en hielo y precipitado de sal y crioprotector.

Al igual que hicimos al estudiar la deshidratación celular sin presencia de crioprotectores, consideraremos dos casos extremos

• En el primero la velocidad con la que se produce la transformación de la solución líquida saturada, en hielo y precipitado de sal y crioprotector es lo suficientemente pequeña, como para permitir que el medio intracelular alcance el equilibrio con el medio extracelular, alcanzando la composición del punto eutéctico ternario, y aun permanezca solución líquida saturada en el medio extracelular.

• En el segundo la velocidad con la que se produce la trasformación a hielo y precipitado de sal y crioprotector, es infinita, es decir, el tiempo necesario para que la solución líquida saturada desaparezca es infinitamente pequeño. El sistema extracelular permanece en las condiciones del punto eutéctico ternario un instante infinitesimal.

Una deshidratación real de una célula se encontrará entre ambos casos extremos.

A continuación vamos a describir cómo sería la evolución de la deshidratación celular en cada caso.


341

3.2.4.1 La solución líquida saturada extracelular desaparece después de alcanzar el equilibrio con el medio intracelular

Al igual que ocurría en el caso de ausencia de crioprotector, el medio extracelular impone una condición de temperatura impuesta sobre el medio intracelular, que continúa deshidratándose. El número de grados de libertad del medio intracelular mientras se deshidrata a temperatura constante es:


Como tenemos una condición de temperatura impuesta, el número de grados de libertad queda reducido a uno. Fijando la composición del sistema (fracción molar de crioprotector), podemos conocer la temperatura del sistema, independientemente de la velocidad de enfriamiento.

La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones hasta que finalmente el medio intracelular queda también saturado en crioprotector, momento en el cual se detiene la deshidratación por encontrarse el interior de la célula en equilibrio con el exterior. Sin embargo debido a la impermeabilización de la membrana, por encontrarnos a tan bajas temperaturas, impide este acercamiento al equilibrio. La célula no puede deshidratarse cuando se alcanzan las condiciones de temperatura impuesta.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0


Tem

pe

ratu

ra/º

C


1

2 A

B

3



C


* 4ª etapa s indeshidratación

Figura 102


342

El número de grados de libertad del medio intracelular en estas condiciones de bloqueo osmótico por falta de permeabilidad en la membrana es:


La condición de temperatura impuesta reduce en uno el número de grados de libertad. Igualmente, la condición de flujo osmótico nulo reduce en uno el número de grados de libertad, resultando un sistema invariante.

El sistema en estas condiciones, permanece como paralizado, no modifica ni su temperatura ni su composición.

Esta situación de parálisis termina cuando la última gota de solución líquida extracelular saturada, se transforma en hielo y precipitado de sal y crioprotector. En ese instante la temperatura del sistema comienza de nuevo a disminuir, al tener tanto el sistema intracelular, como extracelular un grado de libertad.

Análisis de los grados de libertad del medio extracelular.

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=3 Hielo, sal precipitada, crioprotector precipitado GL=3-3+1=1

Análisis de los grados de libertad del medio intracelular.


Como la condición de flujo osmótico nulo permanece, el número de grados de libertad se reduce en uno, resultando un sistema monovariante.

A partir de este momento el subenfriamiento del sistema intracelular crece indefinidamente, puesto que la temperatura del sistema es monótonamente decreciente, y la temperatura de equilibrio para la composición del sistema, es constante, de manera que por cada grado centígrado que disminuya la temperatura del sistema, el subenfriamiento aumenta en un grado centígrado.

La evolución del subenfriamiento se indica en la figura 103.


343

-90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 00

10

20

30

40

50

60

70

SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAREN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL

Fracción másica de solutos/%p

Tem

pe

ratu

ra/º

C




Temperatura del eutéctico

Figura 103

El programa necesario para poder dibujar el gráfico anterior se encuentra en el anexo PROGRAMAS, en el apartado 30.

Observamos como al llegar a la temperatura del eutéctico el subenfriamiento NO se reduce a cero, como debiera ocurrir si la permeabilidad de la membrana fuera no nula. El sistema permanecerá a dicha temperatura y por tanto manteniendo el subenfriamiento constante, mientras en el medio extracelular exista solución líquida. En el momento en que desaparece la última gota de solución líquida saturada extracelular el subenfriamiento crece indefinidamente. La línea a trazos indica cual hubiera sido la evolución del subenfriamiento de no existir la condición de temperatura impuesta desde el medio extracelular.

Llegaremos a una temperatura en la que sea imposible evitar la formación de hielo intracelular. Cuando aparezca hielo dentro de la célula el número de grados de libertad se reduce a cero.

La temperatura interior de la célula permanecerá constante mientras exista solución líquida saturada intracelular. En el momento en que sólo tengamos hielo y sal precipitada dentro de la célula, el sistema volverá a ser monovariante, es decir, volverá a reducirse la temperatura.


344

Debido al desequilibrio térmico entre el interior y el exterior de la célula, el medio intracelular se enfriará más deprisa que el extracelular, hasta que finalmente ambos tengan la misma temperatura.

Si artificialmente conseguimos que la permeabilidad celular sea no nula a bajas temperaturas, reduciendo por ejemplo la energía de activación a la mitad, tenemos la siguiente evolución de la deshidratación celular:

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0



Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2

3

A B

C

Deshidratación con permeabilidad modificada

Deshidratación con permeabilidad NO modificada

Figura 104

Vemos que aunque exista permeabilidad a bajas temperaturas, las condiciones de temperatura impuesta son prácticamente idénticas a las del estado del eutéctico ternario, por lo la deshidratación a temperatura constante es un periodo de deshidratación prácticamente despreciable.

Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento, consideramos varias velocidades de enfriamiento lineal.

La evolución de la concentración de la sal con respecto a la temperatura del sistema se muestra en la figura 105:


345

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0


Tem

pe

ratu

ra/º

C


-10ºC/min

-25

-30

-40 -60

Figura 105

La evolución del subenfriamiento para distintas velocidades de enfriamiento se muestra en la figura 106 en la siguiente página.


346

-80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 00

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULARDE UNA SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL


Tem

pe

ratu

ra/º

C

-10ºC/min

-25

-30

-40

-60

Figura 106


347

3.2.4.2 La solución líquida saturada extracelular desaparece instantáneamente

Como el medio extracelular deja de ser invariante instantáneamente, la temperatura del sistema no permanece constante en ningún momento. Por lo tanto, el medio intracelular continuará deshidratándose y disminuyendo su temperatura.

En esta nueva etapa de deshidratación tenemos un medio extracelular formado por hielo y un precipitado de sal y crioprotector, y un medio intracelular formado por una solución saturada en sal y un precipitado de sal.

Para poder modelar matemáticamente la deshidratación, aplicaremos de nuevo la hipótesis de la Capa Líquida Saturada, de manera que alrededor de cada célula tendremos en todo momento una delgada película de solución líquida saturada en sal y crioprotector.

Ahora la evolución de la composición del medio extracelular es conocida y constante, por lo que podemos aplicarle la ley de Raoult.

El número de grados de libertad del medio intracelular es:


Necesito conocer la composición de la solución intracelular (fracción molar de crioprotector), y la velocidad de enfriamiento, para poder conocer la temperatura del sistema.

La célula continúa deshidratándose bajo estas condiciones hasta que corta a la curva de solubilidad del crioprotector. En ese instante, la solución intracelular alcanza las condiciones de saturación respecto al crioprotector.

Sin embargo debido a la impermeabilización de la membrana no se produce deshidratación ninguna, siendo la evolución con respecto a la temperatura análoga a la del caso anterior, hasta que de igual manera llegamos a cortar a la curva de solubilidad del crioprotector.


348

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0


Tem

pe

ratu

ra/º

C


1

2 A

B

3



C


* 4ª etapa s indeshidratación

Figura 107

En esta nueva situación, conforme enfriamos el sistema, la temperatura, tanto del medio intracelular, como del extracelular disminuyen.

Bajo la hipótesis de la Capa Líquida Saturada, alrededor de la célula hay una delgada capa de disolución líquida con la composición del eutéctico ternario. Como la temperatura del sistema sigue disminuyendo, la solubilidad del crioprotector cada vez es menor, por lo que debe precipitar parte de los moles disueltos de glicerol, aunque no se produzca deshidratación alguna.

En el caso de que aun existiese permeabilidad y puesto que la composición del medio intracelular, que está saturado, tiene una concentración inferior a la del eutéctico, la célula tendería a seguir deshidratándose, y puesto que la concentración no puede aumentar, comienza a precipitar crioprotector en el interior de la célula, además de sal que ya estaba precipitando desde etapas anteriores de deshidratación.

El número de grados de libertad del medio intracelular en estas nuevas condiciones es:

C=3 Agua, cloruro sódico, crioprotector F=3 Solución saturada en ClNa y crioprotector, ClNa precipitado,

crioprotector precipitado GL=3-3+1=1


349

Si la membrana no se impermeabilizase, teóricamente continuaríamos la deshidratación hasta tener en el interior de la célula únicamente sal y crioprotector precipitados. Sin embargo, probablemente debido a problemas para transportar agua hacia la membrana, en su interior siempre quedará solución líquida saturada. En el momento en que se deshidrata por completo la célula, la capa de líquido saturado alrededor de la célula desaparece. La evolución del sistema es una vertical.

Sin embargo la impermeabilización, deja atrapada una cierta cantidad de agua en el interior de la célula, saturada en sal y crioprotector, que superado un cierto subenfriamiento formará hielo.

A partir de este momento el sistema estará constituido por un medio extracelular formado por hielo y un precipitado de sal y crioprotector, y un medio intracelular formado por un precipitado de sal y crioprotector, y algo de solución líquida saturada. La temperatura del sistema en estas condiciones se reduce indefinidamente.

El subenfriamiento de este proceso de deshidratación crece indefinidamente, sin excluir la existencia de máximos locales al comienzo del subenfriamiento. A partir del punto de corte con la curva de solubilidad del crioprotector, punto C, por cada grado centígrado que disminuye la temperatura del sistema, el subenfriamiento aumenta un grado centígrado, es decir, todo el descenso de temperatura se invierte en el subenfriamiento.

La evolución gráfica del subenfriamiento, para el caso de espermatozoides de ratón, enfriados mediante un perfil lineal de –30ºC/min se muestra en la figura 108:


350

-90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 00

10

20

30

40

50

60

70

SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAREN UN SISTEMA TERNARIO AGUA-ClNa-GLICEROL


Tem

pe

ratu

ra/º

C




Temperatura del eutéctico

Figura 108

La evolución del subenfriamiento es análoga a la del caso anterior.

Si al igual que en caso anterior modificamos artificialmente la permeabilidad de la membrana, para que no sea impermeable a bajas temperaturas, el proceso de deshidratación que tiene lugar antes de alcanzar a la curva de solubilidad del crioprotector es prácticamente despreciable, por lo que no lo vamos a tener en cuenta en los programas de MATLAB. Para tener en cuenta esta pequeña etapa de deshidratación, lo único que haremos será desplazar ligeramente la vertical que representa la evolución del medio intracelular una vez saturado en glicerol, hacia la derecha indicando así que en ese pequeño tramo hay una leve e imperceptible deshidratación.


351

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0



Tem

pe

ratu

ra/º

C

1

2

3

A B

C

Deshidratac ión con permeabilidad modificada

Deshidratación con permeabilidad NO modificada

Figura 109

Para ver el efecto de la velocidad de enfriamiento sobre el fenómeno de la solubilidad, calculamos las curvas de deshidratación y subenfriamiento con respecto a la temperatura para varias velocidades de enfriamiento lineal.


352

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-100

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0


Tem

pe

ratu

ra/º

C


-10ºC/min

-25

-30

-40 -60

Figura 110

La conclusión del estudio realizado sobre el efecto de la solubilidad en el proceso de deshidratación de sistemas ternarios, es que apenas si hay efectos, debido a que la impermeabilización de la membrana anula los procesos de deshidratación que harían que la solubilidad fuera un factor determinante.


353

3.3. MODELOS TEÓRICOS DE DESHIDRATACIÓN CON DISOLUCIONES SATURADAS

3.3.1 MODELO DE DESHIDRATACIÓN CON MEDIO INTRACELULAR SATURADO EN CLORURO SÓDICO

La ecuación para modelar la deshidratación, va a ser la del flujo osmótico, que fue obtenida en el apartado 6.2 del capítulo 4.

in

ex

A

g

PP

V

TRATL

dtdV

ln)(

* ⋅⋅⋅⋅

= Ec. 414

Para un proceso de enfriamiento, la temperatura T, y la variable tiempo t, están relacionadas. Para un perfil de enfriamiento lineal esta relación es de la forma:

BdtdT

−= Ec. 415

Sustituyendo esta expresión en la ecuación Ec414 tenemos:

in

ex

A

g

PP

BV

TRATL

dTdV

ln)(

* ⋅⋅

⋅⋅⋅= Ec. 416

Aplicando las mismas expresiones y simplificaciones que en el apartado 6.2 del capítulo 4, llegamos finalmente a una ecuación de deshidratación de la forma:

−

⋅⋅

⋅⋅⋅= ∫

T

AF

A

g xdTTRTL

V

TRATL

dtdV

15.2732* ln)()(

Ec. 417

Lo que va a diferenciar esta ecuación de la que obtuvimos en el apartado 2.2 del capítulo Los Crioprotectores, es la expresión de la fracción molar de disolvente xA. Cuando desarrollamos la ecuación diferencial que permitía modelar la deshidratación celular con presencia de crioprotectores la fracción molar de disolvente era de la forma:

**ACPAABBCPACPABB

CPACPABBA VnVnVnVnV

VnVnVx

⋅+⋅⋅+⋅−⋅−⋅−⋅−

= ∞∞

∞∞

ν Ec. 418

donde nB son los moles iniciales de sal, y que permanecían constantes durante todo el proceso de deshidratación.

Sin embargo en el modelo que planteamos a continuación el número de moles de sal disuelta nB no permanece constante, sino que disminuye con el tiempo. La razón es que al estar la solución saturada, no puede aumentar la


354

concentración en cloruro sódico, al ser ésta constante e igual al valor de saturación. Como la célula continúa deshidratándose se tendería a seguir aumentando la concentración en cloruro sódico, pero como esto no es posible, parte de los moles de sal disueltos deben precipitar, para cumplir así con la condición de que su concentración permanezca constante.

Por lo tanto el número de moles de sal disuelta dependen del volumen intracelular que haya en cada momento; a menor volumen, menor cantidad de moles de sal disueltos. Para obtener la expresión que me relaciona los moles de sal disueltos, con el volumen de disolución intracelular, aplicaremos la condición de concentración constante, e igual al valor de saturación. Como parámetro que mide la concentración emplearemos la fracción másica de cloruro sódico Xw,B:

CPACPABBAA

BBBw MnMnMn

MntotalmasaClNademasa

X⋅+⋅+⋅

⋅==, Ec. 419

donde nA, nB, y nCPA son los moles de agua, sal, y crioprotector respectivamente, y MA, MB, y MCPA son los pesos moleculares del agua, la sal , y el crioprotector respectivamente.

Si multiplicamos y dividimos la ecuación Ec419 por V*A ⁄ MA tenemos:

***

*

,

AA

CPACPAA

A

BBAA

AA

BB

Bw

VM

MnV

MM

nVn

VMM

nX

⋅⋅+⋅⋅+⋅

⋅⋅= Ec. 420

Como ya sabíamos de desarrollos anteriores, el volumen de la disolución intracelular cumple de forma aproximada la siguiente igualdad:

∞∞ ⋅+⋅+⋅≈ CPACPABBAA VnVnVnV * Ec. 421

Por lo tanto la expresión de la fracción másica de cloruro sódico será:

**

*

,

AA

CPACPAA

A

BBCPACPABB

AA

BB

Bw

VM

MnV

MM

nVnVnV

VMM

nX

⋅⋅+⋅⋅+⋅−⋅−

⋅⋅=

∞∞ Ec. 422

Despejando el número de moles de cloruro sódico, y teniendo en cuenta que la fracción másica de la sal, corresponde al valor de saturación, tenemos:


355

satBw

satBw

AA

BB

AA

CPACPACPA

B

X

XV

MM

V

VM

MVnV

n

,

,*

*

1−⋅⋅+

⋅−⋅−

=∞

∞

Ec. 423


356

3.3.2 CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO IDEAL CUANDO LA SOLUCIÓN INTRACELULAR ESTÁ SATURADA EN CLORURO SÓDICO

Para obtener la evolución del medio extracelular, supusimos que esta evolución era a través de sucesivos estados de equilibrio. Esta curva la obteníamos por tanto, a partir de planteamientos de equilibrio. El equilibrio que planteábamos era el del medio intracelular con el medio extracelular. Por lo tanto, la evolución de la composición del medio extracelular la obteníamos como la evolución que tendría el medio intracelular, si éste evolucionara por sucesivos estados de equilibrio.

La solución intracelular permanecerá en equilibrio termodinámico con la solución extracelular mientras se produzca la igualdad de presiones de vapor:

⋅=⇒⋅=⇒= ∫

Tfin

AinAlAsA

inex dTTR

TLxxTPTPTPTP

2732

*,

*,

)(exp)()()()( Ec. 424

Sustituyendo el valor de la fracción molar de disolvente xAin en función del

volumen de disolución, tenemos:

( ) ( ) QdTTR

TL

VVnVVnVVnVnV T

f

ACPACPAABBB

CPACPABB =

⋅=

−⋅−⋅−⋅−⋅−⋅−

∫∞∞

∞∞

2732**

)(exp

ν Ec. 425

Despejando el volumen de disolución, tenemos la ecuación de la curva de descenso crioscópico, cuando la solución intracelular está saturada en cloruro sódico:

QVcteV

Qcte

cte

QVVcte

ctenQV

Vctecte

n

V

B

AB

CPACPA

CPAAB

BCPA

⋅⋅⋅

−−⋅−

−⋅⋅

⋅−+⋅⋅

⋅−

=

∞

∞∞∞

2)1(

212

)1(1

21

21

*

*

ν

ν

Ec. 426

donde :

satBw

satBw

B

A

A

B

AA

CPACPACPA

X

X

VV

MM

cte

VM

MVncte

,

,*

*

112

1

−⋅⋅+=

⋅−⋅=

∞

∞

Ec. 427


357

3.3.3 MODELO DE DESHIDRATACIÓN CON LA SOLUCIÓN INTRACELULAR SATURADA EN CLORURO SÓDICO, CON EL MEDIO EXTRACELULAR SATURADO EN CLORURO SÓDICO Y CRIOPROTECTOR

Puesto que esta deshidratación es despreciable frente a las que se han producido anteriormente, como hemos podido ver en las evoluciones gráficas realizadas en el apartado anterior, la ecuación que describe esta deshidratación no ha sido programada en MATLAB.

Al igual que en todos los modelos de deshidratación vistos hasta ahora, partimos de la siguiente ecuación:

in

ex

A

g

PP

BV

TRATL

dTdV

ln)(

* ⋅⋅

⋅⋅⋅= Ec. 428

Al igual que hicimos en el apartado 2.3.1.2 de este mismo capítulo, las expresiones de las presiones son:

inAlA

in xTPP ⋅= )(*, Ec. 429

exAlA

ex xTPP ⋅= )(*, Ec. 430

De esta manera la expresión de la deshidratación es:

inA

exA

A

g

xx

BV

TRATL

dTdV

ln)(

* ⋅⋅

⋅⋅⋅= Ec. 431

El valor de la fracción molar del disolvente en el medio extracelular es conocida, por ser su composición constante e igual al valor de saturación:

satCPA

satB

exA xxx −−= 1 Ec. 432

donde xBsat y xCPA

sat son las fracciones molares de saturación del cloruro sódico, y del crioprotector respectivamente.

La expresión de la fracción molar de disolvente en el medio intracelular es idéntica a la calculada en el apartado 3.3.1:

**ACPAABBCPACPABB

CPACPABBA VnVnVnVnV

VnVnVx

⋅+⋅⋅+⋅−⋅−⋅−⋅−

= ∞∞

∞∞

ν Ec. 433

donde el número de moles de sal, nB varía según la ley obtenida en el mismo apartado:


358

satBw

satBw

AA

BB

AA

CPACPACPA

B

X

XV

MM

V

VM

MVnV

n

,

,*

*

1−⋅⋅+

⋅−⋅−

=∞

∞

Ec. 434

ANEXO PROGRAMAS

359

ANEXO PROGRAMAS

360

VII. ANEXO PROGRAMAS

SECCIÓN 1.01 PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 4. LA DESHIDRATACIÓN CELULAR

APARTADO 1 PROGRAMA PRINCIPAL %************************************************************** % Programa que permite calcular la deshidratación con % respecto al tiempo con un perfil de enfriamiento lineal. %************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón %AQUÍ CALCULO LA CURVA DE EQUILIBRIO [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; if ncpa==0 plot(t0-273,V0,'r--') else plot(t0-273,V0,'r:') end hold on; %AQUÍ CALCULO LAS CURVAS DE DESHIDRATACIÓN for B=[ -15 ] tspan=[273 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; if ncpa==0 plot(t1-273,V1,'b','LineWidth',1) else plot(t1-273,V1,'g','LineWidth',1) end axis([-20 0 0 1.2]); hold on; end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');

ANEXO PROGRAMAS

361

SUBPROGRAMA DescCrio_id_integrado function [t,y]=DescCrio_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa) %********************************************************************* % Subprograma que permite calcular la curva de descenso crioscópico %********************************************************************* if nargin<4 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5; end if nargin<3 | isempty(ncpa) ncpa=0; end R=8.3143; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; VmA=18*1e-6; Vsol=n2*Vm2+ncpa*Vmcpa; nsol=(v2*n2+ncpa); a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273; fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R; fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R; fact3=(c+3*d*z)/R; fact4=d/(2*R); T=[190:1:272.99]; To=273; integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2-To^2); Q=exp(integralLf); V_eq=Vsol+(Q./(1-Q))*nsol*VmA; t=T; y=V_eq;

ANEXO PROGRAMAS

362

SUBPROGRAMA enfr_id_lineal function varargout=enfr_id_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) %******************************************************************************** % Subprograma que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación % celular cuando el sistema es sometido a un perfil de enfriamiento lineal %******************************************************************************** if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0; end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. F=B;%perfil de enfriamiento lineal aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F)); dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))]; function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

ANEXO PROGRAMAS

363

APARTADO 2 PROGRAMA PRINCIPAL %************************************************************************* % Programa que permite calcular la deshidratación celular % con repecto al tiempo, para varias velocidades de enfriamiento lineal. %************************************************************************* Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; ncpa=aux; if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); if ncpa==0 plot(t0-273,V0,'r--') else plot(t0-273,V0,'r:') end hold on; for B=[-15 -50 -100] tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; tm1=(273-t1)/(-B); plot(tm1,V1,'b','LineWidth',1) axis([0 3 0 1]); hold on; end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TIEMPO/min'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');

Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

364

APARTADO 3 PROGRAMA PRINCIPAL %**************************************************************************** %Programa que permite calcular la deshidratación celular con %respecto a la temperatura para tres perfiles de enfriamiento distintos: %lineal,cuadrático, y exponencial. %**************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; ncpa=aux; if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); if ncpa==0 plot(t0-273,V0,'r--') else plot(t0-273,V0,'r:') end hold on; for B=[-15 -50 -1000] tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; V2=y2./Vi; V3=y3./Vi; plot(t1-273,V1,'r',t2-273,V2,'b',t3-273,V3,'g','LineWidth',1) axis([-55 0 0 1]); hold on; end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA'); Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

365

SUBPROGRAMA enfr_id_cuadratico function varargout=enfr_id_cuadratico(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) %******************************************************************************** % Subprograma que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación % celular cuando sometemos el sistema a un perfil de enfriamiento cuadrático %******************************************************************************** if nargin<12 |isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0; end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. G=B^2/273; F=-sqrt(B^2+2*G*(273-t));%perfil de enfriamiento cuadratico aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F)); dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))]; function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

ANEXO PROGRAMAS

366

SUBPROGRAMA enfr_id_exponencial function varargout=enfr_id_exponencial(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) %******************************************************************************** % Subprograma que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación % celular, cuando sometemos al sistema a una perfil de enfriamiento exponencial %******************************************************************************** if nargin<12 |isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0; end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. k=B/273; F=k*t;%perfil de enfriamiento exponencial aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F)); dydt=[aux*(SLf-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))]; function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

ANEXO PROGRAMAS

367

APARTADO 4 PROGRAMA PRINCIPAL %***************************************************************************** %Programa que permite calcular la deshidratación con %respecto al tiempo para tres perfiles de enfriamiento distintos: lineal, %cuadrático, y exponencial. %***************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; ncpa=aux; if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); if ncpa==0 plot(t0-273,V0,'r--') else plot(t0-273,V0,'r:') end hold on; for B=[-15 -50 -100] tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; tm1=(273-t1)/(-B); V2=y2./Vi; tm2=273*(B+sqrt(B^2+2*B^2*(1-t2/273)))/B^2; V3=y3./Vi; tm3=(273/B)*log(t3/273) plot(tm1,V1,'r',tm2,V2,'b',tm3,V3,'g','LineWidth',1) axis([0 3 0 1]); hold on; end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TIEMPO/minutos'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA'); Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1. Los subprogramas enfr_id_cuadrático y enfr_id_exponencial son los mismos que los del apartado 3.

ANEXO PROGRAMAS

368

APARTADO 5 PROGRAMA PRINCIPAL %******************************************************************************** %Programa que permite calcular la evolución %de los subenfriamientos con respecto a la temperatura, para distintos tipos %de perfiles de enfriamiento. %******************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-5 -15 -30 -35 -50 ] Tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; %Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden %con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración %de las ecuaciones de deshidratación. s1=interp1(y0,t0,y1); %Calculamos los subenfriamientos. subenfr1=s1-t1; if ncpa==0 plot(t1-273,subenfr1,'b') else plot(t1-273,subenfr1,'g') end hold on; axis([-55 0 0 30]); %Calculamos el pico del subenfriamiento, si existe. Si no existe %nos da el último subenfriamiento. z=size(t1); i=1; while (subenfr1(i+1)>subenfr1(i)) i=i+1; if i==z(1,1) break; end end %mostramos por pantalla: %1)la temperatura a la que se alcanza el maximo del subenfriamiento %2)el maximo de subenfriamiento %3)posición del subenfriamiento max en el vector de subenfriamientos %4)dimensión del vector de subenfriamientos [t1(i)-273,subenfr1(i),i,z(1,1)] end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR');

ANEXO PROGRAMAS

369


ANEXO PROGRAMAS

370

APARTADO 6 PROGRAMA PRINCIPAL %*********************************************************************************** % Programa que permite calcular la evolución % de los subenfriamientos con respecto a la temperatura, para uno o % varios perfiles de enfriamiento lineal. %*********************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-15 ] % VELOCIDAD DE ENFRIAMIENTO Tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); %integramos de nuevo la ecuacion de deshidratacion pero para una permeabilidad %de la membrana que es doble de la original. [t2,y2]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,2*Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; V2=y2./Vi; %Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden %con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración %de las ecuaciones de deshidratación. s1=interp1(y0,t0,y1); s2=interp1(y0,t0,y2); %Calculamos los subenfriamientos. subenfr1=s1-t1; subenfr2=s2-t2; if ncpa==0 plot(t1-273,subenfr1,'r',t2-273,subenfr2,'b') else plot(t1-273,subenfr1,'r:',t2-273,subenfr2,'b:') end hold on; axis([-20 0 0 5]); %Calculamos el pico del subenfriamiento, si existe. Si no existe %nos da el último subenfriamiento. z=size(t1); i=1; while (subenfr1(i+1)>subenfr1(i)) i=i+1; if i==z(1,1) break; end end %mostramos por pantalla: %1)la temperatura a la que se alcanza el maximo del subenfriamiento %2)el maximo de subenfriamiento %3)posición del subenfriamiento max en el vector de subenfriamientos %4)dimensión del vector de subenfriamientos [t1(i)-273,subenfr1(i),i,z(1,1)]

ANEXO PROGRAMAS

371

end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR'); Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

372

APARTADO 7 PROGRAMA PRINCIPAL %************************************************************************************* %Programa que permite calcular la evolución de los subenfriamientos con respecto a la %temperatura, para distintos tipos de perfiles de enfriamiento. %************************************************************************************* Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-5 -15 -30 -35 -50 ] Tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; V2=y2./Vi; V3=y3./Vi; %Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden %con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración %de las ecuaciones de deshidratación. s1=interp1(y0,t0,y1); s2=interp1(y0,t0,y2); s3=interp1(y0,t0,y3); %Calculamos los subenfriamientos. subenfr1=s1-t1; subenfr2=s2-t2; subenfr3=s3-t3; %Dibujamos las evoluciones de los subenfriamientos. if ncpa==0 plot(t1-273,subenfr1,'r',t2-273,subenfr2,'b',t3-273,subenfr3,'g') else plot(t1-273,subenfr1,'r:',t2-273,subenfr2,'b:',t3-273,subenfr3,'g:') end hold on; axis([-55 0 0 30]); %Calculamos el pico del subenfriamiento, si existe. Si no existe %nos da el último subenfriamiento. z=size(t1); i=1; while (subenfr1(i+1)>subenfr1(i)) i=i+1; if i==z(1,1) break; end end %mostramos por pantalla: %1)la temperatura a la que se alcanza el maximo del subenfriamiento %2)el maximo de subenfriamiento para el enfriamiento LINEAL. %3)posición del subenfriamiento max en el vector de subenfriamientos %4)dimensión del vector de subenfriamientos [t1(i)-273,subenfr1(i),i,z(1,1)]

ANEXO PROGRAMAS

373

end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('SUBENFRIAMIENTO DEL MEDIO INTRACELULAR'); Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1. Los subprogramas enfr_id_cuadrático y enfr_id_exponencial son los mismos que los del apartado 3.

ANEXO PROGRAMAS

374

APARTADO 8 PROGRAMA PRINCIPAL %********************************************************************************* %Programa que permite calcular la evolución del caudal de flujo osmótico %con respecto al tiempo, para un perfil de enfriamiento lineal. %********************************************************************************* Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-5 -50] tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; n=size(y1); for i=1:1:n(1,1) Q(i)=-B*1e18*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); end plot((t1-tspan(1,1))/B,Q,'b','LineWidth',1) axis([0 3 0 70]); title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TIEMPO/MIN'); ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)'); hold on; % sumo todos los caudales evacuados para calcular el caudal medio QT=0; for i=1:1:n(1,1) QT=QT+Q(i); end %calculo el área bajo cada curva de flujo osmótico, %que da el agua total evacuada durante la deshidratación. %Este dato lo meto en la variable z. z=0; for i=1:1:n(1,1)-1 h=(Q(i)+Q(i+1))/2; l=(t1(i+1)-tspan(1,1))/B-(t1(i)-tspan(1,1))/B; z=z+h*l; end % Por pantalla salen tantos vectores como velocidades de enfriamiento % tengamos. En cada vector tenemos primero el caudal medio y luego la % integral del caudal. [QT/n(1,1) z] clear Q; end end Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

375

APARTADO 9 PROGRAMA PRINCIPAL %********************************************************************************* %Programa que permite calcular la evolución de la %concentración de moles de sal con respecto a la temperatura, para un perfil de %enfriamiento lineal. %********************************************************************************* Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-15 -30 -35 -50] Tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; %calculo los volumenes de la curva de equilibrio que corresponden a las %temperaturas que son numéricamente igual a las proporcionadas por la %integración de la deshidratación:t1 y0p=interp1(t0,y0,t1); %idem pero para la fracción de volumen celular con respecto al inicial. V0p=interp1(t0,V0,t1); %calculo las evoluciones de la concentración de moles de soluto, siguiendo %la curva de equilibrio(Cmo) y siguiendo las curvas de deshidratación(Cm1). Cm0=(n2)./(y0p*1000); Cm1=(n2)./(y1*1000); if ncpa==0 %dibujo las evoluciones de la concentracion siguiendo curvas de deshidratacion plot(t1-273,Cm1,'b'),axis([-55 0 0 10]); ylabel('CONCENTRACIÓN/(mol/m3)'); title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); hold on; else plot(t1-273,Cm1,'g'),axis([-55 0 0 10]); ylabel('CONCENTRACIÓN/(mol/m3)'); title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); hold on; end hold on; end %dibujo evolución de la concentracion siguiendo curva de equilibrio. if ncpa==0 plot(t1-273,Cm0,'r') else plot(t1-273,Cm0,'r:') end end

ANEXO PROGRAMAS

376


ANEXO PROGRAMAS

377

APARTADO 10 PROGRAMA PRINCIPAL %**************** RESOLUCIÓN PARA ESPERMATOZOIDES DE RATÓN ******************** %Programa que permite calcular la evolución del caudal osmótico con la temperatura %para un perfil de enfriamiento lineal, cuadrático, y exponencial %****************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); for B=[-5 -15 -30 -50 ] tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t2,y2]=ode15s('enfr_id_cuadratico',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t3,y3]=ode15s('enfr_id_exponencial',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; V2=y2./Vi; V3=y3./Vi; n=size(y1); m=size(y2); s=size(y3); for i=1:1:n(1,1) Q1(i)=1e18*(-B)*enfr_id_lineal(t1(i),y1(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); end for i=1:1:m(1,1) Q2(i)=1e18*(sqrt(B^2+2*B^2*(1-t2(i)/273)))*enfr_id_cuadratico(t2(i),y2(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); end for i=1:1:s(1,1) Q3(i)=1e18*(-B)/273*t3(i)*enfr_id_exponencial(t3(i),y3(i),'',B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); end [ B Q1(1) Q2(1) Q3(1)] if ncpa==0 plot(t1-273,Q1,'r',t2-273,Q2,'b',t3-273,Q3,'g','LineWidth',1) axis([-55 0 0 80]); title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)'); hold on; %FALTA CALCULAR LAS EVOLUCIONES EL CAUDAL CON EL TIEMPO %PARA PERFILES DE ENFRIAMIENTO NO LINEALES. else subplot(2,1,1),plot(t1-273,Q,'g','LineWidth',1) axis([-55 0 0 70]); hold on; title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)'); %SOLO ESTÁ CALCULADA LA EVOLUCIÓN TEMPORAL PARA PERFIL LINEAL DE TEMPERATURA subplot(2,1,2),plot((t1-tspan(1,1))/B,Q,'g','LineWidth',1) axis([0 3 0 70]); title('MOUSE SPERMATOZOA'); xlabel('TIEMPO/MIN');

ANEXO PROGRAMAS

378

ylabel('FLUJO VOLUMENTRICO DE AGUA(micras^3/min)'); hold on; end clear Q1; clear Q2; clear Q3; end end Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1. Los subprogramas enfr_id_cuadrático y enfr_id_exponencial son los mismos que los del apartado 3.

ANEXO PROGRAMAS

379

APARTADO 11 PROGRAMA PRINCIPAL %*********************************************************************************** % Programa que permite calcular la evolución de % el subenfriamiento con la temperatura para un protoco de enfriamiento lineal % a trozos.El número de etapas de enfriamiento a 30ºC/min y de temperatura constante % es igual a 4. El subenfriamiento máximo admisible es de 5ºC. %************************************************************************************ Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux%DATO:moles iniciales de crioprotector if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón % Calculamos la curva de descenso crioscópico y %la temperatura inicial de cambio de fase Tini [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Tini=interp1(V0,t0,1); Ti=Tini; Vini=Vi; for B=[-30]%la velocidad de enfriamiento lineal es de 30ºC/min tm0=0; To=273; %Iniciamos el bucle del protocolo. for wert=1:1:5 %Llamamos a la función subenfr_limite_X, que nos va a proporcionar: %1. Intervalo de temperatura de la etapa de enfriamiento lineal con la % condición de que el subenfriamiento esté por debajo de los XºC, en el % vector Tspan. %2. Los volúmenes de la célula, que cumplen la condición de un subenfriamiento % por debajo de los XºC, en el vector V. %3.La evolución del subenfriamiento durante esta etapa de enfriamiento lineal, % en el vector subenfr. %4.La dimensión de los vectores Tspan,V y subenfr, que es igual en todos. X=5; [Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]); %Llamamos a la función Tramo_Tcte, que nos va a proporcionar: %1. La evolución del volumen celular en la etapa de temperatura constante, en el % vector Vol. %2. El intervalo de tiempo de la etapa de temperatura constante, con la condición % de que el volumen al final de esta etapa sea al menos el 95% del volumen de % equilibrio marcado por la curva de descenso crioscópico a la temperatura % constante a la que se lleva a cabo esta etapa del protocolo, en el vector time. %3. La dimensión de los vectores Vol y time, que es la misma. [Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]); %Dibujamos los resultados numéricos obtenidos hasta ahora.No dibujamos las lineas %verticales de las etapas a temperatura constante, eso lo hacemos manualmente. %Esta es la razón por la que el bucle tiene 5 etapas a pesar de que tan solo %buscamos ejecutar 4. Necesitamos una etapa adicional de enfriamiento para saber %donde termina la anterior etapa de temperatura constante. plot(Tspan-273,subenfr,'r') title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC');

ANEXO PROGRAMAS

380

ylabel('SUBENFRIAMIENTO'); hold on; axis([-55 0 0 5]); clear subenfr; %Las condiciones iniciales para la siguiente etapa de enfriamiento lineal a 30ºC/min %son las condiciones finales de la etapa anterior. Tini=Tspan(dim1) Vini=Vol(dim2) end %Calculamos también la evolución del subenfriamiento cuando no tenemos %en cuenta las etapas a temperatura constante. Tspan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; %Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden %con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración %de las ecuaciones de deshidratación. s1=interp1(y0,t0,y1); %Calculamos los subenfriamientos. subenfr1=s1-t1; plot(t1-273,subenfr1,'b') end end clear all; El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

381

SUBPROGRAMA subenfr_limite_X function [T,V,subenfr,max]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,Vmcpa) %********************************************************************************** %Subprograma que se encarga de obtener la evolución del volumen V,la temperatura T %y el subenfriamiento en un proceso de enfriamiento lineal a una velocidad %de enfriamiento B. La función además devuelve la dimensión de estos vectores %en la variable max.El subenfriamiento maximo es X. %********************************************************************************** if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0; end [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Tspan=[Tini 190]; %calculo la evolución del volumen durante el enfriamiento. options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vini,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; s1=interp1(y0,t0,y1); %De todos los valores calculados antes, solo me quedo con aquellos volumenes %que cumplan que el subenfriamiento esté por debajo de los XºC. i=1; while s1(i)-t1(i)<X i=i+1; end if s1(i)-t1(i)>X i=i-1; end %Genero a partir de los vectores totales, los vectores que a mi me interesan %es decir aquellos valores asociados a subenfriamientos menores de XºC. for k=1:1:i T(k)=t1(k); V(k)=y1(k); subenfr(k)=s1(k)-t1(k); end max=i; Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

382

SUBPROGRAMA Tramo_Tcte function [Vol,time,max]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,Vini,ncpa,Vmcpa) %****************************************************************************** %Subprograma que me permite calcular la evolución del volumen con el tiempo en %una etapa a temperatura constante.El programa también devuelve la dimensión %de los vectores volumen y tiempo. %****************************************************************************** if nargin<11 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<10 | isempty(ncpa) ncpa=0; end options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Veq=interp1(t0,y0,Tcte); %OJO:SIEMPRE ESTOY CONSIDERANDO QUE EL EQUILIBRIO SE ALCANZA ANTES DE 5 MINUTOS %calculo la evolución del volumen con respecto al tiempo en la etapa de temperatura cte %durante un periodo de 5 minutos. duracion=5; [t,y]=ode45('Tcte_id',[],Vini,options,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,duracion,[],ncpa,[]); V=y./Vi; n=size(t); vfinal=y(n(1,1)); %No todos lo valores calculados anteriormente, me interesan.Solo me interesan % los valores de volumen tal que el volumen de la célula sea el 99% del volumen %en el equilibrio para esa temperatura cte. i=1; while (V(i)>1.01*Veq/Vi & t(i)<10)%solo me interesan los valores por encima del 99.5% del %volumen de equilibrio siempre que se alcance en un tiempo %inferior a 10 minutos. Si el tiempo requerido es mayor nos quedamos con la %deshidratación alcanzada tras esos 10 minutos. i=i+1; if i>n i=i-1; break; end end for k=1:1:i Vol(k)=y(k); time(k)=t(k); end max=i;

ANEXO PROGRAMAS

383

SUBPROGRAMA Tcte_id function varargout=Tcte_id(t,y,flag,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiempoTcte,to,ncpa,Vmcpa) %**************************************************************************** %Subprograma que modela la ecuación diferencial que describe la evolución %de la deshidratación celular, durante una etapa de temperatura constante. %**************************************************************************** if nargin<14 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;% CASO GLICEROL. end if nargin<13 | isempty(ncpa) ncpa=0;%por defecto no hay crioprotector. end if nargin<12 | isempty(to) to=0;%el tiempo cuenta a partir de cero end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init(to,tiempoTcte); otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,ncpa,Vmcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(Tcte); Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/Tcte-1/Tgo))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. aux=(Lg*A*R*Tcte/VmA); sum=log((y-Vsol)/((y-Vsol)+VmA*nsol)); dydt=[aux*(SLf-sum)]; function [tspan,y0,options]=init(to,tiempoTcte) tspan=[to to+tiempoTcte]; y0=[3.1629*1e-17];%DATO esperma ratón options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

ANEXO PROGRAMAS

384

APARTADO 12 PROGRAMA PRINCIPAL %********************************************************************************** %Programa que permite calcular la evolución de %la deshidratación con la temperatura para un protocolo lineal a trozos, siendo %el número de etapas del protocolo un valor fijado por nosotros en la variable wert. %*********************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de glicerol aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux%DATO if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Tini=interp1(V0,t0,1); Ti=Tini; Vini=Vi; for B=[-30] tm0=0; To=273; for wert=1:1:4 X=5;%subenfriamiento límite [Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]); [Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]); plot(t0-273,V0,'b',Tspan-273,V/Vi,'r') hold on; plot(Tspan(dim1)-273,Vol(dim2)/Vi,'*r',Tspan(dim1)-273,V(dim1)/Vi,'*r') title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FRACCION VOLUMEN INICIAL'); hold on; axis([-55 0 0 1]); Tini=Tspan(dim1); Vini=Vol(dim2); end %también dibujamos la evolución con la temperatura de la deshidratación %sin incluir ninguna etapa a temperatura constante. options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; plot(t1-273,V1,':m','LineWidth',1) end end clear all; El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

385

Los subprogramas subenfr_limite_X y Tcte_id son los mismos que los del apartado 11.

ANEXO PROGRAMAS

386

APARTADO 13 PROGRAMA PRINCIPAL %********************************************************************************** %Programa que permite calcular la evolución de %la deshidratación con el tiempo para un protocolo lineal a trozos, estableciendo %el número de etapas del protocolo, en la variable wert. %********************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de glicerol aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Tini=interp1(V0,t0,1); Ti=Tini; Vini=Vi; for B=[-30]%perfil lineal a 30ºC/min tm0=0; To=273; for wert=1:1:4 X=5%subenfriamiento limite [Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]); [Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]); tm=(To-Tspan)/(-B); plot(tm0+tm,V/Vi,'r',tm0+tm(dim1)+time,Vol/Vi,'g') title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TIEMPO/min'); ylabel('FRACCION VOLUMEN INICIAL'); hold on; Tini=Tspan(dim1); Vini=Vol(dim2); tm0=tm0+time(dim2)+tm(dim1); To=Tspan(dim1); %Por pantalla mostramos: %1)el número de la etapa %2)tiempo en segundos necesarios en la etapa de enfriamiento lineal %3)tiempo en segundos necesarios en la etapa de temperatura cte %4)temperatura al final del la etapa enfriamiento+Tcte %5)tiempo acumulado en minutos [wert,tm(dim1)*60,time(dim2)*60,Tspan(dim1)-273,tm0] end %tambien dibujamos la evolución temporal de la deshidratacion sin incluir %ninguna etapa a temperatura constante. options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; tm1=(273-t1)/(-B); plot(tm1,V1,'b:','LineWidth',1) end end clear all;

ANEXO PROGRAMAS

387

Los subprogramas subenfr_limite_X y Tcte_id son los mismos que los del apartado 11. Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

388

APARTADO 14 PROGRAMA PRINCIPAL %***************************************************************************** % Programa que permite calcular la evolución de % el subenfriamiento con el tiempo para un protoco de enfriamiento lineal % a trozos, donde el número de etapas del protocolo no viene fijado a priori % sino que serán las necesarias para llegar a los –40ºC %****************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0 1]; num=size(CMcpa); aux=CMcpa*Vi*1000; conta=1; for ncpa=aux%DATO:moles iniciales de crioprotector if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Tini=interp1(V0,t0,1); Ti=Tini; Vini=Vi; for X=[2]%FIJAMOS EL SUBENFRIAMIENTO MAXIMO ADMISIBLE DEL PROTOCOLO. for B=[-30]%la velocidad de enfriamiento lineal es de 30ºC/min tm0=0; To=273; cont=0; Tini=Ti; Vini=Vi; while Tini>233 & cont<20% el protocolo como maximo tendrá 20 etapas %y tendrá menos si alcanza los -40ºC antes. [Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]); [Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]); %calculamos las temperaturas de la curva de equilibrio asociadas a %los volúmenes que son numericamente iguales a los proporcionados por %la funcion Tramo_Tcte. t0p=interp1(y0,t0,Vol); %calculo el subenfriamento en la etapa a temperatura cte subenfr2=t0p-Tspan(dim1); %Calculo el vector de tiempos de la etapa de enfriamiento a partir del %vector de temperaturas. tm=(To-Tspan)/(-B); subplot(num(1,2),1,conta),plot(tm0+tm,subenfr,'r',tm0+tm(dim1)+time,subenfr2,'g') hold on; axis([0 20 0 6]); clear subenfr; Tini=Tspan(dim1); Vini=Vol(dim2); tm0=tm0+time(dim2)+tm(dim1); To=Tspan(dim1); %Por pantalla mostramos: %1)el número de la etapa %2)tiempo en segundos necesarios en la etapa de enfriamiento lineal %3)tiempo en segundos necesarios en la etapa de temperatura cte %4)temperatura al final del la etapa enfriamiento+Tcte %5)tiempo acumulado en minutos [cont+1,tm(dim1)*60,time(dim2)*60,Tspan(dim1)-273,tm0]

ANEXO PROGRAMAS

389

cont=cont+1; end %Calculamos también la evolución del subenfriamiento cuando no tenemos %en cuenta las etapas a temperatura constante. Tspan1=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan1,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; %Obtenemos las temperaturas en la curva de equilibrio, que corresponden %con volumenes que son numéricamnete iguales a los dados por la integración %de las ecuaciones de deshidratación. s1=interp1(y0,t0,y1); %Calculamos los subenfriamientos. subenfr1=s1-t1; %calculamos el vector de tiempos a partir del vector de temperaturas tm2=(273-t1)/(-B); plot(tm2,subenfr1,'b') hold on; end%fin del bucle de velocidad end%fin del buble de subenfriamiento max conta=conta+1; end%fin del bucle de crioprotector clear all;

Los subprogramas subenfr_limite_X y Tcte_id son los mismos que los del apartado 11. Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

390

APARTADO 15 PROGRAMA PRINCIPAL %**************************************************************************************** % Programa que permite comparar la deshidratación con respecto a la temperatura para % el caso ideal y no ideal, para un perfil de enfriamiento lineal en espermatozoides % de ratón. %**************************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti_id=interp1(V0,t0,1); options00=odeset('Events','on','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t00,y00,TE,YE,IE]=ode15s('enfr_NOid_integrado',[],Vi,options00,-.00001,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V00=y00/Vi; Ti_NOid=min(TE); plot(t0-273,V0,'g',t00-273,V00,'r') hold on; for B=[-5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 -55 -60] Tspan_id=[Ti_id 190]; Tspan_NOid=[Ti_NOid 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_integrado',Tspan_id,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t2,y2]=ode15s('enfr_NOid_integrado',Tspan_NOid,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; V2=y2./Vi; w1=interp1(t1,y1,t2); V1p=w1./Vi; plot(t1-273,V1,'b',t2-273,V2,'ko','LineWidth',1,'MarkerSize',4) axis([-55 0 0 1]); hold on; Z=abs(100*(V1p-V2)./V2); s=size(y2); dim=s(1,1); [Ymax I]=max(Z); [Ymax t2(I)-273] end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');


ANEXO PROGRAMAS

391

SUBPROGRAMA enfr_NOid_lineal function varargout=enfr_NOid_lineal(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) %******************************************************************************** % Subprograma que modela la ecuación diferencial no ideal que muestra la deshidratación % celular cuando el sistema es sometido a un perfil de enfriamiento lineal %******************************************************************************** if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL. end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5); function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) MA=18; R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lg=(Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5)); VmA=18*1e-6; v2=2; Vm2=2.69611*1e-5; Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa); roA=1000; a=276*1e-12; alfa=6057.3147; beta=56.81071417*1e9; AT=alfa*t^(-1.5); BT=beta*t^(-.5); m2=n2/(roA*(y-Vsol)); mcpa=ncpa/(roA*(y-Vsol)); aux=(1+a*BT*sqrt(m2)); aux0=(Lg*A*R*t/(VmA*B)); sum1=(-AT*m2*sqrt(m2)/aux); sum2=(2*AT/(a^3*BT^3))*(.5*(aux-1)^2+log(aux)-aux); CTE=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa); dydt=[aux0*(SLf+.001*MA*v2*(sum1+sum2+m2+mcpa/v2)-CTE)];

ANEXO PROGRAMAS

392

SUBPROGRAMA CTEintegrar function y=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa) %*************************************************************************************** % Subprograma que permite calcular la constante de integración de la ecuación diferencial % de deshidratación no ideal %*************************************************************************************** if nargin<8 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL. end if nargin<7 | isempty(ncpa) ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector end VmA=18*1e-6;roA=1000;MA=18; v2=2; Vm2=2.69611*1e-5; Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa); a=276*1e-12; alfa=6057.3147; beta=56.81071417*1e9; Vref=Vi; [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa,Vmcpa); V0=y0./Vi; Tref=interp1(V0,t0,1); xAref=(Vref-Vsol)/(Vref-Vsol+VmA*(v2*n2+ncpa)); SLfref=integralLf(Tref); gammaref=1/xAref*exp(SLfref); aAref=xAref*gammaref; m2ref=n2/(roA*(Vref-Vsol)); mcparef=ncpa/(roA*(Vref-Vsol)); ATref=alfa*Tref^(-1.5); BTref=beta*Tref^(-.5); auxref=(1+a*BTref*sqrt(m2ref)); sum1ref=(-ATref*m2ref*sqrt(m2ref)/auxref); sum2ref=(2*ATref/(a^3*BTref^3))*(.5*(auxref-1)^2+log(auxref)-auxref); y=log(aAref)+.001*MA*v2*(sum1ref+sum2ref+m2ref+mcparef/v2);

ANEXO PROGRAMAS

393

APARTADO 16 PROGRAMA PRINCIPAL %**************************************************************************************** % Programa que permite comparar la deshidratación con respecto a la temperatura para % el caso ideal y no ideal, para un perfil de enfriamiento exponencial en espermatozoides % de ratón. %**************************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma raton n2=9.014*1e-15;%DATO esperma raton A=3.5394*1e-10;%DATO esperma raton CMcpa=[0];%concentración molar inicial de crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma raton E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma raton else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma raton E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma raton end Tgo=273.15;%DATO esperma raton [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti_id=interp1(V0,t0,1); options00=odeset('Events','on','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t00,y00,TE,YE,IE]=ode15s('enfr_NOid_exponencial',[],Vi,options00,-.00001,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V00=y00/Vi; Ti_NOid=min(TE); plot(t0-273,V0,'g',t00-273,V00,'r') hold on; for B=[-5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 -40 -45 -50 -55 -60] Tspan_id=[Ti_id 190]; Tspan_NOid=[Ti_NOid 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_exponencial',Tspan_id,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); [t2,y2]=ode15s('enfr_NOid_exponencial',Tspan_NOid,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; V2=y2./Vi; w1=interp1(t1,y1,t2); V1p=w1./Vi; if ncpa==0 plot(t1-273,V1,'b',t2-273,V2,'ko','LineWidth',1,'MarkerSize',4) else plot(t1-273,V1,'b',t2-273,V2,'ko','LineWidth',1,'MarkerSize',4) end axis([-55 0 0 1]); hold on; Z=abs(100*(V1p-V2)./V2); s=size(y2); dim=s(1,1); [Ymax I]=max(Z); [Ymax t2(I)-273] end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TEMPERATURA/ºC'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA');

ANEXO PROGRAMAS

394

El subprograma enfr_id_exponencial es el mismo que el del apartado 3.

ANEXO PROGRAMAS

395

Subprograma enfr_Noid_exponencial function varargout=enfr_NOid_exponencial(t,y,flag,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL. end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0;% por defecto no hay crioprotector end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5); function dydt=f(t,y,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa) MA=18; R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lg=(Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5)); VmA=18*1e-6; v2=2; Vm2=2.69611*1e-5; Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa); roA=1000; a=276*1e-12; alfa=6057.3147; beta=56.81071417*1e9; AT=alfa*t^(-1.5); BT=beta*t^(-.5); m2=n2/(roA*(y-Vsol)); mcpa=ncpa/(roA*(y-Vsol)); aux=(1+a*BT*sqrt(m2)); aux0=(Lg*A*R*t/(VmA*B*t/273)); sum1=(-AT*m2*sqrt(m2)/aux); sum2=(2*AT/(a^3*BT^3))*(.5*(aux-1)^2+log(aux)-aux); CTE=CTEintegrar(Vi,n2,A,ncpa,Vmcpa); dydt=[aux0*(SLf+.001*MA*v2*(sum1+sum2+m2+mcpa/v2)-CTE)];

El subprograma CTEintegrar es el mismo que el del apartado 15.

ANEXO PROGRAMAS

396

SECCIÓN 1.02 PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 5. LOS CRIOPROTECTORES

APARTADO 17 PROGRAMA PRINCIPAL %***************************************************************************** % Programa que permite calcular las dos etapas, primero la de deshidratación, % y luego la rehidratación con respecto al tiempo al añadir crioprotector. %***************************************************************************** Vi=1.87752*1e-13;% DATO óvulo de ratón no fertilizado A=184*1e-10;% DATO óvulo de ratón no fertilizado CM2=0.188;%DATO óvulo de ratón no fertilizado for CMcpap=[3] for CMcpanp=[0.3] Vmcpanp=2.15412*1e-4;%sacarosa MA=18;VmA=18*1e-6; v2=2;Vm2=1.66*1e-5; Vmcpap=7.28523*1e-5;%glicerol %PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL AGUA EN PRESENCIA DE GLICEROL if CMcpap==0 Lgo=0.43*1e-6;%DATO óvulo de ratón no fertilizado E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulo de ratón no fertilizado else Lgo=.215*1e-6;%DATO óvulo de ratón no fertilizado E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulo de ratón no fertilizado end Tgo=293;%DATO óvulo de ratón no fertilizado %PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL GLICEROL P=6*1e-6;%DATO óvulo de ratón no fertilizado %FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS [mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp); XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp; %FUNCIÓN QUE CALCULA LA DESHIDRATACIÓN INICIAL T=293;%temperatura a la que se añade el crioprotector tspan=[0 30];%intervalo de tiempo en minutos options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vi,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA); V=y./Vi; z=size(y); i=1; %dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 99.5% del volumen final, pues %la evolución es asintótica. while V(i)>1.005*V(z(1,1)) i=i+1; if i==z(1,1); break; end end for j=1:1:i tp1(j)=t(j); Vp1(j)=V(j); end plot(tp1,Vp1,'b') hold on; plot(t(i),V(i),'*r') hold on; [t(i)*60 V(i)] %FUNCIÓN QUE CALCULA LA REHIDRATACIÓN CELULAR tspan1=[t(i) 40]; y0=0; n2=v2*CM2*Vi*1000;

ANEXO PROGRAMAS

397

Smex=mB+mcpap+mcpanp; [t1 y1]=ode45('rehidrata',tspan1,y0,options,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap); V1=(n2+y1)/(MA/(1000*VmA)*Smex)+n2*Vm2+y1*Vmcpap; dim=size(V1); V1(dim(1,1))/Vi plot(t1,V1/Vi,'r') hold on; clear tp1; clear Vp1; end end clear all;

ANEXO PROGRAMAS

398

SUBPROGRAMA ConversionConc function [mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp) %**************************************************************************************** % Subprograma que permite pasar valores de concentración dados en concentraciones molares % a molalidades, y fracciones molares %**************************************************************************************** if nargin<5 | isempty(Vmcpanp) Vmcpanp=2.15412*1e-4;%CASO SACAROSA end if nargin<4 | isempty(Vmcpap) Vmncpap=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end Vm2=1.66*1e-5; v2=2; VmA=18*1e-6; MA=18; nA=(1e-3-v2*CM2*Vm2-CMcpap*Vmcpap-CMcpanp*Vmcpanp)/VmA; %MOLALIDADES masaA=nA*MA/1000; mB=v2*CM2/masaA; mcpap=CMcpap/masaA; mcpanp=CMcpanp/masaA; %FRACCIONES MOLARES ntot=CM2*v2+CMcpap+CMcpanp+nA; XB=CM2*v2/ntot; Xcpap=CMcpap/ntot; Xcpanp=CMcpanp/ntot;

ANEXO PROGRAMAS

399

SUBPROGRAMA deshid_inicial function varargout=deshid_inicial(t,y,flag,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA) %************************************************************************** % Subprograma que modela la ecuación diferencial que describe % la deshidratación celular en el instante justamente posterior de añadir % crioprotector tanto permeable, como no permeable al medio extracelular %************************************************************************** switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA) R=8.3143; Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/T-1/Tgo))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; n2=CM2*Vi*1000; nsol=n2*v2;% moles de sal Vsol=n2*Vm2;% volumen de sal aux=(Lg*A*R*T/VmA); dydt=[aux*(log(XA)-log((y-Vsol)/(y-Vsol+nsol*VmA)))]; function [tspan,y0,options]=init tspan=[0 60]; y0=[1.87752*1e-13]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

ANEXO PROGRAMAS

400

SUBPROGRAMA rehidrata function varargout=rehidrata(t,y,flag,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap) % ********************************************************************************** % Subprograma que modela la ecuación diferencial que describe % la rehidratación celular al añadir crioprotector permeable cuando aplicamos un % perfil de enfriamiento lineal % ********************************************************************************** if nargin<8 | isempty(Vmcpap) Vmcpap=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,flag,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,flag,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap) R=8.3143; VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5; dydt=[1000*P*A*(mcpap-Smex*y/(n2+y))]; function [tspan,y0,options]=init tspan=[0 180]; y0=[0]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

ANEXO PROGRAMAS

401

APARTADO 18 PROGRAMA PRINCIPAL %******************************************************************************** % Programa que permite calcular el protocolo de adición de crioprotector, % calculando primeramente la deshidratación con respecto al tiempo al añadir % crioprotector, en varias etapas, y posteriormente calcular la rehidratación % también en varias etapas, ambas fijadas por nosotros a priori. %********************************************************************************* %DATOS NUMÉRICOS Vi=1.87752*1e-13;% DATO óvulos de ratón no fertilizados A=184*1e-10;% DATO óvulos de ratón no fertilizados VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;v2=2; Vmcpap=7.28523*1e-5;%glicerol Vmcpanp=2.15412*1e-4;%sacarosa T=293;%temperatura a la que añadimos los crioprotectores CM2=0.188;%DATO óvulos de ratón no fertilizados CMcpap=3; CMcpanp=.3; etapasCPAnp=3; pasoCPAnp=CMcpanp/etapasCPAnp; etapasCPAp=10; pasoCPAp=CMcpap/etapasCPAp; if CMcpanp>0 [Vfinal1,tfinal1]=ProtoAdicCPAnp(Vi,A,CM2,CMcpanp,pasoCPAnp,T,Vmcpap,Vmcpanp); end if CMcpap>0 if CMcpanp==0 V0=Vi; t0=0; else V0=Vfinal1; t0=tfinal1; end [Vfinal2,tfinal2]=ProtoAdicCPAp(Vi,A,V0,t0,CM2,CMcpanp,CMcpap,pasoCPAp,T,Vmcpap,Vmcpanp); end %******************************************** %FUNCIÓN QUE CALCULA LA REHIDRATACIÓN CELULAR %******************************************** %PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL GLICEROL P=6*1e-6; óvulos de ratón no fertilizados %FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS [mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp); Smex=mB+mcpap+mcpanp; %INTERVALO DE INTEGRACIÓN if CMcpap==0 tspan1=[tfinal1 30]; else tspan1=[tfinal2 30]; end %CONDICIÓN INICIAL:no hay glicerol en el interior de la célula y0=0; n2=v2*CM2*Vi*1000; %INTEGRACIÓN PARA CALCULAR LA REHIDRATACIÓN options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1 y1]=ode45('rehidrata',tspan1,y0,options,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap); V1=(n2+y1)/(MA/(1000*VmA)*Smex)+n2*Vm2+y1*Vmcpap; plot(t1,V1/Vi,'r') hold on; %******************************************* %* DESHIDRATACIÓN-REHIDRATACIÓN SIN ETAPAS *

ANEXO PROGRAMAS

402

%******************************************* XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp; if CMcpap==0 Lgo=0.43*1e-6;%DATO óvulos de ratón no fertilizados E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulos de ratón no fertilizados else Lgo=.215*1e-6;%DATO óvulos de ratón no fertilizados E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO óvulos de ratón no fertilizados end Tgo=293;%DATO óvulos de ratón no fertilizados %ETAPA DE DESHIDRATACIÓN tspan=[0 30];%intervalo de tiempo en minutos options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vi,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA); V=y./Vi; %dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 99.5% del volumen final, pues %la evolución es asintótica. z=size(y); i=1; while V(i)>1.005*V(z(1,1)) i=i+1; if i==z(1,1); break; end end for j=1:1:i tp1(j)=t(j); Vp1(j)=V(j); end plot(tp1,Vp1,'b') hold on; %ETAPA DE REHIDRATACIÓN tspan=[t(i) 30]; y0=0; n2=v2*CM2*Vi*1000; [t1 y1]=ode45('rehidrata',tspan,y0,options,P,A,n2,mcpap,Smex,Vmcpap); V1=(n2+y1)/(MA/(1000*VmA)*Smex)+n2*Vm2+y1*Vmcpap; plot(t1,V1/Vi,'r') hold on; %FIN DEL PROGRAMA clear all;

Los subprogramas ConversionConc, deshid_inicial, y rehidrata son los mismos que los del apartado 17.

ANEXO PROGRAMAS

403

SUBPROGRAMA ProtoAdicCPAnp %************************************************************** %PROTOCOLO ESCALONADO DE ADICIÓN DEL CRIOPROTECTOR NO PERMEABLE %************************************************************** function [Vfinal,tfinal]=ProtoAdicCPAnp(Vi,A,CM2,CMcpanp,paso,T,Vmcpap,Vmcpanp) CMcpap=0; CM=paso; ti=0; Vini=Vi; while CM<=CMcpanp %FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS [mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CMcpap,CM,Vmcpap,Vmcpanp); XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp; %FUNCIÓN QUE CALCULA LA DESHIDRATACIÓN POR ADICION DEL CRIOPROTECTOR NO PERMEABLE tspan=[ti 30];%intervalo de tiempo en minutos %permeabilidad de la membrana al agua sin presencia de CPA permeable Lgo=0.43*1e-6;%DATO E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO Tgo=293;%DATO options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vini,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA); V=y./Vi; z=size(y); i=1; %dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 95% del volumen final, pues %la evolución es asintótica. while V(i)>1.005*V(z(1,1)) i=i+1; if i==z(1,1); break; end end for j=1:1:i tp1(j)=t(j); Vp1(j)=V(j); end [t(i) V(i)] plot(tp1,Vp1,'g') hold on; plot(t(i),V(i),'*r') CM=CM+paso; ti=t(i); Vini=V(i)*Vi; clear tp1; clear Vp1; end Vfinal=Vini; tfinal=ti;

ANEXO PROGRAMAS

404

SUBPROGRAMA ProtoAdicCPAp %************************************************************** %PROTOCOLO ESCALONADO DE ADICIÓN DEL CRIOPROTECTOR PERMEABLE %************************************************************** function [Vfinal,tfinal]=ProtoAdicCPAp(Vi,A,V0,t0,CM2,CMcpanp,CMcpap,paso,T,Vmcpap,Vmcpanp) CM=paso; ti=t0; Vini=V0; while CM<=CMcpap %FUNCIÓN QUE CALCULA LAS MOLALIDADES Y FRACCIONES MOLARES DE LOS SOLUTOS [mB,mcpap,mcpanp,XB,Xcpap,Xcpanp]=ConversionConc(CM2,CM,CMcpanp,Vmcpap,Vmcpanp); XA=1-XB-Xcpap-Xcpanp; %FUNCIÓN QUE CALCULA LA DESHIDRATACIÓN POR ADICION DEL CRIOPROTECTOR PERMEABLE tspan=[ti 30];%intervalo de tiempo en minutos %PERMEABILIDAD DE LA MEMBRANA AL AGUA EN PRESENCIA DE GLICEROL Lgo=.215*1e-6;%DATO E_Lgo=58.6152*1e3;%DATO Tgo=293;%DATO options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t,y]=ode45('deshid_inicial',tspan,Vini,options,Vi,CM2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,T,XA); V=y./Vi; z=size(y); i=1; %dibujo la deshidratación hasta que alcanza el 99.5% del volumen final, pues %la evolución es asintótica. while V(i)>1.005*V(z(1,1)) i=i+1; if i==z(1,1); break; end end for j=1:1:i tp1(j)=t(j); Vp1(j)=V(j); end [t(i) V(i)] plot(tp1,Vp1,'c') hold on; plot(t(i),V(i),'or') hold on; CM=CM+paso; ti=t(i); Vini=V(i)*Vi; clear tp1; clear Vp1; end Vfinal=Vini; tfinal=ti;

ANEXO PROGRAMAS

405

APARATADO 19 PROGRAMA PRINCIPAL %***************************************************************************** % Programa que permite calcular la deshidratación celular con respecto al tiempo % en una etapa de temperatura constante %***************************************************************************** Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón Tcte=263;%TEMPERATURA A LA QUE SE LLEVA A CABO LA DESHIDRATACIÓN. tiempoTcte=3;%DURACIÓN DE ETAPA A T CTE EN MINUTOS. options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); CMcpa=[0 0.5 1 2]; aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); Veq=interp1(t0,y0,Tcte); for B=[-30] Tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); Vo=interp1(t1,y1,Tcte); [t2,y2]=ode45('Tcte_id',[],Vo,options,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tcte,tiempoTcte,[],ncpa,[]); V2=y2./Vi; if ncpa==0 plot(t2,V2,'b','LineWidth',1) else plot(t2,V2,'g','LineWidth',1) end hold on; n=size(t2); Vfinal=y2(n(1,1)); plot(t2,t2.*Veq./(Vi*t2),'r:') hold on; end end title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TIEMPO/MIN'); ylabel('FRACCIÓN DEL VOLUMEN INICIAL DE AGUA'); Veq/Vi clear all;

Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1. El subprograma Tcte_id es el mismo que el del apartado 11.

ANEXO PROGRAMAS

406

APARTADO 20 PROGRAMA PRINCIPAL %********************************************************************************* %Programa que permite calcular la evolución de %la deshidratación con el tiempo para un protocolo lineal a trozos. El número %de etapas del protocolo no es fija, sino las necesarias para llegar a los -40ºC %siempre que el número de etapas necesarias sea inferior a 20. %********************************************************************************* Vi=3.1629*1e-17;%DATO esperma ratón n2=9.014*1e-15;%DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;%DATO esperma ratón CMcpa=[0 1 2 5]; aux=CMcpa*Vi*1000; for ncpa=aux if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Tini=interp1(V0,t0,1); Ti=Tini; Vini=Vi; for B=[-30]%perfil lineal a 30ºC/min tm0=0; To=273; cont=0; while Tini>233 & cont<20% el protocolo como maximo tendrá 20 etapas y tendrá %menos si alcanza los -40ºC antes. X=5;%subenfriamiento limite [Tspan,V,subenfr,dim1]=subenfr_limite_X(X,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tini,Vini,ncpa,[]); [Vol,time,dim2]=Tramo_Tcte(B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,Tspan(dim1),V(dim1),ncpa,[]); tm=(To-Tspan)/(-B); plot(tm0+tm,V/Vi,'r',tm0+tm(dim1)+time,Vol/Vi,'g') title('ESPERMATOZOIDE DE RATÓN'); xlabel('TIEMPO/min'); ylabel('FRACCION VOLUMEN INICIAL'); hold on; Tini=Tspan(dim1); Vini=Vol(dim2); tm0=tm0+time(dim2)+tm(dim1); To=Tspan(dim1); %Por pantalla mostramos: %1)el número de la etapa %2)tiempo en segundos necesarios en la etapa de enfriamiento lineal %3)tiempo en segundos necesarios en la etapa de temperatura cte %4)temperatura al final del la etapa enfriamiento+Tcte %5)tiempo acumulado en minutos [cont+1,tm(dim1)*60,time(dim2)*60,Tspan(dim1)-273,tm0] %actualizamos el contador de etapas cont=cont+1; end %tambien dibujamos la evolución temporal de la deshidratacion sin incluir %ninguna etapa a temperatura constante. options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi;

ANEXO PROGRAMAS

407

tm1=(273-t1)/(-B); plot(tm1,V1,':m','LineWidth',1) end end clear all;


El subprograma Tcte_id es el mismo que el del apartado 11, salvo que ahora dejamos que el sistema evolucione a temperatura constante hasta que alcanzamos el 99.5% del volumen de equilibrio, mientras que en apartado 11 recordamos llegábamos al 99%. El subprograma subenfr_limite_X es el mismo que el del apartado 11.

ANEXO PROGRAMAS

408

SECCIÓN 1.03 PROGRAMAS DEL CAPÍTULO 6. EL LÍMITE DE SOLUBILIDAD

APARTADO 21 PROGRAMA PRINCIPAL %*********************************************************************************** % Programa que permite calcular la curva de descenso crioscópico y % la curva de solubilidad para una disolución acuosa de cloruro sódico %************************************************************************************ n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; for ncpa=[0]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. [t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); XB=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/251.8)); Z=size(t0); %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD i=1; A=XB(i)-ysol(i); B=XB(i+1)-ysol(i+1); while sign(B)==sign(A) i=i+1; if i>=Z(1,2) break; end A=XB(i)-ysol(i); B=XB(i+1)-ysol(i+1); end X1=1/(ysol(i)-ysol(i+1)); X2=1/(XB(i)-XB(i+1)); fracmasat=(ysol(i)*X1-XB(i)*X2)/(X1-X2); Tsat=t0(i)+(t0(i)-t0(i+1))*X2*(fracmasat-XB(i)); [fracmasat*100 Tsat-273] %escogemos la parte de las curvas que están por encima de el punto de intersección for j=2:1:Z(1,2)-i+1 XBp(j)=XB(j-1+i); ysolp(j)=ysol(j-1+i); t0p(j)=t0(j-1+i); end %Añadimos el punto de intersección calculado, a las curvas de solubilidad y de %descenso crioscópico. ZZ=size(XBp); XBp(1)=fracmasat; ysolp(1)=fracmasat; t0p(1)=Tsat; %Dibujamos las curvas if ncpa==0 plot(XBp*100,t0p-273,'r',ysolp*100,t0p-273,'b',XB*100,t0-273,'r:',ysol*100,t0-273,'b:') axis([0 80 -40 0]); hold on; else plot(XBp*100,t0p-273,'r:',ysolp*100,t0p-273,'b:') axis([0 80 -40 0]); hold on; end end

ANEXO PROGRAMAS

409

clear all;

ANEXO PROGRAMAS

410

SUBPROGRAMA Descrio_id_integra1 function [t,y]=DescCrio_integra1(Vi,n2,ncpa,Vmcpa) %******************************************************************************* % Programa que describe la curva de descenso crioscópico de una solución acuosa %******************************************************************************* if nargin<4 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5; end if nargin<3 | isempty(ncpa) ncpa=0; end R=8.3143; v2=2; Vm2=1.66*1e-5; VmA=18*1e-6; Vsol=n2*Vm2+ncpa*Vmcpa; nsol=(v2*n2+ncpa); a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273; fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R; fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R; fact3=(c+3*d*z)/R; fact4=d/(2*R); T=[190:1:274]; To=273; integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2-To^2); Q=exp(integralLf); V_eq=Vsol+(Q./(1-Q))*nsol*VmA; t=T; y=V_eq;

ANEXO PROGRAMAS

411

APARTADO 22 PROGRAMA PRINCIPAL %************************************************************************** % Programa que permite calcular la evolución de la deshidratación celular % sin que alcancemos el límite de solubilidad del cloruro sódico %************************************************************************** n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa); XB=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/251.8));%curva de solubilidad if ncpa==0 plot(XB*100,t0-273,'r',ysol*100,t0-273,'b') axis([0 35 -30 0]); hold on; else plot(XB*100,t0-273,'r:',ysol*100,t0-273,'b:') axis([0 35 -30 0]); hold on; end %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD i=1; Z=size(t0); a=XB(i)-ysol(i); b=XB(i+1)-ysol(i+1); while sign(a)==sign(b) i=i+1; if i>=Z(1,2) break; end a=XB(i)-ysol(i); b=XB(i+1)-ysol(i+1); end X1=1/(ysol(i)-ysol(i+1)); X2=1/(XB(i)-XB(i+1)); fracmasat=(ysol(i)*X1-XB(i)*X2)/(X1-X2); Tsat=t0(i)+(t0(i)-t0(i+1))*X2*(fracmasat-XB(i)); [fracmasat*100 Tsat-273] [t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V00=y00./Vi; Ti=interp1(V00,t00,1); for B=[-30]% velocidades de enfriamiento options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); tspan=[Ti 190] [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); X=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA); Xsat=interp1(t1,X,Tsat); dim=size(X); j=1; while X(j)<Xsat

ANEXO PROGRAMAS

412

j=j+1; if j>dim(1,1) break; end end [X(j-1) Xsat X(j)] for k=1:1:j-1 Xp(k)=X(k); t1p(k)=t1(k); end Xp(k+1)=Xsat; t1p(k+1)=Tsat; if ncpa==0 plot(Xp*100,t1p-273,'k',Xsat*100,Tsat-273,'r*',X*100,t1-273,'k:') axis([0 35 -30 0]); hold on; else plot(X*100,t1-273,'k:') axis([0 35 -30 0]); hold on; end clear Xp; clear t1p; end end clear all;

El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado 21. Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1.

ANEXO PROGRAMAS

413

APARTADO 23 PROGRAMA PRINCIPAL %********************************************************************************** % Programa que permite calcular la evolución del subenfriamiento del medio % intracelular cuando el crecimiento de cristales de hielo es lento %********************************************************************************** n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón %CALCULAMOS EL PUNTO EUTÉCTICO Y LA TEMPERATURA INICIAL DE CAMBIO DE %FASE Ti [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); X0=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); [Xeut Teut]=intersec_solub(t0,X0); for B=[-30] [Tp1,Xp1,Xp1f]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); t00=interp1(X0,t0,Xp1); subenfr1=t00-Tp1; dim=size(Tp1) Tp1f=Teut; Tspan=[Tp1f:-1:190] tam=size(Tspan); subenfr(1)=0; for i=[2:1:tam(1,2)] subenfr(i)=subenfr(i-1)+abs(Tspan(i)-Tspan(i-1)); end plot(Tp1-273,subenfr1,'k',Tspan-273,subenfr) axis([-55 0 0 30]); hold on; Tespan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tespan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; t=interp1(y0,t0,y1);%Calculo una nueva curva de descenso crioscópico subenfr=t-t1; plot(t1-273,subenfr,'k:') axis([-55 0 0 30]); clear Xp1; clear Tp1; clear subenfr; end end clear all;

ANEXO PROGRAMAS

414


ANEXO PROGRAMAS

415

SUBPROGRAMA Desh_Etapa_1 function [t1p,Xp,Xsat]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Tsat,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa) %********************************************************************************** % Programa que permite calcular la evolución de la fracción másica de sal con % respecto a la temperatura cuando aún no se han alcanzado las condiciones de saturación %*********************************************************************************** if nargin<12 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<10 | isempty(ncpa) ncpa=0; end VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); tspan=[Ti 190]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); X=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA); %plot(X*100,t1-273,'k:'); hold on; Xsat=interp1(t1,X,Tsat); dim=size(X); j=1; while X(j)<Xsat j=j+1; if j>dim(1,1) break; end end [X(j-1) Xsat X(j)]; for k=1:1:j-1 Xp(k)=X(k); t1p(k)=t1(k); end Xp(k+1)=Xsat; t1p(k+1)=Tsat;

ANEXO PROGRAMAS

416

APARTADO 24 PROGRAMA PRINCIPAL %********************************************************************************* % Programa que permite calcular la evolución de la deshidratación cuando la % velocidad de formación de hielo es instantánea %********************************************************************************* n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón [t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa); XB=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/251.8));%curva de solubilidad if ncpa==0 plot(XB*100,t0-273,'r',ysol*100,t0-273,'b') axis([0 35 -30 0]); hold on; else plot(XB*100,t0-273,'r:',ysol*100,t0-273,'b:') axis([0 35 -30 0]); hold on; end %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD [Xeut Teut]=intersec_solub(t0,XB); %CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN [t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V00=y00./Vi; Ti=interp1(V00,t00,1); for B=[ -30] [Tp1,Xp1,Xp1f]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); Tp1f=Teut; [Tp2,Xp2,dim2]=Desh_Etapa_2(B,Tp1f,Xp1f,Xeut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); if ncpa==0 plot(Xp1*100,Tp1-273,'k',Xp1f*100,Teut-273,'r*') hold on; plot(Xp2*100,Tp2-273,'g',Xp2(dim2)*100,Tp2(dim2)-273,'r*',Xp2(dim2)*100,190-273,'c') axis([0 35 -30 0]); hold on; else plot(Xp1*100,Tp1-273,'k:') axis([0 35 -30 0]); hold on; end [Xp1f*100 Teut-273 Xp2(dim2)*100 Tp2(dim2)-273]%punto de interseccion clear Xp1,Xp2; clear Tp1,Tp2; end end

ANEXO PROGRAMAS

417

clear all;

El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado 1. El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado 21. El subprograma Desh_Etapa_1 es el mismo que el del apartado 23.

ANEXO PROGRAMAS

418

SUBPROGRAMA Desh_Etapa_2 function [Tp2,Xp2,dim2]=Desh_Etapa_2(B,Tp1f,Xp1f,Xeut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa) %********************************************************************************* % Programa que permite calcular la deshidratación cuando la formación % de hielo es instantánea y estamos con temperatura impuesta constante %********************************************************************************* if nargin<13 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<12 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(ncpa) ncpa=0; end VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN nsol=(v2*n2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. Ti=Tp1f;tspan=[Ti 190]; Vo=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(Xp1f*MA);%volumen inicial para comenzar a integrar Veut=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(Xeut*MA); Xext=v2*n2*VmA/(Veut-Vsol+nsol*VmA); options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1 y1]=ode15s('enfr_id_lineal_sat',tspan,Vo,options,Veut,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); %pasamos los datos de volumen celular a fraccion masica de sal XB=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA); plot(XB*100,t1-273,'g:'); hold on; %calculo la intersección de esta curva con la de solubilidad [Xinter Tinter]=intersec_solub(t1,XB); %calculo los puntos de la curva de deshidratación que están por encima de la curva %de solubilidad dim=size(XB); j=1; while XB(j)<Xinter j=j+1; if j>dim(1,1) break; end end [XB(j-1) Xinter XB(j)]; for k=1:1:j-1 Xp2(k)=XB(k); Tp2(k)=t1(k); end W=size(Xp2); Xp2(W(1,2)+1)=Xinter; Tp2(W(1,2)+1)=Tinter; WW=size(Xp2); dim2=WW(1,2);

ANEXO PROGRAMAS

419

SUBPROGRAMA intersec_solub function [Xinter,Tinter]=intersec_solub(t,y) %********************************************************************************* % Programa que permite calcular el punto de intersección de una curva (t,y) % de deshidratación con la curva de solubilidad %********************************************************************************** R=8.3143; ysol=0.225*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t-1/251.8));%curva de solubilidad hold on; i=1; Z=size(t) if Z(1,1)==1 dimen=Z(1,2); else dimen=Z(1,1); end a=y(i)-ysol(i); b=y(i+1)-ysol(i+1); while sign(a)==sign(b) i=i+1; if i>=dimen break; end a=y(i)-ysol(i); b=y(i+1)-ysol(i+1); end X1=1/(ysol(i)-ysol(i+1)); X2=1/(y(i)-y(i+1)); Xinter=(ysol(i)*X1-y(i)*X2)/(X1-X2); Tinter=t(i)+(t(i)-t(i+1))*X2*(Xinter-y(i));

ANEXO PROGRAMAS

420

APARTADO 25 PROGRAMA PRINCIPAL %*********************************************************************************** % Programa que permite calcular la evolución del subenfriamiento con la temperatura % cuando la formación de hielo es instantánea. %*********************************************************************************** n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; for ncpa=[0 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón %CALCULAMOS EL PUNTO EUTÉCTICO Y LA TEMPERATURA INICIAL DE CAMBIO DE %FASE Ti [t0,y0]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V0=y0./Vi; Ti=interp1(V0,t0,1); X0=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); [Xeut Teut]=intersec_solub(t0,X0); for B=[-30] [Tp1,Xp1,Xp1f]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); t00=interp1(X0,t0,Xp1); subenfr1=t00-Tp1; Tp1f=Teut; [Tp2,Xp2,dim2]=Desh_Etapa_2(B,Tp1f,Xp1f,Xeut,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); t000=interp1(X0,t0,Xp2); subenfr2=t000-Tp2; Tspan=[Tp2(dim2):-1:190] tam=size(Tspan); subenfr(1)=subenfr2(dim2); for i=[2:1:tam(1,2)] subenfr(i)=subenfr(i-1)+abs(Tspan(i)-Tspan(i-1)); end plot(Tp1-273,subenfr1,'k',Tp2-273,subenfr2,'r',Tspan-273,subenfr) axis([-55 0 0 30]); hold on; Tespan=[Ti 190]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',Tespan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[]); V1=y1./Vi; t=interp1(y0,t0,y1);%Calculo una nueva curva de descenso crioscópico subenfr=t-t1; plot(t1-273,subenfr,'k:') axis([-55 0 0 30]); clear Xp1,Xp2; clear Tp1,Tp2; clear subenfr; end end

ANEXO PROGRAMAS

421

clear all;

Los subprogramas DescCrio_id_integrado y enfr_id_lineal son los mismos que los del apartado 1. El subprograma Desh_Etapa_1 es el mismo que el del apartado 23.

El subprograma Desh_Etapa_2 es el mismo que el del apartado 24.

ANEXO PROGRAMAS

422

APARTADO 26 PROGRAMA PRINCIPAL %*************************************************************************************** % Programa que permite dibujar las curvas de descenso crioscópico y las curvas de % solubilidad del cloruro sódico y del crioprotector. %*************************************************************************************** n2=9.014*1e-15;% DATO esperma ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; CMcpa=[0.4];%molaridad inicial del crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000%moles iniciales de crioprotector for ncpa=aux msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma ratón %Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las %distintas etapas de deshidratación. [Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa); end

ANEXO PROGRAMAS

423

SUBPROGRAMA Curva_Crioscopica function [Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2,Xtot1,t0,Xtot2,t1]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa) %*********************************************************************************** % Subprograma que permite calcular y dibujar las curvas de solubilidad, % la curva de descenso crioscópico, así como sus puntos de intersección. %*********************************************************************************** if nargin<5 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<4 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end VmA=18*1e-6;MA=18;%AGUA Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN R=8.3143; msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. %CALCULAMOS DESCENSO CRIOSCÓPICO SIN ESTAR LA SOLUCIÓN SATURADA [t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa); XB1=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); Xcpa1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); Xtot1=XB1+Xcpa1 %CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIALES ysol0=0.15*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo) %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIAL [XBeut01 Teut01]=intersec_solub(t0,XB1,ysol0); Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut01) Xcpaeut01=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando %estamos saturados en sal. Xtoteut01=XBeut01+Xcpaeut01; %CALCULAMOS LEYES DEFINITIVAS DE SOLUBILIDAD DE LA SAL ysol=XBeut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo) ysol1=Xtoteut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(dibujar) %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL DEFINITIVO [XBeut1 Teut1]=intersec_solub(t0,XB1,ysol); Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut1) Xcpaeut1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando %estamos saturados en sal. Xtoteut1=XBeut1+Xcpaeut1; %CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA %DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL dim=size(Xtot1); j=dim(1,2); while Xtot1(j)<Xtoteut1 j=j-1; if j==1 break; end end for k=1:1:dim(1,2)-j Xtot1p(k)=Xtot1(dim(1,2)+1-k); t0p(k)=t0(dim(1,2)+1-k); end Xtot1p(k+1)=Xtoteut1; t0p(k+1)=Teut1; %CALCULAMOS NUEVA LEY DE DESCENSO CRIOSCÓPICO PARA CUANDO LA SOLUCIÓN %EXTRACELULAR ESTÁ SATURADA EN SAL.

ANEXO PROGRAMAS

424

[t1,y1]=Desc_Crios_SatClNa(Vi,n2,ncpa,Teut1,XBeut1,Vmcpa,Mcpa); XB2=XBeut1; nB=(y1-ncpa*(Vmcpa/MA*VmA))./(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBeut1)/XBeut1); Vsol2=nB*Vm2+ncpa*Vmcpa; msol2=nB*M2+ncpa*Mcpa; Xcpa2=(ncpa*Mcpa/MA*VmA)./(y1-Vsol2+msol2*VmA/MA); Xtot2=XB2+Xcpa2; %CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR zsol=.63*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(cálculo) zsol1=(.63+XBeut1)*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(dibujar) %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA NUEVA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR [Xcpaeut2 Teut2]=intersec_solub(t1,Xcpa2,zsol); XBeut2=XBeut1; Xtoteut2=XBeut1+Xcpaeut2; %CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA %DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR dim=size(Xtot2); j=1; [Xtot2(1) Xtot2(j)] while Xtot2(j)<Xtoteut2 j=j+1; if j==dim(1,2) break; end end for k=1:1:j-1 Xtot2p(k)=Xtot2(k); t1p(k)=t1(k); end Xtot2p(k+1)=Xtoteut2; t1p(k+1)=Teut2; [Xtot2p t1p] %DIBUJAMOS LAS CURVAS DE DESCENSO CRIOSCÓPICO plot(Xtot1p*100,t0p-273,'r',Xtot1*100,t0-273,'r:') hold on; plot(ysol1*100,t0-273,'b',zsol1*100,t1-273,'g') hold on; plot(Xtoteut1*100,Teut1-273,'*k') hold on; plot(Xtot2p*100,t1p-273,'c',Xtot2*100,t1-273,'c:') hold on; plot(Xtoteut2*100,Teut2-273,'*k') axis([0 100 -100 0]); hold on;

El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado 21.

El subprograma intersec_solub es el mismo que el del apartado 24.

ANEXO PROGRAMAS

425

SUBPROGRAMA Desc_Crios_satClNa function [t,y]=Desc_Crios_SatClNa(Vi,n2,ncpa,Tsat,XBsat,Vmcpa,Mcpa) %******************************************************************************** % Subprograma que permite calcular los puntos de la curva de descenso crioscópico % cuando la solución está saturada en cloruro sódico. %******************************************************************************** if nargin<7 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<6 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end VmA=18*1e-6;MA=18;%AGUA Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN R=8.3143; a=6004.8;b=38.016;c=.11088;d=.00090432;z=273; fact1=(a-b*z-c*z^2-d*z^3)/R; fact2=(b+2*c*z+3*d*z^2)/R; fact3=(c+3*d*z)/R; fact4=d/(2*R); T=[Tsat:-1:170];%RANGO DE TEMPERATURAS DE LA CURVA To=273; integralLf=fact1*(1/To-1./T)+fact2*log(T./To)-fact3*(T-To)+fact4*(T.^2-To^2); XAin=exp(integralLf); K1=(ncpa*(Vmcpa-Mcpa/MA*VmA)); K2=(1+M2/MA*VmA/Vm2*(1-XBsat)/XBsat); num=((ncpa-K1/K2*v2/Vm2)*XAin*VmA+(ncpa-K1/K2*1/Vmcpa)*(1-XAin)*Vmcpa); den=((K2-1)/K2*(1-XAin)-(v2*XAin*VmA)/(Vm2*K2)); V_eq=num./den; t=T; y=V_eq;

ANEXO PROGRAMAS

426

APARTADO 27 PROGRAMA PRINCIPAL %******************************************************************************** % Programa que permirte calcular la evolución de la deshidratación celular % en presencia de crioprotectores sin que la solución esté saturada ni en ClNa % ni en crioprotector. %******************************************************************************** n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; CMcpa=[0.4];%molaridad inicial del crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000%moles iniciales de crioprotector for ncpa=aux msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón %Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las %distintas etapas de deshidratación. [Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa); %CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN [t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V00=y00./Vi; Ti=interp1(V00,t00,1); for B=[ -30] [Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa); Tp1f=Teut1; plot(Xp1*100,Tp1-273,'k') axis([0 100 -100 0]); hold on; clear Xp1; clear Tp1; end end clear all;

El subprograma DescCrio_id_integrado es el mismo que el del apartado 1. El subprograma Curva_Crioscopica es el mismo que el del apartado 26.

ANEXO PROGRAMAS

427

SUBPROGRAMA Desh_Etapa_1_ternario function [t1p,Xtotp]=Desh_Etapa_1(B,Ti,Tsat,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa) %************************************************************************************ % Subprograma que permite calcular la evolución de la fracción másica de soluto % cuando la solución aún no está saturada ni en ClNa ni en crioprotector %************************************************************************************ if nargin<12 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<10 | isempty(ncpa) ncpa=0; end VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. %CALCULO LA EVOLUCIÓN DEL VOLUMEN CELULAR SIN TENER EN CUENTA FACTORES DE %LÍMITES DE SOLUBILIDAD options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); tspan=[Ti 170]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); XB=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA); Xcpa=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA); Xtot=XB+Xcpa; plot(Xtot*100,t1-273,'k:'); hold on; %CALCULO LA COMPOSICIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR CUANDO SE ALCANZA LA TEMPERATURA %A LA CUAL EL MEDIO EXTRACELULAR QUEDA SATURADO EN SAL XBsat=interp1(t1,XB,Tsat); Xcpasat=interp1(t1,Xcpa,Tsat); Xtotsat=XBsat+Xcpasat; plot(Xtotsat*100,Tsat-273,'*k'); hold on; %CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA QUE QUEDA POR ENCIMA DE LA TEMPERATURA %A LA CUAL QUEDA SATURADA EN SAL LA SOLUCIÓN EXTRACELULAR dim=size(Xtot); dim(1,1) j=1; while Xtot(j)<Xtotsat j=j+1; if j>dim(1,1) break; end end [Xtot(j-1) Xtotsat Xtot(j)]; for k=1:1:j-1 Xtotp(k)=Xtot(k); t1p(k)=t1(k); end Xtotp(k+1)=Xtotsat; t1p(k+1)=Tsat;

ANEXO PROGRAMAS

428

APARTADO 28 PROGRAMA PRINCIPAL %******************************************************************************** % Programa que permite calcular la deshidratación celular hasta la segunda etapa % en presencia de crioprotectores. %******************************************************************************** n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL R=8.3143; CMcpa=[0.4];%molaridad inicial del crioprotector aux=CMcpa*Vi*1000%moles iniciales de crioprotector for ncpa=aux msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón %Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las %distintas etapas de deshidratación. [Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa); %CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN [t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V00=y00./Vi; Ti=interp1(V00,t00,1); for B=[ -30] [Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1_ternario(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); clear dim; [Tp2,Xp2,XBsat2,Xcpasat2,Tsat2]=Desh_Etapa_2_ternario(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); plot(Xp1*100,Tp1-273,'k') hold on; plot(Xp2*100,Tp2-273,'k:') axis([0 100 -100 0]); hold on; clear Xp1,Xp2; clear Tp1,Tp2; end end clear all;

El subprograma Curva_Crioscopica es el mismo que el del apartado 26.

El subprograma Desh_Etapa_1_ternario es el mismo que el del apartado 27.

ANEXO PROGRAMAS

429

SUBPROGRAMA Desh_Etapa_2_ternario function [t1p,Xtotp,XBsat,Xcpasat,Tsat]=Desh_Etapa_2(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa) %********************************************************************************* % Subprograma que me permite calcular la evolución de la fracción másica de soluto % durante la segunda etapa de deshidratación ante la presencia de crioprotectores. %********************************************************************************* if nargin<12 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<10 | isempty(ncpa) ncpa=0; end VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. %CALCULAMOS LA EVOLUCIÓN DE LA COMPOSICIÓN DEL MEDIO INTRACELULAR SUPONIENDO %QUE EXISTE SOLUBILIDAD INFINITA DE LOS SOLUTOS options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-24,'RelTol',1e-4); tspan=[Ti 170]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal',tspan,Vi,options,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa); XB=n2*VmA*M2/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA); Xcpa=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y1-Vsol+msol*VmA/MA); Xtot=XB+Xcpa; plot(Xtot*100,t1-273,'k:'); hold on; %CALCULAMOS LA INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN CELULAR CON LA CURVA DE %SOLUBILIDAD DE LA SAL R=8.3143; ysol=XBeut1*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t1-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL [XBsat Tsat]=intersec_solub(t1,XB,ysol); Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBsat); Xcpasat=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA); Xtotsat=XBsat+Xcpasat; plot(Xtotsat*100,Tsat-273,'*k') %CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA QUE QUEDA POR ENCIMA DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN %CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL dim=size(Xtot); j=1; while Xtot(j)<Xtotsat j=j+1; if j>dim(1,1) break; end end [Xtot(j-1) Xtotsat Xtot(j)]; for k=1:1:j-1 Xtotp(k)=Xtot(k); t1p(k)=t1(k); end Xtotp(k+1)=Xtotsat; t1p(k+1)=Tsat;

El subprograma enfr_id_lineal es el mismo que el del apartado 1.

El subprograma interec_solub es el mismo que el del apartado 24.

ANEXO PROGRAMAS

430

APARTADO 29 PROGRAMA PRINCIPAL %******************************************************************************** % Programa que permite calcular la deshidratación celular HASTA la tercera etapa % en presencia de crioprotectores. %******************************************************************************** n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL for ncpa=[1.26516*1e-14 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón %Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las %distintas etapas de deshidratación. [Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa); %CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN [t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V00=y00./Vi; Ti=interp1(V00,t00,1) for B=[-30]% velocidad de enfriamiento lineal %Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio %extracelular queda saturado en sal:Teut1 [Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1_ternario(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); %Deshidratación celular hasta que el medio intracelular queda saturado en sal [Tp2,Xp2,XBsat2,Xcpasat2,Tsat2]=Desh_Etapa_2_ternario(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); %Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio %extracelular queda saturado en crioprotector [Tp3,Xp3,Xcpa3]=Desh_Etapa_3_ternario(B,Tsat2,XBsat2,Teut2,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); plot(Xp1*100,Tp1-273,'k') hold on; plot(Xp2*100,Tp2-273,'k') hold on; plot(Xp3*100,Tp3-273,'g') axis([0 100 -100 0]); hold on; clear Xp1,Xp2,Xp3; clear Tp1,Tp2,Tp3; end end clear all;

El subprograma Curva_Crioscopica es el mismo que el del apartado 26.


ANEXO PROGRAMAS

431


ANEXO PROGRAMAS

432

SUBPROGRAMA Desh_Etapa_3_ternario function [t1p,Xtotp,Xcpa3]=Desh_Etapa_3_ternario(B,Tsat,XBsat,Teut2,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa) %********************************************************************************* % Subprograma que me permite calcular la evolución de la fracción másica de soluto % durante la tercera etapa de deshidratación ante la presencia de crioprotectores. %********************************************************************************* if nargin<12 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<11 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end if nargin<10 | isempty(ncpa) ncpa=0; end VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN nsol=(v2*n2+ncpa);%moles de soluto msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de soluto:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. %CALCULAMOS EL VOLUMEN INTRACELULAR INICIALDE LA 3ª ETAPA DE DESHIDRATACIÓN Vini=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBsat); %CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN CELULAR options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-26,'RelTol',1e-4); tspan=[Tsat 170]; [t1,y1]=ode15s('enfr_id_lineal_satClNa',tspan,Vini,options,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); XB=XBsat; nB=(y1-ncpa*(Vmcpa/MA*VmA))./(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBsat)/XBsat); Vsol2=nB*Vm2+ncpa*Vmcpa; msol2=nB*M2+ncpa*Mcpa; Xcpa=(ncpa*Mcpa/MA*VmA)./(y1-Vsol2+msol2*VmA/MA); Xtot=XB+Xcpa; plot(Xtot*100,t1-273,'g:'); hold on; %CALCULAMOS LA COMPOSICIÓN DE LA SOLUCIÓN INTRACELULAR CUANDO LA TEMPERATURA ES %IGUAL A LA QUE LA SOLUCIÓN EXTRACELULAR QUEDA SATURADA EN CRIOPROTECTOR Xcpa3=interp1(t1,Xcpa,Teut2); Xtot3=XB+Xcpa3; plot(Xtot3*100,Teut2-273,'*k'); hold on; %CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA QUE QUEDA POR ENCIMA DE LA TEMPERATURA %A LA CUAL LA SOLUCIÓN EXTRACELULAR QUEDA SATURADA EN CRIOPROTECTOR. dim=size(Xtot); j=1; while Xtot(j)<Xtot3 j=j+1; if j>dim(1,1) break; end end for k=1:1:j-1 Xtotp(k)=Xtot(k); t1p(k)=t1(k); end Xtotp(k+1)=Xtot3; t1p(k+1)=Teut2;

ANEXO PROGRAMAS

433

SUBPROGRAMA enfr_id_lineal_satClNa function varargout=enfr_id_lineal_satClNa(t,y,flag,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa) %********************************************************************************* % Programa que modela la ecuación diferencial que muestra la deshidratación % celular cuando el sistema es sometido a un perfil de enfriamiento lineal % en un medio intracelular saturado en cloruro sódico. %********************************************************************************* if nargin<14 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09; end if nargin<13 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end switch flag case '' varargout{1}=f(t,y,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa); case 'init' [varargout{1:3}]=init; otherwise error(['Unknown flag']); end function dydt=f(t,y,XBsat,B,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,Vmcpa,Mcpa) R=8.3143; SLf=integralLf(t); Lg=Lgo*exp(-E_Lgo/R*(1/t-1/Tgo))/(1.01325*1e5); VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;v2=2;M2=58.455; nsol=(n2*v2+ncpa);% moles de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. F=B;%perfil de enfriamiento lineal aux=(Lg*A*R*t/(VmA*F)); nB=(y-ncpa*(Vmcpa-Mcpa/MA*VmA))/(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBsat)/XBsat); XAin=(y-nB*Vm2-ncpa*Vmcpa)/(y-nB*(Vm2-v2*VmA)-ncpa*(Vmcpa-VmA)); dydt=[aux*(SLf-log(XAin))]; function [tspan,y0,options]=init tspan=[273 190]; y0=[3.1629*1e-17]; options=odeset('Events','off','AbsTol',1e-25,'RelTol',1e-5);

ANEXO PROGRAMAS

434

APARTADO 30 PROGRAMA PRINCIPAL %************************************************************************************ % Programa que permite calcular y dibujar la evolución del subenfriamiento a lo % largo de todo el proceso de deshidratación celular cuando hay presente crioprotectores. %************************************************************************************* n2=9.014*1e-15;% DATO esperma de ratón Vi=3.1629*1e-17;% DATO esperma de ratón A=3.5394*1e-10;% DATO esperma de ratón VmA=18*1e-6;MA=18; Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;%CASO SAL COMUN Vmcpa=7.28523*1e-5;Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL for ncpa=[1.26516*1e-14 ]%DATO:Aquí metemos los moles iniciales de crioprotector if ncpa==0 Lgo=0.01*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=94.1*1e3;%DATO esperma de ratón else Lgo=.004*1e-6;%DATO esperma de ratón E_Lgo=63.6*1e3;%DATO esperma de ratón end Tgo=273.15;%DATO esperma de ratón %Calculamos la evolución de la curva de descenso crioscópico para las %distintas etapas de deshidratación. [Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2,Xtot1,t0,Xtot2,t1]=Curva_Crioscopica2(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa); %CALCULAMOS LA CURVA DE DESHIDRATACIÓN [t00,y00]=DescCrio_id_integrado(Vi,n2,ncpa); V00=y00./Vi; Ti=interp1(V00,t00,1); for B=[-30] %Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio %extracelular queda saturado en sal:Teut1 [Tp1,Xp1]=Desh_Etapa_1_ternario(B,Ti,Teut1,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); t01=interp1(Xtot1,t0,Xp1); subenfr1=t01-Tp1; dim1=size(subenfr1); %Deshidratación celular hasta que el medio intracelular queda saturado en sal [Tp2,Xp2,XBsat2,Xcpasat2,Tsat2]=Desh_Etapa_2_ternario(B,Ti,Vi,XBeut1,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); t02=interp1(Xtot1,t0,Xp2); subenfr2=t02-Tp2; dim2=size(subenfr2); %Deshidratación celular hasta que alcanzamos la temperatura a la cual el medio %extracelular queda saturado en crioprotector [Tp3,Xp3,Xcpa3]=Desh_Etapa_3_ternario(B,Tsat2,XBsat2,Teut2,Vi,n2,A,Lgo,E_Lgo,Tgo,ncpa,[],[]); dim3=size(Tp3); j=1; Xtoteut1=XBeut1+Xcpaeut1; while Xp3(j)<Xtoteut1 j=j+1; if j==dim3(1,2) break; end end %CASO EN EL QUE NUNCA ALCANZAMOS EN EL MEDIO INTRACELULAR LA COMPOSICIÓN DE %SATURACIÓN EN SAL DEL MEDIO EXTERIOR if j==dim3(1,2) t03=interp1(Xtot1,t0,Xp3);

ANEXO PROGRAMAS

435

subenfr3=t03-Tp3; plot(Tp3-273,subenfr3,'g') axis([-80 0 0 50]); hold on; end if j==1 t03=interp1(Xtot2,t1,Xp3); subenfr3=t03-Tp3; plot(Tp3-273,subenfr3,'g') axis([-80 0 0 50]); hold on; end %CASO EN EL QUE SI ALCANZAMOS EN EL MEDIO INTRACELULAR LA COMPOSICIÓN DE %SATURACIÓN EN SAL DEL MEDIO EXTERIOR if j<dim3(1,2)& j>1 for m=1:1:j-1 Xp3izq(m)=Xp3(m); Tp3izq(m)=Tp3(m); end for k=1:1:dim3(1,2)-j+1 Xp3der(k)=Xp3(j-1+k); Tp3der(k)=Tp3(j-1+k); end t03izq=interp1(Xtot1,t0,Xp3izq); subenfr3izq=t03izq-Tp3izq; t03der=interp1(Xtot2,t1,Xp3der); subenfr3der=t03der-Tp3der; plot(Tp3izq-273,subenfr3izq,'g',Tp3der-273,subenfr3der,'g') axis([-80 0 0 50]); hold on; clear Xp3izq,Xp3der; end %Dibujamos las curvas de subenfriamiento plot(Tp1-273,subenfr1,'k',Tp1(dim1)-273,subenfr1(dim1),'*r') hold on; plot(Tp2-273,subenfr2,'k:',Tp2(dim2)-273,subenfr2(dim2),'*r') hold on; clear Xp1,Xp2,Xp3; clear Tp1,Tp2,Tp3; end end clear all;


El subprograma Desh_Etapa_2_ternario es el mismo que el del apartado 28. El subprograma Desh_Etapa_3_ternario es el mismo que el del apartado 29.

ANEXO PROGRAMAS

436

SUBPROGRAMA Curva_Crioscopica2 function [Teut1,XBeut1,Xcpaeut1,Teut2,XBeut2,Xcpaeut2,Xtot1p,t0p,Xtot2p,t1p]=Curva_Crioscopica(Vi,n2,ncpa,Vmcpa,Mcpa) if nargin<5 | isempty(Mcpa) Mcpa=92.09;%CASO GLICEROL end if nargin<4 | isempty(Vmcpa) Vmcpa=7.28523*1e-5;%CASO GLICEROL end VmA=18*1e-6;MA=18;%AGUA Vm2=1.66*1e-5;M2=58.455;v2=2;%CASO SAL COMUN R=8.3143; msol=(n2*M2+ncpa*Mcpa);% masa de solutos:sales y crioprotectores. Vsol=(n2*Vm2+ncpa*Vmcpa);% volumen de los solutos. %CALCULAMOS DESCENSO CRIOSCÓPICO SIN ESTAR LA SOLUCIÓN SATURADA [t0,y0]=DescCrio_id_integra1(Vi,n2,ncpa); XB1=n2*VmA*M2/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); Xcpa1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(y0-Vsol+msol*VmA/MA); Xtot1=XB1+Xcpa1; %CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIALES ysol0=0.15*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo) %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL INICIAL [XBeut01 Teut01]=intersec_solub(t0,XB1,ysol0); Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut01); Xcpaeut01=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando %estamos saturados en sal. Xtoteut01=XBeut01+Xcpaeut01; %CALCULAMOS LEYES DEFINITIVAS DE SOLUBILIDAD DE LA SAL ysol=XBeut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(cálculo) ysol1=Xtoteut01*exp((-30.2*1e3/R)*(1./t0-1/238));%SOLUBILIDAD DE LA SAL(dibujar) %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL DEFINITIVO [XBeut1 Teut1]=intersec_solub(t0,XB1,ysol); Vaux=Vsol-msol*VmA/MA+n2*VmA*M2/(MA*XBeut1); Xcpaeut1=ncpa*VmA*Mcpa/MA./(Vaux-Vsol+msol*VmA/MA);%concentracion de CPA cuando %estamos saturados en sal. Xtoteut1=XBeut1+Xcpaeut1; %CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA %DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DE LA SAL dim=size(Xtot1); j=dim(1,2); while Xtot1(j)<Xtoteut1 j=j-1; if j==1 break; end end for k=1:1:dim(1,2)-j Xtot1p(k)=Xtot1(dim(1,2)+1-k); t0p(k)=t0(dim(1,2)+1-k); end Xtot1p(k+1)=Xtoteut1; t0p(k+1)=Teut1; %CALCULAMOS NUEVA LEY DE DESCENSO CRIOSCÓPICO PARA CUANDO LA SOLUCIÓN %EXTRACELULAR ESTÁ SATURADA EN SAL. [t1,y1]=Desc_Crios_SatClNa(Vi,n2,ncpa,Teut1,XBeut1,Vmcpa,Mcpa); XB2=XBeut1; nB=(y1-ncpa*(Vmcpa/MA*VmA))./(Vm2+M2/MA*VmA*(1-XBeut1)/XBeut1); Vsol2=nB*Vm2+ncpa*Vmcpa; msol2=nB*M2+ncpa*Mcpa; Xcpa2=(ncpa*Mcpa/MA*VmA)./(y1-Vsol2+msol2*VmA/MA);

ANEXO PROGRAMAS

437

Xtot2=XB2+Xcpa2; %CALCULAMOS LEYES DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR zsol=.63*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(cálculo) zsol1=(.63+XBeut1)*exp((-18.3*1e3/R)*(1./t1-1/193));%SOLUBILIDAD DEL GLICEROL(dibujar) %CALCULAMOS EL PUNTO DE INTERSECCIÓN DE LA NUEVA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO %Y LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR [Xcpaeut2 Teut2]=intersec_solub(t1,Xcpa2,zsol); XBeut2=XBeut1; Xtoteut2=XBeut1+Xcpaeut2; %CALCULAMOS LA PARTE DE LA CURVA DE DESCENSO CRIOSCÓPICO QUE QUEDA POR ENCIMA %DEL PUNTO DE INTERSECCIÓN CON LA CURVA DE SOLUBILIDAD DEL CRIOPROTECTOR dim=size(Xtot2); j=1; while Xtot2(j)<Xtoteut2 j=j+1; if j==dim(1,2) break; end end for k=1:1:j-1 Xtot2p(k)=Xtot2(k); t1p(k)=t1(k); end Xtot2p(k+1)=Xtoteut2; t1p(k+1)=Teut2;

El subprograma DescCrio_id_integra1 es el mismo que el del apartado 21.

El subprograma intersec_solub es el mismo que el del apartado 24.

BIBLIOGRAFÍA

438

BIBLIOGRAFÍA

439

VIII. BIBLIOGRAFÍA (1) Armand M. Karow, Ph.D. ,2001,”Cryobiology 2001 for mammakian

embryologists”, www.xyrex.com . (2) Eroglu A., Russo M.J, Bieganski R., Cheley S., Bayley H., Toner M, 2000,

“Intracellular trehalose improves the survival of cryopreserved mammalian cells”, Nat Biotech, 18, 166.

(3) Rubinsky B., 2000 ,”Cryosurgery”, Annu.l Rev Biomed Eng. (4) Bischof J.C., 2000, “Quantitative measurement and prediction of

biophysical response during freezing in tissues”, Annu. Rev. Biomed Eng. (5) Karlsson J.O.M, Cravalho E.G., Toner M., 1994, “A model of diffusion-

limited ice growth inside biological cells during freezing”, J. Appl. Phys 75, 4442.

(6) Karlsson J.O.M, Cravalho E.G., Rinkes H.M.B, Tompkins R.G., Yarmush M.L., Toner M., 1993, “Nucleation and Growth of Ice Crystals inside Cultured Hepatocytes during freezing in the presence of dimethyl sulfoxide”, Biophys J 65, 2524.

(7) Karlsson J.O.M, Toner M., 1996, “Long-term storage of tissues by cryopreservation: critical tissues”, Biomaterials 17, 243-256.

(8) Karlsson J.O.M, Toner M, 2000, “Cryopreservation”, Principles of Tissue Engineering, capítulo 24, 293-307.

(9) Wolfe J., Bryant G., “Cellular cryobiology:thermodinamic and mechanical effects”, International Journal of Refrigeration.

(10) McGann L.E., Farrant J.,1976, “Survival of Tissue Cultured Cells Frozen by a Two-Step procedure to –196ºC holding temperature and time”, Cyobiology 13, 261-268.

(11) Mazur P., 1963, “Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing”, J General Physiology 47.

(12) Mazur P., Leibo S.P, Miller R.H., 1974, “Permeability of the bobine red cell to glycerol in hyperosmotic solutions at various temperatures”, J. Membrane Biol 15, 107-136.

(13) Mazur P., 1984, “Freezing of living cells:mechanisms and implications”, Am J. Physiol. 247(Cell Physiol),C125-C-142.

(14) Mazur P., Armitage W.J, 1984, “Toxic and osmotic effects of glycerol on human granulocytes”, Am. J Physiol 247,(Cell Physiol 16), C382-C389.

(15) Mazur P., 1990, “Equilibrium quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos”, Cell Biophysics 17, 53-91.

(16) Toner M., Cravalho E.G., Karel m., 1990, “ Thermodynamics and kinetics of intracellular ice formation during freezing of biological cells”, J. Appl. Phys. 67(3), 1582-1593.

(17) Toner M. , Intracelluar ice Nucleation. (18) Levin R.L., Cravalho E.G., Huggins C.E., 1976, “A membrane model

describing the effect of temperature on the water conductivity of erythrocyte membranes at subzero temperatures”, Cryobiology 13, 415-429.

BIBLIOGRAFÍA

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