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MONOGRAFÍAS DR. ANTONIO ESTEVE

TRANSDUCCIÓNDE SEÑALES

COMO DIANAFARMACOLÓGICA

J.M. Baeyens • A. Zorzano

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© 1999, Fundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 2. E-08032 Barcelona.Teléfono: 93 436 84 05; Fax: 93 450 48 99

Depósito legal: B.- 41.988-96Coordinación y producción:Ediciones Doyma, S.A.Travesera de Gracia, 17-21. E-08021 BarcelonaImpreso en España por Gráficas AlmogávaresPrinted in Spain

La Fundación Dr. Antonio Estevecontempla como objetivo prioritario el estímulo del progreso de la terapéuticapor medio de la comunicación y ladiscusión científica. La Fundación quierepromover la cooperación internacional en la investigación farmacoterapéutica y, a tal fin, organiza reuniones internacionalesmultidisciplinarias donde grupos reducidosde investigadores discuten los resultadosde sus trabajos. Estas discusiones sonrecogidas en las publicaciones de los Esteve Foundation Symposia.Otras actividades de la Fundación Dr. Antonio Esteve incluyen la organizaciónde reuniones dedicadas a la discusión de problemas de alcance más local y publicadas en el formato de la presentemonografía. La Fundación participatambién en conferencias, seminarios,cursos y otras formas de apoyo a las ciencias médicas, farmacéuticas y biológicas y, con carácter bienal,concede un premio al mejor artículopublicado por un autor español dentro del área de la farmacoterapia.

Tanto la introducción como los artículos ydiscusiones de la presente monografía recogenla opinión de los correspondientes autores, porlo que la Fundación Dr. Antonio Esteve no sehace necesariamente partícipe de su contenido.

AGRADECIMIENTOS

La Fundación Dr. Antonio Esteve deseaexpresar su agradecimiento a Marcel Brosa porel diseño del programa System Chair y suadaptación técnica para la gestión informáticade la moderación de las mesas redondas quedan lugar a la edición de estas monografías, asícomo a Pere Gavaldà y a sus colaboradorespor su contribución en las distintas fases dedicho proceso.

J.M. BAEYENS Y A. ZORZANO

Introducción 9

A. GARCÍA DE HERREROS

Regulación de la adhesión intercelular y de la movilidad de células intestinales 11

A.M. PLANAS, C. JUSTICIA, M. SORIANO, A. ESTRADA Y O. SANZ

Mecanismos moleculares implicados en la isquemia y excitotoxicidad cerebral 21

R. JAÉN, M. PÉREZ-MORÁN Y R. BORGES

Mecanismos moleculares implicados en la secreción de catecolaminas por las glándulas suprarrenales 31

F. MAYOR, JR.

Mecanismos de regulación de receptoresacoplados a proteínas G 41

R. MALDONADO

Mecanismos moleculares implicados en la dependencia opiácea 49

J.C. LEZA, B. CUÉLLAR, I. LIZASOAIN, M.A. MORO Y P. LORENZO

Papel del óxido nítrico en la abstinenciaopiácea 55

I. SÁENZ DE TEJADA Y GORMAN

El óxido nítrico en la erección: del laboratorio a la aplicación clínica 73

P. KALIMAN, J. CANICIO Y A. ZORZANO

Identificación de vías intracelulares implicadas en la diferenciación muscular 81

V. SÁNCHEZ MARGALET, J. SANTOS ÁLVAREZY C. GONZÁLEZ YANES

Señalización del receptor de pancreastatina: cross-talkcon el receptor de insulina 89

R. BARTRONS

Antiinflamatorios no esteroides en la prevención del cáncer de colon 99

A. MUÑOZ Y C. CAELLES

Potencial farmacológico de inhibidores de la Jun N-Terminal Kinase (JNK) 109

J. MOSCAT Y M.T. DÍAZ MECO

Nuevas dianas terapéuticas en la transducción de señales por proteincinasas C 117

Transducción de señales como diana farmacológica

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Relación de participantes

JOSÉ MANUEL BAEYENSDepartamento de Farmacología y de TerapéuticaFacultad de Medicina. Universidad de GranadaAvda. de Madrid, s/n18012 Granada

RAMON BARTRONSUnitat de Bioquímica. Departament de Ciències FisiològiquesDivisió de Ciències de la Salut.Universitat de BarcelonaCampus de Bellvitge. Freixa Llarga, s/n08907 L´Hospitalet de Llobregat.

RICARDO BORGESDepartamento de Medicina Física y FarmacologíaFacultad de Medicina. Universidad de La Laguna38071 La Laguna

FÈLIX BOSCHFundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 208032 Barcelona

ORIOL BULBENADepartamento de Bioanalítica MédicaInstituto de Investigaciones Biomédicasde Barcelona. CSIC-IDIBAPSJordi Girona, 18-2608034 Barcelona

ANTONIO CELADADepartament de Fisiologia AnimalFacultat de Biologia. Universitat de BarcelonaAvda. Diagonal, 64508028 Barcelona

VALENTÍN CEÑADepartamento de FarmacologíaFacultad de Medicina. UniversidadMiguel HernándezCampus de San Juan. Apdo. Correos 37403080 Alicante

SERGIO ERILLFundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 208032 Barcelona

VICENTE FELIPOInstituto de Investigaciones CitológicasFundación Valenciana de Investigaciones BiomédicasAmadeo de Saboya, 446010 Valencia

EDUARDO FERNÁNDEZSEGURADepartamento de Biología CelularFacultad de Medicina. Universidad de GranadaAvda. de Madrid, s/n18012 Granada

ANTONIO GARCÍA DEHERREROSUnitat de Biologia Cel.lulari MolecularInstitut Municipal d’InvestigacióMèdicaDr. Aiguader, 8008003 Barcelona

AGUSTINA GARCÍASÁNCHEZDepartament de Bioquímica i Biologia MolecularInstitut de Biologia Fonamental Villar Palasí. Universitat Autònoma de BarcelonaCampus de Bellaterra08193 Bellaterra

AMADEU GAVALDÀDepartamento de FarmacologíaAlmirall-Prodesfarma, S.A.Cardener, 68-7408024 Barcelona

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PERLA KALIMANDepartament de Bioquímica i Biologia MolecularFacultat de Biologia. Universitat de BarcelonaAvda. Diagonal, 64508028 Barcelona

JUAN CARLOS LEZADepartamento de FarmacologíaFacultad de Medicina. Universidad Complutense de MadridAvda. Complutense28040 Madrid

RAFAEL MALDONADODepartamento de NeurofarmacologíaFacultad de Ciencias de la Salud y de la VidaUniversitat Pompeu FabraDoctor Aiguader, 8008003 Barcelona

FEDERICO MAYOR, JR.Departamento de Biología Molecular y Centro de Biología Molecular“Severo Ochoa” (CSIC-UAM)Universidad Autónoma de MadridCanto Blanco28049 Madrid

JORGE MOSCATLaboratorio GlaxoWellcome-CSIC de Biología Celular y Molecular Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CSIC-UAM)Universidad Autónoma de MadridCanto Blanco28049 Madrid

ALBERTO MUÑOZInstituto de InvestigacionesBiomédicasConsejo Superior de InvestigacionesCientíficasArturo Duperier, 428029 Madrid

MANUEL PALACÍNDepartament de Bioquímica i Biologia MolecularFacultat de Biologia. Universitat de BarcelonaAvda. Diagonal, 64508028 Barcelona

ANNA M. PLANASDepartamento de Farmacología y ToxicologíaInstituto de InvestigacionesBiomédicas de Barcelona. CSIC-IDIBAPSJordi Girona, 18-2608034 Barcelona

GABRIEL PONSDepartament de Ciències Fisiològiques IIUnitat de Bioquímica. Facultad de MedicinaCampus de Bellvitge.Freixa Llarga, s/n08907 L´Hospitalet de Llobregat.

ENRIQUE PORTILLODepartamento de Farmacología y de TerapéuticaFacultad de Medicina. Universidad de GranadaAvda. de Madrid, s/n18012 Granada

GONZALO ROMEROUnidad de Biología Molecular. División de BiologíaLaboratorios Dr. Esteve, S.A.Avda. Mare de Déu de Montserrat, 22108041 Barcelona

IÑIGO SÁENZ DE TEJADAY GORMANFundación para la Investigación y el Desarrollo en Andrología (FI + DA)Antonio Robles, 4, 9.º C28034 Madrid

JOAN SALLÉSDepartamento de FarmacologíaFacultad de Farmacia. Universidad País VascoLos Apraiz, 201006 Vitoria-Gasteiz

VÍCTOR SÁNCHEZMARGALETDepartamento de Bioquímica ClínicaHospital Universitario VirgenMacarenaAvda. Fedriani, 341071 Sevilla

RAMON TRULLÀSUnidad de Neurobiología.Departamento de Bioanalítica MédicaInstituto de InvestigacionesBiomédicas de Barcelona. CSIC-IDIBAPSJordi Girona, 18-2608034 Barcelona

PERE VENTAYOLLaboratori de NeurofarmacologiaDepartament de Biologia. Universitat Illes BalearsCtra. de Valldemosa km 7,507071 Palma de Mallorca

FRANCESC VENTURADepartament de Ciències Fisiológiques II Humanes i NutricióUnitat de Bioquímica. Facultat d’OdontologiaCampus de Bellvitge. Feixa Llarga s/n08907 L´Hospitalet de Llobregat.

ANTONIO ZORZANODepartament de Bioquímica i Biologia MolecularFacultat de Biologia. Universitat de BarcelonaAvda. Diagonal, 64508028 Barcelona

Los trabajos y debates presentados en estamonografía son el fruto de una reunión científi-ca que, patrocinada por la Fundación Dr. Anto-nio Esteve, tuvo lugar a mediados de 1998 enBarcelona y permitió el intercambio de ideasentre investigadores españoles que procedende campos de conocimiento diversos (bioquí-mica, farmacología o fisiología, entre otros) yque utilizan abordajes experimentales muy di-ferentes (desde estudios en células aisladas oen cultivo hasta análisis epidemiológicos), peroque comparten un mismo presupuesto teórico.Esta idea común implica que identificar losacontecimientos que se producen en una célu-la (y sus repercusiones fisiopatológicas) comoconsecuencia de la llegada de información pro-cedente de otra, no sólo nos ayuda a conocermejor el funcionamiento de nuestro organismo,sino que permite identificar puntos de actua-ción potencial para la búsqueda de nuevos fár-macos que ayuden al tratamiento de las enfer-medades que nos afectan.

La comunicación entre células implica el in-tercambio de moléculas de señalización (neu-rotransmisores, hormonas, etc.) que actúan so-bre receptores específicos situados en la mem-brana plasmática o en el interior celular. Ennumerosas enfermedades se produce una alte-ración, primaria o adaptativa, en los mediado-res químicos que cumplen la función de men-sajeros intercelulares o en sus receptores celu-lares. Por tanto, no debe extrañar que durantemuchos años la estrategia fundamental de lafarmacología en la búsqueda de nuevos fárma-cos consistiera en identificar moléculas que, obien modularan la cantidad del mediador quí-mico circulante (aportando el propio mensajeroo sus precursores, modificando la actividad delas enzimas encargadas de su síntesis o degra-dación), o bien actuaran directamente sobrelos receptores para estos mediadores (activán-dolos o bloqueándolos).

Durante el último cuarto de siglo ha tenidolugar un extraordinario avance en la caracteri-zación de los procesos bioquímicos celularesencargados de promover la respuesta a los me-diadores químicos intercelulares. Se ha puestode manifiesto que las proteínas receptoras deestos mediadores, en realidad, son sólo el co-mienzo de toda una cascada de acontecimien-tos celulares que implican a distintos sistemas

transductores (p. ej., proteínas G) y efectorescelulares (enzimas, segundos mensajeros o ca-nales iónicos). Estos sistemas, a su vez, partici-parán en la regulación del grado de fosforila-ción de distintas proteínas celulares (mediantecinasas y fosfatasas) o en la modulación de latranscripción génica, por poner sólo algunosejemplos. Por otra parte, cada vez existen másevidencias de la alteración de algunos de estosprocesos bioquímicos en enfermedades queafectan al ser humano. Estos hechos represen-tan todo un mundo de posibilidades para labúsqueda de nuevos fármacos que, al interferircon tales procesos, puedan ser útiles en tera-péutica. Existen algunos ejemplos de fármacosde uso clínico que actúan modulando la con-centración intracelular de segundos mensaje-ros (p. ej., los inhibidores de las fosfodiestera-sas) o el funcionamiento de algunos sistemasefectores celulares (p. ej., los bloqueadores delos canales del sodio o del calcio dependientesde voltaje) pero, desde luego, son una minoríacomparados con el número de fármacos queactúan modulando los efectos de los mediado-res químicos intercelulares.

Resulta llamativo que entre los pocos fárma-cos que se empleaban a principios de siglo ytodavía tienen bastante uso clínico se encuen-tren varios productos que actúan sobre los sis-temas de transducción de señales, como lasxantinas, los nitratos, los digitálicos o los anes-tésicos locales. Por tanto, parece que reorientarla búsqueda de nuevos fármacos hacia sustan-cias que tengan como diana tales sistemaspuede ser extraordinariamente productivo parala farmacología.

Entre los objetivos de la Fundación Dr. Anto-nio Esteve se encuentra promover el intercam-bio multidisciplinario de conocimientos. Losparticipantes en esta reunión consideramos és-te como uno de los mayores logros del encuen-tro y queremos dejar constancia de nuestroagradecimiento a la Fundación y a su Director,el Prof. Sergio Erill, por haberlo hecho posible.

J.M. Baeyens* y A. Zorzano***Departamento de Farmacología

y de Terapéutica. Universidad de Granada.**Departament de Bioquímica i Biologia

Molecular. Universitat de Barcelona.

Introducción

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La diferenciación de las células intestinalesse encuentra acoplada a la migración en las criptas intestinales

La cripta intestinal, la unidad proliferativadel intestino, es un sistema dinámico perfecta-mente regulado, en el que la diferenciación,proliferación y migración celular se hallan es-trechamente acopladas1. Los cuatro tipos ce-lulares maduros presentes en este epitelio (en-terocitos, células mucosecretoras, células en-teroendocrinas y células de Paneth) seoriginan a partir de una célula multipotencial,situada hacia la base de la cripta. Excepto enel caso de las células de Paneth, que migranen dirección opuesta, la génesis de estos tiposcelulares se produce mediante un proceso dediferenciación continuo, durante el cual las cé-lulas migran formando bandas verticales des-de la base de la cripta hacia la parte superiorde ésta y, posteriormente, a lo largo del villushasta ser exfoliadas1. La proliferación se en-cuentra restringida a los dos tercios inferioresde la misma; una vez llegado a ese nivel, lascélulas se encuentran terminalmente diferen-ciadas y son plenamente funcionales. En esteproceso de migración y diferenciación, la ca-pacidad de las células de establecer contactoscon las células vecinas o con la matriz basaldesempeña un papel crucial; por ejemplo, va-rios experimentos han demostrado alteracio-nes en la formación de las criptas cuando seincrementa o se disminuye de modo artificialla adhesión intercelular2 (fig. 1).

Es evidente que la comprensión de una ma-nera precisa de cómo se regulan estos proce-sos tiene especial importancia. Basta para ellorecordar que las alteraciones en estos proce-sos son necesarias para la génesis de los tu-mores de colon, una de las principales causasde mortalidad ligada al cáncer en el mundooccidental4. El tratamiento de esta enferme-

dad no ha experimentado avance alguno enlos últimos 30 años, ya que por el momentono ha sido posible hallar ningún fármaco quepresente una eficiente actividad contra los tu-mores de este origen in vivo5.

El estudio de los procesos de diferenciacióny proliferación se ha visto tradicionalmenteperjudicado por la falta de métodos reproduci-bles para el cultivo de células del epitelio in-testinal y por el fenotipo muy indiferenciadoque presentaban las líneas celulares colorrec-tales6,7. Sin embargo, durante los últimos añosse han descrito varias líneas, obtenidas a partirde tumores que, en cultivo, tras alcanzar laconfluencia experimentan un proceso de dife-renciación semejante al que se produce en lacripta y adquieren un fenotipo semejante al decélulas mucosecretoras o enterocíticas madu-ras. Entre estas células cabe destacar las sub-poblaciones M6 y M3 obtenidas a partir de lalínea celular HT-29, por selección en condicio-nes de estrés8. Las células así seleccionadasson capaces de formar complejos de adhesiónintercelular (uniones adherentes, desmosomasy uniones estrechas) y originar una monocapade células polarizadas, con un borde en cepi-llo bastante bien estructurado. Por esta razón,estas células han sido utilizadas como modelopara estudiar in vitro la regulación de la dife-renciación intestinal.

La diferenciación de líneas celularesintestinales se bloquea por la activación de PK-Cα

Utilizando las HT-29 M6 como modelo detrabajo se han identificado varios factores queafectan a su diferenciación. En primer lugar,se ha determinado que la adición de ésteresde forbol como el PMA impide que estas célu-las formen contactos adecuados y bloquea laaparición del fenotipo diferenciado9. La adi-

Regulación de la adhesión intercelular y de la movilidad de células intestinales

Antonio García de Herreros Unitat de Biologia Cel.lular i Molecular. Institut Municipal d’Investigació Mèdica. Barcelona.

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ción de este compuesto induce cambios celu-lares que han sido denominados scattering odispersión; estos cambios consisten en pérdi-da de los contactos intercelulares, incrementode la adhesión a la matriz, incremento de lamovilidad celular y, en general, adquisición deuna morfología más fibroblastoide10. El efectode scattering no es algo específico de células

intestinales sino que el PMA lo induce tambiénen otros tipos celulares epiteliales11. Otros fac-tores, entre los que el factor de crecimiento dehepatocitos (HGF) es el de efecto más general,causan también el scattering de las célulasepiteliales11.

El PMA es un activador específico de unafamilia de proteincinasas colectivamente deno-

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TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES COMO DIANA FARMACOLÓGICA

ZONA DE EXTRUSIÓN

Lumen intestinal

VILLI (sin división celular)

CÉLULAS EPITELIALES

Tránsito celular

Tejido conectivo

Células diferenciadas

VILLI(sección transversal)

Células en rápida división

Célula pluripotencialde división lenta

Células diferenciadas

CRIPTA(sección transversal)

DIRECCIÓN DE LAMIGRACIÓN CELULAR

Fig. 1. Esquema del epitelio intestinal en el que se observa el tránsito cripta-villus (Tomada de Alberts et al3.)

minadas proteincinasa C (PK-C)12. Esta familiaestá compuesta por, al menos, 10 miembrosagrupados en tres subfamilias: PK-C conven-cionales (cPK-C), nuevas (nPK-C) o atípicas(aPK-C); de éstos, los ocho miembros de lassubfamilias c y nPK-C pueden ser activadospor el PMA13. Se ha podido demostrar que laactivación de la isoforma cPK-Cα es suficientepara inducir el proceso de scattering; la intro-ducción de un mutante activado de esta iso-forma causa la adquisición de un fenotipo fi-broblastoide semejante al obtenido tras trata-miento con PMA14. Sin embargo, no se puededescartar que alguna de las otras isoformas dePK-C sensibles a PMA y presentes en estascélulas (nPK-C ε y η) pueda contribuir a esteefecto, ya que se ha detectado la transactiva-ción de otras formas de PK-C en las célulastransfectadas con el mutante activado de cPK-Cα (Llosas et al, resultados no publicados).

Además de inducir el scattering de las célu-las HT-29 M6, el PMA, como la transfeccióndel mutante de cPK-Cα , ejerce otro efectoaparentemente no relacionado: disminuye lavelocidad de proliferación10,14-16. A diferenciadel scattering, que ocurre en más tipos celula-res epiteliales, este efecto es específico de laslíneas celulares intestinales y parece estar re-lacionado con la inducción de p21cip1 yp27kip1, inhibidores de la proteincinasa de-pendiente de ciclinas17. Experimentos de tu-morogénesis realizados en ratones atímicosrefieren que los dos efectos observados (sca-ttering e inhibición del crecimiento) se re-producen también en los tumores, y requierenun diferente grado de activación de esta enzi-ma. Así, los clones que poseen una elevadaactividad cPK-Cα son incapaces de formar tu-mores, mientras que los que contienen valoresmoderados de esta enzima originan tumoresde menor tamaño y con características anato-mopatológicas más invasivas14.

¿Cómo encajan nuestros resultados dentrode un papel de la PK-C en la carcinogénesiscolónica? Ciertos datos epidemiológicos ha-bían sugerido que alguno de los miembros deesta familia podían desempeñar un papel re-levante en el proceso de carcinogénesis coló-nica18. Existían, además, resultados que su-gerían que alteraciones en la actividad de estafamilia de enzimas podían estar relacionadascon el proceso de transformación maligna enhumanos, actuando de manera diferente enlos estadios tempranos y tardíos de este pro-ceso. Así, en modelos experimentales de car-cinogénesis se han detectado cambios que

sugieren que una activación de la PK-C en losadenomas causa una depleción posterior deesta actividad19,20. Nuestros resultados indi-can que una activación moderada de la PK-Cpuede desempeñar un papel en la modula-ción de los contactos celulares. En condicio-nes normales esta modulación sería necesariapara que las células pudiesen modificar suscontactos con las células vecinas y migrar a lolargo de la cripta; una activación no reguladaimpediría iniciar el proceso de tumorogénesis.En células en la parte superior de la cripta laactivación de la PK-Cα sería necesaria parabloquear el crecimiento celular; es en esta zo-na en la que se ha encontrado una asociaciónmayoritaria de esta isoforma con la membra-na plásmática, indicativa de su activación16.En tumores avanzados, la depleción de estaenzima induciría el crecimiento incontroladode células en compartimientos donde no loharía normalmente (fig. 2).

Proteínas tirosincinasas regulan la funciónde la E-cadherina

La aparición del fenotipo de scattering esconsecuencia de cambios coordinados en va-rias propiedades celulares como son una ma-yor afinidad hacia la matriz extracelular, unaadhesión intercelular disminuida y una movili-dad incrementada. A su vez, las modificacio-nes en estas propiedades de las células sonconsecuencia de alteraciones aparecidas enlas moléculas que ejercen un papel importanteen su regulación; así, por ejemplo, la pérdidade adhesión intercelular se asocia, y probable-mente se debe, a una disminución en la fun-cionalidad de la E-cadherina10. Ésta es unaproteína transmembrana responsable, a travésde interacciones homotípicas, del estableci-miento de las uniones adherentes, los comple-jos de unión que se establecen con más rapi-dez en células epiteliales21. Al tratar las célu-las HT-29 M6 con PMA se produce la pérdidade funcionalidad de la E-cadherina que dejade ser capaz de interaccionar con el citosque-leto de actina22. En este proceso influyen pro-teínas tirosincinasas, puesto que inhibidoresde estas enzimas (como la herbimicina), incre-mentan la asociación de E-cadherina con el ci-tosqueleto y, por tanto, su funcionalidad,mientras que los inhibidores de las fosfoproteí-na-fosfatasas (como el ortovanadato) la dismi-nuyen22.

Varias proteínas tirosincinasas se han rela-cionado con la regulación de la E-cadherina.

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REGULACIÓN DE LA ADHESIÓN INTERCELULAR Y DE LA MOVILIDAD DE CÉLULAS INTESTINALES

Los datos más consistentes se refieren al pro-ducto del gen v-src; así, la transformaciónproducida por este gen incrementa la fosforila-ción tanto de la beta como de la p120-cateni-na23,24. En las células HT-29 M6, la pérdidade los contactos celulares inducida por PMAse ve precedida por un incremento en la acti-vidad del análogo celular de v-src, p60c-src,concomitantemente a la fosforilación de p120-catenina20. No se detectan cambios en el con-tenido en fosfotirosina de betacatenina, proba-blemente a causa de la elevada presencia deesta modificación en células HT-29 M6. Enparalelo a la fosforilación se detectó un cambioen la asociación de E-cadherina por estas pro-teínas; en condiciones de control esta proteínase encuentra asociada en gran medida a beta-catenina e inapreciablemente a p120-cateni-na; tras la fosforilación, estas proporciones seinvierten22. Estos resultados, unidos a otrosdatos obtenidos en células transformadas conv-ras25, han sugerido un modelo según el cualla funcionalidad de la E-cadherina, que de-

pende de su interacción con alfacatenina y, através de ésta, con el citosqueleto, está contro-lada por la fosforilación26. En ausencia de estí-mulos, la E-cadherina estaría unida a la beta-catenina que actuaría de puente para su inte-racción con la alfacatenina; tras lafosforilación, en residuos de tirosina (indicadacomo PY en el esquema expuesto en la fig. 3),la afinidad de la E-cadherina hacia la p120-ca-tenina se incrementaría y ésta desplazaría a labetacatenina del complejo, provocando la pér-dida de la asociación de la E-cadherina con elcitosqueleto26. Este modelo, basado en uncambio en afinidades relativas, dista de estarprobado; una posibilidad que no lo alteraríademasiado consistiría en que la entrada de lap120-catenina en el complejo causase, no eldesplazamiento de la betacatenina, sino sólola pérdida de la interacción con la alfacateni-na. En cualquier caso, la validación de estemodelo requerirá la determinación de lasconstantes de asociación de la E-cadherinapor las cateninas, tanto cuando éstas se en-

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Func

iona

lPr

olife

rativ

o

Actividad

Alta

Baja

Papelfisiológico

Parada delcrecimiento

(diferenciación)

Alteracionestumorigénicas

Depleción(crecimiento alterado)

Control de la funciónde la E-cadherina

adhesión intercelular,migración

(migración)

Aumento moderadode actividad

(menor funcionalidadde la E-cadherina)

(adhesión intercelular)

Fig. 2. Papel fisiológico de la cPK-Cα en la diferenciación y migración de las células intestinales y de sus altera-ciones en procesos carcinogénicos.

cuentren fosforiladas en tirosina como en esta-do basal. Estudios de este tipo se encuentranya en marcha en nuestro laboratorio utilizandoproteínas recombinantes; mediante este siste-ma ya se ha podido determinar que la afinidaddel fragmento citosólico de la E-cadherina ha-cia la betacatenina es mucho mayor que haciala p120-catenina (Piedra y Duñach, resultadosno publicados) (fig. 3).

La betacatenina actúa como factortranscripcional

Recientemente se ha podido demostrar que,además de ejercer un papel crucial en la for-mación y regulación de los contactos adheren-tes, la betacatenina también actúa como acti-vador transcripcional. Diversos estudios, rea-l izados inicialmente en X. laevis y D.melanogaster y completados en células huma-nas, indican que la betacatenina puede trans-locarse al núcleo, unirse a un factor transcrip-cional de la familia LEF-1 (en el intestino,hTCF-4) y activar la transcripción de una seriede genes aún desconocidos27-29. La capaci-dad de la betacatenina de trasladarse al nú-cleo se encuentra en función de las concen-traciones de esta proteína que se encuentranen el citosol no asociadas a E-cadherina, valo-

res que dependen principalmente de la veloci-dad de degradación de esta proteína. La esta-bilidad de la betacatenina está controladapor fosforilación en residuos de serina y treo-nina, modificación que realiza la proteincinasaGSK-327-29. La capacidad de esta enzima parafosforilar residuos específicos de la betacateni-na está muy delicadamente regulada; se hademostrado que puede ser bloqueada por unacadena de reacciones iniciada por un factorextracelular (wnt en células eucariotas) y querequiere la acción acopladora de una proteínadenominada APC27-29.

La importancia de este nuevo papel de labetacatenina como coactivador transcripcionalviene resaltada por el hecho de que esta acti-vidad parece ser esencial para el desarrollo delos tumores de colon, cualquiera que sea suestadio. Así, mutaciones de APC que impidenque la betacatenina se degrade son un acon-tecimiento muy habitual en los tumores de co-lon (más del 85%); esta lesión parece ser lainiciadora del proceso de carcinogénesis coló-nico30. En un amplio porcentaje del 15% delos tumores restantes, en los que no se ha de-tectado lesión en APC, aparecen mutacionesen la betacatenina, que impiden que la proteí-na sea fosforilada en Ser/Thr y degradada31.Esto hace que, comparados con los tejidos

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p120-catenina

α-catenina

β-cateninaCitosqueletode actina

Fosforilación en tirosina(c-src cinasa)

p120-catenina. PY

β-catenina. PY

DentroFueraDentro

E-cadherina

E-cadherina

Citosqueletode actina

α-catenina

Fig. 3. Regulación de la asociación de la E-cadherina con el citosqueleto de actina mediante fosforilación en tiro-sina de cateninas.

normales, una gran mayoría de los tumores decolon (líneas celulares derivadas de ellos) po-sean concentraciones elevadas de betacateni-na y una mayor presencia de esta proteína enel núcleo (Fabre et al, resultados no publica-dos).

Es también interesante destacar que la en-trada de la betacatenina en el núcleo se reali-za de una forma atípica, ya que se efectúa demanera independiente de las proteínas trans-portadoras clásicas (importinas)32. Los datosmás recientes sugieren que la betacatenina in-teracciona con el mismo receptor que las im-portinas presentes en los poros nucleares32

(fig. 4).En las células HT-29 M6, la activación pro-

longada de la cPK-Cα induce la translocaciónal núcleo de la betacatenina. Este efecto no sedebe a un incremento en las concentracionesde esta proteína puesto que estas células no

son capaces de degradar la betacatenina yaque la proteína APC que expresan está muta-da. La translocación al núcleo de la betacate-nina se acompaña de un incremento de la ac-tividad transcripcional mediada por betacate-nina, determinada mediante ensayos detransfección transitoria de un gen reporter bajola expresión de un promotor con secuenciasde unión para hTCF-4. El mismo efecto se haencontrado en otras líneas celulares intestina-les con valores bajos de E-cadherina, comoSW-480 (Baulida et al, resultados no publica-dos). Estos datos indican que la actividadtranscripcional mediada por betacatenina estásujeta a regulación aun en ausencia de APC eintroducen un elemento más de control en elesquema anteriormente descrito; es posibleque la unión de la betacatenina al receptor nu-clear también esté modulada de una maneradirecta. Otra posibilidad a ser considerada es

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ADN Gen X

Transcripción

ActinaCSK

α-catenina

E-cadherina

wnt

Frzl(h)

Tir. fosfor.Dsh(h)

GSK-3

Axinaβ-catenina

β-importinreceptor

LEF-1(hTCF-4)

APC

Ser, ThrFosforil.

Fig. 4. Efectores del papel de la betacatenina como activador transcripcional.

que el PMA incremente la accesibilidad de labetacatenina a los receptores debido a su me-nor interacción con otras proteínas.

El gran interrogante de este modelo continúaconsistiendo en identificar a los genes cuyatranscripción está siendo modulada in vivo porel complejo betacatenina-hTCF-4. En nuestro la-boratorio se está procediendo a este estudio uti-lizando como sistema células SW-480, que po-seen alta actividad transcripcional del complejobetacatenina-hTCF-4 y células SW-480 en lasque esta actividad ha sido bloqueada mediantela introducción ectópica de una forma truncadade este factor transcripcional (∆hTCF-4), quecarece del dominio de unión para la betacateni-na. La introducción de este mutante es capazde disminuir entre seis y ocho veces la activi-dad basal del complejo en estas células en en-sayos de expresión transitoria; en transfeccio-nes estables las disminuciones son más modes-tas (tres-cuatro veces), lo que puede serinterpretado como que es necesario un ciertonivel de transcripción mediada por este com-plejo para que las células puedan sobrevivir encultivo (Baulida et al, resultados no publicados).En consonancia con estos datos, la sobreexpre-sión de APC en células HT-29 y en otras líneasintestinales induce apoptosis33.

Un gen candidato a ser regulado por betaca-tenina-hTCF-4 es la E-cadherina. Se ha pro-puesto que el incremento en transcripción me-diada por betacatenina estaría relacionado conla transición epitelio-mesénquima y la desapa-rición de esta proteína que aparece frecuente-mente en los tumores34,35. Sin embargo, variosdatos indican que si la betacatenina está regu-lando negativamente la transcripción de la E-cadherina, no lo hace directamente. En primerlugar, la desaparición de la E-cadherina no esun acontecimiento temprano en el desarrollode los tumores, a diferencia de la mutación deAPC y el incremento en transcripción36. Tam-poco se ha encontrado en la zona del promotorde la E-cadherina murina responsable de la es-pecificidad de linaje epitelial la presencia desecuencias claras de unión de hTCF-437. Porúltimo, en los clones caracterizados en nuestrolaboratorio en los que se ha disminuido la acti-vidad transcripcional mediada por betacateni-na tras la expresión de ∆hTCF-4 no se observaun aumento concomitante en E-cadherina,aunque la funcionalidad de esta proteína pare-ce menor. Sin embargo, no puede descartarseque la betacatenina esté actuando en conso-nancia con otros estímulos, por ejemplo, facto-res de crecimiento, para estimular la expresión

de un gen que actúe como represor de latranscripción de la E-cadherina.

Agradecimiento

Agradezco a mis colaboradores Eduard Bat-lle, Santiago Roura, Javier Verdú, David Domín-guez, Maria del Mont Llosas, Silvia Gómez, Jo-sep Baulida, Francesc Alameda, José A. Piedray Mireia Duñach sus ideas y consejos, así co-mo la realización de los experimentos presen-tados en este artículo. El trabajo de laboratorioha sido financiado por la Fundación RamónAreces, la Comisión Interministerial de Cienciay Tecnología (SAF94-1008 y SAF97-0080) y laComissió Interdepartamental de Recerca i Tec-nologia (ayuda GRQ 93-9301 concedida a laUnitat de Biologia Cel.lular i Molecular).

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DISCUSIÓN

A.M. PLANAS: Esta entrada de la betacateninaal núcleo, ¿está siempre asociada a una si-tuación patológica, es decir, no ocurre encondiciones fisiológicas?

A. GARCÍA DE HERREROS: En las criptas normalessólo observamos presencia de betacateninanuclear en una célula situada cerca de la ba-se de la cripta, que podría ser la célula ma-

dre. De hecho, APC sólo se expresa en losdos tercios superiores de la cripta y no se ex-presa en la parte inferior. También se puedeapreciar la presencia de betacatenina nu-clear en algunos casos de alteraciones pre-neoplásicas.

J. MOSCAT: En primer lugar, los experimentosrealizados expresando PK-Cα, ¿habéis inten-tado realizarlos también con la expresión deun mutante que carezca de actividad enzi-mática? Lo pregunto porque la expresión dePK-Cα muchas veces produce efectos inde-pendientes de su actividad enzimática como,por ejemplo, la activación de la fosfolipasa D.En segundo lugar, en los experimentos conPMA y dado que se trata de una moléculabastante artificial, ¿cuál es el estímulo fisioló-gico real que estáis estudiando?

A. GARCÍA DE HERREROS: Con PK-Cα negativo noobtuvimos clones estables, los clones moríanenseguida. Probablemente esto se deba aque las células requieran un cierto nivel dePK-Cα para adherirse y ser capaces de so-brevivir. Con otras PK-C hemos observadoefectos parciales. Por ejemplo, si sobreexpre-samos PK-Cε se obtiene un fenotipo ligera-mente parecido al de scattering, pero no sedetiene el crecimiento. Si sobreexpresamosPK-Cη ocurre lo contrario, el fenotipo es igualpero las células proliferan más despacio. Portanto, no podemos descartar que el efectopudiera deberse a una transactivación. Encuanto a tu segunda pregunta, nuestra ideaal utilizar PMA en estas células se basa enuna serie de experimentos descritos hacetiempo, en los que Harry Wenstein, epide-miólogo molecular, y otros autores posterior-mente, trataron de involucrar a la PK-Cα enla carcinogénesis. Se fundamenta en que, enpacientes con cáncer de colon, la dieta ricaen grasas podría constituir un factor de ries-

go tumoral, ya que la presencia de diacilgli-cerol en estas dietas parece actuar como ac-tivador fisiológico. De hecho, parte de esteefecto puede también observarse en estascélulas con PMA cuando se añade diacilgli-cerol en cantidades muy altas.

A. MUÑOZ: ¿Consigues reproducir los efectosde TPA o de PMA con algún factor de creci-miento, por ejemplo? En segundo lugar, y da-da la importancia de las mutaciones en elp53 o en la vía de RAS en el cáncer de co-lon, ¿existe alguna interacción con este siste-ma?

A. GARCÍA DE HERREROS: Mi respuesta a la pri-mera pregunta es: no en estas células. Nohemos podido conseguir a la vez scattering yparada del crecimiento. Sólo hemos observa-do uno u otro efecto, pero no los dos a lavez. Sobre la segunda cuestión, cabría men-cionar que nuestra idea se fundamenta enque la activación del APC es un efecto ini-cial. Se sabe que la expresión de p53 bajo elcontrol de un promotor en el intestino de ani-males transgénicos no induce el desarrollode ningún tipo de proliferación celular. Cree-mos que el APC y la betacatenina generanmás células madre o generan células que es-tán fijadas en un compartimiento determina-do y que son capaces de proliferar sin mi-grar. Es decir, una mutación en RAS en unacélula normal no fijada hace proliferar másdeprisa células que ya proliferan rápido, yconducirá a la migración y el desprendimien-to celular sin producir ningún tipo de altera-ción. Pero si se incrementa el número de cé-lulas que son capaces de proliferar sin mi-grar se crea un nuevo foco de cripta y segeneran más células madre, lo que favoreceque mutaciones posteriores que afecten a suvelocidad de proliferación sean capaces deincidir sobre su capacidad carcinogénica.

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Introducción

Durante un episodio de isquemia cerebralse produce una interrupción o reducción delflujo sanguíneo y, en consecuencia, del aportede glucosa y de oxígeno a las células neuralesafectadas. En el núcleo de la zona isquémica,es decir, la zona que sufre la disminución másimportante de flujo sanguíneo, se desarrolla uninfarto con signos de necrosis manifiestos a las24 h. Sin embargo, a medida que transcurre eltiempo también se observan alteraciones de lamorfología celular en las zonas colindantes,puesto que el tamaño de la lesión aumentaprogresivamente según se va desarrollando elinfarto cerebral en los días que siguen al epi-sodio isquémico1. Se ha propuesto que en laisquemia se producen fenómenos de excitoto-xicidad mediada por receptores de glutamato2.Por esta razón, los cambios en la señalizaciónintracelular que ocurren previamente a lamuerte neuronal podrían ser similares tanto enla penumbra como en situaciones de excitoto-xicidad. En este sentido, estudiaremos deter-minadas señales intracelulares tanto en la pe-numbra isquémica como en modelos de exci-totoxicidad, tras inyección de ácido caínico enrata, para dilucidar la implicación de determi-nadas vías de señalización intracelular en res-puesta a la agresión, y su posible relación conla muerte o supervivencia celular.

Tanto la isquemia como la excitotoxicidadprovocan cambios en el patrón de expresión gé-nica con la inducción de genes que normal-mente no se expresan. Dentro de este grupoexaminaremos la expresión del gen que codificapara la proteína de estrés celular denominadaHsp70 (72 kD, Heat shock protein)3-12, el pro-tooncogén c-fos9,12-15 y el gen de la ciclooxige-nasa 29,16,17. Hsp70 pertenece a una extensa

familia de proteínas, denominadas HSP, alta-mente conservadas en eucariotas18, que entreotras funciones tienen la de acompañar a otrasproteínas para permitir su plegamiento, ensam-blaje y translocación a través de membranas19-23.Algunos miembros de la familia HSP están ex-presados de forma constitutiva, mientras queotros como la Hsp70 se inducen en situacionesde estrés. Múltiples evidencias experimentalesindican que en dichas condiciones las HSPejercen un efecto protector18-20,24. Dicho efectopodría estar mediado por la unión de HSP aproteínas desnaturalizadas que se generan encondiciones de estrés celular25.

El c-fos está implicado en la regulación de latranscripción génica y participa en procesoscelulares fundamentales, ya que transporta se-ñales citoplasmáticas hacia el núcleo dondeinteracciona con el ADN26. Frecuentemente lainducción del gen c-fos se puede correlacionarcon incrementos de la actividad eléctrica ymetabólica de las células27. Por ello, la expre-sión de c-Fos se puede utilizar como marcadorde la actividad neuronal28,29. La ciclooxigena-sa (Cox) es una enzima que metaboliza el áci-do araquidónico a prostanoides. Existen evi-dencias experimentales que sugieren que elmetabolismo del ácido araquidónico contribu-ye a los efectos neurotóxicos que se producendespués de la isquemia, durante el período dereperfusión30. Se ha caracterizado a dos genesde la Cox: Cox-1, que está expresado de formaconstitutiva, y Cox-2, que es inducible en res-puesta a la inflamación31. La Cox-2 se inducetambién en neuronas mediante estimulacióneléctrica32, convulsiones9,33 e isquemia9,16,17.

Material y métodos

Se han utilizado ratas macho adultas (250-320 g de peso corporal) de la cepa Sprague-Dawley (Iffa-Credo, Lyon, Francia). El trabajocon animales de experimentación se ha reali-zado bajo las normas vigentes en España y de

Mecanismos moleculares implicados en la isquemiay excitotoxicidad cerebral

Anna M. Planas, Carles Justicia, Marc Soriano, Anna Estrada y Olga Sanz

Departamento de Farmacología y Toxicología. Instituto de Investigaciones Biomédicas de Barcelona. CSIC. IDIBAPS. Barcelona.

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Este trabajo se ha realizado con un Proyecto del Fondode Investigaciones Sanitarias (97/0490).

acuerdo con las directrices de la Unión Euro-pea (86/609/CEE, 24 de noviembre de 1986).Causamos una isquemia cerebral focal transi-toria (1 h) por oclusión intraluminal de la arte-ria cerebral media (ACM) en la rata, como seha descrito previamente34,35. Los controlesfueron animales sometidos a la operación qui-rúrgica pero a los que sólo se les ocluyó laACM durante un período de tiempo inferior a1 min. Los estudios de excitotoxicidad se lleva-ron a cabo mediante administración intraperi-toneal de ácido caínico (9 mg/kg de peso cor-poral), como hemos descrito anteriormente5,6.Los controles recibieron una inyección de sue-ro fisiológico. La hibridación in situ se llevo acabo utilizando oligonucleótidos de ADN espe-cíficos para Hsp705,6, c-fos12 y Cox-216, mar-cados con [33P]- o [32P]-dATP (Amersham oNew England Nuclear), como hemos descritocon anterioridad. Para los estudios de hibrida-ción in situ se utilizaron cortes de tejido conge-lado. Para los estudios de inmunohistoquímicase realizó perfusión intracardíaca de los ani-males utilizando paraformaldehído al 4% entampón fosfato. Los cortes de tejido se obtu-vieron con un vibratomo y la inmunohistoquí-mica se realizó mediante la técnica de flota-ción6,9,11,16. El anticuerpo anti-Hsp70 es unanticuerpo monoclonal (Oncogene) que se usaa la dilución de 1:200. El anticuerpo contrac-Fos es policlonal (Santa Cruz Biotechnology,K4) que se usa a una dilución de 1:1.500. Fi-nalmente, el anticuerpo contra Cox-2 es unanticuerpo monoclonal (Affinity) que se usa auna dilución de 1:100 o 1:200.

Resultados

Modelo de isquemia cerebral focal transitoriaen rata

La isquemia puede conducir al desarrollo deun infarto cerebral en función de la magnitudde reducción de la irrigación y de la duracióndel período isquémico1. En un episodio de is-quemia de 1 h, hemos determinado las varia-ciones relativas de flujo sanguíneo con el finde conocer si existe una relación entre la dis-minución del flujo en la superficie de la corte-za cerebral y el volumen de infarto cerebral re-sultante. Las variaciones relativas de flujo san-guíneo se pueden monitorizar continuamentey de forma poco invasiva mediante flujometríapor láser-Doppler35. En este modelo experi-mental de isquemia transitoria en rata determi-

namos el flujo sanguíneo en una zona periféri-ca de la corteza cerebral y obtenemos una dis-minución de un 70 ± 6% respecto al valor ba-sal, que se mantiene constante durante el pe-ríodo de oclusión de la ACM y que se recuperadurante la reperfusión. Además, la reducciónde flujo es consistente y reproducible entre in-dividuos. Como resultado, se desarrolla un in-farto que afecta a la zona parietal de la cortezacerebral y el núcleo estriado de forma repro-ducible entre animales (fig. 1). Estudiando elvalor de flujo sanguíneo durante la isquemia yel volumen de infarto resultante a los 7 días,hemos encontrado una relación entre ambosparámetros, de manera que la disminución deflujo sanguíneo permite estimar cuál será el ta-maño del infarto resultante35.

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Fig. 1. Cortes coronales de cerebro de rata 24 hdespués de oclusión de la arteria cerebral media. EnA y B se observan dos niveles diferentes. El lado iz-quierdo de las imágenes (ipsilateral respecto a la ar-teria ocluida) aparece más pálido en la zona en laque se manifiesta el infarto. En esta zona se observaun aumento de volumen respecto al lado derecho(control) debido a la formación de un edema consi-derable. Tinción con violeta de cresilo.

Excitotoxicidad por administración de ácido caínico

El ácido caínico es un agente excitatorio yneurotóxico que actúa sobre el subtipo cainatode receptor de glutamato y que posee un im-portante efecto convulsionante36. Una horadespués de la administración se manifiestanconvulsiones tónico-clónicas en el 75% de losanimales. La evaluación histopatológica a los 4días revela una lesión cerebral con pérdidaneuronal sólo en aquellos animales que hanmanifestado signos de convulsión. Se observauna pérdida neuronal considerable en la corte-za piriforme, la capa piramidal (campos CA1 yCA3) y el hilus del hipocampo y, en menorgrado, en la amígdala y el tálamo.

Inducción de Hsp70

La isquemia provoca inducción del ARNmHsp70 en el lado del cerebro ipsilateral al deoclusión de la ACM. El ARNm se detecta apartir de 30 min después del episodio isqué-mico durante el período de reperfusión del teji-do (fig. 2). Una franja estrecha de tejido queenvuelve al núcleo isquémico presenta el ma-yor nivel de expresión del ARNm. Más adelan-te, entre las 8 y las 24-48 h, se observa en es-ta zona la expresión de la proteína Hsp70 enneuronas que presentan un aspecto morfológi-co normal. Se ha propuesto que esta franja detejido con neuronas que expresan Hsp70 co-rresponde a la zona de penumbra37,38. En elnúcleo isquémico la proteína Hsp70 se locali-za en unas pocas neuronas, astrocitos, y mi-croglía y células endoteliales. Los valores deHsp70 disminuyen a partir de las 24-48 h,hasta que a los 7 días apenas se detecta laproteína.

La administración de ácido caínico causa in-ducción del ARNm y proteína Hsp70 en el ce-rebro de rata4-6,8. Ambos se detectan sólo enlas ratas que previamente han manifestadoconvulsiones. A las 2,5 h después de la admi-nistración de ácido caínico ya se detecta unainducción considerable de ARNm5, que au-menta a las 5 h6. Las regiones cerebrales queexpresan este ARNm son mayoritariamente lacorteza piriforme y entorinal, las zonas CA1 yCA3 de la capa de neuronas piramidales delhipocampo, los complejos amigdaloide y subi-cular, así como la corteza parietal y temporal.La proteína Hsp70 se detecta a las 6, 12 y 24 hposteriores a su administración (fig. 3) siguien-do un patrón regional similar al del ARNm4-6.

En general, las neuronas que expresan Hsp70poseen una morfología normal según se obser-va mediante inmunohistoquímica, que revelaun marcaje similar al de la tinción de Golgi(fig. 4). Se detecta una expresión neuronal deHsp70 en la corteza piriforme, a las 6 h poste-riores a su administración, pero no a las 24 h,ya que en este tiempo dicha zona presentauna lesión con pérdida neuronal importante.Este es un ejemplo de expresión de ARNm yproteína en neuronas que pueden morir des-pués de la lesión. Sin embargo, neuronas queexpresan Hsp70 en otras zonas del cerebrosobrevivirán ya que, por ejemplo, en la corteza

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MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN LA ISQUEMIA Y EXCITOTOXICIDAD CEREBRAL

Fig. 2. Expresión de ARNm hsp70 (A) y c-fos (B)mediante hibridación in situ en cortes de cerebroconsecutivos a los 30 min después de 1 h de isque-mia. Hsp70 se induce principalmente en la cortezaparietal y estriado. La inducción ocurre de forma te-nue en la zona de infarto y más intensamente en lazona de penumbra situada entre el núcleo isquémi-co y el tejido no lesionado. Comparativamente, la ex-presión de c-fos abarca una zona más extensa queincluye zonas más alejadas del infarto, como la cor-teza frontal, donde la inducción es mayor.

parietal existe una abundante expresión deHsp70 y en cambio no se observan signosmorfológicos de lesión5,6. Sin embargo, a los 4y 7 días, el patrón de distribución regional dela Hsp70 se ve modificado porque la proteínaha viajado a otras regiones mediante transpor-te axonal4.

Inducción de c-fos

El c-fos es un gen inducible que normal-mente no se expresa en el cerebro en condi-

ciones fisiológicas. Sin embargo, después deun episodio de isquemia focal de 1 h de dura-ción se detecta ARNm c-fos en la zona irriga-da por la ACM ya a los 30 min, aumenta hasta1 h y después decae a las 2-4 h. A partir deeste momento queda una inducción baja dec-fos en las áreas adyacentes al núcleo isqué-mico. La proteína c-Fos se detecta en el nú-cleo de las células, ya que es un factor detranscripción que normalmente adquiere unadistribución nuclear. De forma similar alARNm, hemos detectado la proteína c-Fos en

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Fig. 3. Expresión de la proteína Hsp70 en el hipocampo de rata control (A), y 24 h después de la administraciónde ácido caínico (B-D). El ácido caínico induce una intensa expresión de Hsp70 en CA3 y CA1. Estas zonas su-fren una importante pérdida neuronal; DG: giro dentado; CA1 y CA3: zonas de la capa piramidal. Escala: A y B,500 µm; C y D, 100 µm.

células situadas en la zona más afectada porla isquemia a las 6 h. Sin embargo, a las 24 h,sólo se detecta c-Fos en células localizadas enzonas perifocales respecto al núcleo isquémi-co. Comparada con la distribución de Hsp70,c-Fos no suele expresarse en las mismas célu-las, y aunque hemos visto que Hsp70 podríademarcar la zona de penumbra, c-Fos se sitúamás lejos de la zona de infarto. La adminis-tración de ácido caínico también provoca in-ducción de c-Fos mayoritariamente en células

que no expresan Hsp70. Aun así, a tiemposcortos después de la isquemia o administra-ción de ácido caínico (horas) se observa deforma ocasional y transitoria una coexpresiónde Hsp70 y c-Fos en algunas pocas células9.

Inducción de Cox-2

En ratas control se observan unos valoresmuy bajos del ARNm y proteína Cox-2 en lacorteza cerebral, capa granular del giro denta-do y zona CA3 de la capa piramidal. Un episo-dio de isquemia focal produce la inducción deCox-2 en el lado ipsilateral al de oclusión de laACM. El ARNm inducido se detecta ya a los30 min después de un episodio de 1 h de is-quemia, o bien después de convulsión provo-cada por ácido caínico. Tanto el ARNm comola proteína están localizados principalmente enzonas perifocales al núcleo9,16. Seis horasdespués de la agresión sólo se observa coloca-lización de Cox-2 y Hsp70 en unas pocas cé-lulas. Sin embargo, a las 24 h no existe colo-calización entre Cox-2 y Hsp70. En cambio,Cox-2 y c-Fos están expresadas en las mismascélulas, aunque c-Fos es una proteína nucleary Cox-2 citoplasmática9.

Discusión

Un episodio de isquemia cerebral focal pro-voca la inducción de Hsp70 en neuronas, as-trocitos, microglía y endotelio, de acuerdo conlo observado en estudios previos8,11,37,38. Ki-nouchi et al38 han propuesto un modelo segúnel cual se puede establecer un grado de sensi-bilidad celular a la isquemia en función de laexpresión de Hsp70. Así, las neuronas seríanlas células neurales más sensibles capaces deexpresar Hsp70 después de un episodio is-quémico de baja intensidad. Les seguirían lascélulas gliales y, finalmente, las endoteliales.Las neuronas situadas en la zona de la pe-numbra isquémica son las que presentan losmayores valores de expresión de Hsp70. Lazona de penumbra39,40 circunda el núcleo is-quémico y sufre sólo una pequeña reduccióndel flujo sanguíneo. En esta zona, el metabolis-mo energético sostiene unos valores mínimossuficientes como para mantener determinadasfunciones celulares vitales como, por ejemplo,el gradiente transmembrana. Sin embargo, es-tos mínimos no son suficientes para mantenerla actividad eléctrica. Así, se producen cam-bios importantes tanto intra como extracelula-res y algunas neuronas pueden morir a medi-

25


Fig. 4. Neuronas corticales que expresan Hsp70 24 hdespués de administración de ácido caínico. Las di-ferentes imágenes corresponden a capas corticalesen la zona de la corteza parietal: (a) capa II; (b) ca-pa IV, y (c) capa VI. La corteza cerebral no sufre le-sión histológica. Escala 25 µm.

da que transcurre el tiempo41. La zona de pe-numbra posee, por esta razón, un especial in-terés desde el punto de vista farmacológico, yaque la pérdida neuronal que sufre no ocurrede forma tan inmediata como la que se produ-ce en el núcleo isquémico y es, por tanto, mu-cho más susceptible de responder a trata-mientos farmacológicos42. Se ha propuestoque la Hsp70 ejerce un efecto protector sobrelas neuronas de la penumbra43. Sin embargo,numerosos trabajos concuerdan en que la pro-teína Hsp70 puede ser necesaria, aunque enalgunos casos no es suficiente para asegurarla supervivencia celular8. De todas formas, lapotenciación de la expresión de Hsp70 en lasneuronas de la penumbra isquémica podríaprevenir o atenuar la muerte celular en estazona.

La administración sistémica de ácido caíni-co provoca una intensa expresión del ARNm yproteína Hsp70 en diferentes regiones cere-brales. Comparando las regiones en las que seinduce el gen hsp70 con las zonas que desa-rrollan muerte celular después de administra-ción de ácido caínico se observa que no existeuna correlación clara. Por tanto, la expresióndel ARNm hsp70 no predice si la célula va ono a morir5,8,9.

El MK-801, un antagonista no competitivodel receptor NMDA, puede prevenir la induc-ción de Hsp70 en ciertas regiones cerebralesdespués de administración de ácido caínico6 ode un análogo del ácido iboténico7. El MK-801inhibe la expresión de Hsp70 inducida por elácido caínico en la corteza y el tálamo, lo quepodría representar la correlación neural delefecto anticonvulsionante que posee este anta-gonista NMDA. Estos resultados indican que laexpresión de Hsp70 inducida por fenómenosde excitotoxicidad está mediada, al menos enparte, por receptores NMDA. De forma similar,se ha descrito que el MK-801 reduce el nivelde inducción de c-Fos13,14 y también de Cox-233 después de la isquemia o de convulsiones,de lo que se deduce que la expresión de estosgenes está mediada en parte por receptoresNMDA y, por tanto, la inducción génica des-pués de administación de ácido caínico debeproducirse de forma transináptica.

La expresión de Cox-2 y c-Fos ocurre enneuronas que sobreviven a la isquemia (zonasperifocales como son la corteza frontal y cin-gulado) o excitotoxicidad (neocórtex y girodentado del hipocampo). Además, la expre-sión de c-Fos y Cox-2 se observa también enzonas que desarrollan muerte neuronal des-

pués de la administración de ácido caínico(corteza piriforme y capa piramidal del hipo-campo).

Cox-2 se induce en neuronas que expresanc-Fos. Sin embargo, se desconoce si estos dosfenómenos están relacionados entre sí. En elnúcleo de las células, c-Fos interacciona conmiembros de la familia Jun y forma complejosheterodiméricos capaces de unirse a las se-cuencias AP-1 del ADN y así modular la trans-cripción de otros genes26. En el promotor delgen de la Cox-2 se ha descrito la presencia deuna secuencia similar a AP-1 junto con otroselementos reguladores44,45, que pueden con-tribuir en mayor o menor grado a impulsar lainducción de Cox-2.

Este trabajo sugiere que c-Fos, Cox-2 yHsp70 se expresan como resultado de la res-puesta celular a un entorno alterado. La expre-sión indica sensibilidad celular pero no el de-venir de la células afectadas.

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V. CEÑA: Resulta un poco sorprendente queMK-801 sea capaz de proteger de algunaforma o de inhibir la expresión de heat shockprotein (HSP) tras la administración de caíni-co. ¿Se ha comprobado experimentalmenteque están incrementados los valores de se-creción de glutamato tras la administraciónde ácido caínico?

A.M. PLANAS: No puedo responderte con todacerteza con qué técnicas, pero otros autoreshan demostrado que se produce un incre-mento de glutamato tras la administración deácido caínico. Además de inhibir la expre-sión de HSP, MK-801 también inhibe la ex-presión de c-fos y de Cox-2. De ello sededuce que podría estar interfiriendo sobrealgún aspecto de la propagación de la activi-dad eléctrica cerebral.

V. CEÑA: Mi segunda pregunta tiene que vercon el papel que puede desempeñar la ex-presión de Hsp70 en la cadena de aconteci-mientos que tras la isquemia conducen a lamuerte neuronal, especialmente en la zonade penumbra, donde se expresa Hsp70, ypor la trascendencia que puede tener desdeel punto de vista terapéutico. Si bien la Cox-2parece claro que va a producir secundaria-mente un incremento de radicales libres,¿dónde encajaría la Hsp70 en esta cadenade acontecimientos?

A.M. PLANAS: Este es un tema muy interesante.A través de experimentos in vitro, se ha ob-servado que la existencia de proteínas des-

DISCUSIÓN

naturalizadas en una célula desencadena laactivación del head shock factor, que actua-ría como promotor de la HSP activando la ex-presión del ARNm, lo que favorece la síntesisproteica. En nuestras células, los cambios is-quémicos generan desnaturalización de pro-teínas y, por tanto, se induce Hsp70. La HSPpodría contribuir a que las proteínas perma-nezcan estables, de forma que no se degra-den ante una situación adversa del entorno.Aunque parece que el papel de la HSP esmuy importante para asegurar la superviven-cia de la célula, probablemente no sea elúnico elemento responsable. Si la expresiónde HSP en la penumbra se demuestra quees muy significativa, verdaderamente tendríagran interés disponer de herramientas farma-cológicas, hasta el momento inexistentes,que contribuyeran a incrementar dicha ex-presión.

R. BARTRONS: Cada vez en más modelos expe-rimentales y en diferentes tejidos se está de-mostrando que la isquemia induce apopto-sis. ¿Habéis estudiado si realmente la muer-te en la primera zona es apoptótica? Ensegundo lugar, me gustaría destacar unosresultados publicados recientemente* donde

*Grilli M, Pizzi M, Memo M, Spano P. Neuroprotectionby aspirin and sodium salicylate through blockade ofNF-κB activation. Science 1996; 274: 1.383-1.385.

inhibidores de ciclooxigenasa producían unadisminución de la neurotoxicidad inducidapor glutamato y donde se postulaba que es-te hecho probablemente estaba relacionadocon la inhibición de NFκ-B. ¿Habéis estudia-do si la inducción de Cox-2 puede frenarsemediante la presencia de estos inhibidores?

A.M. PLANAS: No hemos efectuado estos estu-dios, aunque justamente ahora estamos ini-ciando una serie de trabajos con NFκ-B queno se han presentado por disponer única-mente de resultados preliminares. Es eviden-te el interés que supone analizar el efecto delos inhibidores, sobre todo orientado a la po-sibilidad de prevenir los efectos secundariosque ocurren durante la reperfusión del tejidoy que acontecen de una manera más lentaque la lesión isquémica en sí.

Respecto a la primera pregunta, se podríadiscutir extensamente sobre si la muerte esapoptótica o necrótica. En el modelo de is-quemia global en gerbos, podríamos decirque la muerte neuronal tiene más de apopto-sis que de necrosis, aunque tampoco res-ponde al patrón clásico de muerte celularprogramada. Quizá las definiciones de necro-sis y apoptosis sean dos extremos entre loscuales encontramos un abanico de diferen-tes situaciones que pueden llevar a la muer-te. En la zona de isquemia focal pienso queexiste un componente necrótico muy impor-tante, un gran edema y una considerablegliosis. En cambio, en la zona de penumbradonde la muerte ocurre de una forma másprogresiva antes de morir de una formaapoptótica podría producirse un intento derespuesta ante un entorno adverso.

J.C. LEZA: En vuestro modelo experimental,¿habéis estudiado si existe colocalización,por ejemplo, con iNOS y cuál sería la partici-pación temporal de los dos sistemas?

A.M. PLANAS: No lo hemos estudiado específi-camente, aunque creo que también debería-mos analizar la posible relación con NFκ-B.A pesar de haber centrado mi presentaciónen los acontecimientos que se producen a

corto plazo después de la isquemia, lógica-mente deberíamos pensar también en la par-ticipación de otros elementos y sistemas co-mo, por ejemplo, la respuesta glial, que tam-bién estamos estudiando, que tienen lugarde una forma mucho más progresiva. Evi-dentemente que la activación de NOS puededesempeñar algún papel, aunque lo desco-nocemos en este momento.

R. MALDONADO: ¿Sabéis si el aumento de expre-sión de c-fos tiene alguna relevancia funcio-nal específica, o bien se trata simplementede un marcador de cambios en la actividadmetabólica?

A.M. PLANAS: Inicialmente pensábamos quepodía ser marcador de muerte celular, peroobservamos que también se expresaba en al-gunas células que no sufrían necrosis niapoptosis. Actualmente creemos que la ex-presión de c-fos junto con otros elementos,pero no por sí sola, puede tener significaciónfuncional en el proceso de muerte celular.

J.M. BAEYENS: Los bloqueadores de los canalesdel calcio dependientes de voltaje mejorantanto las convulsiones como determinadosfenómenos isquémicos. ¿Conocéis si en ani-males pretratados con dichos compuestos sealtera la expresión de estas proteínas?

A.M. PLANAS: En trabajos realizados por el gru-po del Dr. Juan Serratosa del Departamentode Farmacología de nuestro centro de inves-tigación se sugiere que la expresión de c-fospodría estar relacionada con la activación decanales de calcio. Esto no ocurre, sin embar-go, con la HSP. Analizando varios agentesconvulsionantes que actuaban a diferentesniveles, sólo observamos inducción de HSPcuando la lesión era suficientemente impor-tante como para llegar a producir muerteneuronal, sin que ello pudiera asociarse acanales o receptores conocidos. Desde unpunto de vista puramente intuitivo, pareceque la HSP únicamente se expresaría en cé-lulas excitatorias, porque se ha evidenciadoen neuronas piramidales tanto del hipocam-po como de la corteza cerebral.

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Introducción

La exocitosis es un proceso que consiste enla fusión de una vesícula citoplasmática con lamembrana celular y es el más común de losmétodos que utilizan las células para secretarsustancias al exterior y para renovar su mem-brana. La exocitosis es un proceso celular uni-versal que abarca desde las levaduras hastalas neuronas. La mayor parte de los neuro-transmisores son liberados por exocitosis.

Las células cromafines de la médula supra-rrenal constituyen un excelente modelo para elestudio de la neurosecreción. Estas células li-beran catecolaminas (adrenalina y noradrenali-na) al torrente sanguíneo en respuesta a estí-mulos estresantes como el frío, el ejercicio, elmiedo o las situaciones de hipoglucemia, dehipotensión o de alergia. Las catecolaminas an-tagonizan gran parte de estas acciones deleté-reas inducidas por mediadores como la hista-mina o la bradicinina y nos protegen en las si-tuaciones de estrés.

En particular, el uso de las células cromafi-nes se ha revelado como un excelente métodopara el estudio del fenómeno exocitósico.

Los mecanismos moleculares implicados enla respuesta secretora se han ido dilucidando alo largo de los últimos 35 años y constituyen unhermoso ejemplo de cómo el avance de la cien-cia ha ido cambiando nuestra visión de la biolo-gía celular. A lo largo de los años sesenta y se-tenta se fueron estableciendo los requerimien-tos iónicos necesarios para desencadenar lasecreción. Así, se supo que era el calcio el úni-co elemento cuya presencia era necesaria (ysuficiente) para que el proceso tuviera lugar. Tales la dependencia del calcio que se acuñó eltérmino acoplamiento excitación-secreción porla analogía con la contracción muscular1. El pa-pel crucial del calcio se vio reforzado cuando secomenzaron los experimentos con células per-meabilizadas. A finales de la década de los se-

tenta, Baker y Knight descubrieron que si lascélulas cromafines eran sometidas a descargaseléctricas de alto voltaje en la membrana de és-tas se producían unos poros por los que podíandifundir iones y pequeñas moléculas2.

El uso de células permeabilizadas ha venidosirviendo para dilucidar algunos mecanismosmoleculares implicados en el funcionamientode la maquinaria secretora. Así, el concurso dela sinaptobrevina se estableció tras comprobar-se que las toxinas botulínica y tetánica inhibíanla secreción3,4. El papel de las distintas pro-teincinasas C, A y G se ha ido esclareciendomediante la comparación entre los efectos so-bre células intactas y permeabilizadas5-7.

La llegada de las técnicas de patch-clampcon sus variantes ha servido para el estudio delos canales iónicos y la exocitosis por los méto-dos de capacitancia. La circunstancia de quela pipeta provoque el rápido dializado del cito-sol permite la aplicación de sustancias al inte-rior celular y establecer su papel en el fenóme-no secretor8.

Buena parte de nuestro conocimiento, noobstante, está llegando de la mano de la biolo-gía molecular y de las técnicas de hibridaciónin situ9.

Una característica que ha permitido el es-pectacular avance reciente sobre el esclareci-miento del fenómeno secretor es su universali-dad. Buena parte de las proteínas implicadasen la exocitosis comparten papel en todas lascélulas10.

Acoplamiento excitación-secreción. La señal del calcio

Dos son los tipos de estímulos que recibe lamédula suprarrenal: la descarga de los nerviosesplácnicos y las sustancias secretagogas quellegan por vía hemática. La acetilcolina es elprincipal mediador de los nervios esplácnicosque, actuando sobre receptores nicotínicos,

Mecanismos moleculares implicados en la secreciónde catecolaminas por las glándulas suprarrenales

Ruth Jaén, Manuel Pérez-Morán y Ricardo BorgesDepartamento de Medicina Física y Farmacología.

Facultad de Medicina. Universidad de La Laguna. Tenerife.

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produce la despolarización de la célula con laapertura de canales voltaje-dependientes paraNa+ y Ca2+. La entrada de este último ion va aponer en marcha el proceso exocitósico.

El receptor nicotínico adrenomedular esdel tipo neuronal11 y su estimulación por fár-macos agonistas va seguida de una rápidadesensibilización (fig. 1). Las respuestas se-cretoras mediadas por receptores nicotínicosson enteramente dependientes del Ca2+ ex-tracelular.

Diversas sustancias como la histamina12,13,la bradicinina12, la muscarina13 o la angiotensi-na II12 estimulan la secreción mediante la mo-vilización adicional de Ca2+ desde reservoriosintracelulares. La capacidad de estos reservo-rios es pequeña si se compara con otras célu-las como las musculares. Dependiendo de sulocalización, los reservorios intracelulares pue-den mantener la secreción celular, duranteunas decenas de segundos, en ausencia decalcio extracelular13-15.

Los receptores para estas sustancias estánacoplados a proteínas G y median sus respues-tas mediante la movilización de inositoles fosfa-tos y la translocación de la PKC. Sin embargo,los ésteres de forbol que estimulan directa-mente la PKC potencian la secreción mediadapor estímulos despolarizantes (agonistas nicotí-nicos o soluciones ricas en potasio), no alteranlas mediadas por bradicinina y abolen las res-puestas secretoras inducidas por histamina,angiotensina II o muscarina12. Estas observa-ciones ponen de manifiesto importantes dife-rencias en los mecanismos de transducciónaparentemente similares.

La movilización del Ca2+ intracelular median-te cafeína o IP3 ha sido utilizada para dilucidarel papel de estos reservorios. La cafeína provo-ca la liberación de catecolaminas de maneraindependiente del Ca2+ extracelular13. La for-ma en la que los rerservorios se recargan deCa2+, corrientes capacitativas, es aún poco co-nocida porque se desconoce el mediador quela pone en marcha, pero esta recarga ocurreen muy pocos segundos.

El papel fisiológico que los distintos cana-les de calcio desempeñan en la secreción fueobjeto de amplio estudio en un reciente nú-mero de estas monografías16, por lo que nonos parece oportuno volver a ahondar en eltema.

Las concentraciones intracelulares del Ca2+

vuelven a sus valores normales utilizando losmismos mecanismos de todas las células eu-cariotas: recaptación (calciosomas, retículo en-

doplásmico, mitocondrias y gránulos cromafi-nes), intercambio Na+-Ca2+ y la bomba deCa2+ (ATPasa).

Las técnicas amperométricas nos ofrecenuna “visión”, a tiempo real, del fenómenoexocitósico

Nosotros hemos utilizado para nuestros estu-dios primordialmente este tipo de técnicas. Laamperometría se basa en la detección electro-química de los productos liberados. Muchassustancias se oxidan instantáneamente si seles aplica un potencial eléctrico positivo. Ennuestro caso, cada molécula de catecolaminaproduce dos electrones que son captados porel propio electrodo con el que se aplica el po-tencial. Los electrodos suelen construirse decarbón y pueden ser de gran tamaño, para es-tudios de superfusión de células o de glándu-las suprarrenales17-20, o muy finos con los quepueden fabricarse microsensores de muy po-cos micrómetros de diámetro. La adquisiciónde señales se lleva a cabo mediante un poten-ciostato; éste es un amplificador modificadopara mantener constante un potencial sobre elelectrodo, lo cual permite ajustar el potencialde oxidación, en este caso, para las catecola-minas21.

Las catecolaminas se almacenan en altísi-mas concentraciones, superiores a 500 mM,en el interior de los denominados gránulos cro-mafines. Unas 10.000 de estas estructuras ve-siculares se encuentran distribuidas en el cito-plasma de las células, aunque sólo una por-ción de ellas está l ista para l iberar sucontenido. Las catecolaminas presentes en lamédula suprarrenal son suficientes para, de li-berarse, provocar la muerte del animal. Es,pues, imprescindible que las células cuentencon precisos mecanismos de control22.

La secreción puede estimularse aplicandoun secretagogo (una sustancia que estimula lasecreción: acetilcolina, histamina, bario o solu-ciones despolarizantes) en la cercanía de la cé-lula. En pocas décimas de segundo puedenobservarse, en el osciloscopio, una serie de de-flecciones que se corresponden con la oxida-ción de las catecolaminas liberadas por exoci-tosis desde los gránulos cromafines. Estas de-flecciones, o espigas, poseen una morfologíamuy variable y es necesario realizar un análisispoblacional de varios cientos de espigas para in-ferir la concentración de los componentes solu-bles. De esta forma, se ha estimado la concen-tración de catecolaminas en torno a 550 mM.

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33

MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN LA SECRECIÓN DE CATECOLAMINAS POR LAS GLÁNDULAS SUPRARRENALES

DMPP 100 µM5 min

Adr

enal

ina

500

ng/m

l

DMPP100 µM

Histamina30 µM

Bradicinina10 nM

Acetilcolina100 µM

Metacolina30 µM

Angiotensina II100 nM

Fig. 1. Monitorización continua de las respuestas secretoras de catecolaminas por la glándula adrenal de rataperfundida. Se exponen algunos registros típicos obtenidos con detección electroquímica. En la parte superiorse demuestra la reproducibilidad de las respuestas ante estímulos nicotínicos de corta duración (DMPP, dime-til-fenilpiperazinio) durante 10 s cada 8 min. En los trazos inferiores se observa la respuesta secretora ante di-versos agonistas aplicados durante el tiempo señalado con la barra horizontal fina. La barra superior señala eltiempo (5 min) y la vertical la calibración en ng/ml de adrenalina.

Sabemos que el ATP (trifosfato de adenosina)se almacena en una proporción fija cuatro ve-ces inferior, es decir unos 130 mM. Si ademásconsideramos la alta cantidad de calcio (80mM) y la presencia de proteínas, ascorbato ypéptidos, no deja de parecer asombrosa la ca-pacidad de almacenamiento que poseen estaspequeñas organelas23,24.

Último estadio de la exocitosis. El poro de fusión. Papel de la matriz intragranular

Una vez que el gránulo se ha unido a lamembrana puede ocurrir o no la exocitosis, yaque, si bien el proceso de acercamiento re-quiere de Ca2+ y de ATP, este último sólo de-pende del Ca2+. Estudios con amperometríaevidencian la presencia de un “pie” que es ob-servable en un 30-50% de las espigas de se-creción23 (fig. 2). Durante unos 10 ms se for-ma un poro de fusión que une el espacio extra-celular con el lumen granular. Este poro va apermitir la salida de la fracción de catecolami-nas no complejadas (44 mM) calculándoseque unas 34.000 moléculas pasan por el poroen cada ms. Se ha estimado en un 10% laadrenalina contenida en el gránulo que se en-cuentra en este estado libre.

El diámetro estimado del poro de fusión esde unos 2 nm, aproximadamente los valoresestimados para un canal iónico. La naturalezaquímica de este poro de fusión, proteica o lipí-dica, sigue siendo materia de controversia. Seha demostrado recientemente que la fusiónpuede ser reversible y que puede no producir-se la exocitosis total24.

El poro de fusión va a permitir la entrada deagua y de otros iones extracelulares al interiorprovocando el brusco hinchamiento y el ensan-che del poro de fusión hasta formar una ima-gen en Ω, para posteriormente verter el conte-nido completamente al exterior. Sólo van a per-manecer unidas a la membrana algunasfracciones de proteínas como la DBH o las cro-mograninas.

El gel compuesto por proteínas, ATP y cate-colaminas se termina de disociar a continua-ción. La exocitosis transcurre en unos 10-30 msy se liberan unas 350.000 moléculas de cate-colaminas.

La altísima concentración de solutos intra-granulares mencionada anteriormente permitecalcular la osmolaridad en unos 800 mOsm.Esta hipertonicidad llevaría al hinchamiento delgránulo y a su rotura. Es plausible la presenciade mecanismos de complejación de los solutos

entre sí formando una matriz que es visible a lamicroscopia electrónica.

Durante los últimos años se ha especuladoacerca del papel fisiológico de la matriz intra-granular. Su principal componente es la cro-mogranina A, una proteína acídica (pKa 5,5)que se libera en su práctica totalidad tras laexocitosis. Algunos de sus fragmentos poseenuna potente actividad biológica25, aunque noestá demasiado clara la existencia de mecanis-mos de corte específico operantes. Sin embar-go, la presencia de la matriz intragranular escomún a muchas células, aunque su naturale-za química sea variable. Así, los mastocitos uti-lizan un gel de heparán sulfato para formarcomplejos de histamina y serotonina. El hechode que ambos tipos celulares, mastocitos ycromafines, se comporten de manera similarante cambios de temperatura, ambienteiónico26 o cambios osmóticos27 hace pensarque las cromograninas desempeñan un papelimportante en el almacenamiento de las cate-colaminas.

Recientemente se ha postulado que es posi-ble que la matriz intragranular no limite su pa-pel a la asociación pasiva de sus componentessolubles y que pueda ejercer un papel funcio-nal en el equilibrio fracción libre/complejada.En este sentido, se ha descrito la presencia deun receptor para IP3 en la membrana granularacoplado a la cromogranina A28. De ser así, esposible que un mediador celular pudiera alte-rar el grado de unión de las catecolaminas y elATP a la matriz proteica. La cantidad de cate-colaminas por gránulo no se alteraría, pero sí lavelocidad en que éstas serían liberadas al me-dio externo. En una sinapsis esto se traduciríaen un incremento de la concentración con laque el neurotransmisor llega a la neurona post-sináptica y, por tanto, un incremento de la efi-ciencia sináptica.

El ciclo vital de los gránulos cromafines

Debido a que contienen proteínas de grantamaño, los gránulos cromafines sólo puedenser fabricados en el trans-Golgi aunque alcan-zan su maduración una vez liberados al cito-plasma. El proceso de maduración se lleva acabo de una parte acidificando el contenidogranular hasta un pH 5,5 y por otra recargán-dose de catecoles, purinas, ATP, ascorbato y,probablemente, péptidos. De igual forma, losgránulos constituyen un amplio reservorio decalcio cuyo papel fisiológico está aún por esta-blecer.

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300 pA

20 s

Máximo

Inicio Final

Electrodo

Pipeta

Imax= 189.61 pA

Q= 1.315 9 pC

t1/2= 3.415 2 ms

*

Fig. 2. Registro amperométrico de la respuesta exocitótica de una célula cromafín bovina. En el trazado supe-rior se observa un registro obtenido tras la aplicación de Cl2Ba 5 mM durante 5 s. La secreción se evidencia enforma de espigas cuya morfología nos ofrece información acerca de los mecanismos de almacenamiento y deliberación. En la parte superior se expone la situación del electrodo y en la parte inferior un registro amplificadode la espiga señalada con el asterisco. De cada espiga se obtienen una serie de parámetros básicos: Imax, t1/2 y Q,que se corresponden con la concentración de catecolaminas liberadas, la velocidad de secreción y la cantidadde aminas presentes en el gránulo. Las barras de calibración indican la corriente de oxidación (en nA) y eltiempo (en ms).

Como mencionábamos anteriormente, unafracción importante de gránulos (aproximada-mente el 70%) no son susceptibles de ser libe-rados. De los restantes se distinguen al menosdos poblaciones en virtud de su capacidad pa-ra ser liberados.

Las células cromafines poseen un armazónde citosqueleto formado por fibras de actinaque previene el acceso de los gránulos a lamembrana plasmática29. La presencia de cal-cio facilita, además de la exocitosis, el movi-miento de vesículas desde un compartimientoal otro30. El proceso de desensamblaje del ar-mazón de actina, aunque sigue siendo objetode debate, parece estar mediado por una pro-teína activada por calcio, la escinderina9, quecorta la actina. Esta reacción está aceleradapor la proteincinasa C y el ATP, ya que los és-teres de forbol la favorecen y la ausencia deATP la impide. De cualquier manera, el desen-samblaje de la actina puede ser condición ne-cesaria, pero no suficiente para la secreción.

Estudios llevados a cabo con técnicas ampe-rométricas y de capacitancia permiten distin-guir dos31 o tres32 diferentes poblaciones degránulos en virtud de su rapidez para secretar.Un primer grupo de gránulos, estimado enunos 20, puede ser liberado casi de inmediatoy podríamos denominarlo de liberación ul-trarrápida32, y un segundo grupo de pocoscientos de gránulos lo hace en pocossegundos30-32. La exocitosis de ambos gruposde gránulos sólo requiere de la elevación delcalcio. Existe, no obstante, una gran controver-sia acerca de la concentración de calcio nece-saria para producir la exocitosis. Mientras laspruebas bioquímicas apuntan a valores bajos,unos 1-15 µM2,33, datos recientes parecen evi-denciar que el enorme gradiente extra-intrace-lular unido a la baja difusión del calcio34 pue-den llevar a crear microdominios de alto calcio(varios cientos de µM) en donde se producirían“zonas calientes” de secreción35,36. El resto delos gránulos precisa ser transportado hacia lavecindad de la membrana, proceso que re-quiere Ca2+ y ATP, y los gránulos se liberan alo largo de decenas de segundos30.

El gránulo, una vez secretado, es retraídohacia el interior celular y sus membranas sonrecicladas para formar nuevos gránulos. Esteproceso, denominado endocitosis, tiene porobjeto mantener la superficie de la membranaconstante y ahorrar materiales. La endocitosises, a su vez, un proceso dependiente del cal-cio. No obstante, el gránulo recuperado retienegran parte de sus componentes de membrana,

puede recaptar catecolaminas e, incluso, vol-ver a secretar si se aplica un estímulo secreta-gogo lo suficientemente intenso37. En su viajede vuelta al Golgi estas vesículas, recubiertasde clatrina, pueden fundirse con lisosomas for-mando endosomas, grandes vesículas claraspresentes en el citoplasma. Estas grandes vesí-culas claras se aprecian claramente tras la esti-mulación intensa de la célula.

En las células cromafines se distingue otraclase de vesículas, las vesículas claras peque-ñas. Éstas son muy abundantes en neuronassimpáticas y en la línea de feocromocitoma38

(un tumor de células cromafines) de rataPC12. El ciclo celular y, sobre todo, la funciónde estas vesículas, continúan siendo un temaoscuro.

El complejo de fusión

Toda una larga serie de proteínas han sidoimplicadas en el disparo y regulación de la exo-citosis. A lo largo de la última década este rom-pecabezas parece haber ido acomodando suspiezas. No obstante, estamos muy lejos de co-nocer cómo funciona realmente. Aunque noexiste un consenso sobre dónde ubicar cadauna de las proteínas, en la figura 3 se exponeun esquema acerca de cómo concebimos elcomplejo de fusión en la actualidad. Antes dela llegada del gránulo a su “punto de atraque”en la membrana celular, precisa de una proteí-na dependiente de GTP, la Rab 3A, sita en lamembrana del gránulo de la que se disociaráantes de la fusión. El NSF (n-ethylmaleimi-desensitive factor) está íntimamente acopladoa las SNAP (α, β y γ) antes de asociarse alSNARE (receptor para SNAP). El SNARE estacompuesto por una serie de proteínas cuyafunción continúa aún sin establecerse. Lasprincipales son la sinaptobrevina y la sinapto-tagmina presentes en la membrana granular yla SNAP-25 y la sintaxina que lo están en la ca-ra interna de la membrana plasmática39.

La sinaptobrevina es el sustrato de actuaciónde las toxinas botulínica y tetánica. La sinapto-tagmina parece ser el sensor de calcio que de-sencadena la exocitosis. En las terminacionesnerviosas simpáticas parece asociarse a los ca-nales de calcio tipo N40, pero la colocalizaciónno está tan clara en la célula cromafín donde,además, el canal N no parece estar implicadoen la secreción de catecolaminas20.

La sinaptofisina es la más abundante de lasproteínas de la membrana granular. Su fun-ción, sin embargo, continúa siendo un miste-

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rio. Su capacidad para formar poros en mem-branas lipídicas ha hecho postular la hipótesisde que se trata de la iniciadora del poro de fu-sión. También se ha especulado con su partici-pación en el proceso de endocitosis39 (fig. 3).

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Cromogranina A

Rab 3AGTP

Sinaptotagmina

Sinaptobrevina

NSF

SNAP

SNAP25Sintaxina

Ca2+

α/β γ

Sinaptofisina

Fig. 3. Complejo de fusión. Se representan algunas de las proteínas putativas que intervienen en el proceso deatraque y fusión del gránulo cromafín. El tipo de canal del calcio y su posible colocalización son objeto de debate.

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38


39


V. CEÑA: Cuando has hablado del efecto de latemperatura, aparte de que a 37 ºC se disociamucho mejor el complejo granular, hay otraserie de cambios que ocurren en la célula.Por ejemplo, la temperatura de transición defase de la membrana para la célula cromafínbovina es de 31 ºC, lo que significa que a 37 ºCla membrana es mucho más fluida y se facili-tan mucho más los fenómenos de fusión.Existe también la probabilidad de que el siste-ma SNAP-SNARE, a la hora de facilitar los fe-nómenos de fusión, funcione mejor a 37 ºC.En primer lugar, ¿qué parte considerarías quees relevante, en cuanto a la disociación delcomplejo de la matriz del gránulo, una vezque ha sido producida la exocitosis? Y, en se-gundo lugar, ¿qué valor le darías a una mejo-ría temperatura-dependiente de los mecanis-mos moleculares que llevan a la exocitosis?

R. BORGES: El incremento del número de espi-gas secretoras observado tras el cambio detemperatura es probablemente dependientede modificaciones ejercidas sobre la maqui-naria secretora. Estos cambios pueden ser laaceleración del transporte de gránulos hastala membrana celular e igualmente incremen-tar la afinidad de los mismos por el complejode fusión, teoría del SNARE. Sin embargo,nosotros estamos observando un notable in-cremento en la propia velocidad de expulsióndel contenido intragranular. Resulta difícilpensar que estos cambios sean motivadospor factores extragranulares como el SNARE.La hipótesis que nos parece más plausiblesería la de una interacción directa sobre laconstante de disociación de las catecolami-nas con la matriz proteica intragranular.

A. ZORZANO: ¿Hasta qué punto las proteínas sin-taxinas, SNAP-25, etc., son específicas y ex-clusivas de las vesículas secretoras? ¿Se en-cuentran también en otros compartimientosendosomales?

R. BORGES: El gran número de proteínas queexisten hace casi imposible responder de unaforma general a esta pregunta. La exocitosis,

tanto la constitutiva como la inducible, es de-pendiente de casi todas las proteínas que sehan descrito. Algunas de ellas también parti-cipan en la fusión de organelas dentro de lacélula, de forma independiente de los meca-nismos de exocitosis. Por esta razón, creoque la fusión es un fenómeno lo suficiente-mente general como para que la totalidad delas proteínas estén implicadas de una formabastante universal.

A. ZORZANO: Has comentado que estas vesícu-las proceden del aparato de Golgi y no de en-dosomas. ¿Qué evidencia experimental apoyadicha afirmación?

R. BORGES: Los gránulos poseen proteínasgrandes y péptidos para los que no existentransportadores en la membrana del gránulo,lo que obliga a pensar que proceden del apa-rato de Golgi. También en neuronas simpáti-cas, donde existe transporte axoplásmico, seobserva este transporte en vesículas densas olos gránulos, lo que conlleva a pensar quesea tributario a esta vía. Sin embargo, estándescritas las sinaptic-like vesicles, estas vesí-culas pequeñas recubiertas inicialmente declatrina, que probablemente sean productobien de la endocitosis o bien de endosomassituados cerca de la membrana celular, refi-riéndonos a neuronas largas.

V. SÁNCHEZ MARGALET: ¿Habéis estudiado el po-sible papel del ATP y de algunos de los pépti-dos, incluida la proteína de cromogranina,que se hallan a tan alta concentración?

R. BORGES: Lo primero que llama la atención esla estequiometría tan fija 1/4, que da la im-presión de que, de alguna manera, el ATP, lacromogranina y las catecolaminas están inter-actuando de una forma bastante estequimé-trica también. Mi opinión, que no he podidocontrastar, es que este ATP se puede llegar ahidrolizar de forma espontánea, aunque seaen un bajo porcentaje. Cambios bruscos depH y de la concentración del calcio puedenllegar a hidrolizar el ATP e incrementar estasfuerzas de disociación. Los experimentos de

DISCUSIÓN

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temperatura, los realizados con angiotensinaII, o simplemente aquellos en los que se au-menta la cantidad de IP3, refuerzan esta hi-pótesis.

V. SÁNCHEZ MARGALET: Dado que las células cro-mafines poseen receptores purinérgicos, mipregunta se refería concretamente a si exis-tían estudios del posible papel de estas sus-tancias una vez se han secretado.

R. BORGES: Se sabe que la activación de los re-ceptores purinérgicos inhibe la secreción. Sinembargo, el problema radica en la dificultadde depletar los gránulos de ATP sin inducir lamuerte de la célula.

J.M. BAEYENS: Me consta que habéis trabajadocon PKC pero, en cambio, no has hablado defenómenos de fosforilación y de su implica-ción sobre la liberación.

R. BORGES: Aunque realizamos algunos estu-dios con proteincinasa C sobre la transduc-

ción receptorial, he preferido no abordar estetema por tratarse de una línea de investiga-ción complementaria para nuestro grupo. Sinembargo, me gustaría destacar que resultacurioso, por ejemplo, observar que tras la in-cubación de células con concentracionesmuy bajas de cualquiera de los ésteres deforbol, las respuestas secretoras inducidaspor potasio se incrementan. Sin embargo,los ésteres de forbol no afectan a las res-puestas secretoras inducidas por bradicininamientras que estos activadores de la PKCabolen las respuestas a la histamina, a la an-giotensina II o a la metacolina. Esto nos lla-mó mucho la atención, y nos llevó a pensarque probablemente estemos hablando dedistintas dianas dentro de la célula. Estos ex-perimentos los realizamos en glándulas per-fundidas y es muy difícil hacer bioquímica enestas condiciones.

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IntroducciónLos receptores acoplados a proteínas G

(GPCR) constituyen la más importante superfa-milia de receptores de membrana plasmática,y median las acciones de numerosas hormo-nas, neurotransmisores, quimioquinas y estí-mulos sensoriales. La activación de este tipo dereceptores conduce a la interacción con proteí-nas G heterotriméricas específicas, que se di-socian en subunidades α y βγ, que a su vezmodulan la actividad de diferentes efectores demembrana plasmática, como adenilil ciclasas,fosfolipasas, canales iónicos, etc. Más reciente-mente se ha puesto de manifiesto que losGPCR modulan también vías de cinasas mito-génicas, lo que refuerza el amplio espectro deacciones fisiológicas mediadas por este tipo dereceptores, y el interés en conocer con detallesus mecanismos de activación y desactiva-ción1-3. En efecto, una característica generalde estos receptores es que poseen complejosmecanismos de regulación que modulan sucapacidad de respuesta, y que son esencialesen la integración de señales celulares y en pro-cesos de plasticidad y desensibilización. Estosmecanismos de regulación pueden afectar a suexpresión, a su funcionalidad y a su localiza-ción subcelular.

El trabajo realizado por diversos grupos enlos últimos 12 años ha puesto de manifiesto laexistencia de dos familias de proteínas que de-sempeñan un papel clave en la rápida modula-ción de la funcionalidad y la dinámica intrace-lular de receptores tras la activación por ago-nistas. En primer lugar, la familia de cinasas deGPCR, denominadas GRK (G protein-coupledReceptor Kinases), que fosforilan a estos re-ceptores de forma dependiente de agonista4-6.En segundo lugar, las proteínas desacoplantes

denominadas arrestinas, que se unen a los re-ceptores que han sido fosforilados por GRK,impidiendo de esta forma la transducción de laseñal desde aquél a las proteínas G heterotri-méricas6,7. Posteriormente, se inicia un proce-so de internalización transitoria de receptoresque permite su desfosforilación y reciclaje fun-cional5,8. Este complejo entramado regulatorioes, por tanto, parte esencial del sistema detransducción de señales al interior celular.

El papel esencial de las GRK y arrestinas enla modulación de la función de GPCR sugiereque cambios en su expresión y/o actividadafectarán a la eficacia de los sistemas de trans-ducción y podrán tener trascendencia fisiopa-tológica, lo que constituye la hipótesis funda-mental del proyecto de investigación de nues-tro laboratorio. El desarrollo de esta hipótesisrequiere un incremento sustancial del conoci-miento de los mecanismos moleculares de re-gulación de la funcionalidad y de la expresiónde GRK y arrestinas, así como de sus papelesen diversos procesos fisiológicos, lo que permi-tirá también la identificación de nuevas dianasy estrategias terapéuticas.

Procesos de desensibilización de receptoresacoplados a proteínas G

La desensibilización homóloga se define co-mo la pérdida de respuesta de un receptor asucesivas estimulaciones por su propio ligan-do. Utilizando inicialmente el modelo deladrenoceptor β2 (β2AR), se comprobó que ladesensibilización promovida por sus agonistasimplica muy principalmente a serina/treoninacinasas que fosforilan específicamente la formaactivada del receptor. La primera de estas ci-nasas que se identificó se denominó βARK (β-adrenergic receptor kinase)9. La fosforilaciónmediada por βARK per se no desacopla al re-ceptor de la proteína G, sino que más bien pro-mueve la unión de un factor citosólico, la pro-teína β-arrestina, que forma parte de una fami-lia de proteínas moduladoras7. La asociación

Mecanismos de regulación de receptores acoplados a proteínas G

Federico Mayor, Jr.Departamento de Biología Molecular y Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. CSIC-UAM.

Universidad Autónoma. Madrid.

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La investigación en el laboratorio del autor está financia-da por el Ministerio de Educación y Cultura(DGICYT/PM95-0033) y la Unión Europea. El Centro deBiología Molecular recibe una ayuda institucional de laFundación Ramón Areces.

de la β-arrestina es la responsable final deldesacoplamiento, al impedir la interacción delreceptor con la proteína G y bloquear así latransducción de la señal4,5. A este proceso dedesacoplamiento sigue una rápida internaliza-ción transitoria del receptor en estructuras en-docíticas, cuyo posible papel se ha sugeridoque puede ser permitir la desfosforilación delreceptor y su reciclado en estado funcional a lamembrana plasmática (proceso de resensibili-zación), como se discutirá posteriormente.

A raíz de estos datos se empezó a compro-bar que mecanismos de regulación muy simila-res operan en otros receptores acoplados aproteínas G. Además del sistema paralelo querige en la retina (con la rodopsina, la rodopsinacinasa y la arrestina), se ha demostrado queβARK puede fosforilar y regular diversos recep-tores, como adrenoceptores α2, muscarínicos,de sustancia P, de trombina, de angiotensina,receptores de aromas y otros muchos4-6. Estosdatos, junto con la reciente caracterización dedistintas cinasas relacionadas con βARK, queconstituyen la denominada familia multigénicaGRK, permite sugerir que todos los receptoresacoplados a proteínas G tendrán mecanismosde regulación similares.

Familia de cinasas de receptores acopladosa proteínas G

Como ya se ha mencionado, βARK fue el pri-mer miembro clonado de esta familia, y se de-nomina actualmente GRK2. Hasta el momento,se han identificado y clonado 6 GRK en mamí-feros, y dos homólogos en Drosophila y en C.elegans7-10. La mayoría de las GRK, con la ex-cepción de GRK1, que se expresa en retina ypineal y GRK4 (que se expresa mayoritaria-mente en testículo y células germinales), tie-nen un amplio patrón de expresión.

Las GRK comparten un dominio catalíticocentral de 272 aminoácidos homólogo a otrasserina-treonina cinasas y difieren tanto en unextremo N-terminal de 183-188 residuos defunciones aún poco conocidas como en un do-minio C-terminal de dimensión más variable yque contiene sitios de modificación postraduc-cional y regiones implicadas en la interaccióncon la membrana plasmática y con otras pro-teínas10. En efecto, puesto que sus sustratosconocidos, los GPCR, se encuentran en lamembrana plasmática, otro aspecto importantea considerar es cómo las GRK se asocian otranslocan a la membrana. La rodopsina cinasa(GRK1) posee en su extremo C-terminal el mo-

tivo CAAX que dirige su isoprenilación incorpo-rando un grupo farnesilo. GRK2 y GRK3 po-seen un dominio de interacción con las subu-nidades βγ de las proteínas G (residuos 546-670) que contiene un dominio de homología apleckstrina (pH, residuos 553-651), presenteen muchas proteínas de citosqueleto y proteí-nas señalizadoras11. Dado que las subunida-des βγ están constitutivamente asociadas conlas membranas a través del grupo geranilgera-nilo de la subunidad γ, la unión de GRK2 conβγ sería el mecanismo seleccionado para el an-claje de estas cinasas. Esto permitiría un con-trol muy exacto de localización de estas proteí-nas en un punto concreto de la membrana yen el momento en el que se necesitan, ya quela disponibilidad de subunidades βγ libres res-pondería a la activación de una población dereceptores dada. Así mismo, la presencia de βγestimula la actividad de GRK25,10.

El segmento de aminoácidos 643-673 deGRK2 parece ser crítico para la unión de Gβγ,y un péptido sintético correspondiente a esasecuencia bloquea la interacción entre ambasproteínas12. Por otra parte, se ha referido queel dominio N-terminal de la región de homolo-gía a pleckstrina interacciona con fosfatidilino-sitolbisfosfato (PIP2) y otros fosfolípidos. Datosmuy recientes sugieren que la unión de lípidosy Gβγ al dominio C-terminal de GRK2 aumentasinérgicamente la actividad de la cinasa y queambos anclajes son precisos para una correctalocalización de GRK2 en la membrana plasmá-tica13,14. El conjunto de los datos parece suge-rir que existen múltiples niveles de interacciónque cooperan para la activación y transloca-ción a la membrana de GRK2 tras la interac-ción del receptor con un agonista.

De hecho, la situación parece ser aún máscompleja. Nuestro laboratorio ha demostradorecientemente que una fracción muy significa-tiva de GRK2 está asociada a membranas in-ternas microsomales en distintos tejidos y lí-neas celulares, lo que plantea nuevas pregun-tas sobre las funciones fisiológicas de estacinasa15,16. Utilizando cinasa recombinante ensistemas reconstituidos, nuestro laboratorio haencontrado que GRK2 se asocia con alta afini-dad, como proteína periférica y mediante inter-acciones electrostáticas a una proteína integralde las membranas microsomales, de forma si-milar a su asociación transitoria con la mem-brana plasmática17. Es muy importante desta-car que aunque las proteínas G endógenas delas membranas microsomales son capacesde estimular la actividad de GRK2 unida, las

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subunidades βγ no parecen ser el principalcomponente de las membranas responsablesde la unión de GRK2. A diferencia de lo queocurre con las subunidades βγ, para las queGRK2 parece tener un sitio de unión en la zonaC-terminal (véase anteriormente), nuestros da-tos indican que el extremo N-terminal de la ci-nasa sería el responsable de su interacción conmembranas microsomales17,18. En definitiva,nuestros resultados sugieren la existencia deproteínas de anclaje adicionales para GRK2 ydefinen un nuevo dominio funcional en esta ci-nasa. En cuanto a otras GRK, GRK5 posee undominio C-terminal rico en aminoácidos bási-cos y polares que promoverían su asociación amembranas a través de interacciones iónicascon grupos negativamente cargados de los fos-folípidos. Por último, GRK6 se modifica porpalmitoilación en su región C-terminal, modu-lando así su asociación a membrana10.

Además de los mecanismos descritos, la ac-tividad y dinámica intracelular de las GRK, par-ticularmente de la mejor conocida GRK2, po-dría estar modulada por su asociación conotras proteínas o mediante fosforilación porotras cinasas. Así, muy recientemente se hadescrito la fosforilación de GRK2 y GRK5 porPKC, lo que alteraría su actividad modulandosu interacción con la membrana plasmática4.Datos preliminares de nuestro laboratorio su-gieren que la fosforilación de GRK2 por otro ti-po de cinasas será también importante para supapel en la célula.

Por otra parte, datos recientes indican queGRK2 es capaz de asociarse a microtúbulos yde fosforilar tubulina19, lo que aumenta el hori-zonte de sus funciones celulares. Por último,nuestro laboratorio ha identificado reciente-mente la existencia de un factor proteico cito-sólico capaz de modular la actividad de GRK2(Ruiz-Gómez et al, en preparación). En resu-men, la existencia de múltiples y complejosmecanismos de regulación de la actividad y lalocalización subcelular de GRK2 concuerdacon un papel esencial de esta cinasa en la se-ñalización mediada por GPCR.

Familia de proteínas desacoplantes de receptores acoplados a proteínas G:arrestinas y β-arrestinas

Las arrestinas desempeñan un papel claveen los procesos de desensibilización de GPCR,al interaccionar con el receptor fosforilado porGRK y desacoplar la señal de las proteínas G.La arrestina fue el primer miembro de la familia

identificado y clonado. Es la proteína solublemás abundante en los segmentos externos delos fotorreceptores y su asociación a rodopsinafosforilada por la GRK1 bloquea completamen-te la señalización mediada por el receptor lumí-nico. Posteriormente se identificaron proteínashomólogas en sistemas distintos al visual, clo-nándose β-arrestina 1 y β-arrestina 2, de losque se conocen distintas variantes por splicingalternativo7. Los miembros de la familia de lasarrestinas presentan una gran homología desecuencia, compartiendo un 45% de identidaden la región correspondiente a los residuos16-349 de la arrestina. La mayor divergenciaen la familia se concentra en el extremo C-ter-minal de las distintas variantes polipeptídicas,lo que probablemente determine su distintasensibilidad a efectos reguladores, fosforilaciónu otras modificaciones postraduccionales6.

Frente a los datos de que se dispone en elcaso de GRK2 y otras GRK, se sabe muy pocoacerca de los mecanismos implicados en mo-dular la actividad o la localización subcelularde las arrestinas, lo que constituye un campode gran atractivo para la investigación.

GRK2 y arrestinas e internalización de receptores acoplados a proteínas G

La presencia de agonistas induce, ademásdel desacoplamiento funcional descrito entrereceptores y proteínas G, un secuestro o inter-nalización transitorio de receptores que en dis-tintos casos se ha comprobado que tiene lugaren vesículas endosómicas cubiertas por clatri-na. Sin embargo, no todos los GPCR tendríanque seguir esta vía endocítica5,6,8.

El papel funcional del secuestro ha sido con-trovertido. Datos recientes indican que la inter-nalización de receptores es una etapa necesariaen la desfosforilación y reciclado de GPCR pre-viamente fosforilados por GRK y desacopladospor arrestinas. Krueger et al20 han identificadouna GPCR-fosfatasa, miembro de la familia defosfatasas PP2A, que colocaliza con el βAR enendosomas durante la internalización promovi-da por agonista, y que puede actuar gracias alos cambios conformacionales que induce en elreceptor el bajo pH intraluminal de las vesículasendocíticas, lo que explicaría el requerimientode la internalización para la resensibilizacion.Así, el proceso de desensibilización en su con-junto resultaría del equilibrio entre los fenóme-nos de desacoplamiento y de reciclaje5,8.

De hecho, datos muy recientes indicaríanque tanto las arrestinas como GRK2 podrían

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MECANISMOS DE REGULACIÓN DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAS G

actuar como adaptadores moleculares entre elGPCR y proteínas implicadas en internaliza-ción. Un posible modelo para el proceso de in-ternalización se basaría en la fosforilación delreceptor por GRK2 en respuesta a agonista, loque promovería el reclutamiento de β-arresti-na, que a su vez actuaría como adaptador,acoplando el complejo a la maquinaria de lavía endosómica ya que es capaz de interaccio-nar in vitro con clatrina, un componente clavede las vesículas cubiertas21,22. Sin embargo, lasituación puede ser más compleja, ya que,muy recientemente, nuestro grupo ha observa-do que GRK2, además, colocaliza con β2AR in-ternalizado23. Por tanto, es posible que GRK2desempeñe también un papel de adaptador ode modulador del proceso de internalización.

La consecuencia funcional y fisiológica másimportante que emerge de estas observacioneses que GRK y arrestinas desempeñan un papelcentral tanto en el proceso de desensibilizaciónde GPCR como disparando y controlando sureciclaje y resensibilización. Así, la velocidad yel grado de desensibilización y secuestro de undeterminado receptor dependerá del comple-mento celular y/o la actividad de GRK y dearrestinas, como recientmente se ha referidopara adrenoceptores β, m2 muscarínicos oCCR5 de quimiocinas5,24,25. Todos estos datosrefuerzan el papel central de GRK y arrestinasen la modulación de GPCR, e indican quecambios fisiológicos o patológicos en sus valo-res o actividad podrán modificar la eficacia dela transducción de señales.

Mecanismos de regulación de la expresiónde GRK

De lo tratado hasta ahora se deduce clara-mente el interés por conocer las señales y me-canismos que gobiernan la expresión de losmiembros de estas familias de proteínas regu-ladoras en distintos tipos celulares y circuns-tancias fisiológicas. Nuestro laboratorio está in-teresado especialmente en los mecanismosque regulan la actividad transcripcional del genGRK2 humano, así como en la estabilidad deestas proteínas en las células. Así, como se in-dica posteriormente, hemos investigado cómodiversos estímulos modulan la actividad delpromotor de GRK2 en células del sistema car-diovascular. Por otra parte, hemos podido de-terminar que los valores celulares de GRK2 es-tán estrechamente y rápidamente regulados encunato a la degradación proteolítica por la víadel proteasoma. Es muy interesante destacar

que la activación de GPCR aumenta la ubiquiti-nación y la velocidad de degradación de GRK2,lo que indica la importancia fisiológica de unadecuado control del complemento celular deesta cinasa (Penela et al, en prensa).

Funciones fisiológicas de GRK2

Sistema cardiovascularLos GPCR median acciones de mensajeros

esenciales para la función del sistema cardio-vascular, que constituyen la diana de múltiplesfármacos utilizados en el tratamiento del fallocardíaco congestivo, la angina de pecho, o lahipertensión, enfermedades muy frecuentes yque constituyen un objetivo sanitario de primerorden. Dado que las proteínas reguladorasGRK son piezas clave del entramado regulato-rio que modifica la eficacia de la transduccióna través de GPCR, la hipótesis de que cambiosen la actividad y/o expresión de estas proteínassean de especial importancia fisiológica en elsistema cardiovascular resulta atractiva. Losprincipales datos que apoyan esta hipótesisson los siguientes:

1. La capacidad de GRK2 y otras GRK defosforilar GPCR implicados en la función car-diovascular: β1 y β2 adrenérgicas, α2-adrenér-gicas, α1B-adrenérgicas, angiotensina AT1, en-dotelina ET-A y ET-B, etc.5,10,26.

2. La participación de mecanismos dedesensibilización de receptores en la etiología yprogresión de ciertas enfermedades cardiovas-culares. Así, la desensibilización de adrenocep-tores β es un factor importante en pacientescon fallo cardíaco congestivo o en hi-pertensión5, y se han detectado alteraciones enlos valores de cierta isoforma de GRK en esassituaciones patológicas, y en otras asociadas ahipertrofia cardíaca27-29.

3. Ratones transgénicos que sobreexpresanGRK2 presentan una importante reducción enla contractilidad cardíaca en respuesta a ago-nistas. Por otra parte, la sobreexpresión de unfragmento C-terminal de la cinasa que actúacomo inhibidor de GRK2 endógena, incremen-ta la contractilidad basal y en respuesta a ago-nistas30. Todo ello confirma un importante pa-pel de GRK2 como regulador de la función car-díaca in vivo.

4. La disrupción del gen GRK2 en ratonesconduce a la muerte de los ratones homozigo-tos entre los días embrionarios 9 y 14, siendoel principal rasgo fenotípico una importante hi-

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poplasia del miocardio31. Esto sugiere un papelesencial para esta cinasa en el crecimiento y ladiferenciación de las células de corazón.

Todos estos datos parecen apuntar a un re-levante papel de las proteínas reguladoras GRKy arrestinas en la función y disfunción del siste-ma cardiovascular. En este sentido, nuestro la-boratorio está intentando investigar los estímu-los que gobiernan la expresión de GRK2 endistintos tipos celulares cardiovasculares. He-mos podido comprobar que vías de señaliza-ción estimuladas por mensajeros “vasocons-trictores” (angiotensina, catecolaminas a travésde adrenoceptores α1 o endotelinas) aumentanla actividad transcripcional del promotor delgen GRK2 humano en células de músculo lisode aorta de rata, mientras que la transcripcióndisminuye en la presencia de citocinas proin-flamatorias (Ramos-Ruiz y Mayor, enviado). Elmejor conocimiento de los mecanismos que re-gulan la expresión de GRK ayudará a entendersus alteraciones en circunstancias patológicasy al diseño de nuevas estrategias terapéuticas.

Papel de GRK en la regulación de receptoresde quimiocinas

Los estudios de expresión tisular de las di-versas GRK y arrestinas indicaron una notableexpresión de GRK2, GRK3, GRK5 y GRK6 enleucocitos y distintas líneas celulares de origenmieloide y linfoide4,32. Se planteaba, por tanto,qué tipo de receptores constituirían la diana deregulación en estos tipos celulares. En los últi-mos años se han identificado numerososGPCR que están presentes en estas células yque desempeñan un papel fundamental enprocesos de respuesta inmune e inflamatoria,mediando las respuestas de mensajeros qui-mioatrayentes, como fMLP o C5a, o de distin-tos tipos de quimiocinas33.

La activación del receptor es el paso que ini-cia la respuesta celular necesaria para la mi-gración de las células en respuesta al gradientede quimiocinas. La desensibilización del recep-tor también se ha propuesto como un procesoesencial para la correcta migración de la célulaa través del gradiente de mensajero34, pero seconoce muy poco tanto acerca de la transduc-ción de la señal como de los mecanismos mo-leculares de desensibilización de estos recep-tores, especialmente los receptores de quimio-cinas CC.

La abundancia e importancia funcional de losreceptores de quimiocinas, y el potencial papel

clave de la desensibilización en procesos de mi-gración celular, les hace unos candidatos muyatractivos para el estudio de sus mecanismosde regulación, y se convierten en los principalescandidatos para explicar los altos niveles de ex-presión de GRK y arrestinas en leucocitos. Enlos últimos 3 años, diversos laboratorios, inclui-do el nuestro, han demostrado la capacidad deGRK2 y GRK3 de fosforilar receptores de IL-8,fMLP y de CC-quimiocinas como CCR2b yCCR524,34-37. Por tanto, parece confirmarseque las proteínas GRK desempeñan un papelimportante en la modulación de la respuesta demonocitos y linfocitos a quimiocinas. Otro as-pecto de interés en este sentido es que estudiosmuy recientes indican que las quimiocinas tam-bién se producen por células no hematopoyéti-cas del sistema nervioso central, y que recepto-res de quimiocinas se expresan en astrocitos ycélulas microgliales e incluso en neuronas; portanto, cabe especular que estos mensajerosquimiotácticos desempeñan también un papelen las reacciones inflamatorias en el sistemanervioso, de gran importancia en situacionespatológicas24.

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J. MOSCAT: ¿Es el mutante cinasa inactivo deGRK2 dominante negativo?

F. MAYOR: Se puede comportar como dominan-te negativo si se tiene cuidado con los nivelesde expresión. Este patrón de desensibiliza-ción que aparece con receptores de quimioci-nas transfectados no se observa cuando seexpresa el mutante K220R. El K220R contie-ne dominios de homología a plextrina y sitiosde unión a subunidades βγ de las proteínas Gque pueden interferir también en los proce-sos de señalización celular.

J. MOSCAT: ¿Habéis estudiado si se comportacomo el mutante de β-arrestina que blo-quea la internalización y la activación deMAPcinasa?

F. MAYOR: Estamos realizando actualmente es-tos experimentos, aunque todavía no dispo-nemos de resultados concluyentes.

R. BORGES: El receptor β (β1) es el típico ejem-plo de receptor acoplado a la adenilato cicla-sa. ¿Existe algún tipo de regulación por pro-teincinasa A?

F. MAYOR: Efectivamente, estos receptores pue-den ser también modulados por fosforilaciónpor proteincinasas. Lo que todavía no se co-noce del todo es si existe algún tipo de fosfo-rilación jerárquica, en el sentido de que lafosforilación previa por GRK o por proteinci-nasa A, modifique la acción de otras cinasas.De todas maneras, existe otra posible acciónde estas cinasas sobre los mecanismos deregulación, actuando sobre la expresión deestas proteínas. Se sabe, por ejemplo, que laβ-arrestina incrementa su expresión en pre-sencia de dibutiril-AMPc. Por otra parte, sesabe que efectivamente ésteres de forbol au-mentan la expresión de GRK, lo que indicaríaque pueden modularse. Se trataría, pues, demecanismos que indirectamente modularíanla señal, actuando sobre la actividad o la ex-presión de estos receptores.

J.M. BAEYENS: Desde el punto de vista de la to-lerancia opiácea, poder bloquear el efecto deGRK o de β-arrestina creo que sería clave.¿Hay alguna herramienta que atraviese la

membrana y sea capaz de producir este tipode bloqueos?

F. MAYOR: Por el momento no se conoceningún inhibidor específico de GRK2 o deβ-arrestinas. Se sabe que los polianiones, co-mo la heparina, pueden inhibir in vitro laGRK2, pero no existen herramientas permea-bles a la membrana. Otra aproximación parabloquear estas proteínas podría ser, por ejem-plo, el empleo de ratones transgénicos quesobreexpresan la zona C-terminal de la cina-sa. Esto, en principio, inhibiría su transloca-ción a la membrana y su actuación, inhibien-do la desensibilización. También se han reali-zado intentos con terapia génica en conejos,mediante adenovirus acoplados a esta cons-trucción. Sin embargo, se debe tener encuenta que este fragmento C-terminal de lacinasa puede inhibir también subunidades βγde las proteínas G, lo que ejercería una ac-ción muy inespecífica. Probablemente hayaque conocer mejor la relación estructura-fun-ción de GRK2 para intentar diseñar algún otrotipo de inhibidores.

J.M. BAEYENS: Los bloqueadores de receptoresacoplados a proteína G producen una regula-ción al alza de sus receptores tras la adminis-tración crónica. ¿Existe alguna explicación so-bre el papel de la GRK o de la β-arrestina enestas situaciones y su posible efecto, porejemplo, sobre la internalización del receptor?De hecho, uno de los problemas de los blo-queadores dopaminérgicos en el tratamientode la esquizofrenia es que producen una re-gulación al alza de los receptores dopaminér-gicos, la cual genera problemas clínicos comoconsecuencia del tratamiento. Sería muy inte-resante, pues, conocer cuáles son los meca-nismos implicados en este proceso y, por tan-to, poder modularlo.

F. MAYOR: Aunque se dispone de algunos expe-rimentos realizados en corazón de cerdos tra-tados con antagonistas de los adrenoceptoresβ en los que se ha observado que puedenmodular los valores de GRK2, creo que espreciso conocer con más detalle cómo se re-

DISCUSIÓN

gula la expresión de estas proteínas. Por tan-to, lo que comentas es una posibilidad muyinteresante pero sobre la cual todavía no exis-te una respuesta en la actualidad.

A. GARCÍA DE HERREROS: Durante el desarrollohabéis visto que las GRK se expresan especí-ficamente en las zonas de migración. Especu-lando sobre su posible papel, ¿crees que po-drían estar involucrados negativamente en lamigración de las células de esta zona, ac-tuando a través de los receptores de quimio-cinas?

F. MAYOR: Es una posibilidad realmente muyinteresante. En general, los mecanismos dedesensibilización pueden ser relevantes en si-tuaciones de seguimiento de gradientes qui-miotácticos, es decir, cuando una célula sepone en movimiento hacia una determinadadiana. Además, esta célula ha de ser capazde corregir su trayectoria y sería en este mo-mento cuando los mecanismos de on/off su-cesivos podrían desempeñar un papel pri-mordial. Es curioso observar que las GRK engeneral se expresan preferentemente en leu-cocitos, en espermatozoides y también en de-terminadas células migratorias durante algu-nos períodos embrionarios (datos todavía sinpublicar). Esto sugiere esta posible relaciónentre receptores de sustancias quimiotácti-cas, la función de estas proteínas y los proce-sos generales de migración. Sin embargo,también existen algunos datos negativos alrespecto. Si se mutan los lugares de fosforila-ción por esta cinasa en algunos receptores dequimiocinas, el posterior estudio de quimiota-xis que ha analizado únicamente la capaci-dad de migración, ha evidenciado que man-tienen su capacidad migratoria. Tal vez con-vendría analizar también los posibles cambiosde dirección en los gradientes quimiotácticos.

A. ZORZANO: Me ha parecido entender que en elextremo C terminal de BARK-1 el dominio deunión βγ es también un dominio PH. Desdeeste punto de vista, ¿tienes idea de si puedehaber algún tipo de cross-talk entre BARK-1o BARK-2 y PI-3 cinasa?

F. MAYOR: Existe un dominio de homologíaplextrina que se solapa parcialmente con eldominio de unión de βγ. Estudios de otrosgrupos sugieren que la parte N-terminal deldominio de homología a plextrina interaccionacon PIP-2 mientras que la zona más terminales más relevante en cuanto a su unión a βγ, yque ambas interacciones de una forma sinér-gica modulan la actividad de la cinasa. La po-

sibilidad de relaciones entre PI-3 cinasa yGRK-2 resulta interesante por varias razones:por la interacción de modulación por produc-tos de PI-3 cinasa sobre la actividad GRK-2 ypor otras derivaciones también en el contextodel papel de arrestinas y de la propia GRK-2en la transducción de señales. En este mo-mento estamos trabajando en intentar ver po-sibilidades de interacción entre PI-3 cinasa yalgunos de los componentes del sistema quehe mencionado.

V. SÁNCHEZ MARGALET: Volviendo al tema de re-gulación de GRK-2, parece que la subunidadα es más importante para la activación y, sinembargo, hay un dominio PH en βγ que po-dría ser responsable de la localización. ¿Hayalgún tipo de especificidad por parte de lasdiferentes familias de proteínas G, y en con-creto con diferentes combinaciones de subu-nidades α y βγ?

F. MAYOR: Por un lado, me gustaría precisarque el efecto sobre las GRK por parte de lassubunidades βγ de las proteínas G es unefecto sobre la actividad, fundamentalmenteporque permite la translocación de la cinasadesde el citosol a la membrana. En este senti-do las subunidades βγ de las proteínas G úni-camente regulan GRK2 y GRK3, que son lasque tienen este dominio. No está claro si exis-te una especificidad de determinadas combi-naciones de subunidades βγ que sean más omenos eficaces en producir estos efectos. Porotro lado, he comentado el efecto que puedetener la cotransfección de ciertas subunida-des α, no sobre la actividad sino sobre la ex-presión, sobre la actividad transcripcional delpromotor del gen GRK2. No se ha descrito unefecto directo de interacción entre las α y es-tas GRK.

V. SÁNCHEZ MARGALET: Dada la reciente publica-ción de datos sobre animales transgénicosque sobreexpresan αq en tejido miocárdico yque presentan hipertrofia cardíaca, ¿creesque el efecto hipertrófico podría deberse a lasobreexpresión de GRK y de arrestina, secun-dario a la sobreexpresión de αq?

F. MAYOR: Creo que, efectivamente, es una po-sibilidad muy interesante. Los animales quesobreexpresan αq presentan unas caracterís-ticas de frecuencia cardíaca y una alteraciónen el patrón de desensibilización de algún ti-po de receptores acoplados a proteínas G enlos que pensamos que un factor que pudieracontribuir es la alteración secundaria en losvalores de GRK-2.

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Introducción

La morfina y sus derivados constituyen ungrupo de fármacos conocidos con la denomi-nación de opiáceos. Estos compuestos poseenpropiedades farmacológicas de un gran interésterapéutico y han sido ampliamente utilizadosen clínica para el tratamiento de diferentescuadros dolorosos. Así, los opiáceos son losfármacos analgésicos más eficaces de entre to-dos los existentes. Sin embargo, la administra-ción repetida de estos compuestos produceuna serie de modificaciones en el organismoque originan el desarrollo de fenómenos de de-pendencia y de tolerancia a la mayor parte desus respuestas farmacológicas. Estos procesosse desarrollan como consecuencia de los cam-bios adaptativos celulares y moleculares que seproducen en el sistema nervioso central en res-puesta a la presencia repetida del opiáceo, yque persisten durante un largo período detiempo incluso después de la interrupción deltratamiento.

Se han realizado múltiples estudios para in-vestigar los mecanismos neurobiológicos impli-cados en los fenómenos adaptativos que origi-nan los procesos de dependencia a los opiá-ceos. Una primera hipótesis sugirió la existenciade una disminución en el número y/o afinidadde los receptores opioides en respuesta a lapresencia continua del fármaco en la hendidurasináptica. Este fenómeno ha sido claramenteobservado en cultivos celulares que poseen di-chos receptores tras la administración de ago-nistas opioides1,2. Sin embargo, dicho procesose observó raramente en los estudios realizadosin vivo2-5. Además, en las escasas ocasiones enlas que se obtuvo esta subsensibilización in vivoresultó difícil relacionarla con el desarrollo de latolerancia y la dependencia, ya que éstas estu-vieron limitadas a algunas estructuras cerebra-les y tan sólo tras ciertas condiciones particula-res de tratamiento opiáceo6-8.

Otra hipótesis para explicar la implicacióndel sistema opioide endógeno en los fenóme-

nos de dependencia está basada en los efectosde la administración crónica de opiáceos sobrela biosíntesis de péptidos opioides. Según estateoría, durante el desarrollo de la tolerancia y ladependencia opiácea se generarían ciertos frag-mentos peptídicos a partir de los propios pre-cursores de los péptidos opioides endógenos obien a partir de otros precursores que poseeríanpropiedades opuestas a los opioides. Estos frag-mentos peptídicos disminuirían las respuestasfarmacológicas de los opiáceos, participandoasí en la expresión de la abstinencia9-11.

Mecanismos de transducción del sistema opioide

Los cambios producidos en el propio recep-tor opioide o sobre la síntesis y degradación delos péptidos opioides endógenos no parecen te-ner una gran relevancia en los procesos de tole-rancia y dependencia. En efecto, los fenómenosadaptativos que se producen en el sistemaopioide endógeno durante el desarrollo de ladependencia opiácea tienen lugar principal-mente en los sistemas de segundo mensajeroacoplados al receptor opioide, incluyendo entreotros las proteínas G y diversas enzimas trans-membranarias e intracelulares12. Así, la activa-ción de los receptores opioides a través de suinteracción con una proteína G produce la inhi-bición de una enzima transmembranaria, laadenilciclasa, responsable de catalizar la sínte-sis de AMPc. La inhibición de esta enzima es elpunto de partida de toda una cascada de acon-tecimientos intracelulares que incluyen la inhi-bición de enzimas proteincinasas y la fosforila-ción de múltiples proteínas citoplasmáticas ynucleares que son el sustrato de dichas cina-sas. El efecto inhibitorio crónico producido porla presencia continuada del opiáceo induce unahipertrofia compensatoria que afecta a la mayorparte de estos mensajeros intracelulares ligadosa los receptores opioides12,13.

Las primeras observaciones acerca de unaactivación del sistema AMPc durante la absti-

Mecanismos moleculares implicados en la dependencia opiácea

Rafael MaldonadoDepartamento de Neurofarmacología. Facultad de Ciencias de la Salud y de la Vida. Universitat Pompeu Fabra. Barcelona.

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nencia opiácea fueron realizadas a partir de es-tudios sobre cultivos de células híbridas deneuroblastoma/glioma NG 108-1514. Un incre-mento en las concentraciones de AMPc15, asícomo en la actividad proteincinasa16 tambiénse observó en el cerebro durante la abstinenciaa opiáceos. Estudios posteriores han evaluadolas estructuras cerebrales que se encuentranespecíficamente implicadas en estos cambiosadaptativos. La dependencia opiácea produceuna hipertrofia del sistema ligado al AMPcprincipalmente en el locus coeruleus, donde seobservan modificaciones compensatorias enlas proteínas G17 y en las actividades adenilci-clasa y proteincinasa18. Algunas de estas mo-dificaciones también pudieron ser observadasen otras estructuras, como el núcleo accum-bens19 y el estriado20. En el locus coeruleustambién se encontraron modificaciones com-pensatorias en diferentes proteínas que resul-tan fosforiladas por las proteincinasas, inclu-yendo proteínas citoplasmáticas, proteínas delcitosqueleto que controlan la talla y la forma delas neuronas, y factores de transcripción queregulan la expresión genómica de la célula12.Diversos estudios han referido que estos cam-bios en los sistemas de mensajeros son en par-te responsables de la aparición de los fenóme-nos de tolerancia y dependencia opiácea12.

Gracias a los avances en las técnicas de bio-logía molecular, recientemente ha sido posibleel desarrollo de una serie de líneas de ratonestransgénicos con deficiencias en los genes quecodifican determinados receptores o mensaje-ros intracelulares. La utilización de dichos ani-males ha permitido realizar importantes avan-ces en el estudio del sustrato biológico de ladependencia opiácea. Así, mediante el empleode técnicas de recombinación homóloga sehan conseguido ratones en los que se han su-primido los genes responsables de la expresiónde ciertos receptores opioides (receptores µ yκ), monoaminérgicos (receptores dopaminérgi-cos D2) o de factores de transcripción relacio-nados con las respuestas intracelulares de losopiáceos (CREB: cAMP-responsive element-binding protein).

Ratones deficientes para el receptor µ

El empleo de ratones transgénicos con defi-ciencias en el gen que codifica el receptoropioide µ ha permitido clarificar su papel en ladependencia opiácea20. Así, las respuestasanalgésicas inducidas por la administraciónaguda de morfina resultaron completamente

abolidas en esta línea de ratones transgénicos.La morfina tampoco tuvo propiedades reforzan-tes tras su administración repetida en estosanimales. Estos efectos reforzantes de los opiá-ceos se encuentran íntimamente ligados a sucapacidad para inducir el componente psíqui-co de la dependencia21. Por otra parte, el trata-miento crónico con morfina no desarrolló nin-guna manifestación comportamental (signossomáticos y vegetativos de la abstinencia) nibioquímica (elevación de la actividad adenilci-clasa en el estriado) de dependencia opiáceaen ratones con deficiencias en dichos recepto-res. Así pues, estos receptores opioides µ re-sultan imprescindibles no sólo para el desarro-llo de la dependencia morfínica sino tambiénpara la expresión de las principales respuestasfarmacológicas inducidas por este opiáceo.

Ratones deficientes para el receptor κPor otra parte, recientemente ha sido posible

desarrollar ratones transgénicos deficientes enel gen que codifica el receptor opioide κ22. Lasrespuestas analgésicas inducidas por la admi-nistración aguda de morfina, así como las re-puestas reforzantes inducidas tras su adminis-tración repetida, no se vieron modificadas enlos ratones deficientes en dichos receptores.Sin embargo, la expresión de los signos somáti-cos de la dependencia opiácea resultaron mo-deramente reducidos en estos animales. Dichoresultado sugiere que los receptores κ opioi-des desempeñan un papel modulador en laexpresión de la dependencia opiácea. Ade-más, las respuestas analgésicas, locomoto-ras y motivacionales inducidas por el agonis-ta κ selectivo U-50488H resultaron completa-mente abolidas en los animales deficientes enlos receptores κ22.

Ratones deficientes para el factor CREB

La participación de los factores de transcrip-ción ha sido estudiada mediante el empleo deratones transgénicos deficientes en el factorCREB. La eliminación del gen que codifica elfactor de transcripción CREB23 no modificó lasrespuestas farmacológicas inducidas por la ad-ministración aguda de morfina, en particular laactividad analgésica. Sin embargo, los efectosproducidos por la administración crónica deopiáceos se vieron claramente alterados24. Así,el desarrollo de la tolerancia a la actividad anal-gésica de la morfina está disminuido, y tam-bién se observó una redución en la expresión

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de los signos somáticos y vegetativos de la abs-tinencia opiácea. No obstante, ciertas manifes-taciones bioquímicas asociadas a la abstinen-cia no se vieron modificadas por la supresiónde CREB. Así, durante la abstinencia se obser-va un incremento en la expresión de los genesprecoces, c-fos y c-jun, en ciertas estructurascerebrales como el locus coeruleus y en el sis-tema límbico. La expresión de estos genes pre-coces y el incremento en la actividad de la en-zima adenilciclasa producido durante la absti-nencia opiácea no se vieron modificados en losanimales con deficiencia de CREB. El factor detranscripción CREB desempeña, pues, un pa-pel importante en las manifestaciones compor-tamentales de la abstinencia, aunque no pare-ce participar en los efectos analgésicos produ-cidos por la administración aguda de morfina.Los resultados bioquímicos en la actividad ade-nilciclasa sugieren que el mecanismo por elque CREB participa en los procesos de depen-dencia parece ser independiente de los men-sajeros ligados al AMPc. Los sistemas intrace-lulares que participan en dicho mecanismo nohan sido aún identificados y su conocimientoayudará sin duda a esclarecer el sustrato bioló-gico de estos procesos de dependencia.

Otros sistemas implicados

Otros sistemas de neurotransmisión diferen-tes del sistema opioide endógeno se encuen-tran también implicados en los cambios adap-tativos responsables del desarrollo de la depen-dencia opiácea. Estos sistemas van a controlara través de un mecanismo heterólogo la res-puesta del organismo durante el proceso dedependencia. Así, se han descrito diversoscambios durante el desarrollo de la dependen-cia, sobre todo en los sistemas dopaminérgico,noradrenérgico, serotonérgico, colinérgico,GABAérgico y peptidérgico. La participación deciertos mecanismos heterólogos, en particulardel sistema dopaminérgico, también ha podidoser evaluada gracias al empleo de ratonestransgénicos. Así, los efectos producidos por eltratamiento agudo y crónico con morfina fue-ron investigados en ratones deficientes en losreceptores dopaminérgicos D2

25, que han sidorecientemente generados mediante la técnicade recombinación homóloga26. La supresiónde los receptores dopaminérgicos D2 no modi-fica las respuestas analgésicas y motoras indu-cidas por la administración aguda de morfina,ni el desarrollo de la dependencia física tras eltratamiento crónico con opiáceos. Sin embar-

go, los efectos reforzantes producidos por lamorfina resultaron completamente abolidos enestos animales. Las propiedades reforzantes deun estímulo natural, la comida, no se vieronmodificadas en los ratones con deficiencia enreceptores dopaminérgicos D2. Así pues, losreceptores dopaminérgicos D2 están selectiva-mente implicados en las propiedades reforzan-tes de los opiáceos y no parecen desempeñarun papel importante en otras respuestasagudas o crónicas inducidas por estos fár-macos.

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52


A. MUÑOZ: ¿Por qué esperabais que fuese tanimportante CREB en la expresión de c-jun yc-fos, cuando no parece ser el principal factorque influye en la expresión de estos dos ge-nes?

R. MALDONADO: Si bien está claro que no es im-portante en la expresión de c-jun, sí que po-dríamos esperar una cierta participación en lade c-fos. La idea inicial parte de varios estu-dios que sugieren la existencia de una corre-lación entre la actividad del locus coeruleus yla expresión comportamental de la abstinen-cia. Nosotros utilizábamos este marcador dec-fos para comprobar cuál era la actividad dellocus coeruleus durante el proceso de la abs-tinencia. La administración de clonidina, pro-ducto que reduce la sintomatología de la abs-tinencia, produce también una disminuciónde la actividad de las neuronas noradrenérgi-cas en el locus coeruleus. Nosotros esperába-mos que posiblemente, si había esta disminu-ción de la expresión de la abstinencia, tam-bién podría haber una disminución en laexpresión de c-fos.

A. MUÑOZ: ¿Sabéis si los animales CREB −/−tienen alterados los niveles de actividad, decantidad de proteína o de fosforilación delCBP o de las CREM?

R. MALDONADO: CREM está regulado al alza, pe-ro en el caso de CBP lo desconozco.

F. MAYOR: Puesto que está descrito que en ani-males que carecen de CREB se ven alteradostoda una serie de procesos de memoria a lar-go plazo, incluso de memoria de contexto,¿no se puede pensar que esto modifique al-gunos de los comportamientos que vosotrosanalizáis?

R. MALDONADO: En los resultados que hemospresentado no, porque se trata de estudios dedependencia física, donde no participa la me-moria. Pero en experimentos muy recientes,que esperamos se publiquen en breve, se haobservado la preferencia de plaza con anima-les deficientes en αδ-CREB. Ni en los anima-les con deficiencias ni en los animales de ge-notipo normal se observó ningún tipo de mo-dificación de las propiedades reforzantesinducidas por morfina, cocaína ni por comida,

DISCUSIÓN

como estímulo natural. En primer lugar, seconcluye que en estas condiciones CREB nodesempeñarían un papel relevante en las pro-piedades reforzantes inducidas por dichos es-tímulos. Y, en segundo lugar, el déficit de me-moria inducido en estos animales no sería losuficientemente importante para que el ani-mal sea incapaz de relacionar estos estímuloscon el compartimiento asociado. Cabe añadirque los déficit de memoria se analizaron enestudios de memoria espacial y que aparecie-ron sólo en ciertas condiciones experimenta-les particulares, por lo que no se trata de undéficit generalizado. En los últimos estudiosrealizados con el doble mutante, es decir, unalelo carece de αδ y el otro alelo carece deαβδ, no se observan diferencias relevantes encuanto a la memoria. Por tanto, actualmentese cuestiona la importancia que en un princi-pio se propuso de CREB para estos procesosde memoria. Si bien posiblemente participa,parece ser que su trascendencia es menor dela que se sugirió al principio.

F. MAYOR: En vuestro modelo experimental, ¿sesabe si los distintos agonistas opiáceos pro-mueven diferentes patrones de desensibiliza-ción?

R. MALDONADO: Nosotros no hemos trabajadosobre este tema, pero el grupo de Erik Nestlersí que ha realizado estudios de este tipo, yparece que existe una implicación de la pro-teína GRK y de la arrestina en los procesos dedependencia. A pesar de todo, no se disponetodavía de estudios concluyentes al respecto.

V. CEÑA: Es sabido que al final, el efecto gratifi-cante de la morfina se basa en la activaciónde una serie de circuitos eléctricos. ¿Se haestudiado si se modifica significativamente latransmisión sináptica en el síndrome de absti-nencia, en experimentos con rodajas de hipo-campo donde está mantenida la estructuraentre las neuronas?

R. MALDONADO: Se dispone de los datos deriva-dos de experimentos in vivo que reflejan laexistencia de un incremento del firing en ellocus coeruleus como consecuencia de laabstinencia. Sin embargo, dicho incrementono aparecía en los primeros estudios sobreabstinencia realizados con rodajas del locuscoeruleus. Fue posteriormente cuando el gru-po de Aghajanian* comprobó la existencia de

cierto aumento del firing en rodajas del locuscoeruleus, aunque constataron que era infe-rior al observado mediante estudios in vivo.Por esta razón, se cree que existen unas afe-rencias excitadoras que participan tambiénen este proceso de activación del locus coe-ruleus durante la abstinencia y se sugiereparticularmente la participación del núcleoparagigantocelularis a través de sus proyec-ciones glutamatérgicas hacia el locus coeru-leus. Por tanto, nos hallamos ante un meca-nismo intrínseco al locus coeruleus represen-tado por los fenómenos adaptativos que seproducen en la organización intracelular y,por otra parte, ante un fenómeno extrínsecoal locus coeruleus derivado del incremento dela liberación de glutamato proveniente del nú-cleo paragigantocelularis.

V. CEÑA: Puesto que parecen estar implicadosen la propagación del impulso y en la trans-misión sináptica, ¿se podría sugerir que ladiana final de todos los procesos bioquímicosque conducen al síndrome de abstinenciafuera precisamente la modificación de la acti-vidad de canales iónicos?

R. MALDONADO: No me atrevería a hablar dediana final, pero, evidentemente, se trataríade una de las dianas más importantes. Paraexplicar la dependencia creo que no nos po-demos basar en un sistema exclusivo. Ade-más de la participación del sistema homólogoopioide, también se producen modificacionesheterólogas, como en la dopamina, noradre-nalina, péptidos antiopioides, etc. El resultadode los cambios en toda esta serie de sistemasva a dar lugar en su conjunto al proceso de laabstinencia, con la participación de determi-nados canales iónicos en algunos de ellos.

V. CEÑA: Lógicamente me refería a los canalesiónicos como un todo.

J.M. BAEYENS: Nosotros tenemos datos publica-dos acerca de que el bloqueo de los canalesde calcio dependientes de voltaje tipo L inhi-be la abstinencia, mientras que la estimula-ción de canales de potasio sensibles al ATPinhibe la abstinencia.

R. TRULLÁS: En los mutantes de CREB, ¿habéisestudiado otros factores de transcripción ade-más de c-fos y c-jun? En segundo lugar, y tam-bién en estos animales, ¿se observan alteracio-nes motoras que pudiesen explicar los déficiten aprendizaje espacial en otros modelos?

R. MALDONADO: Hemos estudiado animales defi-cientes en CREM y, al igual que otros autores,no hemos observado modificación alguna enla gravedad de la abstinencia. Respecto a tu

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MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN LA DEPENDENCIA OPIÁCEA

*Kogan JH, Nestler EJ, Aghajanian GK. Elevated basalfiring rates and enhanced responses to 8-Br-cAMP inlocus coeruleus in brain slices from opiate-dependentrats. Eur J Pharmacol 1992; 211: 47-53.

segunda pregunta, se observa una ligera dis-minución de la actividad locomotora horizon-tal, aunque difícilmente esto puede interferiren el resultado de la abstinencia, puesto queobservamos cambios en todos los parámetrosy no sólo en el jumping. En cuanto al déficitde memoria espacial, y tratándose de una de-ficiencia motora tan mínima, tampoco creoque desempeñe un papel importante en eldéficit de memoria espacial.

A.M. PLANAS: La abstinencia como síndrometiene muchos componentes. ¿Hasta qué pun-to esta serie de parámetros que analizáis sonsuficientemente representativos del síndromede abstinencia como para afirmar que noexiste en estos animales?

R. MALDONADO: Simplemente constatamos que laexpresión somática de la abstinencia está dis-minuida, sin que esto signifique una aboliciónde la misma. Por estudios realizados previa-mente perfectamente estandarizados y acepta-dos en la actualidad, sabemos que en el ratónexisten una serie de signos que están clara-mente relacionados con la intensidad de laabstinencia, como son el jumping y la pérdidade peso. Por nuestros estudios, podemos afir-mar que ambos se encuentran disminuidos deuna manera notable en estos animales.

J.M. BAEYENS: Con referencia a los ratones condeficiencia de receptores µ1 naturales, algu-nos autores han demostrado que en dichosanimales algunos agonistas µ producen anal-gesia. Mi primera pregunta sería, ¿vuestrosratones presentan deficiencias en µ1 y µ2? Y,en segundo lugar, ¿observáis los mismos re-sultados con otros agonistas µ?

R. MALDONADO: Mi opinión es que en los ani-males que presentan deficiencias de unamanera natural existe una disminución en lapoblación de receptores µ sin alcanzarse unaabolición total de receptores. Nosotros he-mos realizado bastantes estudios con nues-tros animales knock-out deficientes en re-ceptores µ utilizando diferentes agonistas µ.Hay dos tipos de construcciones: unosknock-out que proceden del exón 1, con losque hemos trabajado, y otros knock-out delexón 2 que han sido utilizados por otros au-tores. Todos los grupos estamos de acuerdoen que la morfina no tiene ningún tipo de ac-ción analgésica en animales knock-out pro-cedan del exón 1 o del exón 2. Sin embargo,con heroína, morfina-6-glucurónido y 6-ace-tilmorfina los resultados son algo contradic-torios en función de los modelos experimen-tales utilizados.

54


Introducción

En general, los tratamientos farmacológicosde larga duración inducen cambios perdura-bles en las funciones celulares (en los proce-sos de síntesis y liberación de neurotransmiso-res, en los receptores o canales, en los mensa-jeros intracelulares e incluso cambios en sugenoma)1. En el caso de los opiáceos estasmodificaciones ocurren tanto en neuronasopioides como en células que están bajo la in-fluencia de éstas. La expresión de estos cam-bios en respuesta a la exposición crónica aopiáceos es el desarrollo de tolerancia y depen-dencia de sus efectos.

Los opiáceos son fármacos ampliamente uti-lizados en el tratamiento de las situaciones do-lorosas de intensidad de moderada a grave, y amenudo es necesaria su administración cróni-ca. De esta forma, el desarrollo de tolerancia asu efecto analgésico y a otros efectos es muyfrecuente. Aunque aparece muy raramente enla clínica, es posible que este “nuevo ambien-te” tras el uso crónico sea roto de manerabrusca. Entonces aparece el síndrome de abs-tinencia.

Describiremos algunos términos básicos queayudarán a entender este “nuevo ambiente” ylos acontecimientos que siguen a su ruptura.Las drogas de abuso se definen clásicamentecomo sustancias que pueden producir depen-dencia física, psicológica o ambas, y su admi-nistración crónica es definida como adicción2.Tolerancia representa la reducción de los efec-tos de la droga tras la administración repetidade ésta a dosis iguales, o la necesidad de in-crementar las dosis para que aparezcan losmismos efectos. Dependencia se define comoun estado que se manifiesta por alteraciones fí-sicas o psicológicas tras el cese de la droga.Por último, drogadicción se define como unconstructo biológico, psicológico y conductualcuyo dato fundamental es el uso compulsivode la sustancia, a pesar de que las consecuen-

cias adversas son muy evidentes incluso parael propio sujeto3. Los mecanismos bioquímicoso moleculares de estas tres fases son todavíaobjeto de intensa investigación. El propósito deeste artículo es presentar las evidencias queseñalan un importante papel regulador de lavía aminoácidos excitadores (AAE):L-argini-na:óxido nítrico (NO) en la modulación de lacascada de fenómenos que preceden al sín-drome de abstinencia y concurren en él.

El síndrome de abstinencia no es una situa-ción dramática en términos de mortalidad (ex-cluyendo violencia o traumatismos), pero el co-nocimiento de los mecanismos que llevan a ladependencia y a la abstinencia es esencial pa-ra prevenir el círculo vicioso abuso-abstinencia-recaída. Las fuertes respuestas psicológicas yconductuales tras la abstinencia contribuyen ala recaída, y evitar la abstinencia es segura-mente una de las principales causas por lasque los adictos continúan la administracióncrónica de la sustancia.

Obviamente, este comportamiento que seautoalimenta no es la única causa de la depen-dencia. Las drogas de abuso son “reforzado-res” muy potentes. La capacidad reforzadorapositiva de las drogas refleja su potencia paraproducir dependencia psicológica y numerosasevidencias sugieren que existe un circuito loca-lizado principalmente en al área tegmental ven-tral y el nucleus accumbens, que es comúnpara la mayoría de las drogas de abuso3,4.

Los mecanismos bioquímicos implicados enel desarrollo de la dependencia física y el sín-drome de abstinencia no están absolutamenteesclarecidos. Existen numerosos sistemas impli-cados en este fenómeno5: agentes que actúana través de receptores opioides (opiáceos exó-genos o péptidos opioides), péptidos no opioi-des, inhibidores de peptidasas o encefalinasas,neurotransmisores (serotonina, catecolaminas,adenosina, aminoácidos excitadores [AAE] o in-hibidores), bloqueadores de los canales de cal-cio, agentes que modifican los sistemas de se-

Papel del óxido nítrico en la abstinencia opiáceaJuan Carlos Leza, Beatriz Cuéllar, Ignacio Lizasoain, M.ª Ángeles Moro

y Pedro LorenzoDepartamento de Farmacología. Facultad de Medicina.

Universidad Complutense. Madrid.

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gundos mensajeros (AMPc y GMPc), inmuno-moduladores, etc. Uno de los sistemas implica-dos más recientemente es el NO. En esencia,los datos disponibles hasta el momento indicanque el NO está implicado en los procesos dedependencia y abstinencia, pero todavía no es-tá claro si se trata de una causa o de una con-secuencia de otros procesos. Comenzaremospor presentar algunos aspectos básicos de laabstinencia a opiáceos, y posteriormente explo-raremos las evidencias que demuestran que lavía metabólica AAE:NO está implicada en la de-pendencia física a opiáceos.

El síndrome de abstinencia a opiáceos

Como hemos comentado previamente, ladefinición clásica de adicción requiere por logeneral la evidencia de que existe dependen-cia física. Experimentalmente, la única víapara identificar si una sustancia produce de-pendencia física es el estudio del síndromede abstinencia6. En humanos, el síndrome deabstinencia se describe por una mezcla deansiedad, disforia y deseo de droga, acompa-ñado de evidentes síntomas somáticos. Elsíndrome de abstinencia es, por lo general,fácil de reproducir en el laboratorio, adminis-trando un antagonista o cesando bruscamen-te la administración de la droga. En la mayo-ría de los estudios se utilizan roedores. En latabla I se presentan los signos y síntomas deabstinencia más evidentes en varias especiesanimales.

Existen numerosas evidencias de que se tra-ta de un síndrome influido por múltiples meca-nismos7: a) la complejidad del curso temporal,comienzo y duración del síndrome (por lo ge-neral en dos fases: primera, estimuladora, y se-gunda, depresora); b) la diversidad de aproxi-maciones terapéuticas que han demostrado al-gún efecto antiabstinencia, y c) la localizaciónde múltiples sustratos neuroanatómicos de ladependencia física.

Las áreas anatómicas que participan en elsíndrome de abstinencia han sido ampliamenteestudiadas mediante inyecciones intracerebra-les de antagonistas opiáceos o lesionando cier-tas vías nerviosas en animales morfinodepen-dientes. Uno de los trabajos más relevantes fueel de Maldonado et al8, en el que inyectaronmetilnaloxonio en áreas cerebrales muy con-cretas de ratas con dependencia a la morfina.Los núcleos más sensibles fueron el locus coe-ruleus y la sustancia gris periacueductal. Sinembargo, la expresión de la mayoría de los sig-nos del síndrome de abstinencia tiene un sus-trato anatómico múltiple. Existen también otrossíntomas periféricos de tipo secretor (diarrea,salivación, lagrimeo y rinorrea) que puedenprovocarse tras la administración central de unantagonista9,10, lo que indica que, además deestructuras periféricas, existe una participaciónimportante de estructuras centrales (médulaespinal) en los efectos periféricos11.

El locus coeruleus es un pequeño núcleoque contiene la mayor parte de los cuerposneuronales de neuronas noradrenérgicas del

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TABLA ISÍNTOMAS Y SIGNOS DE ABSTINENCIA OPIÁCEA EN VARIAS ESPECIES5

Ratón Rata Humano

Hiperactividad Hiperactividad Deseo de droga, ansiedad, llanto,Salto Salto congestión nasal, sudor, bostezos,Pérdida de peso Pérdida de peso dificultad para dormir, midriasis,Hipotermia Hipotermia piloerección, temblor,Micción Micción “flashes” de frío y calor, doloresDiarrea Diarrea óseos y musculares, anorexia,Sacudidas Sacudidas insomnio, náuseas, vómitos,Temblor Lagrimeo diarreas, contracturas abdominales,Movimientos Ptosis HTA, hipertermia, hiperpnea,estereotipados Castañeteo de dientes pérdida de peso,

Priapismo eyaculaciones espontáneasSalivaciónContracturas abdominalesMovimientos estereotipadosAgresividadRinorrea

sistema nervioso central12, además de poseeruna gran densidad de receptores opioides13.Tanto las proyecciones aferentes como las efe-rencias de este núcleo están muy extendidaspor todo el sistema nervioso central14,15.

Durante la abstinencia precipitada por nalo-xona en animales con dependencia de morfinase observa una activación de las neuronas dellocus coeruleus16. Este incremento en la activi-dad se correlaciona directamente con los sínto-mas de abstinencia y coexiste con un incre-mento en el recambio de noradrenalina en ellocus coeruleus y en sus áreas de proyec-ción17,18. El primer estudio de Aghajanian16

demostró también que la estimulación del au-torreceptor adrenérgico α2 por clonidina supri-mía los cambios inducidos por la abstinencia.Las primeras (y todavía útiles) aproximacionesterapéuticas no sustitutivas del tratamiento dela abstinencia incluían clonidina y otros estimu-lantes α2. Estas evidencias sugirieron que la hi-peractividad noradrenérgica mediaba la expre-sión de la mayoría de los componentes del sín-drome de abstinencia a morfina en áreas delsistema nervioso central inervadas por el locuscoeruleus.

Este incremento en la transmisión noradre-nérgica durante el síndrome de abstinenciaocurre también en la periferia19,20 y es respon-sable de algunos síntomas periféricos que pue-den ser utilizados como índice de abstinencia(p. ej., incremento de la presión arterial)21.

Regulación aminoacidérgica del locus coeruleus

La “tormenta noradrenérgica” que ocurre enel locus coeruleus durante la abstinencia opiá-cea puede verse influida por otros sistemasneurotransmisores. Una parte sustancial de lahiperactividad coerulear inducida por la absti-nencia opiácea es mediada por un input ami-noacidérgico al locus coeruleus, que se descri-bió por estudios electrofisiológicos y neuroana-tómicos22,23. Se han descrito también otrasrelaciones entre los sistemas noradrenérgico yaminoacidérgico en distintas áreas cerebralesque controlan la presión arterial24 o la funciónneuroendocrina25,26.

Tras estas primeras descripciones, tambiénse demostró que el incremento en la liberaciónde AAE (glutamato y aspartato) ocurría dentrodel locus coeruleus durante el síndrome deabstinencia27. Por otra parte, el hecho de quela hiperactividad de las neuronas coerulearesfuera más pronunciada en modelos in vivo que

in vitro (rebanadas de locus coeruleus)28 indi-caba la existencia de neuronas aferentes al lo-cus coeruleus que controlaban esta hiperactivi-dad, que serían desconectadas en la prepara-ción de rebanadas. Varios estudios demostraronque la activación de estas neuronas era contro-lada por una amplia red de conexiones aminoa-cidérgicas, principalmente desde el núcleo pa-ragiganto-cellularis (PGi) y el núcleo prepositushypoglossi (PHi)22,29,30 y otras, posiblementedesde la lámina I de la médula espinal31. La re-gulación aminoacidérgica puede partir tambiéndel propio locus coeruleus. De hecho, Fung etal32 describieron tres tipos de neuronas coeru-leares en rata y ratón: las que son positivas a lainmunotinción con tirosina hidroxilasa, las queson inmunorreactivas para glutamato, y las quese tiñen con los dos antígenos.

Así mismo, la regulación aminoacidérgicadel locus coeruleus durante el síndrome deabstinencia puede ser regulada a su vez porotros sistemas neurotransmisores: el incremen-to de la transmisión serotonérgica atenúa elcomponente glutamatérgico del síndrome deabstinencia en el locus coeruleus28. Una de lascuestiones que quedan por resolver es si losAAE pueden regular también los cambios enotras áreas fuera del locus coeruleus.

El hecho de que la estimulación del receptorNMDA en células cerebelosas iba seguido dela liberación del factor relajante de origen en-dotelial (EDRF)33, identificado a posteriori co-mo NO34, y la posterior identificación de la NOsintasa en el tejido cerebral35, llevó al estable-cimiento de la vía AAE:L-arginina:NO. El princi-pal mecanismo de transducción del NO es laformación de GMPc, el cual puede modificar laliberación de neurotransmisores en otras neu-ronas36,37 (fig. 1). Veamos, en resumen, cuáles el significado fisiopatológico de esta vía en elsistema nervioso central.

La vía AAE/L-arginina/NO en el sistemanervioso central

El NO, que es sintetizado por la enzima NOsintasa (NOS), es un importante mensajero in-ter e intracelular. La NOS cataliza la oxidacióndel aminoácido L-arginina a NO más citrulina(equimolecular). Esta enzima fue identificadaen un principio en el endotelio vascular38,39,pero también desempeña un importante papelen otros tejidos como el sistema nervioso cen-tral y periférico40. Existen dos clases de NOS,dependiendo de la sensibilidad al calcio: lasconstitutivas (dependientes del calcio, princi-

57

PAPEL DEL ÓXIDO NÍTRICO EN LA ABSTINENCIA OPIÁCEA

palmente en neuronas, nNOS y endotelial,eNOS), y la inducible (independiente del cal-cio, iNOS, descrita inicialmente en macrófagos,hepatocitos y células gliales).

En los últimos años numerosas evidenciashan sugerido el papel del NO en el sistemanervioso central en muchos procesos fisiológi-cos y fisiopatológicos40-42. Alguno de los pape-les fisiológicos propuestos para el NO en el sis-tema nervioso central son: desarrollo cerebral,plasticidad neuronal, formación de memoria(potenciación perdurable LTP en el hipocam-po), regulación de la circulación cerebral,hiperalgesia o estrés43-47. Por otra parte, con-centraciones excesivas de AAE (glutamato) yun incremento de la síntesis de NO también seha demostrado en procesos patológicos comoepilepsia, lesión hipóxico-isquémica48-51 y unamplio espectro de enfermedades neurodege-nerativas como la enfermedad de Alzheimer yde Parkinson o la corea de Huntington52-55. Enla actualidad, todavía no se conoce con exacti-

tud si el NO u otras sustancias relacionadasson causa o consecuencia de estos procesos.

La formación de NO en varias áreas cerebra-les ha sido investigada directa o indirectamentepor varios métodos: a) la formación de citrulinamarcada con 3H o 14C a partir de L-argininamarcada es quizás el método más ampliamen-te utilizado36,56; b) mediciones cuantitativas dela generación de NO midiendo la oxidación dela hemoglobina o la formación de NO2

− + NO3–,

NO–x; c) cuantificación del GMPc, el producto

de la estimulación de la guanilato ciclasa solu-ble por NO57, y d) técnicas histoquímicas, conanticuerpos específicos mono o policlonalescontra las isoformas neuronal, endotelial e in-ducible58. Estos estudios revelaron la presenciade NO en muchas áreas del cerebro. Los pri-meros estudios, en 1990, demostraron clara-mente que la actividad sintetizadora de NO es-tá presente en todo el cerebro en la rata y otrasespecies, con áreas de alta (cerebelo y bulboolfatorio), media (hipotálamo y mesencéfalo),

58


GCGMPc

Glu

Na+

A

L-arginina

NOS

CaM

NCa2+

NO

L-citrulina

Dendritapostsináptica

GC

GC

Astrocito

GMPc

Terminalpresináptica

Fig. 1. El glutamato (glu) liberado de la terminal presináptica actúa sobre receptores NMDA (N) y no NMDA (A),lo que produce un aumento de la entrada de Ca2+. La calmodulina (CaM) activa la NOS, que forma NO. El NO sedifunde hacia otras células. El principal mecanismo de transducción neuronal es la estimulación de la guanilatociclasa soluble (GC), lo que aumentaría las concentraciones de GMPc. (Modificada de Garthwaite37.)

baja (estriado, corteza e hipocampo) y muy ba-ja actividad (médula oblongada)59,60.

Óxido nítrico y dependencia física a opiáceos

La formación de NO está elevada en la dependencia y la abstinencia

Curiosamente, los primeros datos sobre unaposible implicación del NO en la abstinenciaopiácea se obtuvieron al observar que la admi-nistración de inhibidores de la NOS conseguíadisminuir la abstinencia. No fue hasta 1994cuando se observó que, durante la dependen-cia de la morfina, se producía un aumento delas concentraciones cerebrales de los metaboli-tos estables del NO (NO–

2 y NO–3). Posterior-

mente, nuestro grupo61 consiguió demostrarque durante el tratamiento crónico con morfinase producía una elevación de la actividad de laNOS dependiente del calcio en el sistema ner-vioso central (fig. 2). Además, estudios no pu-blicados de nuestro laboratorio indican queexiste un aumento de la expresión de la nNOS

observado por técnicas inmunohistoquímicasen varias áreas cerebrales (bulbo olfatorio, lo-cus coeruleus, nervios del tracto solitario, ner-vio prepósito hipogloso y cerebelo). Este au-mento de la NOS es paralelo al incremento delGMPc durante la dependencia opiácea62.

En cuanto a los cambios que ocurren en laabstinencia, investigaciones previas demostra-ron que los valores de GMPc estaban elevadosen cerebelo en ratas con abstinencia a la mor-fina63. Posteriormente, se presentaron variasevidencias que indicaban un estado de hiper-producción de NO durante la abstinencia: tantola concentración de NO–

x en el tejido cerebral64

como la actividad NOS65 estaban aumentadasdurante la abstinencia. Por último, nuestro gru-po demostró, además, que este aumento de laactividad NOS dependiente del calcio durantela abstinencia se correlacionaba directamentecon la gravedad de ésta66 (fig. 3).

El significado de este aumento de la expre-sión de la NO sintasa constitutiva no inducibleno es conocido en este momento, aunque sehan identificado varias situaciones en las quepuede ocurrir67.

59


Act

ivid

ad N

OS

depe

ndie

nte

del c

alci

o (%

con

trol

, C)

300

250

200

150

100

50

0

C M 1 día M 2 días M 3 días M 4 días

**

****

*

Fig. 2. Aumento de la actividad de la NOS en la dependencia de morfina por implantación s.c. de un pellet de75 mg de morfina (M). Control: pellet placebo. (Para más detalles, véase Leza et al61); *p < 0,05 y **p < 0,01respecto al grupo control.

60


Act

ivid

ad N

OS

depe

ndie

nte

del c

alci

o (%

con

trol

, C) 300

250

200

150

100

50

0

C

350

*

**

*

**

1 2 3 4 6 /días

A

Núm

ero

de s

alto

s

200

150

100

50

0

1 2 3 4 6 /días

B

Fig. 3. Correlación directa entre el aumento de la actividad de la NOS (A) y la gravedad (número de saltos) (B)del síndrome de abstinencia inducido por naloxona tras 1-6 días de adicción en ratones. (Para más detalles, véa-se Leza et al66); *p < 0,05 y **p < 0,01 respecto al grupo control.

61


Salto

s (%

con

trol

, C)

100

40

0

120

80

60

20

C 0,5 5 25 50 0,5 5 25 50 50 L-NAME

L-ARG

D-ARG

**

– +–

– –

–

–

–

–

+ + +

+

–

––––

A

******

Act

ivid

ad N

OS

depe

ndie

nte

del c

alci

o (%

con

trol

, C)

100

40

0

120

80

60

20

C 0,5 5 25 50 0,5 5 25 50 50

****

B

*** ***

Fig. 4. L-NAME previene los síntomas de abstinencia (número de saltos) (A) y la hiperactividad de la NOS (B) enratones con abstinencia por administración de naloxona el cuarto día de adicción. Reversión por L-arginina (L-ARG), pero no por D-arginina (D-ARG). (Para más detalles, véase Leza et al66); *p < 0,01 y **p < 0,001 respec-to al grupo control; ***p < 0,05 respecto al grupo tratado con L-NAME.

Los inhibidores de la NOS previenen la abstinencia

Los primeros estudios demostraron que loninhibidores de la NOS como el L-NAME (NΩ-ni-tro-L-arginina metil éster) y NO2Arg inhibían elsalto estereotipado y la diarrea cuando se inyec-tan antes de la administración de naloxona enratones con dependencia a la morfina68 (fig. 4).A lo largo de los últimos años se han encontra-do resultados similares (tabla II) utilizandootros inhibidores de la NOS.

Uno de los primeros estudios que demostróque la inhibición de la NOS por NO2Arg ate-nuaba varios de los signos de la abstinencia enratas demostró también que estos efectos es-tán claramente afectados por el régimen dedosis69. La reducción de las sacudidas y pér-dida de peso tras la administración de NO2Argy L-NAME es dependiente de la dosis cuandose administran 1 h antes de la naloxona, perono si se administran durante el período deadicción (4 días). Estos datos podrían indicar

que la inhibición de la NOS afecta a la expre-sión de la abstinencia, más que al desarrollode la dependencia en ratas. Un estudio másreciente afirma que tanto L-NAME como L-NM-MA no tienen efectos sobre la abstinencia si seadministran durante la inducción de la depen-dencia física a la morfina, pero pueden dismi-nuir la abstinencia cuando se admininistrandurante la fase de expresión del síndrome70.

Otra cuestión de interés es el hecho de quela inhibición de la abstinencia a la morfina porvarios inhibidores de la NOS está limitada aun cierto rango de dosis y presenta una cur-va acampanada: el efecto antiabstinencia delL-NAME es evidente entre 7,5 y 100 mg/kg,pero dosis de 200-400 mg/kg no tienen esteefecto66,68. La NO2Arg también describe estetipo de curva. Este perfil es similar al que seobserva con MK-801 y otros bloqueadores delos receptores NMDA y no NMDA71,72. La ra-zón de este hecho es desconocida, pero debenconsiderarse otros mecanismos activados porlas altas concentraciones73: por ejemplo, la

62


TABLA IIEFECTOS DE LA ADMINISTRACIÓN AGUDA Y CRÓNICA* DE INHIBIDORES DE NO SINTASA EN LA Referencia 68 76 103 69bibliográfica

NAME NO2Arg NMMA NAME NAME* NO2Arg NO2Arg NO2Arg* NAME7,5-400 3,5-100 3,5-100 100 12 mg 7 días 1-8 mg/kg 7,5-10 1-7,5 mg/kg 7,5-60mg/kg i.p. mg/kg i.p. mg/kg i.p. mg/kg s.c. microbomba 10 días i.p. mg/kg i.p. b.i.d. 4 días mg/kg i.p.

Saltos U U O Dism.

Sacudidas Dism. Dism. Dism. Dism. Dism.

Diarrea Dism. Dism. O Dism. Dism.

Pérdida de peso Dism. Dism. Dism. Dism. Dism.

Castañeteo Dism. Dism. Aum.de dientes

Movimientos estereotipados

Dism.: disminuye; Aum.: aumenta; Dism./Aum.: dosis bajas aumentan, dosis altas disminuyen; O: no cambia; U:no dependiente de la dosis (sólo disminuye a dosis intermedias).

Métodos (animal/dependencia/abstinencia): ratón/pellet 25 mg/naloxona 4 mg/kg68; rata/pellet 75 mg/naloxona 0,5mg/kg76; ratón/inyecciones/naloxona 1 mg/kg103; rata/pellet 75 mg/naloxona 0,5 mg/kg69; rata/pellet 75mg/naloxona 0,5 mg/kg104; ratón/inyecciones/naloxona 2 mg/kg105; ratón/pellet 75 mg/naltrexona 50 µg/kg72;rata/pellet 75 mg/naltrexona 5 mg/kg106; rata/pellet 25 mg/naloxona 4 mg/kg76; ratón/pellet 75 mg/naloxona 1 mg/kg66.

conversión de NO2Arg a L-arginina74 pudieraser una de las explicaciones. Este tipo de cur-vas se observan también con algunos de losefectos antiabstinencia del 7-NI (7-nitro inda-zol), un inhibidor selectivo de la isoforma neu-ronal de la NOS73,75.

Se han sugerido múltiples explicaciones dela disminución del síndrome de abstinencia aopiáceos tras la inhibición de la NOS68,69,76. Laprincipal explicación se refiere al efecto del NOsobre la liberación presináptica de neurotrans-misor. La disminución de la liberación del neu-rotransmisor tras la administración de un inhi-bidor de la NOS podría atenuar los síntomas deabstinencia. La noradrenalina podría ser unode estos neurotransmisores. Esta conexión ca-tecolaminérgica viene apoyada por el hecho deque el GMPc incrementa la tirosina hidroxila-sa77 y potencia la liberación presináptica decatecolaminas78. También se ha sugerido quela hipoactividad dopaminérgica podría ser unfactor que contribuya a los efectos conductua-les de la inhibición del síndrome de abstinen-

cia por inhibidores de la NOS79, ya que la ad-ministración exógena de NO estimula la libera-ción de dopamina en rebanadas de cerebro80.También es posible una conexión colinérgica:durante la abstinencia precipitada por antago-nista se produce un incremento de la transmi-sión colinérgica81,82, y se sabe que se requiereel GMPc para la liberación de acetilcolina(ACh)83. Algunos estudios indican que el me-canismo antiabstinencia de los antagonistas deglutamato84 y de inhibidores de la NOS85 es lainhibición de la liberación de ACh. También seha implicado una conexión de adenosina: losagonistas de receptores de adenosina poseenun potente efecto antiabstinencia86 y la inhibi-ción de la NOS estimula la liberación de ade-nosina87. Otros neurotransmisores han sido im-plicados en los mecanismos que inducen elsalto compulsivo durante la abstinencia a mor-fina precipitada por naloxona, como serotoni-na, ácido gamma aminobutírico, histamina yotros. Sin embargo, la relación precisa entre elNO y estos neurotransmisores no se conoce.

63


ABSTINENCIA MORFÍNICA104 105 72 106 73 66

7-NI NIO NAME NO2Arg NAME NO2Arg NMMA NMMA 7-NI NO2Arg NAME1,8-100 1-300 1 a 56 1 a 30 5 a 20 5 a 20 0,02-4 2 a 8 6,25-50 7,5-100 0,5-400

mg/kg s.c. mg/kg s.c. mg/kg s.c. mg/kg s.c. mg/kg i.p. mg/kg i.p. mg/kg i.p. mg/kg s.c. mg/kg s.c. mg/kg s.c. mg/kg s.c.

Aum. (?) Aum. (?) O O Dism. Dism. Dism. Dism. O O U

Dism. Dism. Dism. Dism. O O Dism. Dism. Dism.

Dism. Dism. Dism. Dism. Dism. O Dism./ U Dism.Aum.

Dism. O Dism. Dism. Dism. O Dism. U

Dism. O O O O Dism. Dism.

Dism. Dism. Dism. Dism. Dism. Dism. O U Dism.

Otros síntomas evaluados: salivación: β por NAME i.p.76 y 7NI s.c.104; lagrimeo: β por NAME s.c.76; ptosis: β porNAME s.c.76; rinorrea: β por NAME s.c.76; temblor: β por NAME s.c.66; priapismo: β por 7NI y NO2ARG73.

NAME: Nω-nitro L-arginina metil éster; NO2Arg: Nω-nitro L-arginina; NMMA: L-Nω-monometil arginina; 7NI: 7-nitroindazol; NIO: N(5)-(1-iminoetil)-L-ornitina.

64


Núm

ero

de s

alto

s

100

40

0

120

80

60

20

SA 5 25 50 100 0,001 0,01 0,1 0,3

**

*

140

***

**

MK-801Lamotrigina

**

AA

ctiv

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NO

S de

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(% S

A)

100

40

0

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60

20

SA 5 25 50 100 0,001 0,01 0,1 0,3

**

**

*

MK-801Lamotrigina

**

**

**

B

Fig. 5. Lamotrigina y MK-801 previenen los síntomas de abstinencia (número de saltos) (A) y la hiperactividad dela NOS (B) en ratones con síndrome de abstinencia (SA) por administración de naloxona el cuarto día de adic-ción. (Para más detalles, véase Lizasoain99); *p < 0,05; **p < 0,01 y ***p < 0,001 respecto al grupo con síndro-me de abstinencia.

Otra cuestión importante es la posibilidad deque los efectos antiabstinencia de los inhibido-res de la NO sintasa estén relacionados consus propiedades ansiolíticas. De hecho, la abs-tinencia a la morfina ha sido utilizada comomodelo de estrés88, y el NO ha sido implicadocomo una “hormona de estrés”45,47. De estaforma, los efectos ansiolíticos de los inhibidoresde la NOS89 podrían tomar parte en el efectoantiabstinencia de estos compuestos.

La conexión aminoacidérgica

Los primeros intentos de disminuir el incre-mento de la transmisión aminoacidérgica en ellocus coeruleus durante la abstinenciaopiácea27 se basaron en el uso de antagonis-tas de receptores de AAE. Estos agentes ate-nuaban los cambios conductuales y tambiénlas alteraciones eléctricas o bioquímicas en laabstinencia en varias especies anima-les23,84,90-93.

Aunque el antagonista no competitivo NMDAdizocilpina (MK-801) es el más ampliamenteutilizado, compuestos con diferentes caracte-rísticas, como agentes competitivos no NMDA(DNQX: 6,7-dinitro-quinoxalina 2,3-diona) oantagonistas del lugar de unión a estricninadel receptor NMDA (5,7 DCKA: ácido 5,7-di-clorokinurénico), atenúan el salto estereotipa-do inducido por naloxona en ratones depen-dientes de morfina. En un intento de explicareste mecanismo de acción común, Cappendijket al71 propusieron que los antagonistasNMDA podrían disminuir la liberación de nora-drenalina o bien su actividad94,95. Por otraparte, los antagonistas NMDA tienen actividadansiolítica96,97, lo que podría inhibir el salto, yaque la ansiedad es un síntoma generalizadoen el síndrome de abstinencia en animales yen humanos98. En la búsqueda de una expli-cación bioquímica a estos hallazgos, Cap-pendijk et al68 sugirieron por vez primera laposibilidad de que el efecto antiabstinenciade los antagonistas de receptores de AAEpodría deberse a la disminución de la pro-ducción de NO.

En concordancia con esta última hipótesis,nuestro grupo de trabajo ha demostrado que lainhibición de la síntesis de NO puede ser elmecanismo por el cual agentes bloqueadoresde receptores de AAE como MK-801 y agentesinhibidores de la liberación de AAE como lamo-trigina (3,5-diamino-6-[2,3-diclorofenil]-1,2,4-triazina) atenúan la abstinencia opiácea en ra-tones99 (fig. 5).

Conclusión y perspectivas

El NO es un modulador de los procesos quellevan al desarrollo de la dependencia opiáceay a la expresión de la abstinencia, y la víaAAE:L-arginina:NO:GMPc podría ser un eje enlos cambios neuronales durante el tratamientocon opiáceos previo a la abstinencia. La com-prensión de los mecanismos de esta interac-ción y la dilucidación de los neurotransmisores,receptores y segundos mensajeros implicadosservirá para diseñar estrategias alternativas enel tratamiento de la dependencia y abstinenciaopiácea.

¿Cuáles podrían ser las futuras direccionesde investigación en esta área para comprobarlas posibilidades reales de estos tratamientosen humanos? En primer lugar, sería interesanteestudiar los efectos de los antagonistas de re-ceptores de AAE o de inhibidores de la NOS enmodelos de abstinencia por deprivación, no enmodelos de abstinencia inducida por antago-nistas. Por otra parte, sería interesante evaluarcómo los antagonistas NMDA o los inhibidoresde la NOS podrían inhibir la abstinencia unavez que se ha expresado ésta. De hecho, lospacientes heroinómanos piden intervenciónmédica cuando ya están sufriendo las conse-cuencias de la abstinencia.

Según una de las últimas reuniones sobre elpapel de los sistemas glutamatérgicos en el de-sarrollo de la abstinencia opiácea, auspiciadopor el National Institute on Drug Abuse100, lasignificación clínica de los antagonistas de AAEo inhibidores de la NOS radica en tres posiblesusos principales: el primero es su uso en laprevención de las recaídas (sobre la base deque la recaída es un proceso de memoria ycon estos agentes puede evitarse el estímulode la “perdurabilidad” que ejerce el NO en losmodelos de LTP). El segundo es el tratamientode los síntomas de abstinencia a opiáceos, y eltercero es la posibilidad de que estos agentespuedan ser coadministrados con otros agentesya en uso como metadona, levo-alfa acetil me-tadol, clonidina o guanfacina, para acortar latransición a un programa de naltrexona.

Otro punto de investigación es el papel de lavía AAE:NO en la recompensa opiácea y en losefectos reforzadores de las drogas de abuso,principalmente en la transmisión dopaminérgi-ca entre al área tegmental ventral y el nucleusaccumbens. Otra cuestión importante es deter-minar los cambios en la vía AAE:NO tras la ad-ministración crónica de los antagonistas opiá-ceos, principalmente en la hipersensibilidad

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tras los tratamientos de deshabituación connaltrexona.

Por último, tras los estudios iniciales en roe-dores, deben comenzarse con los estudios enprimates. Los estudios preliminares indicanque el MK-801 produce toxicidad que puedeser grave. Este fármaco, como otros antagonis-tas NMDA no competitivos, produce reaccio-nes tipo fenciclidina (PCP) en animales comohiperactividad locomotora, caídas, ataxia y ca-talepsia101,102. Otros antagonistas NMDA com-petitivos sobre el receptor del glutamato nopresentan esta toxicidad. El LY-274614, porejemplo, no produce comportamientos tipoPCP, aunque produce una sedación importan-te91. Estos antagonistas sin toxicidad PCP po-drían ser preferibles a otros receptores no com-petitivos del receptor NMDA, pero la relevanciaclínica de este tipo de fármacos debe ser clari-ficada. En el caso de los inhibidores de la NOS,los efectos en la presión arterial son un impor-tante factor limitante. El NO produce hipoten-sión a través de la activación de la NOS endo-telial y, por tanto, la mayoría de los inhibidoresde la NOS inducen hipertensión, con excep-ción de 7-NI (7-nitroindazol), que inhibe espe-cíficamente la NOS neuronal. Los estudios enhumanos deben comenzarse con 7-NI u otrosinhibidores más selectivos.

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69


A. GARCÍA SÁNCHEZ: Entiendo que el glutamatoestá actuando en el locus coeruleus, dondeobserváis un aumento de expresión que, su-pongo, es de nNOS. El óxido nítrico podríaactuar de diferentes formas, ya sea inhibien-do la liberación de la adrenalina o a través deotros mecanismos. ¿Cómo explicáis que tam-bién se observe una inducción de la nNOS encerebelo y en células de Purkinje, que nor-malmente no expresan?

J.C. LEZA: Parece que en ratas no se expresanNOS, pero sí en ratón. Nosotros también nosplanteamos la pregunta de por qué se expre-saba nNOS en el cerebelo y por qué no enotras áreas. Una posible explicación sería quedel locus coeruleus parten aferencias al cere-belo al igual que del estriado, otro de los nú-cleos que está muy implicado en la abstinen-cia opiácea. Estas conexiones noradrenérgi-cas que van al cerebelo están reguladas porinterneuronas glutamatérgicas, lo que podríaexplicar la presencia de inducción de lanNOS. Realmente, a través de estudios de in-munohistoquímica se puede ver que estoocurre también en otras áreas como en locuscoeruleus o en el núcleo paragigantocelular.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: Por otro lado, el glutamatoestimula puntualmente la NOS, porque au-menta la concentración de calcio. Pero, queyo sepa, no hay datos de inducción y vosotrosestáis hablando de una inducción, por tantode un aumento de la cantidad de proteínaque detectáis por inmunocitoquímica. Me re-sulta difícil entender todo este proceso, desdeel glutamato en el locus coeruleus afectandola liberación de noradrenalina y el efecto deesas vías noradrenérgicas sobre el cerebelo.¿Cómo se explica que esta disminución en laliberación de noradrenalina vaya a afectar alas concentraciones de proteína enzimática?

J.C. LEZA: No tengo suficientes elementos dejuicio como para interpretar estos datos des-de la óptica de la biología molecular, peropuedo añadir que en el ensayo de citrulinatrabajamos con tubos control, unos que tie-nen un quelante de calcio y otros tubos queno tienen ese quelante de calcio y que contie-nen un inhibidor de la NOS. Restando la acti-vidad de los terceros de la de los segundos,deducimos si la inducción es dependiente oindependiente del calcio. La actividad quehemos presentado anteriormente es depen-diente del calcio. Sobre la posibilidad de queel glutamato induzca la expresión de la NOS,

sea constitutiva o inducible, puedo añadirque por datos de nuestro grupo, todavía nopublicados, parece ser que sí. Esto lo hemosdemostrado en el modelo de isquemia-reper-fusión donde el glutamato es aplicado en el lí-quido de perfusión que baña la rebanada detejido y donde se ha visto que por sí mismoes capaz de inducir la NOS.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: Me parece interesante eldato, pero no queda claro, puesto que un tra-bajo realizado con anticuerpos frente a la NOneuronal reflejó aumentos de expresión en elcerebelo. Si esto se produce a los 5 o 7 díasquiere decir que es relativamente rápido, te-niendo en cuenta que debe ser un efectobastante indirecto. ¿Existen datos acerca de siexiste algún tipo de inducción en los factoresde crecimiento, en citocinas o en otras sus-tancias en estos modelos?

J.C. LEZA: No que yo conozca.R. MALDONADO: Comentas el tema de la impor-

tancia de la tormenta noradrenérgica en laexpresión de la abstinencia. Los últimos re-sultados al respecto, basados en inducir con6-OH-dopamina una lesión de todas las pro-yecciones del locus coeruleus con la consi-guiente depleción de noradrenalina en todo elcerebro, refieren que en estos animales noexiste ninguna modificación en la expresióncomportamental de la abstinencia y que tam-poco existe ninguna modificación en los efec-tos inducidos por la clonidina sobre la absti-nenia. ¿Cuál es tu opinión sobre estos hallaz-gos?

J.C. LEZA: Una posible explicación es que seprodujeran otros fenómenos como, por ejem-plo, una sobreactivación durante el períodode tolerancia del propio NO. Éste podría estarestimulando la liberación de otros neurotrans-misores, que serían los responsables delefecto observado sin la participación de lascatecolaminas. Quizás hemos focalizado lascosas demasiado en el locus coeruleus y, apesar de tratarse de un centro muy importan-te, evidentemente no es el único. De hecho,también se observó que la clonidina no abolíaabsolutamente el síndrome de abstinencia, loque permite sugerir la posible participaciónde otros neurotransmisores como los amino-ácidos excitadores.

R. MALDONADO: Está demostrado que los cam-bios en el NO se producen sobre todo en elcerebelo. Nosotros hemos obtenido resulta-dos similares para el caso de la abstinencia

70


DISCUSIÓN

por cannabinoides, donde las modificacionesse localizaron específicamente en el cerebeloy no en otras estructuras. ¿Habéis realizadoexperimentos de administración directa en elcerebelo para intentar modificar la expresiónde la abstinencia?

J.C. LEZA: No hemos realizado este tipo de es-tudios, pero creo que, efectivamente, en elcerebelo se observan cambios que procedende otras estructuras como el estriado, locuscoeruleus o el núcleo paragigantocelular.

O. BULBENA: No conozco tanto la nNOS comola iNOS y cuando has mencionado que laactividad era dependiente del calcio he pen-sado en la iNOS. ¿Se dispone de estudiossobre si esta actividad iNOS viene precedidade la expresión del NF-κB? Sobre todo endos sentidos: en un sentido cinético de sa-ber en qué momento se expresa el NF-κBpara inducir este aumento, y posteriormen-te, si cabe pensar que el tratamiento coninhibidores del NF-κB también pudiera re-vertir la sintomatología que ha producido elL-NAME.

J.C. LEZA: Efectivamente, el NF-κB parece serun factor esencial en la expresión de la iNOS.En nuestro modelo de isquemia y reperfusióncerebral in vitro, en rebanadas de cerebro an-terior, hemos observado que la activación delNF-κB precede al aumento que nosotros ve-mos en la actividad de la iNOS. Con PDTC,por ejemplo, se puede evitar la actividad de laiNOS, que es dependiente del calcio, peroque también depende de NFκ-B.

V. FELIPO: Parece que cuando se disminuyenlos valores de NO descienden los síntomas dela abstinencia. ¿Cuál sería el mecanismo mo-lecular que conectaría el NO con los síntomasy que se integraría de algún modo en el me-canismo que ha presentado anteriormenteMaldonado?

J.C. LEZA: No sabría responder cómo se po-drían interrelacionar, pero la fosforilación deproteínas que ocurre en el momento de la to-

lerancia también podría producirse con algu-nas de las NOS.

A.M. PLANAS: Me gustaría hacer un comentarioque creo habría que tener en cuenta respectoa que según en qué células se puede consta-tar o no la presencia de NOS neuronal. Noso-tros hemos trabajado con anticuerpos y nosencontramos que, en función de la fijaciónque se hace del tejido, puede verse o no ver-se la presencia de NOS. Por tanto, siempre sedebe tener en cuenta en qué condiciones seha trabajado y que también dependerá de losvalores de NOS que hubiera. Quisiera, asímismo, hacer una reflexión acerca de estoscambios que observáis en las células de Pur-kinje. Se trata de células inhibidoras y cuandoestán muy activadas pueden producir ataxiaen el animal. ¿Qué relación podría tener unaactivación de NOS con un impedimento físicocomo, por ejemplo, la limitación a que el ani-mal salte? Quiero decir, que estamos centran-do la atención en unos cambios motores den-tro de un amplio conjunto de síntomas de laabstinencia que, tal vez y hasta cierto punto,podrían ser completamente secundarios.

J.C. LEZA: Es realmente complicado interpretarcuándo nos encontramos con neuronas quepueden ser inhibitorias y que están aparente-mente sobreestimuladas en un cuadro que esfundamentalmente excitador. Pero, realmenteno sabría responder específicamente a tupregunta.

R. MALDONADO: Nosotros hemos realizado unestudio similar sobre la dependencia a can-nabinoides y encontramos unas modificacio-nes muy importantes y selectivas de la ciclasaen el cerebelo, que no observamos, al menoscon tanta intensidad, en el caso de la depen-dencia opiácea. Sobre la expresión comporta-mental de estas dos formas de abstinencia,en la abstinencia a cannabinoides el principalsigno que observamos fue precisamente unaataxia y, sin embargo, en la abstinencia aopioides no apareció esta ataxia.

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Introducción

La relajación del músculo liso del pene (delas arterias y del tejido trabecular) inicia y man-tiene la erección. La liberación local de óxidonítrico (NO), desde nervios dilatadores autonó-micos y el endotelio vascular, es fundamentalen la iniciación y mantenimiento de este proce-so. Las siguientes observaciones apoyan el pa-pel del NO en la erección.

Estudios in vitro

La relajación neurogénica y la dependientedel endotelio, tanto del músculo arterial comotrabecular del cuerpo cavernoso, es inhibida obloqueada por los siguientes tratamientos: inhi-bidores de la sintetasa del óxido nítrico (NOS)(p. ej., NG-nitro-L-arginina o NG-metil-L-argini-na), inhibidores de la guanilato ciclasa solu-ble/generadores de superóxido (p. ej., azul demetileno) y captadores del NO (p. ej., oxihemo-globina)1. El contacto de tiras de cuerpo caver-noso con acetilcolina o la estimulación eléctricatransmural de los nervios dilatadores da comoresultado la acumulación de GMPc en este teji-do2,3 (fig. 1). La estimulación eléctrica trans-mural de tiras de cuerpo cavernoso estimula laformación de nitrito, un producto de oxidacióndel NO3. Finalmente, el NO y los donadores deNO son potentes dilatadores del músculo lisode las arterias y del tejido trabecular del cuerpocavernoso1.

Estudios inmunohistoquímicos en tejidos delcuerpo cavernoso han demostrado una inmu-norreactividad NOS-like presente en los nerviosautonómicos y el endotelio4.

Homogenados del tejido del cuerpo caverno-so presentan una actividad considerable deNOS, como se ha demostrado mediante ensa-yos con citrulina2 (fig. 2).

Estudios in vivo

En animales experimentales (perro, conejo yrata), la estimulación eléctrica de los nerviospélvicos/plexos o raíces sacras (en las ratas)produce erección peneana4. Estas respuestasson inhibidas o bloqueadas por la administra-ción local intracavernosa o sistémica de inhibi-dores de los NOS4. Además, la aplicación in-tracavernosa de donadores de NO produceerección.

La presión de oxígeno modula la relajacióndel músculo liso del cuerpo cavernosomediada por el óxido nítrico

La concentración de oxígeno a la que se ex-ponen las tiras de cuerpo cavernoso modula lamagnitud de la relajación neurogénica y la me-diada por el endotelio del músculo liso delcuerpo cavernoso2. El oxígeno ejerce este con-trol mediante la modulación de la síntesis delNO, debido a la dependencia de la NOS, unaoxigenasa, del oxígeno molecular como sustra-to. Esta observación es muy relevante a la fisio-logía y fisiopatología de la función eréctil. Laspresiones de oxígeno fisiológicamente bajaspresentes en el pene flácido pueden desempe-ñar un papel en el mantenimiento del estadoflácido al inhibir la producción de NO, mientrasque los incrementos insuficientes de las presio-nes de oxígeno (por enfermedad vascular) enel inicio de la erección puede impedir una res-puesta eréctil completa. El umbral de la pO2para una síntesis completa del NO y, por tanto,para una relajación dependiente del endotelio yneurogénica máxima, es de aproximadamente50 mmHg en el tejido del cuerpo cavernoso2.Las presiones de oxígeno inferiores a este valorcrítico inhiben progresivamente la relajación dela formación y liberación de NO.

El óxido nítrico en la erección: del laboratorio a la aplicación clínica

Iñigo Sáenz de Tejada y GormanFundación para la Investigación y el Desarrollo en Andrología (FI + DA). Madrid.

73

Modelos de enfermedad que interfieren con la relajación del músculo liso del penemediada por el óxido nítrico

Hipercolesterolemia

Conejos blancos de Nueva Zelanda que reci-ben una dieta alta en colesterol (un 0,5% decolesterol y un 4% de aceite de cacahuete) du-rante un período de 8-10 semanas desarrollanhipercolesterolemia grave. Las concentracionesplasmáticas de colesterol de estos animalesson de 1.628 ± 149 mg/dl a las 10 semanasen comparación con 53 ± 10 y 33 ± 3 mg/dlen los animales de control5. Los tejidos delcuerpo cavernoso de animales alimentadoscon colesterol presentan una deficiente relaja-

ción, dependiente del endotelio, a la acetilcoli-na. En estos animales, las respuestas a los do-nadores del NO, como el nitroprusiato, soncomparables a las registradas en los animalesde control5, lo que indica que la hipercolestero-lemia induce una alteración en la síntesis o enla disponibilidad de NO, preservándose la ca-pacidad del músculo liso del pene de relajarseen respuesta a esta molécula.

Diabetes

La diabetes está fuertemente asociada a laprobabilidad de desarrollar impotencia. Estu-dios in vitro han demostrado en tejido trabecu-lar de pacientes diabéticos que la relajaciónmediada por el NO, tanto dependiente del en-

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GM

Pc

(pm

ol/m

g pr

oteí

na)

0,0

Control

********

**

*

Hipoxia

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

L-NOARG

Tratamiento

Basal EET n = 4

Fig. 1. Acumulación de GMP cíclico en el cuerpo cavernoso de conejo. Las tiras de cuerpo cavernoso se incubaronen solución salina fisiológica oxigenada (control, pO2 = 145 mmHg) a 37 ºC en presencia de indometacina (3 µM),bretilio (10 µM), atropina (0,1 µM), zaprinast (100 µM) y fenilefrina (1 µM). Algunos tejidos también se incubaroncon NG-nitro-L-arginina (L-NOARG; 50 µM) o bajo condiciones de hipoxia. Todas las tiras de tejido fueron entoncessometidas a estimulación eléctrica transmural (EET) a 5 Hz durante 20 s, y rápidamente congeladas en nitrógeno lí-quido. Los tejidos se homogeneizaron en ácido perclórico y se determinó el contenido de GMPc por radioinmuno-análisis (RIA). Los datos se expresan como la media ± EE; *p < 0,025 respecto al valor basal; **p < 0,0005 respec-to al valor basal en condiciones control; ***p < 0,0005 respecto al control estimulado eléctricamente.

75

EL ÓXIDO NÍTRICO EN LA ERECCIÓN: DEL LABORATORIO A LA APLICACIÓN CLÍNICA

DP

M/m

g de

pro

teín

a ×

10 –

4

Producción de citrulina (actividad NOS)

0 10 20 30 40 50 60Tiempo (min)

8

6

4

2

0

10

12

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0Normoxia Hipoxia

Tratamiento

Pro

ducc

ión

de c

itrul

ina

(nm

ol/m

g de

pro

teín

a)

*

A

B

Fig. 2. Actividad de la NOS en tejido cavernoso de conejo. A: en función del tiempo. Las preparaciones citosóli-cas de cuerpo cavernoso de conejo se incubaron a 37 ºC con L-[2,3-3H]-arginina durante períodos variables detiempo (círculos blancos). Se realizaron incubaciones paralelas a 2 ºC (círculos negros) y también a 37 ºC enpresencia de NG-nitro-L-arginina (L-NOARG; 30 µM) (triángulos blancos). En los tiempos indicados, la incuba-ción se finalizó mediante la adición de 2 ml de tampón frío y se cuantificó la radiactividad empleando un conta-dor de centelleo. Cada punto representa la media de los duplicados; B: efecto de la hipoxia. La fracción citosóli-ca del cuerpo cavernoso de conejo se incubó a 37 ºC con arginina tritiada bajo condiciones de normoxia(pO2 = 130-150 mmHg) o de hipoxia (pO2 = 15-25 mmHg). Se llevaron a cabo incubaciones paralelas a 2 ºC pa-ra determinar la actividad inespecífica. La concentración de citrulina tritiada fue calculada restando la actividadinespecífica de la actividad total. Los valores se expresan como media ± EE (n = 6); *p < 0,0005.

dotelio como neurogénica, se encuentra dismi-nuida comparada con la respuesta en tejidosde pacientes no diabéticos6. Estas observacio-nes en tejidos humanos se han corroborado enanimales de experimentación.

En tejidos trabeculares del cuerpo cavernosode conejos tratados con aloxano para inducirdiabetes se ha demostrado, a las 6 semanas,una relajación dependiente del endotelio yneurogénica deficiente del músculo liso trabe-cular cuando se compara con los tejidos deanimales control7. Las respuestas al donadorde NO nitroprusiato son, sin embargo, compa-rables en tejidos de animales diabéticos y con-troles. De nuevo, y como ocurre con la hiperco-lesterolemia, la diabetes altera las respuestasrelajantes que dependen de la generación delNO. Queda sin determinar si esto se debe a

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Rel

ajac

ión

(%)

Cuerpo cavernoso de conejo

log M (fármaco)

0

–20

–40

–60

–80

–100

–6 –5 v4 –3 –2

L-arginina L-hidroxi-arginina

n = 4

Fig. 3. Relajaciones inducidas por la adición de concentraciones crecientes (0,1 µM a 1 mM) de L-arginina yL-hidroxi-arginina en tiras de cuerpo cavernoso de conejo previamente contraídas con fenilefrina (1 µM). Los da-tos se expresan como la media ± EE del porcentaje de la relajación total obtenida con 0,1 mM de papaverina.n indica el número de tejidos empleados, cada uno de un animal diferente.

TABLA IDIANAS FARMACOLÓGICAS PARAPOTENCIAR LA VÍA DEL NO/GMPc

EN EL TRATAMIENTO DE LA IMPOTENCIA

SustratosL-argininaL-hidroxi-arginina

Donadores del NONitratosMoléculas nitrosiladas (p. ej.,

antagonistas de los receptores alfaadrenérgicos nitrosilados)

Inhibidores de las PDESildenafilo (inhibidor selectivo

de la PDE5)

una alteración en la síntesis o en la disponibili-dad de esta molécula.

Aplicación clínica

La evidencia del papel fundamental de la víadel NO/GMPc en la iniciación y el manteni-miento de la erección y de su alteración encondiciones patológicas hace de ésta una dia-na farmacológica para el tratamiento de la im-potencia. En la tabla I se enumeran las distin-tas formas en las que es posible potenciar lavía del NO/GMPc.

La administración de L-arginina a los pacien-tes ha demostrado una escasa efectividad encuanto a la mejoría de la capacidad de erec-ción. Este resultado concuerda con la falta de

efecto relajante que tiene la L-arginina sobre elmúsculo liso del cuerpo cavernoso (fig. 3). Noobstante, la L-hidroxi-arginina, producto inter-medio en la síntesis del NO, sí tiene un efectorelajante dependiente de la generación de NO.Por tanto, es posible que en un futuro la admi-nistración de sustratos y/o intermediarios en lasíntesis de NO represente una vía terapéuticapara la impotencia asociada a una deficienteproducción de NO.

La administración local, intracavernosa, denitratos donadores del NO, específicamente elnitroprusiato, se ha evaluado experimental-mente en algunos pacientes. Aunque huborespuesta en muchos de ellos, los efectos se-cundarios, especialmente la hipotensión arte-rial, fueron importantes en muchos casos. En

77


Rel

ajac

ión

(%)

Cuerpo cavernoso de conejo

log M (fármaco)

0

–20

–40

–60

–80

–100

–7 –5 –4 –3 –2

Moxisilato NMI 221

n = 6

–6

Fig. 4. Relajaciones inducidas por la adición de concentraciones crecientes (0,1 µM a 1 mM) de moxisilato yNMI 221 en tiras de cuerpo cavernoso de conejo previamente contraídas con endotelina (10 nM). Los datos seexpresan como la media ± EE del porcentaje de la relajación total obtenida con 0,1 mM de papaverina; n indicael número de tejidos empleados, cada uno de un animal diferente. Las respuestas inducidas por NMI 221 fueronmás potentes que las producidas por moxisilato, obteniéndose una diferencia estadísticamente significativa alcomparar las curvas mediante un análisis de la variancia (ANOVA; p < 0,005).

este sentido, se está considerando la utilizaciónde nitrosotioles, cuya transferencia del NO escasi inmediata para conseguir un efecto localcon escaso efecto sistémico. Esto ha llevado aproponer la nitrosilación de moléculas que porsí mismas presentan un efecto proerectogéni-co, convirtiéndolas de esta manera en molécu-las con una doble funcionalidad: donadores delNO y, por ejemplo, antagonistas de los recepto-res alfaadrenérgicos. Estas moléculas han de-mostrado poseer potentes efectos relajantesdel músculo liso del pene in vitro (fig. 4) y lacapacidad de inducir erección in vivo, en ani-males de experimentación, con escasos efec-tos sistémicos.

La inhibición de la actividad fosfodiesterasaen el cuerpo cavernoso es la diana terapéuticaque ha alcanzado el uso clínico8. El NO ejercesu acción en el músculo trabecular y arterialmediante la activación de la forma soluble dela guanilato ciclasa con el consecuente aumen-to de la concentración intracelular de GMPc.En la regulación de segundos mensajeros, lasfosfodiesterasas son enzimas clave. Se hanidentificado nueve familias distintas de fosfo-diesterasas (PDE), con un patrón de distribu-ción específico en distintos órganos. Se ha des-crito la existencia de cuatro familias de PDE enel tejido del cuerpo cavernoso humano: PDE2,PDE3, PDE4 y PDE5. Dos de estas enzimas, laPDE2 y la PDE5, son capaces de hidrolizar elGMPc, siendo esta última selectiva para estenucleótido cíclico con una Km baja. El sildena-filo es un inhibidor potente y selectivo de la ac-tividad PDE59. In vitro, el sildenafilo aumenta laacumulación de GMPc en el tejido del cuerpocavernoso humano, lo que potencia la relaja-ción inducida por el NO endógeno y exógeno9.En animales de experimentación el sildenafilopotencia la capacidad de erección tras la esti-mulación del nervio pélvico10. En humanos, elsildenafilo ha demostrado un alto grado deefectividad en el tratamiento de la impotenciade gravedad moderada e incluso en algunoscasos graves8. Este fármaco se administra porvía oral una hora antes de tener relaciones se-xuales y su ventana terapeútica es de 4 h. Da-da la facilidad de la vía de administración oral ysu alta efectividad, el sildenafilo se ha converti-do en la primera línea de tratamiento farmaco-lógico de la impotencia. Su efectividad es me-nor (40%) en pacientes en los que la impoten-cia es secundaria a la cirugía pélvica debido ala lesión que se produce en los nervios libera-dores de NO. Así mismo, la efectividad es limi-tada (55%) en pacientes diabéticos, mientras

que en el resto de los pacientes la efectividadoscila entre el 60 y el 80% dependiendo de laetiología8.

Actualmente se están desarrollando segun-das generaciones de inhibidores de la PDE5con mayor selectividad por esta enzima y dife-rente farmacocinética.

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78


A. GARCÍA SÁNCHEZ: ¿Es, en general, la isoforma5 de la fosfodiesterasa predominante en teji-do muscular de los vasos?

I. SÁENZ DE TEJADA: En el músculo liso de los va-sos predominan las isoformas 2 y 5.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: ¿Cómo se explicaría que sil-denafilo no tenga más efectos indeseablescomo, por ejemplo, producción de hipoten-sión?

I. SÁENZ DE TEJADA: Sorprende porque no sonexcesivamente potentes, pero sildenafilo síque presenta efectos vasodilatadores a otrosniveles. Entre otros, disminuye la presión ar-terial sistólica una media 8 mmHg, en un16% de pacientes produce cefaleas (posible-mente por vasodilatación), causa sensación yenrojecimiento facial, así como sensación decongestión nasal por efecto sobre el tejidoeréctil de la nariz.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: Puesto que hay datos desubsensibilización o down-regulation de gua-nilato-ciclasa mediada por GMPc en determi-nadas situaciones experimentales, ¿existenestudios realizados a largo plazo en animalesde experimentación con sildenafilo para com-probar si también se produce dicha subsensi-bilización de la guanilato-ciclasa?

I. SÁENZ DE TEJADA: No existen evidencias deello, como tampoco las hay de la estimulaciónde la expresión de las fosfodiesterasas porparte de este fármaco. Sin embargo, debe te-nerse en cuenta que la administración de es-te fármaco es a demanda, que tiene una se-mivida biológica de 4 h aproximadamente, yque su efecto es transitorio. Por tanto, los au-mentos de GMPc no son mantenidos.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: Estaba pensando en situa-ciones de abuso del fármaco. Por otro lado,has mencionado que en uno de los experi-mentos la hidroxi-arginina era eficaz, mien-tras que la arginina no lo era. ¿Se ha descrito

tal vez algún tipo de hipofunción de la NOSen algún paciente que pudiese explicar queel intermediario sea eficaz y no el sustrato?

I. SÁENZ DE TEJADA: La verdad es que no lo sa-bemos. Nos interesamos en la hidroxi-argini-na fundamentalmente por el tema de la hipo-xia, pensando que en situaciones de hipoxia,la hidroxi-arginina, como ya contenía oxígenomolecular incorporado, iba a requerir la mitadde concentración de oxígeno para poderreinstituir la síntesis de NO. Y fue en estos ex-perimentos in vitro donde constatamos queno había respuesta a la arginina y sí a la hi-droxi-arginina. Esto también se ha observadoen arterias, en las que para observar una res-puesta vasodilatadora había que deplecionarla arginina primeramente. Esto puede inducira pensar que tal vez exista una reserva paraL-arginina que no existe para hidroxi-argininay que, por tanto, no sea un factor que influyaen su efecto vasodilatador.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: ¿Se dispone de algún estu-dio sobre la funcionalidad de la NOS que su-giera la existencia de correlación entre impo-tencia e hipofunción o disminución de NOS?

I. SÁENZ DE TEJADA: Se ha demostrado disminu-ción en la respuesta funcional en la diabetes,en la hipercolesterolemia y en la isquemia. Eneste último caso, hemos visto que se produ-cía una disminución de la actividad NO sinte-tasa. Cabría destacar también el papel regula-dor de la actividad en el cuerpo cavernosohumano de los andrógenos. Son importantesreguladores de la actividad de la sintetasa delNO, de manera que si disminuyen se reducela actividad y, lo que es más discutido, la ex-presión de la NOS. Otro mecanismo reguladorson las bajas concentraciones fisiológicas deoxígeno, que en el pene en estado de flacidezson atribuibles al aporte sanguíneo de tipo ve-noso.

79


DISCUSIÓN

Introducción

El proceso de desarrollo del músculo esque-lético comprende numerosos acontecimientos:predeterminación de células mesodérmicaspluripotentes para diferenciarse en mioblastos,salida de los mioblastos del ciclo celular, for-mación de miotubos multinucleados por fusiónde mioblastos y, finalmente, crecimiento y ma-duración de las fibras de músculo esquelético1.Molecularmente, la expresión de genes especí-ficos de músculo esquelético implica a la fami-lia de factores de transcripción relacionadoscon MyoD. Esta familia de proteínas básicascon estructura de hélice-giro-hélice (bHLH) in-cluye MyoD, miogenina, myf-5 y MRF42. Laactividad transcripcional de estos factores estáregulada de manera compleja y requiere la for-mación de heterodímeros con los productosdel gen E2A para formar complejos activos3. Laactividad de dichos factores se atenúa cuandoE2A es secuestrado por Id, proteína cuya ex-presión se reprime en el momento de la dife-renciación celular. Actualmente se conocen va-rios factores capaces de regular negativamentela diferenciación del músculo esquelético. En-tre los más caracterizados se encuentran elfactor básico de crecimiento de fibroblastos detipo 2 (bFGF-2), el factor de transformación delcrecimiento β1 (TGF b1) y oncogenes como c-myc, c-jun, c-fos, H-ras y E1a4.

Existen pocos factores descritos capaces deinducir la diferenciación morfológica del mio-blasto y la expresión y activación de la familiade proteínas MyoD. Entre ellos, los factores decrecimiento similares a insulina (IGF-I e IGF-II)son estimuladores potentes de la diferenciaciónmuscular y se consideran candidatos potencia-les para la regulación de la función de las célu-las satélite durante la regeneración ante la le-sión muscular5. La expresión de IGF aumentadurante la diferenciación de los mioblastos6-9.La cantidad de IGF-II secretado se correlacionacon la velocidad de diferenciación espontánea y

se ha descrito que la presencia de oligonucleó-tidos antisentido complementarios al ARNm deIGF-II inhibe la diferenciación en ausencia perono en presencia de IGF-II exógeno10. La expre-sión de IGF-I en el músculo esquelético provocala hipertrofia de las miofibras11 y su sobreexpre-sión en el corazón de ratones transgénicos pro-voca cardiomegalia mediada por un aumentodel número de células12.

En cuanto a su potencial clínico, IGF-I estásiendo administrado a personas afectadas deesclerosis lateral amiotrófica (ELA)13. IGF-I hasido administrado con efectos beneficiosos avarios modelos de degeneración motoneuronalen el ratón. El modelo de ratón mutado (ratón“wobbler”) posee un gen autosómico recesivo(wr) y ha sido caracterizado como modelo ex-perimental de alteraciones de las motoneuro-nas bajas asociadas con atrofia muscular, de-nervación y reinervación. Se ha demostradoque el tratamiento de estos ratones durante6 semanas con IGF-I provoca un aumento del40% en la fuerza14. El diámetro promedio de lafibra muscular, que es menor en los ratones“wobbler” que en los normales, aumenta enlos animales mutantes tratados con IGF-I14.Estos datos revelan que la administración deIGF-I provoca un efecto beneficioso significati-vo en los parámetros histoquímicos y funciona-les del músculo. Un inconveniente claro en eldiseño de terapias de regeneración muscular abase de administración de IGF es que estospéptidos son factores de crecimiento pleiotrópi-cos capaces de inducir hipertrofias generaliza-das. Por esta razón, la identificación de los ele-mentos celulares implicados en la cascada deseñalización miogénica inducida por los IGFconstituirá una base esencial en futuras estra-tegias terapéuticas de regeneración muscular.

Fosfatidilinositol 3-cinasa y miogénesis

La fosfatidilinositol 3-cinasa (PI 3-K) es unaenzima capaz de fosforilar en posición D-3 el

Identificación de vías intracelulares implicadas en la diferenciación muscular

Perla Kaliman, Judith Canicio y Antonio ZorzanoDepartament de Bioquímica i Biologia Molecular. Facultat de Biologia. Universitat de Barcelona.

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82


Control ∆p85IGF-II (nM):

0

0

20

100

100

Día

0D

ía 2

Día

4

Fig. 1. Inhibición de la fusión inducida por IGF-II en células L6E9-∆p85. Células L6E9-∆p85 (f-j) y células controlexpresando la forma salvaje de p85∆ (a-e) crecieron hasta su confluencia en un medio rico en suero (a y f) y lue-go se diferenciaron en medio DMEM (b y g) o en medio DMEM que contenía 20 nM de IGF-II (c y h) o 100 nM(d, e, i y j). Las células se fotografiaron a los 2 días (b, c, g, h, i) o a los 4 días de diferenciación (e y j). Escala, 30mm. Reproducida con permiso de Kaliman et al, 199823.

anillo inositol del fosfatidilinositol (PI) generan-do como productos PI 3-P, PI 3,4-P2 y/o PI3,4,5-P3. La PI 3-K ha sido implicada en unagran variedad de procesos celulares como tráfi-co celular de proteínas, movilidad celular, dife-renciación, regulación de la estructura del ci-tosqueleto y apoptosis15. Según su estructura,función y mecanismo de activación, se puedendistinguir distintos subgrupos de PI 3-K. La PI3-K mejor caracterizada hasta el momento estáformada por una subunidad regulatoria de 85kD (p85) y una subunidad catalítica de 110 kD(p110). La subunidad p85 es capaz de activara la p110 al unirse a través de sus dominiosSH2 a residuos de fosfotirosina de otras proteí-nas16. La PI 3-K de tipo γ no se une a p85 sinoque se activa por unión a las subunidades βγde proteínas G17. Un tercer grupo de PI 3-Kestá formado por la Vps34p (vacuolar proteinsorting) de Saccharomyces cerevisiae y su pro-teína homóloga humana18,19. Estas isoformastienen un papel fundamental en el tráfico intra-celular de proteínas y se activan al asociarse auna proteína con actividad de tipo proteína se-rina/treonina cinasa.

Durante los últimos años se ha avanzadomucho en el conocimiento del papel de los IGFen la miogénesis20. Sin embargo, los procesosintracelulares miogénicos dependientes de IGFson muy poco conocidos. Recientemente,nuestro grupo de investigación ha demostradoque la enzima PI 3-K es un segundo mensajeroesencial para los efectos miogénicos de losIGF21-23. En efecto, nuestros estudios han de-mostrado que la vía miogénica inducida porIGF se bloquea totalmente en células muscula-res tratadas con inhibidores específicos de laactividad PI 3-K y en células musculares queexpresan de manera estable una forma mutadadominante negativa de la subunidad regulado-ra de la PI 3-K, p85 (L6E9 ∆p85)22.

p85-p110 PI 3-K es esencial para lamiogénesis inducida por IGF en mioblastosde rata L6E9, mioblastos humanos y células10 T1/2 transfectadas con MyoD

En nuestro laboratorio hemos demostradoque dos inhibidores específicos y estructural-mente no relacionados de las PI 3-K (la wort-manina24 y el LY29400225) bloquean la capa-cidad de formar miotubos multinucleados apartir de mioblastos de la línea celular de mús-culo esquelético de rata L6E9 y de mioblastoshumanos provenientes de biopsias de múscu-lo esquelético. La inhibición de la PI 3-K no

sólo afecta al proceso morfológico de diferen-ciación de músculo esquelético sino que tam-bién bloquea la expresión de marcadores bio-químicos de diferenciación como son la mio-genina y el transportador de glucosa GLUT4.Así mismo, la inhibición de la PI 3-K impide lasalida de los mioblastos del ciclo celular (pasoesencial en el proceso de diferenciación termi-nal) evidenciado por la inhibición de la induc-ción de la proteína p21, un inhibidor de cina-sas dependientes de ciclinas. Por contra, losinhibidores de la PI 3-K no afectan a la proli-feración de los mioblastos ni los primeros epi-sodios morfológicos de la diferenciación queson el alineamiento y la elongación de losmioblastos21.

La sobreexpresión de MyoD o de otrosmiembros de esta familia de factores de trans-cripción es suficiente para inducir la formaciónde miotubos multinucleados y la expresión degenes específicos de músculo en células queno provienen de un origen muscular26. De estaforma, los fibroblastos 10T1/2 transfectadoscon MyoD son capaces de formar miotubosmultinucleados y de expresar marcadores bio-químicos de músculo. Sin embargo, hemos de-mostrado que la inhibición de la PI 3-K blo-quea la capacidad de MyoD para inducir la di-ferenciación. El tratamiento de células10T1/2-MyoD con wortmanina o LY294002 im-pide la formación de miotubos, la expresión demiogenina, la salida del ciclo celular y tambiénla represión de la proteína Id que es un regula-dor negativo de la miogénesis21.

Resultados recientes de nuestro laboratoriodemuestran que la forma de PI 3-K implicadaen la miogénesis inducida por IGF es la p85-p110: mioblastos L6E9 que sobreexpresan demanera estable una forma mutante dominantenegativa de p85α (∆p85) (incapaz de unir yactivar la p110) no se diferencian morfológicani bioquímicamente en presencia de IGF23. Enla figura 1 se observa que las células L6E9-∆p85 no forman miotubos multinucleados enpresencia de IGF-II mientras que los controles(células L6E9-Wp85 que sobreexpresan la for-ma salvaje de p85α) poseen un alto grado defusión en las mismas condiciones.

Identificación de elementos celulares de la cascada de señalización miogénicadependiente de IGF/PI 3-K

Actualmente, se conoce poco sobre los ele-mentos celulares activados directamente por laPI 3-K y/o por sus productos. Entre ellos, la

83

IDENTIFICACIÓN DE VÍAS INTRACELULARES IMPLICADAS EN LA DIFERENCIACIÓN MUSCULAR

84


IGF

-Wortmanina-LY294002-∆p85α

p85-p110

PI 3-K

Id

Activación de MyoD

Miogenina

p21 (salida del ciclo celular)

Expresión de proteínasespecíficas de músculo:

GLUT4, MHC, caveolina 3

Formación de miotubosmultinucleados

Elongación y alineaciónde los mioblastos

Mioblastos

—

Fig. 2. Modelo de señalización miogénica inducida por IGF. En presencia de IGF-II, los mioblastos inician el pro-grama de diferenciación. Morfológicamente, al principio se alinean y se elongan; 24 h después las células co-mienzan a fusionarse y forman miotubos multinucleados. En presencia de inhibidores químicos de PI 3-K (wort-manina o LY294002) o en células que expresan una p85 dominante negativa (∆p85), IGF-II es incapaz de indu-cir el programa de diferenciación: a) los valores de Id no decaen y se sabe que altos valores de Id inhiben MyoD;b) MyoD permanece inactivo; c) no se induce miogenina, un factor de transcripción esencial para la miogénesis,y d) los mioblastos no salen del ciclo celular, otro requisito esencial para la diferenciación, porque el inhibidor decinasas dependientes de ciclinas p21 no se induce. Estos acontecimientos finalmente provocan la ausencia defusión celular y de expresión de proteínas específicas de músculo como son GLUT4, la cadena pesada de lamiosina (MHC) y la caveolina 3.

proteína p70 S6 cinasa (S6K), una serina/treo-nina cinasa, está implicada en la transmisiónde señales dependientes de la actividad PI 3-Ken varios procesos celulares. La p70 S6K esactivada por la insulina y por IGF en mioblastosL6E9 y Sol8, y su actividad es potentementebloqueada por un inhibidor bien caracterizado,la rapamicina. Recientemente, hemos demos-trado en mioblastos de rata, ratón y humanos,que la p70 S6K no está implicada en la víamiogénica iniciada por IGF/PI 3-K27.

Otros posibles efectores de esta vía podríanser la proteincinasa B (también conocida comoAkt o RAC) y/o algunas isoformas de la pro-teincinasa C (-ε, -δ, -ζ o -η) que son activadaspor productos de la PI 3-K en diversas líneascelulares28-31. Por otra parte, se ha descritoque la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS) esun elemento esencial para la diferenciación decélulas musculares de embrión de pollo32. Re-sultados preliminares de nuestro laboratorio in-dican que el efecto miogénico de los IGF de-pende de la actividad NOS celular y, que a suvez, la actividad miogénica de la NOS es total-mente dependiente de la PI 3-K (Kaliman et al,resultados no publicados).

Sobre la base de estos resultados, hemospropuesto un modelo que representa de formaesquemática los eventos morfológicos y bioquí-micos que conducen a la diferenciación delmúsculo esquelético (fig. 2).

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J. MOSCAT: Demuestras que la fosfatidilinositol3-cinasa (PI 3-K) es necesaria para la activa-ción del factor nuclear kappa B (NFκ-B).¿Tienes algún resultado que pueda demostrarque también es suficiente, o prevés que va aser únicamente necesaria?

P. KALIMAN: No hemos realizado estos experi-mentos. La PI 3-K es esencial para la mioge-nesis, ya que cuando se bloquea no hay nin-gún tipo de diferenciación ni bioquímica nimorfológica. Lo mismo ocurre al bloquearNFκ-B, puesto que también es un paso esen-cial para la miogénesis. Como intermediariosentre PI 3 cinasa y NFκ-B tiene que estar elgrupo de serincinasas que fosforilen I-κ B. Nosé si una mutante permanente activa de PI 3-K puede por sí sola aumentar los niveles deactividad de NFκ-B de la célula.

J. MOSCAT: Me refería a que la sobreexpresiónde mutantes permanente activa de PI 3-K seha visto que activa, por ejemplo, jun o Rac.

P. KALIMAN: No disponemos de los datos, aun-que imagino que sí que es esencial para lacompleta activación de NFκ-B.

G. PONS: En relación con la activación de NFκ-B lo único que sorprende es el tiempo quetarda en descender I κ, que me pareció ser

de 16 o 24 h. ¿No es mucho tiempo en com-paración con la rapidez con que se activanormalmente el sistema en respuesta a otrosfactores? Y, en segundo lugar, ¿habéis proba-do el dominante negativo de I κ?

P. KALIMAN: Aunque no te sabría decir por qué,el descenso más brusco se observa sobre to-do entre las 16 y las 24 h. El proceso de dife-renciación tiene unos tiempos que tampocose pueden comparar a los sistemas donde seinduce una cascada con factores de creci-miento en 5 min. Son procesos que duran 4días en cultivo, como mínimo. Dado que sonresultados muy recientes que no están publi-cados todavía, aún no hemos podido probarel dominante negativo de I κ.

A. MUÑOZ: Puesto que se ha descrito que lahormona tiroidea regula la expresión de ge-nes clave en la diferenciación muscular, co-mo miogenina, MyoD y miosinas, y que porotra parte también regula la expresión de in-sulin growth factor I (IGF-I) y el propio recep-tor en células de riñón, por ejemplo, ¿habéisestudiado qué hace la hormona tiroidea envuestro sistema?

P. KALIMAN: No hemos analizado el efecto de lahormona tiroidea en nuestro modelo. Las célu-

DISCUSIÓN

las musculares secretan de manera autocrinaIGF para promover su diferenciación, y nosotrosestamos adicionando el IGF de manera exógenapara iniciar directamente la miogénesis.

R. BARTRONS: ¿Funciona exactamente igual conlas dos IGF?

P. KALIMAN: No, porque el IGF-II es el que lacélula muscular secreta de manera autocrina,pero su efecto está mediado a través del re-ceptor de IGF-I.

A. CELADA: ¿Cualquier sustancia que induceiNOS, como por ejemplo interferón γ ocualquier otro producto, induce diferencia-ción? Y, en segundo lugar, ¿en qué partedel ciclo celular se detiene la célula con elIGF?

P. KALIMAN: No se han realizado estudios coninterferón en cuanto a inducción de diferen-ciación muscular. Se sabe que la interleucina15 sí que afecta a la diferenciación muscular.En alguno de los experimentos se provó el in-terferón γ, pero no observamos ningún efectoclaro. Respecto a tu segunda pregunta, des-conozco en qué momento del ciclo se detienela célula.

A. GARCÍA DE HERREROS: ¿Habéis estudiado al-gún otro efector de PI 3-K como Akt o algúnotro posterior?

P. KALIMAN: Probamos p70 S6 cinasa (p70S6K) y vimos que la vía no pasa por ahí. Enestos momentos lo estamos analizando enAkt y pensando también, evidentemente, enisoformas de PKC.

A. GARCÍA DE HERREROS: Fibroblastos muy seme-jantes a éstos pueden diferenciarse hacia adi-pocitos si son tratados de otra manera, conun estímulo en el que interviene el IGF-I. ¿Ha-béis estudiado si esta ruta está involucradatanto en la diferenciación hacia la célula mus-cular como hacia el adipocito?

P. KALIMAN: La verdad es que no es exactamen-te comparable la vía de diferenciación adipo-génica. Se ha descrito que la p70 S6K es im-portante para la vía adipogénica, pero no parala miogénica. También hay que pensar queen la diferenciación de adipocitos se inducecon insulina, por ejemplo. Hay algunos pun-tos en común, como el caso de la PI 3-K, quesí que se ha visto implicada en la adipogéne-sis.

A. GARCÍA DE HERREROS: ¿Hay algún elementoque puedas caracterizar que esté involucrado

también en la diferenciación de fibroblastoshacia adipocitos?

P. KALIMAN: Por el momento centramos nuestroestudio en la miogénesis.

F. MAYOR: Es realmente sorprendente que lavía PI 3-K sea la única responsable de todo elprograma de diferenciación cuando realmen-te estos receptores son capaces de poner enmarcha simultáneamente varios procesos. Enrelación con esto, ¿habéis observado si algúnotro receptor en estos tipos celulares quetambién estimule PI 3-K produce el mismoefecto de diferenciación?

P. KALIMAN: La verdad es que no hemos esti-mulado estas células con ningún otro agentediferenciador, porque estamos analizando elmecanismo desde una óptica más fisiológica,que es a través del receptor IGF-I. Pero loque está claro es que la PI 3-I es esencial pa-ra este proceso, puesto que si se bloquea nose obtiene ningún tipo de diferenciación mus-cular. Lo que puede ser es que la PI 3-K noesté actuando sólo en la vía de IGF sino tam-bién por la vía de integrinas. Se sabe que lavía de integrinas es esencial para la miogéne-sis y que los complejos macromolecularesque se encuentran asociados a integrinasunen también PI 3-K. Puede que haya tam-bién distintas isoformas de PI 3-K implicadas.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: Me ha sorprendido que laarginina mimetizase totalmente el efecto delIGF. Para empezar, me pregunto qué isofor-ma se está expresando constitutivamente: ¿esla nNOS, que es abundante en músculo es-quelético, o es la iNOS, de la que actualmen-te empiezan a existir evidencias de que tam-bién se expresa constitutivamente?

P. KALIMAN: Sí, a nosotros también nos sorpren-dió. En el músculo esquelético se expresanlas tres isoformas constitutivas de NOS. Noso-tros observamos que con L-arginina se indu-ce la producción de NO y la fusión. Aunquepuede que no sea sólo a través de iNOS, sinode las otras NOS.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: Aunque sea un experimen-to algo sucio y poco popular, ¿habéis probadoel empleo de donadores?

P. KALIMAN: No podemos usarlos porque tienenuna vida media muy corta y este proceso du-ra 4 o 5 días. Con donadores tipo nonoatos,que tienen una vida media más larga, no ob-servamos ningún efecto claro.

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Introducción

La pancreastatina (PST) es un péptido de 49aminoácidos con una glicina-amida en el extre-mo carboxilo terminal, que fue aislado a partirde páncreas porcino a finales de 19861. LaPST deriva de la proteólisis de un precursorprohormonal, la cromogranina A (CGA), unaglucoproteína muy abundante en el gránulo desecreción cromafín, pero que también estápresente en la mayoría de los gránulos de se-creción de células neuroendocrinas2,3. En losislotes de Langerhans, la PST se localiza tantoen las células β, productoras de insulina, comoen las células δ, productoras de somatos-tatina4, y en las células α, productoras de glu-cagón5,6. Además, la CGA puede sufrir su pro-cesamiento proteolítico fuera de la célula, en elespacio extracelular, tras su secreción, así co-mo en la circulación periférica7,8. Puesto quela mayoría de la CGA circulante se origina entejido cromafín, este origen debe ser la princi-pal fuente indirecta de PST, mientras que elpáncreas endocrino, el antro gástrico y las cé-lulas neuroendocrinas del duodeno son lafuente mayoritaria de secreción de PST proce-sada9,10. El ADNc de CGA de rata reveló la pre-sencia de una secuencia PST-like, homóloga ala PST porcina11-14.

La PST fue denominada así por su acción in-hibidora sobre el primer pico de secreción dela insulina estimulada por glucosa; sin embar-go, se han descrito muchos más efectos bioló-gicos en diferentes tejidos. De hecho, su papelcomo péptido regulador enteropancreático seha establecido tras conocerse una serie deefectos biológicos cuya actividad radica en elextremo carboxilo terminal de la molécula15.Estos efectos se ejercen sobre la secreciónpancreática endocrina y exocrina16-22, la secre-ción gástrica23,24, la liberación de parathormo-na25, las concentraciones de catecolaminas26 yla retención de memoria27. La PST sintética derata también ha demostrado tener actividad

biológica en diferentes tejidos28-30. En el híga-do de rata hemos encontrado que la PST po-see un efecto glucogenolítico comparable alejercido por el glucagón31,32. Este efecto fueconfirmado en hepatocitos aislados de rata,donde resultó ser dependiente de la presenciade calcio en el medio de incubación, e inde-pendiente de la producción de AMPc33. Ade-más, encontramos que la PST incrementa laconcentración de calcio libre citosólico, au-mentando tanto la salida de los depósitos intra-celulares como la entrada de calcio extracelu-lar34. Por otra parte, comprobamos que la PSTinhibe la síntesis de glucógeno estimulada porinsulina en hepatocitos aislados de rata35.

Recientemente hemos encontrado otro efec-to contrarregulador de PST, esta vez sobre laacción de la insulina sobre otra célula diana, eladipocito de rata36. La PST inhibe la captaciónde glucosa y la liberación de lactato estimuladapor insulina. La lipogénesis también se ve inhi-bida por la PST aunque con menor eficacia. LaPST tiene un efecto lipolítico sobre el adipocitoaislado que es inhibido totalmente por la insuli-na36. Por contra, la PST estimula la síntesisproteica, tanto basal como estimulada por in-sulina en los adipocitos aislados de rata36. Endefinitiva, hemos encontrado una nueva acciónendocrina de PST con un posible papel fisioló-gico en la regulación del metabolismo del tejidograso y con posibles implicaciones en procesosfisiopatológicos como la obesidad y otros sín-dromes con resistencia a la insulina.

La acción inhibitoria de PST sobre la secre-ción endocrina y exocrina en general condujo ala idea de que la PST podría desempeñar unpapel en la regulación fina de la secreción tan-to autocrina como paracrina y endocrina. Sinembargo, la estrecha relación de la PST con eltejido cromafín, y los efectos observados en elhígado y en el tejido adiposo, sugieren un pa-pel como péptido contrarregulador de la insuli-na. Así, la PST actuaría en conjunción con lascatecolaminas en la regulación del metabolis-

Señalización del receptor de pancreastatina: cross-talk con el receptor de insulina

Víctor Sánchez Margalet, José Santos Álvarez y Carmen González YanesDepartamento de Bioquímica Clínica. Hospital Universitario Virgen Macarena. Sevilla.

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mo de la glucosa37,38 y los lípidos36, inhibiendotanto la secreción de insulina como su acciónsobre el hepatocito y el adipocito. Este efectosinérgico con el de las catecolaminas podríaser útil en condiciones fisiológicas, como la res-puesta al estrés (p. ej., producido por la hipo-glucemia) (fig. 1). Por otro lado, los efectos dePST inhibiendo la secreción y la acción de lainsulina han llevado a la hipótesis reciente queatribuiría un papel a la PST en la resistencia ala insulina37,38. Así, la diabetes tipo 2 se carac-teriza por una secreción inapropiada de insuli-na y resistencia a la misma39. De hecho, sehan encontrado valores elevados de PST circu-lante en la diabetes tipo 2, en la hipertensión yen la diabetes gestacional, donde parece corre-lacionarse con las catecolaminas40-43. Si bienla resistencia a la insulina parece preceder al

incremento en los valores de PST o de cateco-laminas en la hipertensión esencial44, estashormonas contrarreguladoras podrían empeo-rar el síndrome de resistencia a la insulina.

A pesar de todas las acciones descritas aúnno se conocen los mecanismos precisos porlos que la PST ejerce tantos efectos biológicos.Durante los últimos años nos hemos interesadoen el estudio del sistema de señalización dePST en el hepatocito. Por tanto, vamos a cen-trarnos en revisar nuestro trabajo sobre la se-ñalización de PST en el hígado45.

Receptores de pancreastatina en las membranas hepáticas

Aunque se han descrito múltiples efectosbiológicos de la PST inhibiendo la secreción

90

TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES COMO DIANA FARMACOLÓGÍICA

Hígado Páncreas

Tejido adiposo

Sistema nerviososimpático

Médula adrenal+ –

+

+

–

–

+

PST

PST

PST

CGA

Glucemia

Fig. 1. Modelo del papel fisiológico de la pancreastatina (PST). Una señal de estrés (hipoglucemia) aumenta laactividad simpática, secretándose catecolaminas junto a la cromogranina A (CGA). La PST derivada de CGA inhi-be la secreción y acción de la insulina en el hígado y en el tejido adiposo, estimula la glucogenólisis hepática einhibe la captación de glucosa en el adipocito, lo que llevaría la glucemia a valores de normalidad, a la vez que laactividad simpática se inhibe, autolimitándose. Por otro lado, la PST producida en el páncreas o en el sistemagastrointestinal puede contrarregular la acción de la insulina; +: estimulación; −: inhibición.

exo y endocrina, la presencia de receptores entejidos secretores no ha sido aún descrita. Dehecho, una de las pruebas para demostrar elcarácter endocrino de un péptido es la presen-cia de receptores específicos en la membranaplasmática de la célula diana.

En este sentido, hemos encontrado recepto-res específicos para PST de alta afinidad enmembranas de hígado de rata46. EmpleamosPST marcada con 125I para estudiar la caracte-rización funcional de los receptores de PST.Este estudio sugirió que el hígado de rata pre-sentaba receptores específicos y de alta afini-dad para PST. Así, la unión del ligando eramuy dependiente de la estructura de la PST.Por tanto, PST de otras especies con poca ho-mología estructural (porcina o humana) pre-sentaron muy baja afinidad en los estudios dedesplazamiento del radioligando. El receptor dePST parecía ser una glucoproteína monoméri-ca funcionalmente acoplada a algún sistemade proteínas G, ya que la unión era muy sensi-ble a nucleótidos de guanina, y podía adsor-berse con diferentes lectinas46. Estos resulta-dos hacen pensar en un receptor de 7 domi-nios transmembrana acoplado a las proteínasG. El análisis de la unión en condiciones deequilibrio indicaba la presencia de una únicaclase de sitios de unión, con una Bmax de 15fmol/mg de proteína y una KD de 0,2 nM. Estosvalores se corresponden bastante bien con laED50 observada para los efectos de PST en loshepatocitos33,34, y son comparables a los de lamayoría de receptores de péptidos, y lo que esmás importante, los valores eran compatiblescon las concentraciones circulantes de PST47,lo que refuerza la idea de un papel fisiológicode PST como un regulador del metabolismo dela glucosa.

Recientemente, hemos conseguido solubili-zar receptores de PST a partir de membranashepáticas en un estado funcional y acoplados aproteínas G, como comprobamos al realizar lacaracterización funcional de los receptores so-lubles48. Así, obtuvimos resultados compara-bles a los observados previamente en membra-nas particuladas, con una Bmax de 14 fmol/mgde proteína, una KD de 0,3 nM y una sensibili-dad similar a los nucleótidos de guanina. Lacaracterización molecular del receptor solublede PST por medio de filtración en gel Sep-hacryl S-300 y cross-linking con radioligandoreveló dos componentes: un pico de 80 KD co-rrespondiente al receptor y otro de 170 KDcompuesto de la asociación del receptor conuna proteína G. Esta proteína G debe pertene-

cer a la familia de Gαq ya que fue reconocidacon anticuerpos específicos en el immunoblotde las fracciones cromatográficas correspon-dientes al componente de 170 KD

48.También hemos conseguido, gracias a su

naturaleza glucoproteica, purificar parcialenteel complejo receptor-proteínas G por medio decromatografía de adsorción a lectinas (lectinadel germen de trigo)48. Éste es un primer pasoimportante hacia la purificación definitiva quellevará a la secuenciación y clonación del re-ceptor.

Señalización del receptor de la pancreastatina

Una vez que habíamos encontrado el efectobiológico de la PST sobre el hígado nos intere-só estudiar su señalización en el hepatocito45.

Pronto observamos que el efecto glucogeno-lítico de la PST era independiente de AMPc pe-ro muy dependiente del calcio33. Más aún, ob-servamos que la PST incrementaba el calcio li-bre citosólico ([Ca2+]i), por medio de algúnmecanismo tanto sensible como insensible altratamiento con toxina pertúsica34. Estos re-sultados sugerían que la acción de PST estaríamediada por un sistema efector que incluiría laactivación de PLC. De hecho, comprobamosque la movilización de [Ca2+]i está mediada porel incremento de IP3, a través de un mecanis-mo insensible a toxina pertúsica, mientras quela estimulación de la entrada de calcio extrace-lular parece utilizar un mecanismo sensible atoxina pertúsica34. Así, la PST incrementa laproducción de IP3 y DAG en la membrana delhepatocito por medio de la activación dePLC49,50. La estimulación de PLC por un me-canismo insensible a toxina pertúsica sugeríala intervención de una proteína G de la familiaGαq. Hay que destacar que la producción deDAG estimulada por PST no es equimolar, sinomayor que la producción de IP3. Estos resulta-dos se explican por la actuación de fosfolipasaC sobre otros sustratos como la fosfatidil colina(resultados no publicados).

Si el IP3 producido era responsable del in-cremento en [Ca2+]i, el DAG producía una esti-mulación de la actividad proteincinasa C, comocomprobamos en hepatocitos aislados50. Lafunción celular de ambas vertientes de la seña-lización derivadas del fosfatidil inositol bifosfatoes sinérgica y parece ser responsable de la ac-ción de PST en el hepatocito.

La PST también estimula la producción deGMPc, por medio de un mecanismo sensible a

91

SEÑALIZACIÓN DEL RECEPTOR DE PANCREASTATINA: CROSS-TALK CON EL RECEPTOR DE INSULINA

toxina pertúsica. El papel del GMPc en la fisio-logía del hepatocito no se conoce. Sin embar-go, hemos encontrado que la producción deGMPc inhibe la activación de PLC por PST, loque sugiere una función de retroalimentaciónnegativa sobre la señalización del receptor. Elmecanismo íntimo de esta regulación estásiendo investigado en la actualidad.

Proteínas G acopladas al receptor de PST en las membranas hepáticas

Los estudios del receptor de PST y su acciónen el hepatocito sugerían el acoplamiento deproteínas G en la membrana plasmática. Así,teníamos datos indirectos de que PST estimulauna proteína G: por la sensibilidad de la unióndel radioligando a nucleótidos de guanina46,48

y por la estimulación por PST de la actividadGTPasa de alta afinidad en membranas hepáti-cas49. Estos resultados fueron ratificados conestudios de unión de GTP-γ-35S en membra-nas solubilizadas (resultados no publicados). Eltratamiento con toxina pertúsica de las mem-branas hepáticas sólo inhibía parcialmente(15%) tanto la unión de GTP como la actividadGTPasa estimulada por PST. Esto sugería queel sistema principal de transducción del recep-tor de PST pertenecería a la familia de proteí-nas Gαq, la cual es uno de los principales acti-vadores de PLC de membrana (PLC-b). Porotra parte, el sistema de señalización sensible atoxina pertúsica parece pertenecer a la familiaGα i1,2 (resultados no publicados), y sería elresponsable del acoplamiento con la activaciónde guanilato ciclasa, aunque el mecanismopreciso de esta activación es objeto de estudioen la actualidad.

El siguiente paso fue, por tanto, investigar lanaturaleza de esta interacción receptor-proteí-na G por medio de anticuerpos específicos, uti-lizando diferentes abordajes. El efecto de PSTincrementando la unión de GTP y la actividadGTPasa fue bloqueado de forma específica poranticuerpos contra Gαq/11, y en menor medidapor anticuerpos anti-Gα i1,2, lo que demuestrael acoplamiento funcional del receptor de PSTcon un doble sistema de proteínas G, pertene-cientes a las familias Gαq/11 y Gα i1,2

51. Estosresultados coincidían con los obtenidos por im-munoblot en la cromatografía de exclusión engel46, en los que se observaba la coelución delreceptor con la proteína Gαq/11 formando uncomplejo de 170 kD. Esta asociación física se-lectiva fue comprobada por la presencia deGαq/11 en semipurificado de receptor de PST

por cromatografía de adsorción a lectina degermen de trigo. Por otro lado, la inmunopreci-pitación de Gαq/11 coprecipitó al receptor dePST, como se dedujo de la actividad de uniónde PST al inmunoprecipitado51. Estos resulta-dos demostraban definitivamente el acopla-miento físico entre el receptor y la proteínaGαq/11.

Finalmente, el acoplamiento del receptor dePST con el sistema efector PLC fue bloqueadopor el anticuerpo contra Gαq/11, lo que sugiereque una proteína G de la familia de Gαq/11 esefectivamente el mediador de la señal desde elreceptor de PST a la activación de PKC en lasmembranas de hígado de rata.

Para discernir qué subunidad Gα específicamediaba la activación de PLC por PST emplea-mos anticuerpos específicos contra Gαq y Gα11(cedidos generosamente por el Prof. John H.Exton, Vanderbilt University School of Medici-ne, Nashville, TN), ya que ambas subunidadesestán presentes en las membranas hepáticas.Este estudio reveló que es selectivamente Gα11la proteína que media la activación de PLC porPST, y no la homóloga Gαq

52.

El receptor de PST activa la isoenzimafosfolipasa C-β3

Puesto que PST estimula la actividad PLC enmembranas hepáticas, era de suponer que laisoenzima efectora de esta acción sería PLC-β(PLC-γ es citosólica y sólo se asocia a proteínastirosín fosforiladas de la membrana en res-puesta a la señalización por tirosincinasas).

Sin embargo, hay cuatro isoformas de PLC-βdescritas hasta el momento, y tres de ellas es-tán presentes en las membranas de hígado derata (β1, β2 y β3). Sólo PLC-β4 (específica detejido nervioso) está ausente en las membra-nas hepáticas. Por tanto, utilizamos anticuer-pos específicos contra las 3 isoenzimas dePLC-β presentes en el hígado de rata. Encon-tramos que sólo anti-PLC-β3 fue capaz de blo-quear la acción de PST52. Por tanto, estos da-tos sugieren que PLC-β3 media la respuestadel receptor de PST en el hepatocito.

La pancreastatina inhibe la señalización del receptor de la insulina

Muy recientemente hemos estudiado el efec-to de la PST sobre la señalización del receptorde insulina en las células derivadas de hepato-ma de rata HTC53. La PST inhibe de forma de-pendiente de la dosis la autofosforilación del

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receptor de la insulina. Además, PST tambiéninhibe la tirosín-fosforilación de los sustratosdel receptor de insulina en células HTC, IRS-1y p6254-57, así como su asociación con p85, lasubunidad reguladora de fosfatidilinositol-3-ci-nasa (PI3K). La PST incluso bloqueó la activa-ción de la cinasa de S6, una enzima de la par-te final de la cascada de señalización del re-ceptor de la insulina58. Finalmente, todos estosefectos inhibitorios de PST sobre la señaliza-ción de la insulina se previnieron con inhibi-ción farmacológica de PKC (con estaurospori-na). Esto sugería que el efecto contrarreguladorde PST estaría mediado por fosforilación del re-ceptor de insulina por la PKC activada, lo quefue demostrado por immunoblot con anticuer-pos antiserina y antitreonina de immunopreci-pitado antirreceptor de la insulina53. De nuevo,este efecto de fosforilación del receptor de lainsulina pudo ser bloqueado por estaurospori-na. En definitiva, estos resultados sugieren quela PST ejerce su efecto antiinsulina interrum-

piendo la señalización temprana del receptorde insulina como consecuencia de la activa-ción de PKC. La subunidad específica de PKCque es activada por la estimulación con PST yque sería responsable del cross-talk es objetode investigación en la actualidad.

Conclusiones

En la figura 2 se resumen nuestros conoci-mientos acerca del mecanismo de acción de laPST en el hepatocito. Sabemos que existe unreceptor específico en la membrana plasmática(probablemente de 7 dominios transmembra-na), cuya estructura se dilucidará tras su puri-ficación y clonación. Hemos observado queel receptor de PST es una glucoproteína de80 KD acoplada a dos sistemas de transduc-ción: uno bien conocido, insensible a toxinapertúsica, probablemente la proteína Gα11,que acopla el receptor con la PLC de membra-na (PLC-β), y más específicamente con la PLC-

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Ca2+

PST

PTX

Insulina

GMPc

(?)

DAG IP3

CaMPK

GPK

PKC

GP

GS Glucógeno

Glucosa

RG1

G2GC PLCPIP2

Ca2+

Ca2+Retículo

endoplásmico

GK

Fig. 2. Modelo del mecanismo de acción de la pancreastatina (PST). La PST se une a su receptor en la membra-na del hepatocito y activa los sistemas de transducción de proteínas G. Una proteína G (Gα11) insensible a toxinapertúsica (PT) activa la PLC-β3 produciendo IP3 y DAG, que activan PKC y proteincinasas dependientes de cal-cio, que median el efecto metabólico. La PKC puede fosforilar el receptor de insulina e inhibir su actividad. Otraproteína G sensible a toxina pertúsica (Gα i1,2) media la producción de GMPc, que sirve para inhibir la señal dePLC autolimitándose la acción de PST.

β3. La activación de PLC produce IP3 respon-sable del incremento en [Ca2+]i, y DAG que esresponsable de la activación de proteincinasaC. Estas dos vías son probablemente responsa-bles de la acción de PST sobre el metabolismode la glucosa en el hepatocito. Además, la acti-vidad PKC interviene en el mecanismomolecular de contrarregulación de la insulina,fosforilando su receptor en restos de serina ytreonina y, por ello, inhibiendo la actividad tiro-sincinasa del receptor de insulina. Por otro la-do, existe un sistema de proteínas G sensible atoxina pertúsica (Gαi1,2), responsable del incre-mento en las concentraciones de GMPc. Sinembargo, el mecanismo por el cual el receptorde PST activa una guanilato ciclasa y cómo es-te sistema contrarregula la actividad PLC esmotivo de trabajo en la actualidad, y de sus re-sultados podremos obtener nuevas conclusio-nes respecto a estos sistemas de transducciónde membrana.

Agradecimiento

El trabajo revisado en este artículo ha sidosubvencionado por el Fondo de InvestigaciónSanitaria (FIS 96/1.411). Agradecemos el apo-yo constante del Prof. R. Goberna, Jefe del De-partamento de Bioquímica Clínica, y del Servi-cio Andaluz de Salud (SAS), del que dependeel Hospital Universitario Virgen Macarena.

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96


A. ZORZANO: ¿Cómo se regulan las concentra-ciones circulantes de pancreastatina (PST), yse correlacionan con el estado de sensibilidadinsulínica in vivo? En segundo lugar, los efec-tos de la insulina en las células adiposas noson muy evidentes, ¿depende tal vez de quehabéis estado trabajando con animales deuna determinada edad? Por último, la incuba-ción en presencia de PST disminuye la capta-ción basal de 2-deoxiglucosa; ¿habéis estu-diado la abundancia de GLUT-1 en estascondiciones?

V. SÁNCHEZ MARGALET: Empezando por el final,no lo hemos estudiado, aunque parece queefectivamente puede inhibir tanto el transportede 2-desoxiglucosa como la presencia deGLUT-4 en la membrana. Por otro lado, y co-mo tú comentas, la señal de insulina no es tanbuena como sería deseable, puesto que lasratas en cuanto pesan más de 180 g no res-ponden prácticamente a la insulina y las muypequeñas no responden a PST. Nosotros tra-bajamos con animales entre 5 y 6 semanas devida, que pesan unos 150-180 g. Respecto alas concentraciones circulantes de PST, nor-malmente se correlacionan muy bien con lasconcentraciones de catecolaminas. La mismacélula β secreta PST, pero proporcionalmentees muy superior la secreción de insulina.Cuantitativamente, las concentraciones circu-lantes dependen mucho de la regulación porel sistema simpático, de modo que la cromo-gramina A que se secreta madura por el siste-

ma nervioso simpático se puede degradar aPST, constituyendo la fuente fundamental de PST. Aunque no está demostrado, nuestrahipótesis es que las concentraciones de PSTpueden aumentar en situaciones de estrés ycuando se incrementa la actividad simpática.Creemos que el papel fisiopatológico de esteaumento podría estar de alguna manera rela-cionado con la resistencia a la insulina, puestoque hemos hallado aumentos del péptido ensíndromes de resistencia a la insulina en pa-cientes hipertensos y en diabéticas gestacio-nales. Aunque postulamos una participacióndel péptido, está claro que el síndrome de re-sistencia a insulina es aparte del efecto quepueda tener este péptido sobre la resistencia ainsulina. En este sentido, seleccionamos unaserie de hipertensos resistentes a la insulinaen quienes detectamos un aumento en lasconcentraciones de PST. Posteriormente ob-servamos que la mayoría de los hijos (con unamedia de edad de 20 años) de estos indivi-duos y que no presentaban hipertensión arte-rial, eran ya resistentes a la insulina, pero sinembargo tanto sus concentraciones de cate-colaminas como de PST eran completamentenormales. Por tanto, probablemente la PSTtenga un papel potenciandor de la acción delas catecolaminas, y éstas tengan, a su vez,un efecto inhibidor sobre la acción de la insu-lina.

A. GARCÍA DE HERREROS: El hecho de que el re-ceptor de insulina se inactive es una evidencia

DISCUSIÓN

bastante circunstancial de que la PKC cinasaesté siendo activada, ya que otras cinasastambién pueden hacerlo. ¿Disponéis de másevidencias sobre la activación de la PKC cina-sa? En segundo lugar, observáis que la insuli-na potencia la síntesis de proteínas en lugarde bloquearla. Generalmente se consideraque estos incrementos de síntesis son media-dos por la vía de la activación de S6 cinasa.¿No te resulta curioso que se observe inhibi-ción o potenciación en función de la célula?

V. SÁNCHEZ MARGALET: Por requerimiento deunos referees, en este momento estamos es-tudiando otras evidencias de activación de laPKC en esta línea, ya que únicamente dispo-níamos de datos en hepatocito aislado de ra-ta. Por los trabajos publicados, suponemosque las subunidades específicas que medianesta fosforilación de receptores de insulinaprobablemente serán α o β2. Con referencia atu pregunta del efecto sobre síntesis de pro-teínas, existen antecedentes de hormonas li-políticas que aumentan la síntesis de proteí-nas posiblemente mediado por calcio. Es elcaso de la angiotensina II y otras hormonasdependientes de calcio que son capaces deaumentar la síntesis de proteínas, aunque nopuedo asegurarte si lo hacen sobre tejido adi-poso blanco o marrón.

F. MAYOR: Creo que has comentado que esteacoplamiento era preferentemente por vía deα11, que también observasteis cierta capaci-dad de acoplamiento a proteínas tipo Gi o almenos sensible a toxina pertúsica y que esti-

mulaba actividad guanilatociclasa. ¿Sabéis sise trata de una activación por vía NO? Y, porotra parte, este bloqueo por toxina pertúsica¿es total o parcial?

V. SÁNCHEZ MARGALET: Nosotros hemos observa-do un incremento de las concentraciones deGMPc, pero no sabemos si está o no media-do por NO, aunque es un tema que nos inte-resa y tenemos planificado estudiar. En cuan-to al bloqueo por toxina pertúsica, se trata deun bloqueo total.

J.M. BAEYENS: ¿Se han identificado receptoresde PST en el sistema nervioso central, o secree al menos que puedan existir?

V. SÁNCHEZ MARGALET: No se han identificadoreceptores hasta el momento. Aunque inicia-mos algunos estudios al respecto, los resulta-dos fueron negativos. En la actualidad, sinembargo, no hemos podido seguir esta líneade investigación.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: A propósito de la formaciónde GMPc, ¿sabéis si el aumento de calcio in-tracelular es sensible a toxina pertúsica?

V. SÁNCHEZ MARGALET: Fundamentalmente no loeran, ya que la señal era más baja pero habíaun aumento del calcio.

A. GARCÍA SÁNCHEZ: Un posible mecanismo po-dría explicarse por esta vía. La NO sintetasadependiente del calcio se puede activar porentrada de calcio o por movilización, y pue-den ser sensibles a toxina pertúsica si en laentrada de calcio o en la movilización está in-volucrada una proteína G sensible a la toxinapertúsica.

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Introducción

La mayoría de cánceres son consecuenciade factores genéticos y ambientales. Los facto-res genéticos pueden explicar alrededor de un5% de casos y el resto puede atribuirse a fac-tores externos que actúan conjuntamente confactores genéticos. Entre los factores externospodemos encontrar diferentes sustancias quepueden actuar como carcinógenos: constitu-yentes de la dieta, contaminantes, tabaco, dro-gas, radiaciones y agentes infecciosos1.

El cáncer de colon y recto tiene una inci-dencia de aproximadamente un 10% del totaly se ha asociado al nivel de desarrollo econó-mico y social de la población, con una distri-bución más elevada en los países occidenta-les. Diferentes observaciones epidemiológicasy experimentales han relacionado el riesgo depadecer cáncer de colon con la dieta, la inges-tión calórica aumentada, la actividad sedenta-ria y el exceso de peso.

Los antiinflamatorios no esteroides (AINE)son uno de los grupos de fármacos más am-pliamente utilizados. En la Grecia hipocrática,la escuela médica de Cos ya utilizaba infusio-nes de corteza de sauce (Salix Alba) para eltratamiento de la fiebre y el dolor. El aislamien-to de la salicilina (Buchner, 1828), la síntesisdel salicilato sódico (Kolbe, 1859) y del acetil-salicílico (Hoffmann, 1897) lograron avancessignificativos en el uso terapéutico de estoscompuestos. La identificación de las prosta-glandinas (Von Euler, 1934) y de la enzima ci-clooxigenasa (Bergstrom, 1962) permitió elhallazgo del mecanismo de acción de la aspiri-na (Vane, 1971). Posteriormente, el descubri-miento de nuevos AINE, prostaglandinas sin-tetasas y las isoenzimas de la ciclooxigenasahan aumentado las aplicaciones terapéuticasde los AINE.

Evidencia de los AINE como agentesantineoplásicos

Durante los últimos años se han encontradopropiedades antineoplásicas de los AINE, par-ticularmente en el tracto gastrointestinal2,3.Los datos actualmente disponibles se apoyanen tres líneas de investigación: estudios epide-miológicos, estudios en animales y observacio-nes clínicas.

El primer estudio epidemiológico que relacio-naba el consumo de aspirina con la reducciónde la incidencia de cáncer colorrectal se realizóen Australia (Melbourne Colorectal CancerStudy), y demostró que el uso regular de aspiri-na disminuía un 47% la incidencia en el cán-cer colorrectal2. Posteriormente, otros estudiosepidemiológicos obtuvieron resultados pareci-dos, refiriendo que el uso de aspirina tenía unefecto protector frente al cáncer colorrectal4,5.Otros trabajos han correlacionado el uso de as-pirina y la prevención de diferentes tipos decánceres como de mama, próstata, pulmón,vejiga o riñón, no encontrando resultados signi-ficativos3,6. El estudio más completo4 analizó elconsumo de aspirina y la incidencia de cáncercolorrectal en 600.000 personas. La dosis in-gerida no era del todo precisa, pero se estimóque el riesgo relativo de cáncer de colon paralos que ingerían aspirina, 16 o más veces almes, era de 0,60 para los varones y de 0,58para las mujeres. Por contra, el uso de parace-tamol no variaba la incidencia. El seguimientode esta población demostró también una dis-minución de los cánceres de esófago, estóma-go y recto, además del de colon. La reduccióndel riesgo de cáncer era dependiente de la do-sis y aumentaba en aquellas personas con másaños de tratamiento.

Diferentes AINE como aspirina, indometaci-na, sulindaco o piroxicam han demostrado ser

Antiinflamatorios no esteroides en la prevencióndel cáncer de colon

Ramon BartronsUnitat de Bioquímica. Departament de Ciències Fisiològiques. Campus de Bellvitge.

Universitat de Barcelona. L´Hospitalet de Llobregat. Barcelona.

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inhibidores del crecimiento de tumores de co-lon inducidos por carcinogénesis química7-9, yse han utilizado también en el tratamiento deadenomas de colon y recto en humanos10-12.Aunque conocemos que estos fármacos inhi-ben la enzima ciclooxigenasa, se desconocecuál es el mecanismo molecular de este efectobeneficioso sobre el cáncer colorrectal.

Mecanismos

El desarrollo de nuevas estrategias para pre-venir y tratar el cáncer resulta muy importante.Los AINE aparecen como fármacos de posibleutilidad terapéutica para la prevención y el tra-tamiento antineoplásico, aunque sus efectosadversos requieren el desarrollo de pautas far-macológicas seguras. Para ello es necesarioconocer los mecanismos moleculares a travéslos cuales los AINE ejercen su acción. Losestudios realizados se han centrado en tresáreas distintas: a) activación de carcinógenos

a través de la enzima ciclooxigenasa; b) inhibi-ción de la proliferación celular, y c) inducciónde apoptosis.

Activación de carcinógenos

Numerosos trabajos han relacionado la inhi-bición de la enzima ciclooxigenasa (COX) conla iniciación de la carcinogénesis a través dediferentes mecanismos. Uno de ellos es acti-var carcinógenos contaminantes, tóxicos o in-geridos con los alimentos.

Los productos que se obtienen del metabo-lismo del ácido araquidónico (20 carbonos)como las prostaglandinas, tromboxanos y áci-dos 15-hidroxieicosatetranoicos (HETE), sedenominan eicosanoides, derivado del griegoεικοσι que significa 20. Estos productos par-ticipan en procesos como la inflamación, laovulación, la modulación de la respuesta in-mune o la mitogénesis. El control de la sínte-sis de estos metabolitos es muy importante

100


Fosfolipasas

AraquidónicoFosfolípidos

Ciclooxigenasa

Peroxidasa

Peroxidasa

PGG2

PGH2

Prostaglandinas

ProducciónRadicales oxígenoMDA

Activacióncarcinógenos

COX

PGS

Fig. 1. Reacciones de la ciclooxigenasa.

en la regulación de todos estos procesos, yexisten diferentes y posibles enzimas regula-doras. El primer punto de control se produceen la liberación de ácido araquidónico de losfosfolípidos de la membrana y es catalizadopor la fosfolipasa A2. Esta enzima puede in-ducirse por acción de diferentes estímulos(factores de crecimiento, citocinas, leucotrie-nos, histamina, trombina, etc.) y sintetizar se-ñales que pueden modular diferentes proce-sos celulares.

Una vez el ácido araquidónico se libera delos fosfolípidos de las membranas, puede sermetabolizado: a) por la COX, dando prosta-glandinas y tromboxanos13; b) por las lipooxi-genasas que forman HETE, con la posteriorsíntesis de leucotrienos y lipoxinas14, o c) porla citocromo P450 monooxigenasa, que gene-ra ácidos epoxieicosatrienoicos15. Cada una deestas vías da lugar a diferentes productos. Laciclooxigenasa tiene dos actividades catalíticasdiferentes. Una es la ciclooxigenasa, que ciclay oxigena el ácido araquidónico formandoPGG2, y otra la peroxidasa que reduce PGG2para formar PGH2. La actividad peroxidasa po-see una menor especificidad y puede tambiénreducir otros sustratos, como fenoles, aminasaromáticas o pesticidas (fig. 1). Se han descri-to numerosos ejemplos de carcinógenos acti-vados por la enzima COX y que pueden unirsey modificar el ADN16. Además, esta actividadpuede generar malondialdehido (mutágeno ycarcinógeno) y radicales peróxido que puedenestar implicados en la iniciación de la carcino-génesis. Ambas actividades pueden estar im-plicadas independientemente en otras reaccio-nes y ser inhibidas por diferentes sustancias.Finalmente, a partir de PGH2, diferentes sinte-tasas catalizan la formación de prostaglandi-nas.

La enzima COX existe en dos formas isoen-zimáticas: COX-1 y COX-2, que difieren entresí en la regulación de su expresión, su distri-bución tisular y su localización celular17,18. Laisoenzima COX-1 se expresa constitutivamentey algunos estudios indican que puede ser res-ponsable de la producción de prostaglandinasen el retículo endoplasmático, que posterior-mente saldrán de la célula para actuar sobrereceptores de la membrana celular. En cam-bio, la expresión de COX-2, caracterizada elaño 1989 por Simmons et al19, es inducible yregulada por estímulos específicos17,18,20,21.Los factores de crecimiento y promotores tu-morales inducen la expresión de COX-2 en fi-broblastos, lo que apoya la hipótesis de que la

isoenzima COX-2 está implicada en la mitogé-nesis22. COX-2 sería responsable de la síntesisaumentada de prostaglandinas en respuesta adiferentes citocinas, factores de crecimiento ymitógenos, teniendo un papel clave en los pro-cesos inflamatorios (fig. 2).

Las citocinas IL-4 y IL-10, y los glucocorti-coides bloquean su expresión, acción que per-mite explicar explicar parte de los efectos an-tiinflamatorios de estas sustancias. Su localiza-ción en la membrana nuclear ha sugerido unpapel importante en la proliferación inducidapor diferentes factores de crecimiento a travésde la síntesis de prostaglandinas dirigidas alnúcleo de la célula con funciones modulado-ras de la diferenciación, replicación o muertecelular18,21. Se han sugerido posibles efectosde los productos de COX-2 nucleares puestoque diferentes prostaglandinas pueden funcio-nar como ligandos para los receptores activa-dos del proliferador peroxisomal nuclear(PPAR)23,24.

Inhibición de la proliferación celular

Otro mecanismo a través del cual los AINEpueden afectar a la génesis de tumores puedeser a través del metabolismo del ácido araqui-dónico, los productos del cual se encuentranimplicados en la carcinogénesis25. Los tumoresde colon humanos26, así como los obtenidosen modelos animales27, producen cantidadesaumentadas de prostaglandina E2 (PGE2). Esteaumento de PGE2 en las células intestinalesestimula su proliferación y sería consecuenciade un incremento de la actividad ciclooxigena-sa. Esto plantea la cuestión de cuál de las iso-enzimas de la COX (COX-1, isoenzima constitu-tiva o COX-2, isoenzima inducible) es respon-sable de este aumento. Resultados de estosúltimos años nos indican que la expresión deCOX-2 está aumentada en los cánceres colo-rrectales, sin que se encuentren variacionessignificativas de COX-128. La concentración dePGE2 está aumentada en los adenomas de co-lon humanos28, en el colon de ratas expuestasa carcinógenos8,27 y en los ratones Min queposeen una mutación dominante en el gen su-presor tumoral APC (Adenomatous PolyposisColi), que también está mutado en la poliposisadenomatosa familiar humana (FAP), que pro-duce adenomas gastrointestinales a los 3 me-ses de edad29,30. Este aumento de PGE2 en lascélulas intestinales sería consecuencia de unincremento en la actividad ciclooxigenasa.También en las células epiteliales neoplásicas

101

ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDES EN LA PREVENCIÓN DEL CÁNCER DE COLON

del intestino de los ratones Min se han detecta-do concentraciones aumentadas de proteína yARNm de COX-2. En cambio, no se encuen-tran variaciones significativas de COX-1 en to-dos estos modelos. Además, se han publicadoresultados en los que se refiere que la incuba-ción de células derivadas de cáncer de coloncon inhibidores selectivos de COX-2 inhibe sucrecimiento27,31. Estos resultados sugieren quealgún factor favorece la sobreexpresión deCOX-2 en estas células, siendo su papel esen-cial en la producción aumentada de PGE2.

Uno de los mecanismos propuestos para ex-plicar el efecto antitumoral de aspirina y otrosAINE es la modulación de la proliferación celu-lar. Para estudiar este efecto hemos utilizadoel cultivo de fibroblastos Swiss 3T3 de ratón,ya que es un modelo muy útil para identificarlos factores extracelulares que regulan el cre-cimiento y conocer las señales y fenómenosmoleculares que conducen a la mitogénesis.Estas células pueden mantenerse quiescentesen la fase G0-G1 del ciclo celular en un mediolibre de factores de crecimiento exógenos. Laadición de suero fresco o de determinadosfactores mitogénicos induce la síntesis de ADNy su división. Éste es uno de los sistemas celu-lares en que mejor se han estudiado los meca-nismos a través de los cuales los factores de

crecimiento, generando señales intracelulares,inducen la división celular.

La adición de aspirina o indometacina a loscultivos de fibroblastos Swiss 3T3 inhibe signifi-cativamente la síntesis de ADN inducida porlos factores de crecimiento bombesina y PDGF(platelet-derived growth factor)32. La aspirina, adosis inferiores a 1 mM, sólo inhibe la acciónmitogénica de factores de crecimiento que li-beran ácido araquidónico, el sustrato de COX,y el efecto antiproliferativo de aspirina se puederevertir con PGE2 exógena, el derivado mayori-tario de la vía de COX en estas células. Estosresultados indican que la acción antiproliferati-va de la aspirina, a dosis bajas, es a través lainhibición de COX. La explicación más simplepara comprender estos resultados es que PGE2y/o otros eicosanoides derivados de la PGH2participan en las vías de transducción de seña-les estimuladas por PDGF y bombesina, poten-ciando alguna de las vías conocidas o bien ac-tivando nuevas vías no identificadas implicadasen la síntesis del ADN. También es posible quelas señales inducidas por PGE2 actúen mante-niendo más tiempo las señales inducidas porPDGF y bombesina (fig. 3).

Concentraciones de aspirina más altas(5 mM) inhiben totalmente la acción mitogéni-ca de concentraciones de PDGF saturantes.

102


AraquidónicoFosfolípidos

Prostaglandinas

PLA2 (+)Endotoxinascitocinasmitógenos

Glucocorticoides

InflamaciónProliferación...

AINEPlaquetasEstómagoRiñónIntestino...

COX-1constitutiva

COX-2inducible

(+)

Fig. 2. Isoenzimas de la ciclooxigenasa.

Existen tres argumentos que indican que esteefecto a dosis altas de aspirina no es mediadopor inhibición de COX: a) 5 mM de aspirina in-hiben también el efecto mitogénico de EGF yinsulina, los cuales no inducen liberación deácido araquidónico; b) el efecto inhibidor deaspirina (5 mM) en la mitogénesis estimuladapor PDGF no es contrarrestado por PGE2 exó-gena, y c) la curva dosis-respuesta de aspirinapara inhibir la síntesis de ADN es bifásica, loque sugiere dos mecanismos diferentes. El me-canismo de inhibición de la proliferación celu-lar independiente de COX, a concentracionesde aspirina superiores a 2 mM, se desconoce.

Apoptosis

Las células epiteliales intestinales están pro-gramadas para dividirse y diferenciarse en elproceso que las conduce desde las criptas a lasuperficie del intestino. El número de célulasdepende de la capacidad de proliferación, di-ferenciación y de la velocidad de muerte indu-cida por la apoptosis. Cualquier alteración eneste proceso puede dar lugar a su acumula-ción y a la formación de pólipos y tumores. El

mecanismo de muerte celular programada esel característico de las células epiteliales intes-tinales y es progresivamente inhibido duranteel desarrollo del cáncer colorrectal. La induc-ción de apoptosis podría ser uno de los meca-nismos de acción de los AINE. Se ha demos-trado que sulindaco, sulindaco sulfuro, aspiri-na, indometacina, naproxeno, piroxicam ysalicilatos inducen apoptosis en células deriva-das de cáncer de colon.

Elder et al33 demostraron que los salicilatosproducían una parada del ciclo celular en la fa-se G0-G1 y también inducían apoptosis en dife-rentes líneas celulares. En los ultimos años seha comprobado que la sobreexpresión de COX-2en las células intestinales puede inducir carac-terísticas que aumenten el potencial tumorigé-nico34,35, incluyendo disminución del procesode apoptosis y de expresión de ciertos recepto-res de factores de crecimiento y moléculas deadhesión. La apoptosis es un mecanismo bási-co para mantener un rápido recambio del epi-telio intestinal y una disminución de la activi-dad apoptótica puede resultar en una supervi-vencia aumentada de las células anormales.Éste es uno de los mecanismos que explicarían

103


PDGF

Otras señalesPL

COX-2

– Síntesis ADN– Proliferación– Apoptosis

AA

AINE

PGH2

PGE2

Señales

COX-1

Fig. 3. Mecanismo de inhibición de la proliferación celular.

la acumulación de células del epitelio y la for-mación de pólipos y tumores. Shiff et al36 handemostrado que diferentes AINE reducen laproliferación, aumentan el número de célulasen fase G0-G1 e incrementan también el proce-so de apoptosis. En este sentido, se han publi-cado resultados en los que se ha comunicadoque sulindaco sulfuro, sulindaco sulfona y as-pirina inducen apoptosis en células de carcino-ma de colon humano HT-2936,37. El mecanis-mo responsable de este efecto apoptósico delos AINE no está claro, aunque se ha descritoque la sobreexpresión de COX-2 en células epi-teliales intestinales de rata inhibe la apoptosis yque ésta se puede restablecer administrandoinhibidores de COX-234.

El ratón Min es un modelo animal de tumo-rogénesis intestinal que se parece a la formade FAP. Los individuos con FAP tienen unamutación en un alelo del gen APC que les pro-duce adenomas intestinales múltiples despuésde una mutación somática o de la pérdida delsegundo alelo. Se ha observado que las célulasintestinales alteradas de los ratones Min, con elgen APC mutado, tienen una apoptosis dismi-nuida, pero si se les administran AINE (sulin-daco) recuperan la capacidad de inducir muer-te celular programada, al mismo tiempo quedisminuye el contenido de COX-2 y PGE2 deestas células, lo que sugiere que el efecto so-bre la apoptosis podría deberse a la inhibiciónde COX-2 y a la disminución de la formaciónde PGE2

30. Por otro lado, Reddy et al27 handemostrado que los inhibidores específicos deCOX-2 inhiben la formación de pólipos en mo-delos animales de carcinogénesis, sugiriendoque el isoenzima COX-2 desempeña un papelimportante en este proceso. Además, se ha de-mostrado también que la anulación del gen deCOX-2 o bien el tratamiento con inhibidores se-lectivos de COX-2 suprimen la formación de tu-mores en otro modelo de poliposis inducidapor la supresión del gen APC, lo que pone enevidencia la relación entre expresión de COX-2y la formación de pólipos38. En este modelo,los adenomas han perdido ambas copias delgen APC y sobreexpresan COX-2. La cuestiónbásica es si estos dos procesos están relacio-nados. Se ha comprobado que en el tejido nor-mal, próximo al adenoma, no se produce unaumento de COX-2, lo que sugiere que la in-ducción de esta isoenzima se produce despuésde la pérdida del segundo alelo del gen APC. Afavor de esta hipótesis tenemos que la proteínaCOX-2 no se detecta en pólipos más pequeñosde 2 mm, lo que indicaría que el tumor se ha

iniciado antes de expresarse COX-238. No obs-tante, otros investigadores han demostrado enratones Min que el epitelio próximo al tumortiene la isoenzima COX-2 aumentado. El meca-nismo a través del cual COX-2 facilitaría el cre-cimiento se desconoce, aunque se ha visto quedisminuye la respuesta apoptósica. Los datosobtenidos de COX-2 en el cáncer de colonplantean la cuestión de si la presencia de estaisoenzima es indispensable. La respuesta pare-ce ser negativa. En el trabajo de Oshima et al38

se demuestra que en los ratones deficientes enCOX-2 el número de pólipos se reduce el 86%,pero no llega al 100%. Esto significa que hayotras vías que favorecen la formación de tumo-res, independientemente de COX-2. En estesentido, se ha descrito que la anulación delgen COX-1 en ratones Min también disminuyeel número de adenomas espontáneos.

Recientemente nuestro grupo ha demostra-do que concentraciones de aspirina superioresa 1,5 mM inducen apoptosis en células deleucemia linfática crónica humana a través deun mecanismo independiente de COX y queconlleva la activación de caspasas39.

Conclusiones

Quedan aún muchas preguntas por resolversobre los posibles mecanismos de los AINE enel control de la proliferación celular y apopto-sis, y también en la iniciación, promoción yprogresión de la transformación neoplásica. Enlos próximos años habrá que clarificar el papelde los AINE en la inhibición de las isoenzimasde la COX y las moléculas relacionadas consus efectos, estudiando si el efecto se producepor disminución de los productos de las reac-ciones catalizadas por estas isoenzimas (pros-taglandinas PGE2 o PGJ2, entre otras), por elaumento de la concentración de sustrato (ara-quidónico y ceramida) o bien por la disminu-ción de la activación de carcinógenos y pro-ducción de radicales.

Un gran número de trabajos apoyan la hipó-tesis que la modulación de la isoenzima COX-1puede tener una gran importancia en la preven-ción del cáncer colorrectal. Desconocemos através de qué mecanismos se produce esteefecto, aunque sabemos que facilita la prolifera-ción e inhibe la apoptosis en diferentes tiposcelulares (fig. 4). En relación a la isoenzimaCOX-2, los datos más recientes refieren que suexpresión es un hecho temprano e importanteen el cáncer de colon, lo que sugiere que losfármacos que inhiben COX-2 deberían ser efec-

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tivos en la quimioprevención de este tipo decáncer. En el futuro deberemos poder explicarcómo se regula la expresión de COX-2, qué me-canismos la activan en el proceso de carcinogé-nesis, cuáles son los productos relacionadoscon sus efectos y a través de qué mecanismosy, sin duda, conocer la eficacia de inhibidoresselectivos y las dosis necesarias para obtenerefectos benéficos. También debe destacarse laposible utilización terapéutica de algunos AINEen el tratamiento de diferentes enfermedadesrelacionadas con la inhibición de la apoptosis.

De acuerdo con la bibliografía actual, algunasacciones de los AINE son independientes de lavía COX y el conocimiento de los mecanismos através de los cuales actúan deberá favorecer eldiseño de nuevas dianas farmacológicas y nue-vos enfoques diagnósticos y terapéuticos.

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105


PLA2

Fosfolípidos

Esfingomielina

Apoptosis

Ceramida

SulindacoAA

Prostaglandinas

Proliferación

Apoptosis

Apoptosis

AINE

COX-2

COX-1

AINEselectivos

Otrasdianas

Fig. 4. Mecanismos moleculares de acción de los AINE.

M. PALACÍN: ¿Es posible alcanzar concentracio-nes de 5 mM de ácido acetilsalicílico en tra-tamiento crónico con este fármaco?

R. BARTRONS: Nosotros calculamos que lasconcentraciones máximas alcanzadas son de1,5-2 mM, tras el empleo en tratamiento del

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DISCUSIÓN

ácido acetilsalicílico. Se ha observado quecélulas leucémicas humanas entran enapoptosis con concentraciones de 2,5 mMde ácido acetilsalicílico. Es principalmenterelevante haber podido demostrar en célulashumanas, en este caso por primera vez, quelos AINE puedan ser, si no directamente, almenos utilizados como coadyuvantes en eltratamiento de la leucemia linfática.

A. GARCÍA DE HERREROS: Con relación a estosdatos de muerte celular inducida por inhibi-dores en células HT-29, ¿habéis estudiado lacausa de las muertes, por ejemplo, bloquean-do la apoptosis? ¿Observáis inhibición de cre-cimiento a dosis bajas?

R. BARTRONS: Actualmente estamos trabajandoen este tema. Puede inducirse apoptosis, de-mostrada por fragmentación de ADN y apari-ción de un pico diploide en citometría, incu-bando las células con concentraciones deácido acetilsalicílico superiores a 2,5 mM.Otros autores han demostrado que a concen-traciones bajas no se observa inducción deapoptosis. La respuesta a la segunda pre-gunta es que puede observarse inhibición decrecimiento de las células incubadas en pre-sencia de concentraciones bajas de AINE.

S. ERILL: Este efecto de la aspirina que no seobserva con otros AINE, ¿se produce tam-bién con salicilato sódico añadido directa-mente?

R. BARTRONS: Sí que se produce. En una de lasgráficas que he presentado se incluían losresultados con salicilato sódico.

A. CELADA: ¿La apoptosis se produce tambiénen células normales? Y, ¿a través de qué víaocurre?

R. BARTRONS: No he presentado los datos deestudios realizados con monocitos, en losque observamos que se produce apoptosis ypor un mecanismo, por ahora desconocido,mucho menos sensible tanto a salicilato co-mo a aspirina.

J.M. BAEYENS: Aunque ya ha sido previamentecomentado, me preguntaba si podían existir

diferencias entre aspirina y otros AINE quepudieran ser consecuencia de la capacidadacetiladora de COX-2 y, por tanto, de la inhi-bición irreversible.

R. BARTRONS: En mi opinión deben coexistirmecanismos de acción muy distintos. En losestudios epidemiológicos de prevención car-diovascular con el empleo de bajas dosis deaspirina, la concentración de fármaco quellega al intestino es mínima y no puede, portanto, explicar los efectos que se observanmediante estudios in vitro. En este caso, abajas concentraciones, sugerimos que seproduce inhibición de COX (1 o 2), mientrasque en otras situaciones, a concentracionessuperiores a 2 mM, se verían afectadas otrasvías de señalización que conducirían a laapoptosis.

O. BULBENA: El intestino es de los pocos órga-nos en donde se ha descrito que el NFκ-Bestá incluso expresado en condiciones basa-les y que existe iNOS constitutiva. Tal vez unposible mecanismo de acción de la aspirinapudiera estar relacionado con su efecto inhi-bitorio sobre el NFκ-B.

R. BARTRONS: Desconocemos si 80-125 mg deaspirina pueden modificar el NFκ-B intesti-nal. En los trabajos que se han publicado so-bre el efecto de los salicilatos sobre NFκ-Bse empleaban concentraciones muy altas,del orden de 10-20 mM. Para alcanzar estasconcentraciones en el intestino, deberían ad-ministrarse más de 12 g de aspirina, lo queningún farmacólogo se atrevería a probar.

P. KALIMAN: Recientemente se ha publicado untrabajo que relaciona p38 MAP-cinasa con alapoptosis inducida por salicilatos. ¿Han estu-diado si con el inhibidor se modifica la apop-tosis?

R. BARTRONS: Nuestro grupo ha estudiado p38en dos modelos distintos y no se modifica laapoptosis, ni la MAP-cinasa tampoco. Esprobable que Iκ-B esté modificada, aunquees difícil de estudiar a través de nuestros mo-delos experimentales.

107


Introducción

Las células están constantemente adaptán-dose y respondiendo a los cambios que sufresu entorno, así como, en organismos pluricelu-lares, a mensajes procedentes de otras células.La transducción de señales es el proceso por elcual el estímulo, una vez ha sido percibido porla célula, es convertido en una señal intracelu-lar y enviada a todos aquellos efectores cuyaactividad es necesaria para que se produzca larespuesta celular apropiada. El avance en elconocimiento de las rutas de transducción deseñales implicadas en procesos de prolifera-ción y/o activación celular en los últimos añoshace prever un aumento en el número de fren-tes sobre los cuales se puedan ejercer accio-nes dirigidas a controlar en este tipo de proce-sos. Fenómenos de proliferación celular anó-mala e inflamación acompañan, en ocasionessimultáneamente, a enfermedades muy diver-sas, algunas de ellas con una alta repercusiónsocial como neoplasias, artritis reumatoide y di-versas enfermedades autoinmunes, neurode-generativas, etc. Por esta razón, establecer es-tos potenciales frentes de acción, así como dis-poner de moléculas capaces de interferirlosespecífica y controladamente, tiene un claro in-terés farmacológico.

La Jun N-Terminal Kinase (JNK), tambiénconocida como Stress-Activated Protein Kinase(SAPK), pertenece a la familia de Mitogen-Acti-vated Protein Kinases (MAPK) y constituye eleslabón final de una ruta de transducción deseñales inicialmente implicada en la respuestaa citocinas y condiciones de estrés celular y, enconsecuencia, potencial candidata a participaren la respuesta inflamatoria. La vía de la JNK

también ha sido involucrada en la regulaciónde otros procesos como la proliferación, lamuerte celular programada (apoptosis) yla morfogénesis. Este repertorio funcional de lavía de transducción de señales de la JNK, con-juntamente con otros datos que se van a discu-tir en este artículo, la hacen especialmente in-dicada para la búsqueda de agentes de poten-cial interés terapéutico.

La vía de transducción de señales de la JNK

Bajo la denominación de JNK se engloba ungrupo de proteínas quinasas codificadas portres genes: jnk1, jnk2 y jnk3, a partir de loscuales, mediante procesamiento alternativo delos correspondientes transcritos, se generan untotal de 10 isoformas, 4 de JNK1, 4 de JNK2 y2 de JNK3, respectivamente1,2. Por una parte,este procesamiento alternativo produce las iso-formas correspondientes a Mr 46.000 y55.000, que hasta el momento no han presen-tado diferencias funcionales entre sí. Por otraparte, un segundo procesamiento alternativoproduce dos tipos de isoformas, denominadasα y β, de los transcritos de los genes jnk1 yjnk2, las cuales in vitro difieren en la especifici-dad de sustrato2.

Como rasgos comunes con el resto deMAPK, la JNK se activa por fosforilación dualen los residuos de tirosina y treonina de la se-cuencia Thr-Pro-Tyr localizada en el subdomi-nio VIII, y constituye el último paso de una cas-cada de transducción de señales en la que loseslabones inmediatamente anteriores estánconstituidos por otras proteincinasas denomina-das, de forma genérica, cinasa de la MAPK(MAPKK) y cinasa de la MAPKK (MAPKKK),respectivamente1,3. Una vez activada, la JNK setransloca al núcleo, donde se hallan algunos desus sustratos (como se verá posteriormente).

Hasta el momento, se han caracterizado dosMAPKK responsables de la activación de la JNKpor fosforilación dual, la SEK1/MKK4/JNKK1 y

Potencial farmacológico de inhibidores de la Jun N-Terminal Kinase (JNK)

Alberto Muñoza y Carme Caellesa,b

aInstituto de Investigaciones Biomédicas. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Madrid. bUnitat de Bioquímica. Facultat de Farmacia. Universidad de Barcelona.

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Investigación financiada por la Comisión Interministerialde Ciencia y Tecnología, Plan Nacional de Salud(SAF95-0738 y SAF98-0060). Los resultados que apa-recen en este artículo han sido en parte publicados enla revista Genes & Development 1997; 11: 3.351-3.364.

la MKK7/JNKK23,4. De ellas cabe resaltar que,mientras MKK7 es específica de JNK, MKK4también puede activar a otro miembro de la fa-milia de MAPK, la proteincinasa p384. Además,en células deficientes en MKK4, la activaciónde JNK permanece refractaria únicamente fren-te a determinados estímulos, lo que indica queexiste una especificidad de respuesta entreMKK4 y MKK7, y corrobora que JNK puede seractivada por ambas enzimas4,5. Se han descritovarias MAPKKK responsables de la activaciónde MKK4 y MKK7 o, incluso, capaces de activarla ruta de JNK de forma independiente aéstas6. Finalmente, el repertorio de moléculasimplicadas en transducir la señal desde el estí-mulo extracelular a la cascada de fosforilaciónde la JNK es realmente amplio. En la actualidadse está dedicando un considerable esfuerzo adefinir las moléculas que intervienen en la rutade la JNK en condiciones fisiológicas4.

Se han descrito distintos mecanismos de in-hibición de la actividad JNK. En primer lugar, yal igual que sucede con las otras MAPK, laJNK activada por fosforilación dual en Tyr y Thrpuede inactivarse por acción de fosfatasas deespecificidad dual, recogidas bajo la denomi-nación de Ser/Thr/Tyr MAP Kinase Phosphata-ses (MKP), cuya preferencia hacia las distintasMAPK depende de cada isoforma enparticular7. La actividad JNK puede inhibirse, adiferencia de otras MAPK, por su interaccióndirecta con otras proteínas como la JNK Inter-acting Protein (JIP)-1, que evita su transloca-ción nuclear8, o el producto del gen waf1/cip1,la proteína p21, más conocida por su accióninhibidora de los complejos ciclina/cyclin-de-pendent kinase (CDK) del ciclo celular9.

Regulación de la transcripción por la vía de la JNK

Está ampliamente aceptado que la vía dela JNK regula la expresión génica mediante lamodulación de la actividad de distintos factoresde transcripción que figuran entre los sustratosde la JNK10. Así, la JNK es capaz de regular laactividad de algunos miembros de las familiasde activadores transcripcionales Jun, ATF y Ets(c-Jun, ATF2 y Elk-1, respectivamente) me-diante la fosforilación de sus respectivos domi-nios de transactivación10. Esta fosforilación esun requisito para la interacción de estos activa-dores transcripcionales con otras moléculascoactivadoras, como la CREB-binding protein(CBP) o la p300, necesarias para activar latranscripción génica11. Estos coactivadores son

capaces de modificar la estructura de la cro-matina in situ mediante la acetilación de lashistonas, y/o de reclutar moléculas con dichaactividad histona-acetil-transferasa comoP/CAF12. Alternativamente, la fosforilación porJNK puede modular la actividad de los factoresde transcripción a través de otros mecanismoscomo la regulación de la estabilidad de la pro-teína13 o del transporte al núcleo14. Finalmen-te, la ruta de la JNK puede regular la expresióngénica también postranscripcionalmente, comoes el el caso de la traducción del ARN del fac-tor necrosante de tumores de tipo alfa o Tu-mor-Necrosis Factor (TNF)-α15.

Regulación de la actividad del complejo AP-1por la ruta de la JNK

Sin duda, c-Jun es el activador transcripcio-nal cuya regulación mediante fosforilación porJNK ha sido mejor estudiada. c-Jun es el prin-cipal componente del factor de transcripciónAP-1, un complejo dimérico formado por homoo heterodímeros entre las proteínas codificadaspor los distintos miembros del la familia delprotooncogén c-jun (c-Jun, JunB y JunD) o porheterodímeros entre éstas y los productos delos miembros de la familia del protooncogén c-fos (c-Fos, FosB, Fra1 y Fra2)16. AP-1 es fre-cuentemente activado por estímulos que indu-cen la proliferación y/o activación celular comomitógenos, oncoproteínas, citocinas y condicio-nes de estrés16.

La actividad del complejo AP-1 puede indu-cirse mediante mecanismos tanto independien-tes como dependientes de la expresión génica.En ambos casos la actividad JNK desempeñaun papel clave17. La inducción de la actividadAP-1 de manera independiente de transcrip-ción transcurre a través de la modificación pos-transduccional de los componentes del comple-jo. En este sentido, uno de los mecanismos másrelevantes es la fosforilación del dominio amino-terminal (N-terminal) de c-Jun, concretamenteen los residuos de serina 63 y 7317,18. La pro-teincinasa responsable de esta fosforilación esla JNK. De hecho, esta fosforilación se produceen respuesta a algunos de los estímulos que in-ducen AP-1, como la irradiación con luz ultra-violeta (UV) o TNF-α, los cuales, a su vez, soninductores de la ruta de JNK17,18.

El mecanismo de activación de AP-1 depen-diente de transcripción generalmente implicaun incremento neto de los componentes delcomplejo17. La participación de la ruta de JNKtambién en este mecanismo queda patente por

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el hecho de que la activación transcripcionalde los genes c-jun y c-fos depende, en granmedida, de la actividad de los factores detranscripción ATF2 y Elk-1, respectivamente17.Como ya se ha comentado en anteriormente,tanto ATF2 como Elk-1 son sustratos de laJNK10.

Actualmente existen evidencias directas deque la ruta de la JNK regula in vivo la actividadtranscripcional del complejo AP-1. En célulasdeficientes en MKK4, tanto JNK como AP-1permanecen refractarios a la estimulación poragentes de estrés celular19. Por otra parte, ra-tones en los que se ha inactivado el gen jnk3carecen de actividad JNK en las neuronas delhipocampo y, a su vez, en estas células no seproduce el incremento en la actividad AP-1que sigue a su estimulación con agentes exci-totóxicos20.

La vía de JNK en procesos fisiológicos y patológicos

En la medida en que la vía de la JNK vasiendo caracterizada y estudiada se amplía elabanico de procesos, tanto fisiológicos comopatológicos, en los que es implicada. Por razo-nes de espacio, comentaremos a continuaciónsólo algunos de ellos4.

La activación del complejo AP-1 es un acon-tecimiento que frecuentemente se ha vincula-do a la transformación oncogénica16. En estecontexto, la implicación de la JNK en dicha ac-tivación sugirió, desde un principio, que estaruta podría estar asociada a transformación ce-lular21. Aunque la actividad JNK es inducidapor algunos oncogenes, actualmente este as-pecto es tema de debate, en parte debido a sureciente implicación también en la inducciónde apoptosis en determinados modelos celula-res4,20.

Desde un principio, la activación de la rutade la JNK por citocinas proinflamatorias comoTNF-α y condiciones de estrés celular sugiriósu participación durante la respuesta inflama-toria22. De hecho, la actividad JNK se induceen la activación por coestimulación de célulasT23 y contribuye a la producción y secreción deIL-223,24 y a la proliferación de timocitos24. Porotra parte, también participa en la secreción dela citocina proinflamatoria TNF-α, como ya seha comentado15, y en la activación del gen dela E-selectina en respuesta a TNF-α en célulasendoteliales25.

La ruta de la JNK ha sido, así mismo, impli-cada en la regulación de procesos de supervi-

vencia y muerte celular. La supervivencia du-rante el desarrollo y la activación de células Tnecesita de la transducción de señales a travésde MKK45. En contraposición, tanto la activi-dad JNK como la de AP-1 participan en laapoptosis de la neuronas del hipocampo enrespuesta a agentes que causan excitotoxici-dad20.

Antagonismo entre los receptoreshormonales nucleares y el factortranscripcional AP-1

Los esteroides, retinoides y otras hormonasde naturaleza lipofílica ejercen la mayoría, si notodas, sus acciones a través de su interaccióncon sus receptores celulares, que constituyenla denominada superfamilia de los receptoreshormonales nucleares (HR). Los HR actúancomo factores de transcripción cuya actividadestá modulada por la interacción con su ligan-do, y pueden regular la transcripción de formapositiva o negativa26. La activación de la expre-sión génica implica la unión de los receptores asecuencias específicas de nucleótidos, deno-minados elementos de respuesta hormonal,presentes en las regiones reguladoras (promo-tores) o en el interior (intrones o exones) de losgenes diana. Curiosamente, el mecanismo derepresión transcripcional en general no requie-re la interacción del HR con secuencias deADN específicas, sino que parece tener lugar através de la interferencia con la actividad deotros factores de transcripción, por lo que reci-be el nombre de transrepresión. Entre estosfactores antagonizados por los HR se encuen-tra AP-127.

El estudio del mecanismo por el que tienelugar el fenómeno de transrepresión entre HRy AP-1 tiene un especial interés, ya que para elcaso de glucocorticoides y retinoides esta pro-piedad se ha correlacionado con algunas delas acciones farmacológicas de estas hormo-nas, como son las antineoplásicas, inmunosu-presoras y/o antiinflamatorias27,28. Por ejemplo,en relación a la actividad antiproliferativa, de-terminados tipos de retinoides capaces de acti-var selectivamente la función de transrepresióndel receptor del ácido retinoico inhiben la proli-feración de aquellas líneas celulares con activi-dad AP-1 endógena (p. ej., las células HeLa),pero no así la de aquellas que carecen de estaactividad (como las células F9)29. Por otra par-te, el efecto positivo de los glucocorticoides enel tratamiento de determinadas leucemias, lin-fomas y algunas enfermedades de naturaleza

111

POTENCIAL FARMACOLÓGICO DE INHIBIDORES DE LA JUN N-TERMINAL KINASE (JNK)

autoinmune puede correlacionarse con la pro-piedad de estas hormonas de inducir apoptosisde células T, propiedad que requiere única-mente de la función de transrepresión del re-ceptor hormonal activado, y que es indepen-diente de la de transactivación30. Finalmente, yen relación con su actividad antiinflamatoria yantienvejecimiento de la piel, los retinoides soncapaces de inhibir la inducción de AP-1 quesigue a la exposición prolongada al componen-te de ultravioleta de la luz solar, bloqueandocon ello la indución de metaloproteinasas quedegradan la matriz extracelular como colagena-sas, estromalisina 1 y gelatinasas31.

El fenómeno de la transrepresión de los HRy AP-1 fue descrito a principios de esta décaday, desde entonces, distintos mecanismos hansido propuestos para explicarlo a nivel molecu-lar27,28. Recientemente se ha observado quelos HR, al igual que el factor AP-1, requierendel coactivador transcripcional CBP para acti-var la transcripción génica. Este hecho ha lle-vado a proponer la competencia entre los HR yAP-1 por cantidades limitantes de CBP comomecanismo para explicar la transrepresión32.Es importante hacer notar que la interaccióncon CBP, tanto por parte de AP-1 como de losHR, requiere de un paso previo de activación,que es la fosforilación del dominio N-teminalde c-Jun y la unión del correspondiente ligan-do, respectivamente11,32. Recientemente, re-sultados de nuestro laboratorio han demostra-do que la activación de distintos HR como losde glucocorticoides, retinoides, hormona tiroi-dea y vitamina D inhiben la inducción de la ru-ta de la JNK en respuesta a distintosestímulos33. De acuerdo con el papel de laJNK en la activación de AP-1, la interferenciacon esta ruta se correlaciona con la propiedadde estos HR de bloquear la fosforilación del do-minio N-terminal de c-Jun y, en consecuencia,de inhibir la activación transcripcional depen-diente de AP-1. Además, la inhibición por par-te de los HR de la ruta de la JNK afecta tam-bién a la activación de otros factores de trans-cripción activados por JNK, como ATF2 yElk-1. Es decir, mediante la inhibición de la ru-ta de la JNK, los HR inhiben la activación deAP-1 mediada tanto por mecanismos indepen-dientes de transcripción (fosforilación del domi-nio N-terminal de c-Jun) como dependientesde transcripción (expresión de los genes c-juny c-fos mediada por ATF2 y Elk-1). En resu-men, la interferencia con la ruta de la JNK re-presenta un nuevo mecanismo a través delcual HR antagonizan a AP-1 y, en definitiva, un

mecanismo alternativo por el que hormonascomo los glucocorticoides y retinoides puedenejercer sus acciones farmacológicas33. De he-cho, la inhibición de la JNK y /o ERK (otromiembro de la familia de MAPK frecuentemen-te implicado en proliferación celular) por partede distintas hormonas lipofílicas como el gluco-corticoide sintético dexametasona, ácido reti-noico, estradiol y progestrona ha sido implica-da en el mecanismo por el que estas hormo-nas son capaces de inhibir respectivamente laproducción de TNF-α15, la expresión del genc-fos34 o de la endotelina 1 en respuesta a laangiotensina II35.

La ruta de la JNK participa en la transduc-ción de señales implicadas tanto en procesosfisiológicos normales como en aquellos que seproducen en respuesta a condiciones de es-trés, como es la respuesta inflamatoria, por loque es previsible que moléculas capaces de in-terferir con esta ruta sean candidatas a contro-lar estos procesos. Esta hipótesis está apoyadapor el hecho de que moléculas que normal-mente están implicadas en el mantenimientode la homeostasis celular como las hormonasesteroides, tiroideas y las vitaminas A y D y susmetabolitos actuando a través de sus recepto-res intracelulares son capaces de inhibir la ac-tivación de la ruta de la JNK, y esta propiedadse correlaciona con su habilidad de antagoni-zar la actividad del complejo AP-1. Al menosen el caso de glucocorticoides y retinoides, estacapacidad de transrepresión está íntimamenteligada a sus acciones antiproliferativas, inmu-nosupresoras y/o antiinflamatorias. Es, por tan-to, razonable pensar que inhibidores de la víade señalización de la JNK puedan tener utili-dad farmacológica. Un posible mecanismo deacción de dichos inhibidores es la activaciónde los HR, pero aún más conveniente seríanaquellos inhibidores que actúen independien-temente de aquéllos, ya que esto evitaría losefectos secundarios de los tratamientos conglucocorticoides y retinoides, que son en granmedida consecuencia de la activación génicapor estas hormonas.

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R. BORGES: Mi primera pregunta está relaciona-da con el esquema que presentaste donde lahormona tiroidea y el ácido transretinoico seincorporaban en distintas dianas, pero mepareció entender que actuaban exactamenteen el mismo sitio, cuando los efectos de estassustancias son muy distintos. En segundo lu-gar, y dado que existe una diferencia en lapotencia de los glucocorticoides que se utili-zan en clínica, tal vez una forma correcta deiniciar el cribado podría ser probando otrosglucocorticoides, no solamente dexametaso-na, a fin de comprobar si esta acción dualque has descrito se centra más en un ladoque en otro, y podría explicar la distinta po-tencia de un glucocorticoide frente a otro.

A. MUÑOZ: Respondiendo a tu primera pregun-ta, en realidad no es como tú lo has descrito.El receptor de la hormona tiroidea o el de al-guna vitamina D, forma un heterodímero conel receptor que se denomina RXR, que lo esdel ácido 9-cis-retinoico. El receptor del all-trans-retinoico, que es el RAR también formaun heterodímero con la proteína RXR, de ma-nera que el receptor de la hormona tiroidea yel receptor de all-transretinoico no se pegan alos mismos sitios ni regulan los mismos genesobviamente, pero comparten la proteína conla que dimerizan, de manera que si se sobre-expresa uno, se inhibe por competencia conRXR la función de la otra hormona. Evidente-mente, la vitamina A y la hormona tiroidea nohacen lo mismo. Respecto a tu segunda pre-gunta, próximamente pondremos a punto unsistema que pretendemos sea fácil, económi-co y cuantitativamente posible, para analizarsustancias que se fijen e inhiban JNK. De he-cho, no estamos buscando más glucocorticoi-des con menos efectos secundarios ni molé-culas que se unan a los receptores para evitaren lo posible los efectos secundarios, si noque buscamos inhibidores específicos deJNK, para posteriormente y con ayuda de al-guna compañía farmacéutica, poder seleccio-nar los que no sean tóxicos.

F. VENTURA: ¿Los efectos de represión los ha-béis observado sólo con AP-1 o también con

otros sistemas que utilizan CBP, como porejemplo, con factores miogénicos?

A. MUÑOZ: Se sabe y está publicado, que existetambién con NFκ-B, aunque nosotros sólo lohemos hecho con AP-1.

G. PONS: ¿Habéis estudiado si este efecto de in-hibición de la JNK se produce sin necesidadde que el receptor penetre en el núcleo? Siasí fuera, quedaría claro que no hay ningúnefecto sobre transcripción.

A. MUÑOZ: En el caso de los glucocorticoidesno hemos hecho experimentos de transloca-ción al núcleo. Anteriormente publicamos losresultados de la cinética de inhibición dondeapreciamos que prácticamente en 10 min laJNK está ya inhibida al 50%. Aunque no lohayamos analizado directamente, esto permi-te predecir una buena correlación entre la ci-nética de paso al núcleo y la cinética de inhi-bición. Desde luego, necesariamente tieneque estar presente la hormona, con lo cualcreemos que evidentemente es el complejodentro del núcleo lo que inhibe. Sobre el últi-mo comentario, podemos afirmar que no senecesita transcripción. Lo hemos estudiadocon un mutante de GR, el LS-7, que es de-fectivo en actividad transcripcional, y lo he-mos hecho también con inhibidores, de ma-nera que es un efecto independiente de laactivación génica, requiere el receptor muyposiblemente dentro del núcleo, ligado a suhormona respectiva, y es dependiente de laconcentración de receptor.

M. PALACÍN: En relación con el efecto de trans-represión, ¿habéis visto si existe una interac-ción física directa entre el receptor ocupado yJNK, o alguna de las cinasas que le prece-den?

A. MUÑOZ: Es exactamente lo que estamos es-tudiando actualmente, además de si existeinteracción directa. A continuación pretende-mos esclarecer si es posible que lo que esténhaciendo estos receptores hormonales es, enlugar de inhibir per se la actividad cinásicade la JNK, sencillamente activar su desfosfo-rilación. El problema es que hay muchas fos-fatasas, y son mal conocidas. Recientemente

DISCUSIÓN

se han publicado dos artículos en Sciencesobre la regulación de la ERK y la calcio-cal-modulin-cinasa-4 dentro del núcleo por unafosfatasa que está unida a ella. De maneraque la desensibilización natural fisiológica detodas estas cinasas será porque ellas mis-mas activan a la fosfatasa que está unida yque las inhiben. Podría ser que la acción seprodujese por activar antes de tiempo estafosfatasa, que al parecer, está siempre unidaa la cinasa.

A. CELADA: Me parece muy interesante el meca-nismo de las JNK, particularmente cuando serecuerdan los artículos que se publicaron enCell en el año 1991, de los cuales incluso sederivaron algunos hechos éticamente cuestio-nables. Fui uno de los que demostró la inter-acción entre el MHC de clase II con los corti-coides y también intenté rehacer lo que losotros autores habían realizado para demostrarque las dos proteínas se unían. Pero el siste-ma me pareció tan sumamente artificial quenunca creí en él. Es posible que haya otro me-canismo, y quizás el único problema de vues-tra teoría es que no entiendo cómo, por ejem-plo, las moléculas de clase II del MHC sonfosforiladas por la JNK. Es muy posible queademás haya otro mecanismo mucho mássencillo, que es el mecanismo de captura y deinteracción proteína-proteína. Entiendo elmundo de los factores de transcripción comouna balanza entre activadores e inhibidores, yentre ellos pueden establecerse interaccionesproteína-proteína y puede ser que inhiban launión a los promotores. Esto lo hemos demos-trado en otros sistemas y quizá también sea elcaso de los glucocorticoides.

A. MUÑOZ: Creo que estás proponiendo unaunión de receptores hormonales activadospor su hormona, con algunos de los factorestranscripcionales que se inhiben. Sabes me-jor que yo la gran cantidad de bibliografía pu-blicada al respecto, aunque hay un artículoen el que la adición de glucocorticoides noafectaba el foot-printing in vivo de AP-1.Siempre hay que tener cuidado entre lo queuno observa en una co-inmunoprecipitacióno en un gel-shift in vitro, y lo que ocurre deverdad in vivo. La única excepción se produ-ciría con promotores como la proliferina, enque los sitios están solapantes. Hay tambiénpromotores en los que, sin inhibir la unión aADN de AP-1, sin embargo la transcripciónestá inhibida por el receptor. Proponemosque sea porque está inhibiendo la fosforila-ción de c-Jun por la JNK.

A. CELADA: Todo esto es muy sencillo. Si a unaproteína que está unida al ADN le pegas otraproteína, la ARN polimerasa no puede actuary no se produce transcripción. Creo que estono es ningún problema. En este caso, el pro-motor puede estar ocupado in vivo por losfactores de transcripción. Es posible quevuestra teoría, que es muy atractiva, sea cier-ta pero creo que también deben considerarseotras opciones.

A. MUÑOZ: El problema es que muchas vecesno se dispone de suficientes herramientaspara avanzar como, por ejemplo, para poderdetectar qué factor de transcripción ocupa elpromotor. Por tanto, no siempre resulta tanfácil como pudiera parecer. Evidentemente,se trata de una teoría con la que pretende-mos seguir trabajando.

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Introducción

Los mecanismos de señalización celular aco-plan los receptores de factores de crecimientoo citocinas inflamatorias con respuestas celula-res como proliferación, quimiotaxis, diferencia-ción o apoptosis. Estos procesos de señaliza-ción constituyen un intrincado sistema de re-des bioquímicas que permiten el flujo de lainformación desde el entorno extracelular hastael núcleo de la célula. En la actualidad, la iden-tificación de los distintos componentes queparticipan en estas rutas y de sus alteracionesen situaciones fisiopatológicas son objeto de unintenso estudio en búsqueda de nuevas dianasterapéuticas. En estas rutas desempeña un pa-pel destacado la génesis de segundos mensa-jeros lipídicos que conducen a la activación decascadas de cinasas activables por lípidos. En-tre éstas, la familia de las proteincinasas C(PKC) es una de las mejor caracterizadas1. Sonya más de 12 los isotipos de PKC que han sidoidentificados y que se agrupan en tres subfa-milias, según sus características estructurales ysus propiedades bioquímicas1. La subfamiliade las PKC clásicas (cPKC), cuyo prototipo esαPKC, es sensible a Ca2+ y a diacilglicerol(DAG), mensajeros producidos por la activa-ción de fosfolipasa C de fosfoinosítidos1, mien-tras que las nuevas (nPKC) son activables porDAG y no responden a Ca2+, pudiendo ser dia-nas de fosfolipasa C de fosfatidilcolina2. La clo-nación del isotipo ζ3, que constituye junto a λ yι la subfamilia atípica3-5, abrió nuevas perspec-tivas en el estudio de la señalización celular porestas cinasas.

Características de las PKC atípicas

ζPKC a diferencia de las clásicas, y al igualque las nuevas, no es regulable3 por Ca2+. Otracaracterística que distingue a esta nueva isofor-ma de las otras de su familia es su único zincfinger (lugar hipotético de unión a fosfolípidos)

que es doble en las clásicas y nuevas, y que enotras PKC parece ser responsable de la activa-ción por diacilglicerol y ésteres de forbol1. Esinteresante destacar que las PKC atípicas(aPKC) son insensibles a ésteres de forbol yDAG3-5. Sin embargo, son activables por im-portantes segundos mensajeros lipídicos talescomo fosfatidilinositol 3,4,5-P3 (PI 3,4,5-P3) yceramida6-9 que se generan tras la activacióncelular por citocinas inflamatorias y factores decrecimiento10-12. De acuerdo con esto, se hadescrito la implicación de esta subfamilia atípi-ca de PKC en importantes funciones celulares.Así, la microinyección de un péptido inhibidorcon la secuencia del seudosustrato de lasaPKC, pero no de α o εPKC inhibe completa-mente la maduración y la activación de NF-κBen oocitos de Xenopus laevis, así como la reini-ciación de la síntesis de ADN en fibroblastosquiescentes de ratón13,14. Además, la deple-ción de λ/ιPKC con oligonucleótidos antisenti-do o su inhibición por transfección de mutan-tes que carecen de actividad cinasa y son do-minante negativos inhibe la capacidadproliferativa celular, así como la activación deMAPK15,16, la actividad de promotores depen-dientes de elementos κB14,17-20, la liberaciónde PGE2 en respuesta a IL-1β21, la expresióndel gen de α2 integrina inducida por PDGF22 yla diferenciación de células PC12 en respuestaa NGF23. Así mismo, se ha demostrado recien-temente in vivo que λPKC, y muy probable-mente también ζPKC, es una etapa clave en latransmisión de la cascada mitogénica activadapor PI-3 cinasa24,25.

Mecanismos de regulación y PKC atípicas

Las PKC atípicas no son sólo regulables porlípidos, sino que también lo son por regulado-res proteicos. Así, ζPKC interacciona con Rasin vitro e in vivo26-28, lo que podría explicar elrequerimiento de este oncogén en la activaciónde las aPKC por PDGF26 y el hecho de que

Nuevas dianas terapéuticas en la transducción de señales por proteincinasas C

Jorge Moscat y María T. Díaz MecoLaboratorio GlaxoWellcome-CSIC de Biología Molecular y Celular. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa.

CSIC-UAM. Universidad Autónoma. Madrid.

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ζPKC medie, al menos en parte, las señalesmitogénicas de Ras13,29,30. Sin embargo, tantoRas como los mediadores lipídicos descritoscomo cofactores para las PKC atípicas no sonselectivos para éstas. Así, el PIP3 no sólo activaa ζPKC o λPKC sino que, además, es impor-tante en la activación de otras cinasas comoεPKC, δPKC, c-AKT o PRK124. Las ceramidas,no sólo activan a ζPKC sino que también regu-lan a la CAP cinasa o a la CAP fosfatasa11.

Por tanto, la identificación y caracterizaciónde moduladores proteicos específicos para ca-da isotipo de PKC es importante en el estable-cimiento de estrategias específicas para el blo-queo selectivo de cada isoforma. Es de desta-car, en este sentido, la identificación utilizandoel sistema de doble híbrido en levadura, de dosnuevos moduladores proteicos que controlan laactividad de las aPKC: LIP y el producto delgen par-418,31. LIP es un activador selectivo deλ/ιPKC a través de su interacción con el domi-nio “dedo de cinc” de la cinasa18. Por otro la-do, el producto del gen par-4, que se inducedurante la parada del crecimiento celular y laapoptosis32, también interacciona específica-mente con el “dedo de cinc” de ζPKC yλ/ιPKC, lo que conduce a la inhibición de suactividad enzimática. La interacción de lasaPKC con Par-4 ha permitido desvelar el papelfundamental de estas cinasas en la superviven-cia celular31.

Uno de los posibles efectores directos de es-tas PKC en el control de la supervivencia y laproliferación celular es la cascada deMAPK31,33,34. Al contrario que Raf-135, MAPKparece estar implicada de modo decisivo en losmecanismos de acción de las aPKC en super-vivencia. El hecho de que estas PKC regulen laactivación de promotores dependientes de AP1en respuesta a estímulos mitogénicos24,36 yRas29, junto con la evidencia de que ζPKC esun efector clave de Ras26,28, ya sugería que es-tas isoformas podrían estar implicadas en laactivación de MAPK. En este sentido, se ha de-mostrado recientemente que la sobreexpresiónde un mutante permanentemente activo deζPKC o λ /ι PKC es suficiente para activarMAPK sin efecto alguno sobre SAPK op70s6K16. Además, mutantes dominantes ne-gativos de PKC atípicas inhiben significativa-mente la activación de la cascada de MAPK16.Es interesante destacar que la activación deMAPK por los isotipos clásicos y nuevos dePKC implica la activación de Raf, mientras quelas acciones de aPKC son independientes deRaf pero mediadas por MEK16,37. Todas estas

evidencias en su conjunto indican que lasaPKC constituyen una ruta paralela a Raf paraactivar MAPK sin afectar la cascada deSAPK16,27,30,37,38. Esto puede ser de especialrelevancia ya que el balance de la actividad deMAPK frente a SAPK y p38 puede ser críticoen la inducción de apoptosis39,40. De hecho, elbloqueo de las aPKC por Par-4 o la irradiaciónultravioleta conlleva la inhibición de MAPK yuna activación concomitante de p3833. Resul-tados recientes demuestran, además, que lasimple inhibición de la actividad basal deMAPK es suficiente para desencadenar la acti-vación de p38 de manera dependiente de cas-pasas34. Este efecto se bloquea en presenciade suero a través de la cascada de PI-3 cinasa-Akt34. El hecho de que las aPKC sean activa-das por productos de PI-3 cinasa6,7,25 indicaque estas PKC están sujetas a un doble meca-nismo de control en respuesta a señales de es-trés: la interacción con Par-4 y la inactivaciónde PI-3 cinasa.

Sin embargo, la regulación de las cascadasde MAPK no es la única vía por la que las PKCcontrolan la supervivencia celular. Existen sóli-das evidencias que implican a las aPKC en laregulación de NF-κB8,9,13,16,17,19,20,29. Esteimportante factor de transcripción es esencialpara la inducción de la supervivencia celular yel bloqueo de la apoptosis, por lo que un cam-po de investigación importante en la actualidadlo constituye el estudio del mecanismo por elque estas PKC controlan NF-κB. Resultadosrecientes sugieren que la acción de las PKC enesta ruta está mediada por las cinasas respon-sables de la fosforilación de IκB, las IKK41.

Un mejor conocimiento y caracterización delos mecanismos que regulan estas cinasaspuede suponer un avance significativo para eldiseño de posibles nuevas dianas terapéuticasmás eficaces y selectivas.

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119

NUEVAS DIANAS TERAPÉUTICAS EN LA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES POR PROTEINCINASAS C

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41. Lallena MJ, Díaz-Meco MT, Moscat J. Critical ro-le of the atypical PKC isoforms in the regulationof IκB kinase β by TNFα. 1999. En prensa.

120


A. ZORZANO: En relación con el papel propuestode la ζPKC en proliferación y supervivencia,¿cómo lo cuadras con los resultados de tu co-laboración con Bob Farese de los cuales seevidencia que ζPKC participa en los efectostípicos de una célula diferenciada, como es larespuesta a la insulina estimulando el trans-porte de glucosa?

J. MOSCAT: Aunque no participé directamenteen estos trabajos de Farese, no es tan sor-prendente lo que comentas porque, porejemplo, está ampliamente aceptado quePI-3 cinasa está implicada en supervivenciacelular y, sin embargo, parece ser que tam-bién lo está en el control de GLUT-4. Esto esmuy interesante, porque se relaciona con lalocalización geográfica de las cinasas. EGF yPDGF inducen PI-3 cinasa y, sin embargo,no inducen GLUT-4. Pero la diferencia esque al estimular PI-3 cinasa por insulina, selocaliza cerca del IRS-1 y cuando se estimu-la por el factor de crecimiento está en otrolugar. Por esta razón, la proteinasa que he-mos clonado en p62 puede ser muy intere-sante porque está ubicando ζPKC en unaregión en la que pueda haber un complejode señalización distinto según cada tipo ce-lular.

A.M. PLANAS: Vosotros habéis estudiado estecontrol de la supervivencia en diversos tiposcelulares. Sin embargo, in vivo existen mu-chos más tipos celulares diferentes, sobre to-do pensando en el cerebro que es el órganocon el cual trabajo. ¿Hasta qué punto pen-sáis que vuestros hallazgos podrían ser de-pendientes del tipo celular con el que se estátrabajando? Me refiero a que, tal vez, una se-rie de cinasas podrían estar activadas en unsistema y no en otros.

J. MOSCAT: Desde mi perspectiva de biólogomolecular y celular sólo puedo decirte que,en nuestro grupo, trabajamos en sistemasmodelo que intentamos que reproduzcan almáximo lo que realmente ocurre en situacio-nes fisiológicas. Por ejemplo, el modelo de PI-3cinasa en supervivencia se definió en célulasPC-12, que son realmente unas células demuy mala calidad, pero que los hallazgos de-rivados de su estudio han sido posteriormenteconfirmados con experimentos realizados concélulas reales de hipocampo y de otras regio-nes cerebrales. Los resultados que he pre-sentado indican que existen muchísimos ba-lances relacionados con las proteínas cinasasC y deben interpretarse de forma que en al-gunas células el balance puede estar favore-

DISCUSIÓN

cido algunas de estas rutas, pero que enotras células tal vez participan rutas que toda-vía desconocemos. La ventaja de utilizar sis-temas modelo es que son sistemas bastantelimpios, en los que uno puede diseccionar es-tas rutas, aunque la significación que estoluego pueda tener en la fisiología o la clínicadependerá de que podamos disponer de inhi-bidores farmacológicos para administrar alanimal y estudiar sus efectos. La otra alterna-tiva es utilizar animales knock-out, aunque eneste caso se incurre en el riesgo de que sedesarrollen mecanismos compensatorios quepueden complicar la interpretación de los re-sultados.

P. KALIMAN: En vuestro sistema ¿la activaciónde IKK por ζPKC depende de PI-3 cinasa? Y,en segundo lugar, cuando precipita el com-plejo de IKK, ¿precipita también algún otro ti-po de PKC?

J. MOSCAT: La influencia de PI-3 cinasa la esta-mos explorando en la actualidad. Creo que endeterminados tipos de factores de supervi-vencia la PI-3 cinasa va a ser necesaria, aun-que posiblemente no sea suficiente. Si sobre-expresamos PI-3 cinasa no se aprecia ζPKCmás activa, sin embargo, si bloqueamos PI-3cinasa sí que se inhibe ζPKC. Si realmente estan importante ζPKC como pensamos para laestimulación de NFκ-B y de NFκ-B cinasa,deberíamos tener una respuesta similar.

P. KALIMAN: Esto estaría relacionado con mi co-mentario anterior sobre la limitación endóge-na del sistema. Por ejemplo, cuando nosotrossobreexpresamos la p85 salvaje y estimula-mos las células para diferenciarlas, no vemosque se diferencien más que las células con-troles.

J. MOSCAT: En vuestro experimento añadisteisp85 δ que es dominante negativo, mientrasque p85 de tipo salvaje no hace nada, por loque sugerí añadir p110 permanentementeactivo. Nosotros disponemos del mutantep110 permanentemente activo que es perfec-tamente activo, puesto que estimula RAC yJNK. Fisiológicamente tampoco estamos se-guros de lo que significa, pero por lo menossabemos que está funcionando. En estascondiciones no es suficiente para estimularζPKC, lo cual no quiere decir que sea una li-mitación del sistema, sino que ζPKC puedeutilizar una actividad basal de PI-3 cinasaaunque no sea estimulable. De esto hayejemplos, como AKT que se fosforila porPDK-1 y PDK-1 únicamente es capaz de esti-mular a AKT porque está unido a un PIP 3-4

basal. No hace falta más PIP-3 para estimularPDK-1, aunque sí para estimular AKT. Es de-cir, hay un papel de la PI-3 cinasa basal quepuede ser necesario, aunque su estimulaciónpuede no ser suficiente.

P. KALIMAN: Esto también se recoge en un artí-culo que publicamos hace unos años, dondeel tráfico de GLUT-1 basal en mioblastos de-pende de una actividad basal de PI-3 cinasa.Por más insulina que se añada no vemosmás efectos.

J. MOSCAT: Sobre tu pregunta de si podíamosprecipitar otras PKC, estudiamos αPKC yεPKC, esta última no está presente pero la so-breexpresamos. Cuando se sobreexpresa deforma ectópica αPKC con IKK podemos veruna asociación. Sin embargo, cuando se ana-liza la interacción de las proteínas endógenasno se observa interacción, lo que quiere decirque si forzamos el sistema podemos llegar aver una interacción que es inespecífica. Pre-cisamente esto es todo lo contrario de lo quepasa con la ζPKC, puesto que tras la expre-sión ectópica de IKK observábamos queTNFα inducía a la asociación de la endógena,lo que no ocurre si se hace lo mismo paraαPKC, ni incluso estimulando con PMA, porlo que pensamos que las otras PKC no estánimplicadas en la regulación fisiológica de IKK.Además, esto concuerda con que inhibidoresmás o menos selectivos para αPKC o la βPKCy sin efecto sobre las ζ son incapaces de blo-quear el efecto TNFα.

F. VENTURA: En tu presentación has comentadoque la ζPKC activaba tanto p38 como IKK.¿Habéis estudiado la implicacion de Met cina-sa en estos efectos?

J. MOSCAT: En realidad es la inhibición de ζPKCla que estimula p38. Cuando se induce PAR-4 se inhibe ζPKC y es esta inhibición la quepromueve la estimulación de p38 a través desu sistema de caspasas. Respecto a tu pre-gunta, hemos realizado varios experimentos yno hemos podido constatar ningún tipo de in-teracción entre ζPKC y Met cinasa.

A. GARCÍA DE HERREROS: ¿Podrías comentar algomás sobre la p62 y su papel de localizaciónde la ζPKC en la membrana? Me refiero, porejemplo, a si está involucrada en la activaciónde ζPKC.

J. MOSCAT: p62 no es capaz de estimularζPKC porque interacciona por un dominioque nada tiene que ver con el dominio de in-teracción. En resultados preliminares de la-boratorio, hemos observado que p62 permi-te que SARK fosforile a la ζPKC en una re-

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NUEVAS DIANAS TERAPÉUTICAS EN LA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES POR PROTEINCINASAS C

gión que la activa. De confirmarse, esto seríabastante novedoso porque constituiría unaevidencia de que las ζPKC son activablespor fosforilación en tiroxina. El hecho de quenadie haya objetivado que ζPKC in vitro sefosforile por SARK o por miembros de estafamilia, se debe simplemente a la falta dep62. Si no hay p62 que las una e induzcaun cambio conformacional, no puede haberfosforilación. Pensamos, por tanto, que real-mente va a ser importante la estimulaciónpor tirosincinasas.

R. TRULLÁS: ¿El tratamiento con suero altera dealguna manera la reducción de ERK? Mi se-gunda pregunta sería si el efecto del suero serevierte completamente con wortmanina.

J. MOSCAT: He presentado los resultados basa-les de ERK. El valor de ERK no varía tengan ono tengan suero, porque su valor basal no va-ría ni en células en quiescencia, detenidas enG0-G1, ni en células que estén proliferandoactivamente. La única diferencia es que encélulas que están en quiescencia, al añadirsuero, se produce un pico que es más o me-nos sostenido por las respuestas del valor ba-sal. Nosotros hemos observado que en célulasque proliferan activamente y sin la presenciade suero, a pesar de que el suero no modifi-que en absoluto ERK, si se bloquea ζPKC porinducción de par-4 se induce apoptosis. So-bre tu segunda pregunta, la wortmanina re-vierte totalmente el efecto del suero.

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1. El hospital de día y su repercusión en te-rapéutica (1985).

2. Problemas que se plantean en el trata-miento de infecciones graves por S. au-reus (1986).

3. Contribución del biólogo a la farmacología en España (1987).

4. Un glosario para farmacólogos (1987).5. Aspectos biológicos de los síndromes de-

presivos (1988).6. Bases del tratamiento de las intoxicacio-

nes agudas (1988).7. Investigación básica y medicina clínica

(1988).8. Tratamiento de datos en farmacología

(1989).9. Perspectivas terapéuticas en la esclerosis

múltiple (1989).10. Biotecnología de aplicación farmacéutica

(1991).11. Metodología del ensayo clínico (1991).12. Periodismo científico. Un simposio inter-

nacional (1991).13. El ensayo clínico como tarea cooperativa

(1992).

14. Terapéutica y calidad de vida (1993).15. Investigación sobre cáncer en España: de

la biología molecular a la clínica (1994).16. El tratamiento del dolor: del laboratorio a

la clínica (1994).17. Farmacología de los canales iónicos

(1995).18. Bases de datos en farmacología y tera-

péutica (1996).19. Fármacos y conducción de vehículos

(1996).20. Traducción y lenguaje en medicina

(1997).21. Medicina y medios de comunicación. Tra-

ducción al español de una serie publicadaen la revista The Lancet (1997).

22. Problemas y controversias en torno al en-sayo clínico (1998).

23. Glosario de investigación clínica y epide-miológica (1998).

24. Transducción de señales como diana far-macológica (1999).

25. Investigación médico-farmacéutica enatención primaria. Una visión a través delas publicaciones de la REAP (1999).

Monografías Dr. Antonio Esteve publicadas

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monografÍas dr. antonio esteve transducciÓn de … · 24 t ransducciÓn de seÑales como diana...

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