monografÍas dr. antonio esteve tratamiento de …elección de la metodología de optimización una...

8

MONOGRAFÍAS DR. ANTONIO ESTEVE

TRATAMIENTODE DATOS

EN FARMACOLOGÍAA. Badía, A. Domínguez-Gil, J. Garzón

FUNDACIÓN • l U l DR. ANTONIOi ESTEVE

© 1989, Fundación Dr. Antonio EsteveISBN 84-404-4717-5Depósito legal: B-19.244-89Coordinación y producción:Ediciones Doyma, S.A.Travesera de Grada, 17-21/08021 BarcelonaImpreso en España por Gráficas AlmogávaresPrinted in Spain

La Fundación Dr. Antonio Estevecontempla como objetivo prioritarioel estímulo del progreso de la terapéuticapor medio de la comunicacióny la discusión científica.La Fundación quiere promoverla cooperación internacional en lainvestigación farmacoterapéutica y, a talfin, organiza reuniones internacionalesmultidiscipñnarias donde gruposreducidos de investigadores discutenlos resultados de sus trabajos.Estas discusiones son recogidasen las publicaciones de los «EsteveFoundation Symposia».Otras actividades de la FundaciónDr. Antonio Esteve incluyenla organización de reuniones dedicadasa la discusión de problemas de alcancemás local, así como las conferenciasperiódicas «Dr. Antonio Esteve» y otrasformas de apoyo a las ciencias médicas,farmacéuticas y biológicas.

Tratamiento de datosen farmacología

A. BADÍA, A. DOMÍNGUEZ-GIL y J. GARZÓN

Introducción 9

J.L. GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ

Análisis computacional en farmacología 11

M. CAMPILLO y M.L. MARTÍN-MATEO

Análisis estadístico de la curva dosis-respuestaen farmacología: conceptos generales 17

F.J. MORALES-OLIVAS y E. RUBIO

Análisis de la respuesta a fármacosagonistas 23

J. SALLES y A. BADÍA

Caracterización y cuantificación delantagonismo farmacológico 33

J. GARZÓN

Estudios de fijación y discriminación dereceptores 43

F. BARTUREN y J.A. GARCÍA-SEVILLA

El problema de los receptores de reservaen el análisis de datos farmacológicos 53

A. PAZOS y A.M. GONZÁLEZ

Análisis de datos en estudiosde receptores por autorradiografía 63

R. OBACH

El tratamiento de datos en los estudiosde biodisponibilidad 73

J. MARTÍNEZ -LANAO

Tratamiento de datos farmacocinéticosen estudios experimentales 81

A. DOMÍNGUEZ-GIL y D. SANTOS

Tratamiento de datos en farmacocinéticaclínica 89

Lista de participantes MDepartamento de FarmacologíaFacultad de VeterinariaUniversidad Autónoma08193 Bellaterra(Barcelona)

A. BADÍADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad Autónoma08193 Bellaterra(Barcelona)

J.M. BAEYENSDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaAvda. de Madrid, s/n18012 Granada

J. BAÑOSDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad Autónoma08193 Bellaterra(Barcelona)

F. BARTURENDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad del País Vasco48940 Leioa(Vizcaya)

N. BASIDepartamento de FarmacologíaCentro de Investigación yDesarrollo Aplicado, S.A.Centro Industrial SantigaArgenters, 608130 Santa Perpetua de Mogoda(Barcelona)

R BERGADepartamento de FarmacologíaLaboratorios Almirall, S.A.Cardoner, 7408024 Barcelona

J. BlGORRAEscuela Profesional de FarmacologíaClínicaFacultad de MedicinaCasanova, 14308036 Barcelona

M. CAMPILLODepartamento de Bioestadísticay EpidemiologíaFacultad de MediaraUniversidad Autónoma08193 Bellaterra(Barcelona)

J . DOMÉNECHUnidad Funcional de Farmacia GalénicaFacultad de FarmaciaPz. Pío XII, s/nNúcleo Universitario de Pedralbes08028 Barcelona

A. DOMÍNGUEZ-GILDepartamento de Farmacia GalénicaFacultad de FarmaciaAvda. Campo Charro, s/n37007 Salamanca

S. ERILLFundación Dr. Antonio EsteveLlobet i Vall-Llosera, 208032 Barcelona

A.J. FARRÉDepartamento de FarmacologíaLaboratorios Dr. Esteve, S.A.Avda. Virgen de Montserrat, 22108026 Barcelona

J. FLÓREZDepartamento de Fisiologíay FarmacologíaUnidad de Farmacología PreclínicaFacultad de MedicinaCardenal Herrera Oria, s/n39011 Santander

A. GARCÍA-GARCÍADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad AutónomaArzobispo Morcillo, s/n28029 Madrid

J. GARCÍA-RAFANELLDepartamento de FarmacologíaJ. Uriach y Cía., S.A.Decano Bahí, 59-6708026 Barcelona

J.A. GARCÍA-SEVILLADepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad del País Vasco48940 Leioa(Vizcaya)

J. GARZÓNInstituto CajalVelázquez, 14428006 Madrid

A. GÓMEZ-LUQUEDepartamento de FarmacologíaFacultad de MedicinaCampus Universitario de Teatinos29080 Málaga

A.M. GONZÁLEZDepartamento de Fisiologíay FarmacologíaFacultad de MedicinaCiudad Herrera Oria, s/n39011 Santander

J.L. GONZÁLEZ-HERNÁNDEZDepartamento de Química FísicaFacultad de Ciencias Químicas37008 Salamanca

M.L. MARTÍN-MATEODepartamento de BioestadísticaFacultad de MedicinaUniversidad Autónoma08193 Bellaterra(Barcelona)

J. MARTÍN EZ-LANAODepartamento de Farmaciay Tecnología FarmacéuticaFacultad de FarmaciaAvda. Campo Charro, s/n37007 Salamanca

F.J. MORALES-OLIVASDepartamento de FarmacologíaFacultad de MedicinaAvda. Blasco Ibáñez, 1546010 Valencia

E. MORCILLOVicerrectorado de InvestigaciónCtra./ Madrid-Barcelona, Km 3328871 Alcalá de Henares(Madrid)

R. OBACHDivisión de Ciencias de la SaludDepartamento de FarmaciaUniversidad de Barcelona08028 Barcelona

A. PAZOSDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaCardenal Herrera Oria, s/n39011 Santander

J.M. PEINADODepartamento de FisiologíaFacultad de MedicinaAvda. de Madrid, s/n18012 Granada

J. ROCADepartamento de FarmacologíaLaboratorios Vita, S.A.Avda. de Barcelona, 5108970 Sant Joan Despí(Barcelona)

E. RUBIODepartamento de FarmacologíaFacultad de MedicinaAvda. Blasco Ibáñez, 1546010 Valencia

J. SALLESDepartamento de Farmacologíay TerapéuticaFacultad de MedicinaUniversidad Autónoma08193 Bellaterra(Barcelona)

P. SÁNCHEZ-BLÁZQUEZInstituto CajalVelázquez, 14428006 Madrid

A. SÁNCHEZ-GARCÍADepartamento de FarmacologíaFacultad de MedicinaAvda. Menéndez Pidal, s/n14004 Córdoba

D. SANTOSDepartamento de Farmacia y TecnologíaFarmacéuticaFacultad de FarmaciaAvda. Campo Charo, s/n37007 Salamanca

E, VlLADepartamento de Farmacologíay PsiquiatríaFacultad de MedicinaUniversidad Autónoma08193 Bellaterra(Barcelona)

Introducción

El descubrimiento de nuevos agentes farma-cológicamente activos y la determinación de susefectos por métodos fiables han constituido des-de siempre dos objetivos reconocidos de la far-macología. Sin embargo, lo que confiere a estadisciplina su carácter científico y no meramen-te descriptivo es la cuantificación adecuada delas propiedades farmacológicas. La preocupa-ción por lograr este objetivo le ha conferido des-de sus inicios el carácter de ciencia. Así desdelos primeros ensayos biológicos para la valora-ción de los extractos naturales hasta los estu-dios actuales de la farmacología molecular, elanálisis matemático ha ido asociado indefecti-blemente al desarrollo de los nuevos conoci-mientos farmacológicos. De este modo, graciasa la aplicación de los principios matemáticosque intervienen en la adsorción de gases sobresuperficies de metales pulimentados, Clark de-sarrolló en 1926 las bases de la teoría de la ocu-pación para explicar la interacción de los fárma-cos con los receptores. Esta hipótesis, junto conlas distintas modificaciones introducidas poste-riormente por diferentes autores, constituye labase molecular sobre la que se basa la inter-pretación de los datos derivados de la relaciónexistente entre dosis y respuesta, así como laclasificación de los fármacos que actúan sobrereceptores. La posterior introducción de las téc-nicas de fijación de radioligandos ha potencia-do de forma espectacular los estudios sobre re-ceptores, pero su desarrollo no hubiera sido

posible sin la aplicación de un análisis matemá-tico profundo que permitiese la interpretaciónde los resultados. Paralelamente a estos estu-dios, y gracias también a la aplicación de mo-delos matemáticos, ha sido posible una mejorcomprensión del comportamiento cinético de losfármacos en el organismo, cuando los procesosde absorción, distribución, metabolismo y eli-minación operan simultáneamente. Estos cono-cimientos aportados por la farmacocinética pue-den ser, a su vez, de gran interés para lautilización clínica posterior del fármaco.

En esta monografía se han revisado y actuali-zado algunos de los aspectos referentes al aná-lisis cuantitativo de los resultados en farmaco-logía y que se han esbozado en el apartadoanterior. Los trabajos presentados son el frutode la reunión que, gracias a la Fundación Dr.Antonio Esteve y a su Director Prof. Sergio Erill,tuvo lugar en Barcelona el 19 de mayo de 1988y que permitió el intercambio multidisciplinar deconocimientos sobre el tratamiento matemáti-co de los datos farmacológicos entre investiga-dores de nuestro país.

A. Badía, A. Domínguez - Gil* y J. Garzón"""Departamento de Farmacología y Psiquiatría.

Universitat Autónoma de Barcelona.* Departamento de Farmacia Galénica.

Universidad de Salamanca."Instituto Caja I.

CSIC, Madrid.

Análisis computacional en farmacologíaJ.L, González - Hernández

Departamento de Química Física. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad de Salamanca.

Introducción

El vertiginoso desarrollo experimentado en eluso de los ordenadores y la extensa aplicaciónde las modernas técnicas matemáticas a la in-vestigación en los distintos campos de las cien-cias experimentales13 y de la técnica, han de-terminado un considerable impulso en eltratamiento y resolución de numerosos proble-mas que hasta hace poco tiempo resultaban ina-bordables; todo ello ha contribuido al rápido de-sarrollo del conocimiento en numerosas áreasincidiendo, así mismo, en el progreso de la so-ciedad al elevar el nivel de bienestar y calidadde vida.

Se trata de la «revolución informática» para-lela a la denominada «revolución electrónica»y comparable a los eventos derivados de la an-tigua «revolución industrial». Para apoyar el con-tenido de esta afirmación, permítasenos utilizarel siguiente ejemplo a modo de comparación:con la aparición de las calculadoras programa-bles, la velocidad de las operaciones aritméti-cas se incrementó en menos de 30 años de larealización de aproximadamente 0,1 operacio-nes por segundo a 2 millones, lo que suponeun aumento de 20 millones; sin embargo, res-pecto a la velocidad de desplazamiento del hom-bre a pie, se pasó en el transcurso de muchossiglos a 30.000 km/h en los viajes interplaneta-rios lo que significa un aumento de tan sólo5.000 veces.

Este notable desarrollo ha conllevado una pro-liferación y perfeccionamiento de los métodosmatemáticos numéricos4'5 con más alto gradode sofisticación posibilitando incrementar cua-litativa y cuantitativamente el rigor de los resul-tados que se obtienen. De esta manera han na-cido recientemente y están creciendo a un ritmoconsiderable ciertas ramas de las ciencias ex-perimentales y de la técnica con fines eminen-temente pragmáticos; es el caso de la farma-cometría, la quimiometría7, la tecnometría, etc.con el denominador común de que en todasellas se pretende extraer el máximo de informa-ción contenido en los datos experimentales a fin

de enriquecer el conocimiento acerca del fenó-meno o proceso que los ha originado. Es fácilcomprender que la información será tanto másvaliosa cuanto mayor sea el éxito en la aplica-ción de la metodología matemática mediante eloportuno tratamiento computacional sobre losdatos experimentales dotados de las garantíassuficientes. Estos dos requisitos, metodologíamatemática y tratamiento computacional cons-tituyen los pilares básicos del análisis numéri-co. A continuación los consideraremos en detalle.

Procedimiento general del tratamiento

De forma genérica, el procedimiento habitualque se sigue en el tratamiento de datos experi-mentales comprende las siguientes fases:

Estudio matemático previo

Es evidente que el problema debe ser previay convenientemente analizado desde el puntode vista matemático. Si se trata del ajuste de da-tos experimentales a una función (caso más co-mún) resulta necesario realizar una análisis ex-haustivo del comportamiento matemático de lamisma, delimitando los Intervalos de existencia,evaluando los puntos singulares que posea sinperder de vista las restricciones que vengan im-puestas por las circunstancias del propio fenó-meno que se estudia. En algunos casos, la for-ma explícita de la función es desconocida porlo que deben utilizarse los dispositivos oportu-nos para conseguir un conjunto de valores dis-cretos de la función o de sus derivadas sobrelas que hay que aplicar metodologías de inte-gración numérica; en cualquier caso, el conjuntode valores discretos debe permitir la aplicaciónde métodos de interpolación con «suavizaciónmatemática» previa a la aplicación de splinescúbicos4.

Elección de la metodología de optimización

Una vez determinada la forma explícita de lafunción, o en su defecto valores discretos de la

11

A. BADIA, A. DOMÍNGUEZ - GIL, J. GARZÓN

misma, se plantea el problema del ajuste de losdatos experimentales a la función.

Cuando no se exija un alto grado de precisióny/o exactitud, puede acudirse eventualmente ala utilización de métodos gráficos o bien puedetransformarse la función original de una de mássencillo tratamiento, obteniendo una transfor-mación lineal por agrupamiento de términos, locual lleva consigo la determinación de los nue-vos valores de los factores de ponderación es-tadística de los datos experimentales original-mente obtenidos.

Hemos de decidir el criterio de minimiza-c/dn8'9de las desviaciones respecto al ajuste;los más utilizados son los de mínimos cuadra-dos y de Minimax. Posteriormente, y teniendoen cuenta el resultado del análisis matemáticoprevio, debemos elegir la estrategia de optimi-zación que puede basarse en un método exac-to o aproximado. Generalmente, y excluyendolas funciones lineales, nos encontramos en elsegundo caso, por lo que hemos de adoptar unanueva decisión en cuanto a la elección de unmétodo de búsqueda o uno de gradiente o in-cluso uno híbrido que aproveche las ventajasde ambos. Esta decisión es muy importante ypuede determinar el éxito o el fracaso del ajuste.

Los métodos de búsqueda (Simplex, Pit-ma-pping, Fibonacci, «Golden Section», etc.)10 sonpor lo general más sencillos de aplicar, no ne-cesitan del cálculo de derivadas y se obtienenbuenos resultados en el caso de funciones queobserven buen comportamiento o posean unelevado número de variables o parámetros a op-timizar.

Los métodos de gradiente (Steepest Descent,Newton-Raphson, Marquardt, Davidon-Fletcher-Powell, «quasi-Nexton», etc.) utilizan como di-rección de movimiento un vector basado en elgradiente de la función, son más robustos y con-siguen resultados más precisos pero a su ma-yor dificultad de implantación y su más difícilgeneralización hay que unirle la posibilidad dedivergencia, fundamentalmente si nos encon-tramos en zonas alejadas del mínimo.

En muchas ocasiones se plantea la siguientepregunta: ¿cuál de los innumerables métodosde optimización consigue mejores resultados?La respuesta no puede ser en ningún caso elnombre de un determinado método. La res-puesta debe ser: «depende de la naturaleza dela función y de las características del problema».Esto quiere decir que métodos que resultan ex-traordinariamente efectivos en el tratamiento dedeterminadas funciones pueden fracasar estre-pitosamente cuando se aplican sobre funciones

de otro tipo. Y eso debe hacernos reflexionaracerca del empleo indiscriminado del abundan-te software existente.

Otra cuestión importante que debe tenerse encuenta es la relación esfuerzo/resultado, porque,a veces, se emplean metodologías y estrategiasde una potencia desproporcionada para satis-facer las exigencias de los resultados que sequieren obtener. En otras ocasiones, la super-posición o la aplicación secuencial de dos o másmétodos resulta ser la solución al problema.

Tratamiento estadístico

Un tratamiento estadístico riguroso constitu-ye el perfecto complemento matemático paraevaluar las precisiones de los resultados obte-nidos, niveles de significación, intervalos de con-fianza, etc. Dicho tratamiento resulta tanto másvalioso cuanto mayor sea la imprecisión queafecta a los datos y cuanto menos numeroso seaeste colectivo, resultando determinante cuandoel objetivo del estudio se centra fundamental-mente en la discriminación entre los modelosa los que se ajustan los datos.

Implantación informática

Una vez que se han satisfecho las etapas an-teriores, y al tratarse de métodos iterativos quecomprenden la realización de numerosos cál-culos repetitivos, es necesario plasmar esasideas desarrollando el conveniente programa decálculo. Hemos de ponderar la magnitud delproblema a resolver, las características del or-denador del que disponemos (micro-, mini-, granordenador), el lenguaje informático idóneo (Ba-sic, Fortran 77, Pascal, etc.); todo ello debe con-ducirnos hacia la conveniente computación, ha-cia la obtención de los mejores resultados.

Permítasenos realizar sobre este punto la si-guiente reflexión: es obvio que hemos de tenerpresente el gran contingente de software exis-tente en el mercado, pero su utilización compor-ta ventajas, como la sencillez de aplicacjón, einconvenientes, como una utilización mecánica,ausencia de posibilidades de adaptación a lasexigencias de las peculiaridades de nuestro pro-blema y, por qué no decirlo, los riesgos de quenuestro problema se encuentre más allá de lasfronteras de aplicación del programa o del al-goritmo matemático, alcanzando resultados dra-máticos fundamentalmente cuando éstos, al serincorrectos, sus órdenes de magnitud no coli-sionan con la lógica que impone el proceso queestamos estudiando. En nuestra opinión, el pro-

12

ANÁLISIS COMPUTACIONAL EN FARMACOLOGÍA

cedimiento idóneo, y que mejores resultadosnos ha producido, consiste en escribir uno mis-mo el programa principal que utilice en el mo-mento oportuno las subrutinas que existen enlos paquetes matemáticos de software (HarwellLibrary, Nag Lib. etc.)11 que ofrecen un amplioabanico de tratamientos numéricos de proble-mas matemáticos de muy diversa índole.

En muchas ocasiones resulta muy ilustrativay conveniente la posibilidad de representacióngráfica (en el plano y en el espacio) de los per-files que presenta la función bajo diversas con-diciones así como la representación de los ma-pas de contorno de la función suma dedesviaciones cuadráticas que permiten visuali-zar el progreso de la propia optimización.

Aplicaciones en farmacología

Vamos a considerar de una forma genérica,las posibilidades de aplicación de lo expuestoanteriormente en el campo de la farmacología,considerando los siguientes casos: a) análisis dela relación dosis-respuesta; b) interacciónfármaco-receptor; c) modelos farmacocinéticos,y d) determinación de constantes de ionización.

Análisis de la relación dosis-respuesta

Nos limitaremos a considerar la función bá-sica de la relación dosis-respuesta12:

1. E = (C1/IC2 + D]) D

Sin pretender descender al detalle del trata-miento en las distintas acepciones que puedeadquirir la ecuación1, observamos que la utili-zación de coordenadas cartesianas en el plano(E/D) ofrece un perfil hiperbólico, ante lo cualpodríamos transformar la expresión l tomandosus inversos con lo que tendríamos una relaciónHenal 1/E vs 1/D. Aceptando esta forma lineal,el tratamiento debe considerar el cálculo de losnuevos factores de peso estadístico al aplicarel criterio de mínimos cuadrados cuando lo quese pretende es acceder al conocimiento de losparámetros Cl y C2, en cuyo caso es posiblela aplicación de un método exacto. Naturalmen-te existen otros tratamientos particulares que uti-lizan métodos aproximados dependiendo de lanaturaleza y características de la respuesta quese asemejan a los desarrollados para el trata-miento de la ecuación de Michaelis-Menten encatálisis enzlmática.

Interacción fármaco-receptor

La interacción de un fármaco (B) con un re-ceptor (R), considerando que no existe difusióncomo paso limitante, puede formularse13:

2. B + R «= = =» [BR]

pudiéndose efectuar un tratamiento similar alque se lleva a cabo en cinética química. El pro-cedimiento consiste en integrar las ecuacionesdiferenciales de velocidad utilizando como va-riable a que es la fracción de receptores en for-ma de complejo, obteniendo la función:

3. <rt = aeq (1 - exp(-(kl[B] + k2)t])

que adquiere forma lineal cuando se toman lo-garitmos. Para la determinación conjunta deambas constantes (kl y k2) necesitamos unasegunda ecuación:

4. at = aeq (exp [—k2 • t])

Sin embargo, podríamos obtener simultánea-mente ambas constantes sin ningún tipo deaproximación si sometemos al tratamiento deoptimización que hemos considerado anterior-mente, eligiendo correctamente el método deoptimización, análisis estadísticos que permitanla conveniente implantación informática y com-putacional.

Modelos farmacocinéticos.Cinética química

Estos casos poseen una serie de connotacio-nes características que confieren al estudio unespecial atractivo no exento de un alto gradode complejidad14'15.

Podría plantearse una resolución genérica delos distintos modelos (mecanismos de reacciónen el caso de la cinética química) aplicando mé-todos robustos de resolución de sistemas deecuaciones diferenciales cuyas formas explíci-tas pueden ser substituidas por valores numé-ricos discretos. Tras la aplicación secuencial delos modelos que se consideren aplicables so-metidos al tratamiento de optimización y cuida-doso análisis estadístico, podemos deducir quémodelo (o mecanismo de reacción) se ajustamejor a los datos experimentales, aportando, asímismo, los valores de los parámetros farmaco-

13

A. BADÍA, A. DOMÍNGUEZ - GIL, J. GARZÓN

cinéticos (cinéticos y termodinámícos de acti-vación en el caso de la cinética química).

La tarea resulta, por lo general, complica-da e incluso se corre el peligro de intentar dis-cernir entre modelos que con la informaciónpresentada son matemáticamente indiscer-nibles16'17.

Constantes de ionización

El conocimiento de las constantes de ioniza-ción resulta en general de extraordinario valorpues la naturaleza de la especie cuya concen-tración predomina desempeña un papel muyimportante en los procesos de absorción/elimi-nación, en las posibles interacciones con otrasespecies, en la propia acción terapéutica, etc.

La casuística es muy amplia18-19 y en conse-cuencia las funciones a que dan lugar puedentener características dispares. Sin embargo, eltratamiento de los datos experimentales (poten-ciométricos y espectrofotométricos, fundamen-talmente) puede ser realizado siguiendo pun-tualmente los pasos que hemos expuestoanteriormente.

En el caso del cálculo de constantes, nuestraexperiencia particular, tras haber sometido a es-tudio una amplia variedad de substancias, nosindica que son especialmente efectivos los mé-todos de optimización de gradiente y en parti-cular el algoritmo general de descenso contro-lado (AGDC) que nosotros hemos desarrolladoy puesto a punto y que proporciona excelentesresultados en las funciones ensayadas proce-dentes de los campos de la química, física y far-macología.

BIBLIOGRAFÍA

1. Johnson KJ. Numerical methods in chemistry.Nueva York, Marcel Dekker Inc, 1980.

2. Norris AC. Computational chemistry. An introduc-tion to numerical methods. Nueva York, John Wi-ley and Sons, 1981.

3. Wilson S. Chemistry by computen Nueva York, Ple-num Press, 1986.

4. Gerald CF, Wheatley PO. Applied numercial analy-sis. Nueva York, Addison-Wesley Pub. Co, 1984.

5. Bakhvalov N. Métodos numéricos. Madrid, Para-ninfo, 1980.

6. Demidovich BP, Marón IA. Cálculo numérico fun-damental. Madrid, Paraninfo, 1977.

7. Kowalskí BR. Chemometrics: theory and applica-tion. ACS Symposium Series. Washington, Ed. RFGould, 1977.

8. Walsh GR. Methods of optimization. Chichester,John Wiley and Sons, 1975.

9. Mital KV. Métodos de optimización. Limusa, 1984.10. Gilí P, Murray W, Wrigth MH. Practical optimiza-

tion. Orlando, Academic Press, 1981.11. Harwell Subroutine Library. U.K. Atomic Energy

Authority. Oxfordshire, 1986.12. Tallarida RJ, Jacob LS. The dose-response. Nue-

va York, SpríngerA/elag, 1979.13. KenakinTR Pharmacologic analysisof drugrecep-

tor interaction, Nueva York, Raven Press, 1987.14. Casado J, González JL, Moreno MN. React kln Ca-

tal Lett, 1987; 33: 357-62.15. Casado J, González JL, Moreno MN, Sánchez G.

React Kin Catal Lett, 1988; 36: 337-44.16. Vajda S, Rabitz H. J Phys Chem. 1988; 92: 701-7.17. Delforgue J. Math Biosci. 1986; 81: 127-44.18. Meloun M, Havel J, Hogfeldt E. Computation of

solution equilibria. Chichester, John Wiley andSons, 1988.

19. Leggett DJ. Computational methods for the deter-mination of formation constants. Nueva York, Ple-num Press, 1985.

DISCUSIÓN

J. GARZÓN: Quería hacer una pregunta aclara-toria sobre ciertos procedimientos de adapta-ción de datos teóricos a modelos matemáti-cos. Tengo entendido que algunos sistemasutilizan dentro del proceso iterativo un meca-nismo mediante el cual aquellos puntos quese tienden a apartar sistemáticamente de esacurva de ajuste van siendo eliminados o se lesasigna una ponderación cada vez más baja.¿Qué riesgo comportan tales procedimientosde asociar los puntos experimentales a un mo-delo matemático equivocado, despreciandorealmente a otros que pudiesen fijarlos muchomejor?

J. L. GONZÁLEZ - HERNÁNDEZ: Creo que la pre-gunta es muy interesante. Aquellos puntos quesistemáticamente se apartan del comporta-miento esperado después de una replicaciónadecuada de las experiencias deben ser teni-dos en cuenta. En ausencia de error sistemá-tico en el proceso de minimización, por ejem-plo por mínimos cuadrados si es éste elmodelo elegido, existen unos factores de pon-deración estadística que multiplican a los resi-duales al hacer el sumatorio, de tal forma quelos datos que más se separan tienen un fac-tor de ponderación más pequeño ya que seponderan de forma inversa a la desviación.

14

ANÁLISIS COMPUTACIONAL EN FARMACOLOGÍA

A. GARCÍA: Aquí se plantea un problema muy in-teresante y es la actitud a adoptar cuando en unexperimento o serie de experimentos aparecende forma repetida un determinado número deobservaciones que se apartan del comportamien-to habitual. Mi pregunta en concreto es ¿elimi-namos esos datos después de haber hecho va-rias comprobaciones o bien se incluyen todas lasobservaciones en el análisis matemático?

J.L. GONZÁLEZ - HERNÁNDEZ: Esta preguntaincide de nuevo en lo expuesto en mi anteriorintervención. En principio, no soy en absolutopartidario de eliminar ningún punto, si bien estapostura admite ciertas matizaciones. Cada ca-

so debe tratarse de forma individual, analizan-do si el punto que se aparta de la norma tienealguna explicación científica, si es reproduci-ble o bien si se debe simplemente al azar o aalgún problema técnico o de otro tipo.

J.A. GARCÍA - SEVILLA: Particularmente opinoque ante la posibilidad de eliminar puntos o nodebe prevalecer por encima de todo el senti-do común sobre los modelos matemáticos so-fisticados. Puesto que esta cuestión va a plan-tearse en repetidas ocasiones a lo largo de lareunión, creo que es importante definir la pos-tura de cada uno desde el principio a efectosde facilitar la discusión.

15

Análisis estadístico de la curva dosis-respuestaen farmacología: conceptos generales

M. Campillo y M.L. Martín-MateoLaboratorio de Bioestadfetica y Epidemiología. Facultad de Medicina. Universidad Autónoma de Barcelona. Bellaterra,

Barcelona.

La proliferación y vulgarización de los microor-denadores ha supuesto una mayor utilización demodelos de ajuste en todos aquellos supuestosexperimentales englobables en el diseño clási-co de experiencias; tal es el caso de la curvadosis-respuesta. No obstante, este fenómeno noestá exento de graves problemas, entre los quedestacan la falta de control de las condicionesde aplicabilidad de los modelos así como el ol-vido frecuente de su naturaleza y objetivos.

Este hecho conduce a una situación preocu-pante, ya detectada por nuestro laboratorio 1 aprincipios de esta década. Dicha situaciónmuestra cómo el aumento del uso de técnicasestadísticas se acompaña de un crecimiento dela utilización inadecuada de las mismas. Por elloplanteamos la presente ponencia como un re-cordatorio de las bases estadísticas en las quedebe fundamentarse el análisis de los modelos.

Intencionadamente recordaremos los aspec-tos más básicos, pues son los que se vulnerancon más frecuencia, con el fin de suscitar enlo posible el debate posterior.

La ecuación dosis-respuesta como diseñoexperimental clásico

Hipótesis de trabajo

Dentro del diseño experimental clásico debe-mos suponer que el objeto observable de nues-tro interés, la variable y, es una variable aleato-ria continua. Ello quiere decir que, a pesar deque todos los posibles factores que pueden mo-dificar su valor promedio se encuentren fijos ycontrolados, la observación repetida de y con-duce a (y¡), conjunto disperso de valores alre-dedor de otro central y.

En primer lugar debe recordarse que, en unasituación experimental sin errores sistemáticos,dicha dispersión es superior a la precisión de

la técnica de medida y en ningún caso debe asi-milarse a un error. Así, las distintas respuestasobtenidas para una dosis dada no son erróneasfrente a un valor medio determinado, sino queconstituyen la fluctuación natural de la variable.A riesgo de incurrir en una reiteración, si y pre-senta dispersión es porque es una variable. Loopuesto sería considerar y como una constantemedida con imprecisión.

En segundo lugar, el diseño clásico experi-mental modifica una de las condiciones experi-mentales, x, manteniendo el resto constante.

Así, para distintos valores x o niveles de x, do-sis en este caso, se efectúan diversas observa-ciones de la respuesta, de la variable y.

Por lo tanto, en el dominio prefijado de x,{Xi...X|<) se obtienen N valores de y¡j con el ob-jetivo final de observar la posible relación entreambos conjuntos.

En general, dentro de este contexto experi-mental la hipótesis de trabajo es la relación exis-tente entre el efecto medio observado y la va-riación no aleatoria de la dosis.

Modelo

El modelo más básico, punto de partida deelaboraciones posteriores, consiste en analizarla variación de los yy en diversos componentes:

y¡i = Y+ F(x¡) + e¡j

es decir, la variabilidad natural del observablemedida respecto a su correspondiente media.El efecto medio producido al modificar x respe<>_to al valor promedio obtenido y este último Ycomo elemento de referencia.

Hipótesis estadística

Una vez establecida la hipótesis de trabajo, asícomo el modelo que se pretende ajustar, debe

17


los p

or m

i

"tí1

e n

50-

40-

30-

20-

10-

°c

D

ña

5

DñD

10

D

tf7D

15Sej

D

6

20

D

A1—'D

25

D

D

30 35

Fig. 1. Ritmo cardiaco versus inotropía (+).

seleccionarse el conjunto de hipótesis estadís-ticas adecuadas que nos permitan evaluar elriesgo de que dicho modelo no sea debido alazar o diferente a otro posible.

En el caso también más simple de modelo li-neal, los tests estadísticos se engloban dentrodel contexto del análisis de la varianza y de laregresión lineal a la media, característica estaúltima que se olvida muy frecuentemente.

Descomposición de la dispersión globalobservada

En la figura 1 se representa gráficamente unejemplo de lo expuesto hasta el momento utili-zando los datos de la tabla I. En la misma seobserva cómo el observable y posee una varian-za clara para cada situación experimental, de-finida por el valor adjudicado a x. En ningúncaso, por la propia naturaleza del diseño, pue-de considerarse que x posea varianza, ya queno se trata de una variable aleatoria sino de unfactor fijo predeterminado por el experimen-tador.

En la figura 2 se muestra la descomposición delos términos de dispersión. Así, en la figura 2ase describe la variabilidad natural del observa-ble. Dicha dispersión, posee N—K grados de li-bertad, ya que se encuentra referida a los k va-lores y¡ obtenidos en cada situación del rango( X i . . . X k ) .

En la figura 2b se describe la variación de losR efectos medios respecto al valor promedio glo-

60

50-

cE

por

dos

40

30

20

ío-

0Ó Ü 10 15 20 25 30~ 35

Segi

60

50

I 40

10-

00 5 10 15 20 25 30 35

Seg-i

Fig. 2. a) Dispersión intragrupos; b) dispersión entrelas medias.

TABLA IRITMO CARDÍACO* EN FUNCIÓNDE INOTROPÍA POSITIVA MEDIDO

EN GATOS ANESTESIADOS

512189

Inotropía (+) (seg10202217

15 2026 3131 3824 25

-1)25374432

30425233

'Latidos/minuto.

bal Y : En¡ (y¡ — y)2. Por esta razón esta disper-sión posee k-1 grados de libertad.

La hipótesis estadística adecuada en este es-tadio puede plantearse como: ¿Hasta qué puntola varianza de los efectos medios y¡ es superior

18

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA CURVA DOSIS-RESPUESTAEN FARMACOLOGÍA: CONCEPTOS GENERALES

a la varianza propia de la variable y¡¡ en cadacondición experimental x¡?

Este análisis de comparación de varianzas nospermite determinar, con un índice de riesgopreestablecido, si en el rango de dosis estudia-do, (xi...Xk!, se producen significativamenterespuestas medias, y¡ diferentes.

En el ejemplo descrito en la tabla I la varian-za entre los efectos medios es 10,4 veces su-perior a la varianza promedio de cada situaciónexperimental.

Una vez pasado satisfactoriamente este testdeberían analizarse cuáles son los efectos mediosobservados diferentes realmente mediante eltest a posterior/' más adecuado: Tukey, Schef-fe, etc. Después, debe recordarse el objetivo delmodelo: explicitar F (x¡), es decir, analizar losefectos medios y su posible relación con x.

Reiteramos esta idea dada la frecuencia conque se considera toda la dispersión en la con-secución de un modelo. Es evidente que los pa-quetes matemáticos y estadísticos no poseencriterio y ajustan en lo posible la dispersión quese les introduce. No obstante, conceptualmen-te es como mínimo sorprendente que se inten-te evaluar un modelo ajustando una dispersiónaleatoria que se produce en condiciones expe-rimentales constantes.

Explicitación del modelo F (x¡):regresión lineal a la media

Existen dos maneras de abordar el problemade la explicitación del modelo; ambas poseendiferentes ventajas e inconvenientes.

Presunción a prioriLa respuesta previa del modelo que se pre-

tende ajustar implica un conocimiento fisiológi-co y farmacológico del problema que se estu-dia. Por esta razón, puede prefijarse el riesgoa que se asume en su elaboración así como eldel conjunto de hipótesis estadísticas apropia-das para juzgar el cumplimiento de los objeti-vos que persigue el modelo: explicación de lavarianza entre medias de y, y su utilidad en pre-dicciones posteriores.

Dichas condiciones no deben transgredirse apriori aunque no dejan de ser un esquema dereferencia a la hora de establecer conclusiones.

Normalidad de la variable estudiada. Estacondición se traduce en que, en condicionesconstantes, la distribución de valores se corres-ponde a una función gausiana.

Teniendo en cuenta este hecho, la valoraciónde los posibles outliers cambia de perspectiva.Así, existe un 5 % de probabilidades de que enel transcurso de una experiencia se presente unvalor alejado de valor medio en más de 2 desvia-ciones estándar. ¿Es un valor anómalo? No, sen-cillamente el 5 % de los datos cumplen la condi-ción de outliers si presuponemos la normalidad.

Además, su peso en la media está muy pon-derado por el resto de las repeticiones. Eviden-temente si introducimos los datos individualesen el modelo poseerá una influencia no despre-ciable. Sin embargo, sólo aporta información ala dispersión natural y parcialmente al pro-medio.

¿Por qué no repetir experiencias en dicho ni-vel en vez de eliminar un dato que debe apare-cer en una de cada 20 experiencias?

Homocedasticidad. El modelo de regresión li-neal, basado en el esquema ANOVA, se basaen que dentro de cada dosis, x¡, en cada situa-ción experimental, la varianza del observable semantiene constante.

Esta condición se rebate cotidianamente porla experiencia. En general, la varianza es fun-ción del valor de x fijado por el experimentador.

Afortunadamente, este problema sólo reper-cute en dos aspectos:

1. Cuando no puede rechazarse la hipótesisestadística nula porque puede deberse a la he-terocedasticidad. (La diferente dispersión pue-de enmascarar las verdaderas diferencias, so-bre todo porque el número de repeticiones nosupera en general a n = 4.)

2. Cuando mediante una transformación dela variable se logra dicha homocedasticidad.

Es frecuente buscar la transformación que eli-mine este problema. Así, comúnmente se utili-za el logaritmo natural o decimal de la variableo el arcsen cuando el observable constituye untanto por ciento del máximo de respuesta dis-ponible.

Cualquier tipo de transformación se justificaen sí misma si con ella se logra entrar dentrode las condiciones de aplicabilidad. No obstan-te, no debe olvidarse que la regresión, en estecaso, se efectúa sobre la variable transforma-da y no sobre el original.

Por ejemplo, una transformación logarítmicade y incide sobre el hecho que lo que realmen-te se analiza son medias geométricas y no arit-méticas.

Otra cuestión es linealizar la función, proce-so que en la actualidad no tiene demasiado sen-tido debido a la disponibilidad de una gran va-riedad de algoritmos de ajuste no lineal.

19

A. BADlA, A. DOMÍNGUEZ - GIL, J. GARZÓN

Contraste de hipótesis nulas

Sea cual sea el modelo analizado debe efec-tuarse un contraste de hipótesis estadístico ade-cuado que nos permita discernir cada uno delos tres objetivos parciales definidos a la horade generar dicho modelo:

Test de ajuste. En resumidas cuentas, debeanalizarse si la varianza objeto de estudio, quepodemos descomponer en la que explica el mo-delo y la residual, se encuentra suficientemen-te descrita.

En otras palabras, si la varianza explicada su-pera con creces a la residual.

Test de significación. Si dicho cociente no su-pera a lo previsible por el azar.

Ambos tests se encuentran muy interrelacio-nados pero no constituyen, por separado, con-dición necesaria y suficiente de la bondad deun modelo.

Test de utilidad. La elaboración de un mode-lo no constituye únicamente un esquema des-criptivo de la experiencia. En la mayoría de loscasos lo que se pretende es su posterior utili-zación con el fin de precedir efectos mediospara dosis no consideradas.

Debemos destacar que en este contexto, losmodelos sólo pueden predecir efectos mediosy no casos individuales. (Hemos renunciado aexplicar la variabilidad natural.)

Adicionalmente, y no de manera gratuita,debe recalcarse que el modelo sólo es útil den-tro del dominio de valores de x explorado. Esdecir, la,interpolación conlleva un error valora-ble; la extrapolación no tiene sentido.

Comparación de modelos

La comparación de modelos debe efectuar-se a partir de dos aspectos que en principio noson contrapuestos.

En primer lugar debe analizarse la bondad deajuste, y en segundo lugar su utilidad.

En la mayoría de programas de ajuste se va-lora exclusivamente la bondad del mismo en tér-minos de P, probabilidad a posteriori que noconsidera en ningún caso el número de mode-los contrastados simultáneamente.

Presunción a posteriori

Las facilidades que supone la búsqueda auto-mática de un modelo presenta la ventaja de ob-tener el mejor ajuste numérico a la dispersión

administrada. Sin embargo, debe imperar lacautela con el fin de evitar dos grandes proble-mas: a) la obtención de un modelo sin signifi-cado farmacológico claro, y b) el aumento delriesgo de obtener un modelo fruto del azar.

En el caso más simple, es decir en aquél enque los modelos analizados mediante una téc-nica automática fuesen probabilísticamente in-dependientes, el riesgo total, (a), de rechazarla hipótesis nula: no sigue un modelo sino quese adapta a la función «' = (1 — [1 — a]n)siendo a el valor habitual de p = 0,05 y n elnúmero de modelos analizados.

Por ejemplo, el ajuste de diez modelos inde-pendientes cada uno de los cuales se contras-ta estadísticamente con una hipótesis rechaza-ble al 5 %, posee un riesgo total del 40,3 % deque al azar pueda rechazarse la hipótesis nulaal mentos para un modelo.

Modelo lineal: /¿y, = 0x¡ + a

Dentro de la Innumerable gama de posiblesmodelos, el modelo lineal es el de concepciónmás simple debido fundamentalmente a la fa-cilidad de interpretación.

Generalmente, se abusa más de un modelode este tipo de lo que se usa. La razón es sen-cilla y puede resumirse en el hecho de que, amenudo, sus condiciones de aplicabilidad se ol-vidan o se obvian sin análisis previo.

Globalmente el conjunto de condiciones quepermiten contrastar la hipótesis nula de caren-cia de lineabilidad es el mismo que configurancualquier análisis de tipo ANOVA.

Así mismo, no se dispone de ningún progra-ma que efectúe el análisis de utilidad adecua-do, si bien existe un gran número de textos enlos que se detallan los algoritmos y tests ade-cuados para efectuar la comparación entre mo-delos 3"6. Por este motivo expondremos a con-tinuación los fundamentos conceptuales de losmismos.

Paralelismo

El estudio del paralelismo se traduce en lapráctica en la comparación de las pendientesde los modelos lineales ajustados. El test ade-cuado se basa en la hipótesis nula según la cualambas pendientes son valores muéstrales esti-madores de una misma poblacional.

Por lo tanto el test posee una estructura for-mal similar a la comparación de dos mediasmuéstrales de varianzas desconocidas. Es de-cir, la diferencia de pendientes se distribuye se-

20

ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LA CURVA DOSIS-RESPUESTAEN FARMACOLOGÍA: CONCEPTOS GENERALES

gún una función t con una varianza igual al pro-medio de las varianzas estimadas de cada pen-diente.

En el caso de no poder rechazar la igualdadpueden substituirse ambos valores bi y b2 porsu valor promedio, ponderando cada pendien-te por el rango de valores x para el que se haobtenido.

Intercepción

El mismo esquema de análisis debe aplicar-se a la comparación de pendientes así como alcontraste de que la pendiente obtenida no sediferencia del valor cero.

También en este caso la hipótesis nula supo-ne que las pendientes obtenidas no son másque valores muéstrales de una población queposee media poblacional igual a la y, cuya des-viación típica se estima mediante el promediode las desviaciones de las ordenadas en el ori-gen ajustadas.

Igualmente, si no puede rechazarse la hipó-tesis nula de igualdad entre pendientes es pre-ferible utilizar el promedio ponderado de lasmismas como mejor estimador de la pendien-te poblacional.

Unicidad

Una situación que se presenta con cierta fre-cuencia consiste en la obtención de modelos li-neales en condiciones experimentales ligera-mente distintas, por ejemplo, como caso simple,en dos rangos de x diferentes. La hipótesis nulaa contrastar es en este caso si los modelos ob-tenidos no constituyen en realidad más que as-pectos parciales de un único modelo.

De manera simple, la comparación debe efec-tuarse entre el ajuste obtenido para el rango to-tal de x y el promedio del que se obtiene para

los modelos parciales. En los textos referencia-dos se encuentran descritos los test así comolos algoritmos precisos.

También debe apuntarse la idea de que en elcaso de no poder rechazar la hipótesis de uni-cidad es preferible la utilización del modelo úni-co. Entre otras ventajas que supone este esque-ma está el aumentar considerablemente elnúmero de grados de libertad.

Conclusiones

Como conclusiones generales sólo queremoshacer notar la necesidad que tiene todo experi-mentalista de prefijar con claridad cuál es el fe-nómeno que quiere explicar con un modelo, ob-servar si se cumplen las condiciones deaplicabilidad del mismo y evitar en lo posible ladeterminación del modelo basándose como úni-co criterio en el mejor ajuste numérico y en elvalor de P a posteríori.

BIBLIOGRAFÍA

1. Martín M, Sanz F. Efecto de la introducción de laEstadística en el curriculum de Medicina: análisisde una década, 1970-1980. Medicina Clínica 1982;79 (6): 273-276.

2. Kenakin TP, Johnson SF. Eur J Pharmacol 1985;3: 347-354.

3. Kenakin TP. Pharmacologic analysis of drug-receptor interaction. Nueva York, Raven Press,1987.

4. Kleinbaum D, Kupper L. Applied regression analy-sis and other multivariate methods. Boston, Dux-bury, 1978.

5. Berenson ML, Levine DM, Goldstein M. Interme-díate statistical methods ans applications. New Jer-sey, Prentice-Hall Inc, 1983.

6. Afflifi AA, Clark V. Computer aided multivariateanalysis. California Lifetime Learning Pub, 1984.

DISCUSIÓN

R. OBACH: Quisiera continuar con el tema delos outliers. Cuanto se demuestra de forma re-petitiva que efectivamente un punto se sepa-ra sistemáticamente de un presupuesto mo-delo y ello no es atribuible a problemas meto-

dológicos o al menos explicables, ¿cuál es la so-lución más factible? Particularmente, la supre-sión de un punto no me parece razonable encuanto que hay una constatación experimen-tal de que se va repitiendo. En todo caso

deberían probarse otros modelos que justifi-casen o anulasen esta separación. Otra cues-tión es la postura a adoptar y hasta qué pun-to un solo outlier ante una nube de puntosnumerosa puede o no desvirtuar un modelo.

M.L. MARTÍN-MATEO: La importancia del puntoque se separa de la media, que no pretendoexplicar, es posiblemente muy pequeña. Loque ocurre, en general, y éste es el riesgo dela utilización de ordenadores, es que uno in-

21


traduce todos los datos uno a uno y las má-quinas no interpretan en absoluto cuál es lavoluntad de análisis por lo que analizan lo quese les introduzca cuando en realidad lo queel investigador pretende explicar generalmen-te son efectos medios. La solución que a ve-ces se propone consiste en hacer más répli-cas de la dosis en cuestión para que no pesetanto el outlier, pero no eliminarlo.

J.M. PEINADO: En este contexto yo compartola opinión del Dr. García Sevilla en el sentidode que muchas veces lo que importa es el sen-tido común ante un dato que se aparta y queademás muchas veces no es posible repetir,por ejemplo porque no sea factible obtenernuevas muestras para la analítica. Cuando undato de este tipo no tiene ninguna explicaciónexperimental creo que el sentido común obli-ga muchas veces a prescindir del mismo sinque por ello se alteren los resultados. Quisie-ra además hacer un comentario sobre el nú-mero de datos de un experimento. Yo entien-do que cuanto mayor es este número menores el efecto del azar.

M.L MARTÍN-MATEO: La n a la que he hechomención en mi presentación no se refería alnúmero de datos sino al número posible demodelos que se pueden probar. No hay queolvidar que estadísticamente cualquier mo-delo comporta un riesgo de obtener un resul-tado significativo simplemente por azar y cuan-tos más modelos aplicamos mayor es esteriesgo. Esta es la situación cuando no se defi-ne a príorí el número de parámetros.

E. MORCILLO: Quisiera hacer una pregunta,¿cuál es el argumento definitivo para utilizarun análisis matemático en lugar de un análi-sis estadístico de los datos para la construc-ción de una curva dosis-respuesta? Si se haceuna revisión de las comunicaciones en una re-vista científica de farmacología de buena ca-lidad, se puede advertir que la mayoría de losinvestigadores optan en general por presen-tar sus datos de curvas concentración-respuesta simplemente en unos clásicos ejesde coordenadas y yo diría que en un 90 % delos casos se resisten a aplicar un modelo «ma-temático» al cual se ajusten esos datos.

M.L. MARTÍN-MATEO: No tengo dudas sobrela diferencia entre análisis estadístico y análi-sis matemático, el problema es que en gene-ral ambos términos se confunden. La valora-ción de un modelo matemático, aunque quizásería mejor hablar de modelo numérico, estáen la función de que no sea obtenido por azar.En sentido estricto, lo que se establece en un

estudio experimental es un contraste de hipó-tesis que permite valorar únicamente el ries-go de la afirmación que se hace. Normalmentese confunde la determinación de esa proba-bilidad con la determinación de un modelo porla técnica matemática o numérica. El mal usode la estadística a que yo me refería se pro-duce cuando se aplican indiscriminadamen-te multitud de pruebas hasta obtener la signi-ficación deseada o la confusión existente entrecorrelación y regresión.

J.L. GONZÁLEZ: Estoy completamente deacuerdo con el Dr. Martín Mateo sobre el ries-go que entraña trabajar con paquetes estadís-ticos que aplican multitud de pruebas sin quemuchas veces exista una justificación racio-nal para ello. Quisiera además plantear lacuestión de cuál sería la actitud a adoptarcuando dos modelos proporcionan paráme-tros estadísticos coincidentes, ¿cuál deberíaser la actitud del estadístico ante una situa-ción de este tipo?

M.L. MARTÍN-MATEO: En realidad, el que ela-bora la parte estadística de un problema notoma posteriormente decisiones sobre el re-sultado obtenido. Es el investigador que haplanteado la experiencia quien debe interpre-tarlo. Lo que es realmente importante es queel investigador y el estadístico se pongan deacuerdo a príori sobre lo que pretende real-mente el experimento.

A. GARCÍA: Hay muchos tipos de respuestas fi-siológicas que los farmacólogos valoramospero fundamentalmente podrían agruparse endos: unas que son todo o nada y que deno-minamos cuantales y otras que son gradua-les y que podemos monitorizar más finamen-te. Me pregunto si el análisis estadístico deambos tipos de respuesta en curvas dosis-respuesta es extrapolable o por el contrariopresenta diferencias apreciables.

M.L. MARTÍN-MATEO: Efectivamente existen di-ferencias. En el caso de respuestas cuantitati-vas cuantales se recurre a una transformaciónconsistente en la valoración en tanto por cien-to de las veces que se ha presentado. Por tan-to, trabajando no con la variable sino con el por-centaje de veces que ésta ocurre dentro de unamuestra. El problema que existe es que al re-petir una variable dicotómica dentro de unamuestra pequeña, jamás se obtiene una dis-tribución normal en sentido purista sino que ladistribución es binomial. Lo que ocurre es queafortunadamente se puede pasar de una a otracon unos riesgos de error pequeños utilizandotransformaciones matemáticas.

22

Análisis de la respuesta a fármacos agonistasF.J. Morales-Olivas y E. Rubio

Departamento de Farmacología y Farmacotecnia. Universidad de Valencia,

La lectura del título de nuestra intervencióny su comparación con el de la siguiente nos per-miten deducir el concepto más clásico de fár-maco agonista, aquél que, a diferencia del an-tagonista, es capaz de producir respuesta. Sinembargo, hay que añadir que a la luz de los ac-tuales conocimientos farmacológicos esto es sólouna verdad a medias ya que existen antagonis-tas capaces de producir respuestas per se.

Comenzaremos por asumir de forma explíci-ta que fármaco agonista es el que puede pro-ducir respuestas en un sistema biológico y queéstas derivan de la ocupación de receptores. Esdecir, vamos a tratar exclusivamente el análisisde los agonistas desde el punto de vista de lateoría ocupacional.

Los conceptos que vamos a exponer y los pro-cedimientos de cálculo que desarrollaremos sóloserán válidos si se cumplen las siguientes con-diciones: a) las respuestas de los agonistas seestudian mediante la realización de curvasdosis-respuesta de los mismos en «órganos ais-lados»; b) las respuestas del órgano son el re-sultado directo de la interacción entre fármacoy receptor, y c) la concentración de agonista enla biofase es igual a la concentración añadidaal baño de órganos1.

El objetivo que nos proponemos consiste enobtener información de la interacción fármaco-receptor a partir del análisis de las respuestasproducidas por fármacos agonistas. Este proce-dimiento de estudio proporciona datos acercadel comportamiento del fármaco al ocupar unreceptor específico presente en una determina-da proporción en un sistema biológico, el cualposee mecanismos particulares para traducir lainteracción en respuesta. Un agonista puedeproducir diferentes respuestas no sólo en dis-tintos tejidos, sino también en el mismo cuan-do modificamos las circunstancias particularesde un experimento; por ello, no debe empiear-se esta variabilidad para obtener conclusionesacerca del receptor.

Las propiedades que permiten a un fármacoagonista generar respuestas son: a) su capaci-

dad para unirse a un receptor, denominada afi-nidad, y b) su capacidad para ¡nteractuar conel receptor de tal forma que se produzcan res-puestas. Esta segunda propiedad es definida dediferente forma por los distintos autores que pos-tulan la teoría ocupacional. Ambas fueron ini-cialmente definidas por Clark2 y con el análisisde las respuestas a agonistas se intenta cuanti-ficarlas con el fin de clasificar fármacos y, lo quees más importante, predecir su comportamien-to cuando se administran a un ser vivo.

Unión fármaco-receptor

El primer paso de un fármaco para producirrespuesta consiste en su unión con un recep-tor. En 1926, Clark postuló que la unión de pe-queñas moléculas a las membranas celularesse podía describir mediante las isotermas de ad-sorción de Langmuir, las cuales derivan de apli-car la ley de acción de masas al fenómeno deadsorción de los gases a la superficie de los me-tales. Según esta aproximación, la fracción dereceptores ocupados por un fármaco dependede la concentración del mismo y de la constan-te de disociación en equilibrio del complejofármaco-receptor, de acuerdo con la ecuación:

(A-R)/R,=(A)/(A) + KA

donde: (A-R)=concentración de complejosfármaco-receptor; (Reconcentración de re-ceptores totales; (A)=concentración de fárma-co y KA=constante de disociación en equilibrio.

Esta teoría asume que la unión se realiza en-tre una sola molécula de fármaco y otra de re-ceptor, que ésta no modifica la unión de poste-riores moléculas, que la concentración defármaco tampoco se modifica por la unión y quela concentración de éste es mucho mayor quela de receptores ocupados.

El valor de KA coincide con la concentraciónde fármaco que se une al 50% de receptoresy su inversa expresa la afinidad de la substan-cia por el receptor, a menor constante de diso-

23


2

§Q.V)

&

Bw<D13Q.<s><Do:

100

75'

50-

25

100-

50-

A)

/

yB)

/

\/ l

lx lO-io 10-9

//

/ // // /

'/ Eficacia/ « = 0,7

Log concentración

/ // /

/

//

/ ;

DE5 0 |10-8 10-7 10-6 10-

m

om3s?mm

caci

O)Q.II

M

^ B

5 Logconcentración M

Fig. 1. Representación teórica de: A) curvas dosis-respuesta de un agonista total (D) y parcial (E). Rela-ción entre actividad intrínseca (a) y efecto máximo(Emax). B) curvas dosis-respuesta de 2 agonistas (A)y (B). La relación entre sus dosis eficaces 50 expresasu potencia relativa (—log 10~7/10^9). (Tomada deRubio E et al4.)

ciación mayor afinidad y viceversa. Este pará-metro tiene un valor único para un fármaco dadoy un determinado receptor. La valoración de estedato por métodos directos escapa a nuestros ob-jetivos. Nosotros revisaremos su cuantificaciónmediante el análisis de la respuesta a agonistas.

Análisis de la respuesta medianteel modelo de Clark-Ariens

Clark propone que la magnitud de la respues-ta de un fármaco es directamente proporcionala la fracción de receptores ocupados y la res-puesta máxima se obtiene cuando todos los re-ceptores se ocupan. Por ello:

EA /EM = (A)/(A)+KA

Aunque Clark admite que el fármaco debe«activar» el receptor tras haberse unido a él, noexpresa cuantitativamente esta propiedad. Elcálculo de la afinidad mediante la fórmula an-terior proporciona valores muy alejados de losreales y poco útiles para explicar hechos expe-rimentales como la existencia de antagonistas,los cuales se unen al receptor pero no produ-cen respuestas.

Ahens3, tras observar que una serie de fár-macos de parecida estructura química, dan di-ferentes respuestas máximas a pesar de obte-ner con todos ellos curvas dosis-respuestasaturadas, modifica los postulados de Clark ypropone que la respuesta debe considerarse de-pendiente de dos parámetros: a) afinidad queindica capacidad para unirse al receptor y b) ac-tividad intrínseca (a) o capacidad de producirrespuesta tras unirse al receptor. Existen fárma-cos denominados agonistas que poseen ambaspropiedades y otros que carecen de actividadintrínseca y son antagonistas. Ariens modificala ecuación anterior:

EA/EM = a(A)/(A) + KA

La afinidad del fármaco puede deducirse di-rectamente de la representación gráfica de lacurva dosis-respuesta ya que coincide con laDE50. El otro parámetro que caracteriza la res-puesta es el Emax que Ariens utiliza como me-dida de la actividad intrínseca,-de tal forma quele da valor 1 para el fármaco que produce la má-xima respuesta, el valor 0 corresponde a los an-tagonistas y valores entre 0 y 1, como porcen-taje del máximo alcanzado por el agonista total,para los agonistas que producen efecto máxi-mo inferior al de éste. Los fármacos que reúnenestas últimas características son denominados«dualistas» o agonistas parciales (fig. 1).

La actividad intrínseca de un fármaco se uti-liza para medir su eficacia y es el parámetro quesitúa a la cun/a dosis-respuesta sobre el eje deordenadas, de la misma forma que la potenciacalculada a partir de la DE50 lo sitúa en el ejede abscisas. La potencia suele expresarse comoel logaritmo cambiado de signo de la DE50(PD2). Ambos parámetros se consideran inde-pendientes.

Como se observa en la figura 2, la clonidinase comporta como agonista parcial de los recep-tores H2 en la aurícula aislada de cobayo(KA=1,57 xlO-7 M, a=0,43)5. En el útero ais-lado de rata contraído con CIK, la clonidina ac-túa como agonista total (KA = 7 ,6X10~ 4 M,a=l)6 . De acuerdo con la teoría de Ahens, es-

24

ANÁLISIS DE LA RESPUESTA A FÁRMACOS AGONISTAS

g

es1

Z3Q .(/)d>

ce

83

£ct:

100

80-

60-

40-

20-

A)

f1 i/*

1x10-' 4x10-7 l,6xlO-« 6,4xlÓ-« 2,5xlO-5 1x10-*

100-

80-

60-

40-

20-

B)

10-5

—Log (agonista)

IrirmSí• /r

10-4 10-3 10-2

—Log (agonista)

Fig. 2. Curvas dosis-respuesta de histamina ( • ) yclonidina (A) en aurícula aislada de cobayo (A) y úte-ro aislado de rata (B)5-6.

tos resultados indicarían que los receptores his-tamínicos de la aurícula y el útero son diferentes.

Puede decirse que la principal limitación deesta teoría es la necesidad de aceptar que en-tre ocupación de receptores y respuesta existeuna relación lineal y por tanto es necesario ocu-par el 100% de los receptores para obtener unarespuesta máxima. Sin embargo, este modelopermite el cálculo fácil de los parámetros quecaracterizan al fármaco a partir de la represen-tación gráfica de la curva concentración-res-puesta, lo que ha generalizado su uso.

Análisis de la respuesta medianteel modelo de Stephenson y Furchgott

Stephenson7 modificó la teoría clásica al ne-gar la existencia de relación lineal entre núme-ro de receptores ocupados y respuesta, hechocomprobado experimentalmente por Furchgott8

108 1Q7 1Q6 1Q5 1Q4 1Q3 102

Fig. 3. Curvas dosis-respuesta de histamina en colonaislado de cobayo (A) control, ( • ) ( • ) (A) despuésde incubación con fenoxibenzamina 10~~6 con inter-valos de 10 minutos entre ellas.

y Nickerson9 mediante el empleo de bloquea-dores irreversibles.

Stephenson postula: a) la respuesta a un fár-maco es una función positiva (no necesariamen-te lineal) de la ocupación de receptores; b) elefecto máximo de un agonista puede obtener-se sin necesidad de ocupar todos los recepto-res, y c) los diferentes agonistas tienen distintacapacidad de producir respuesta y por tantopueden producir respuestas iguales ocupandoproporciones de receptores desiguales.

La expresión matemática de esta teoría es:

S=e(A.R)/Rt = e(A)/(A)+KAyE A / E M = f ( S ) = f ( [ ] / [ ] K )

donde S es un parámetro denominado estímu-lo y e es la eficacia.

El estímulo se define de forma semejante ala respuesta de Ariens, siendo e la constante querepresenta la capacidad del fármaco de indu-cir estímulo en un tejido.

Nickerson demostró experimentalmente quese podían alcanzar respuestas máximas sin ocu-par todos los receptores. Al exceso de recepto-res no ocupados lo denominó «receptores de re-serva» (spare receptors). Esta hipótesis pone demanifiesto lo inexacto del cálculo de la afinidada partir de la curva dosis-respuesta, ya que paraproducir un efecto 50% del máximo no es ne-cesario ocupar la midad de los receptores(fig. 3).

La dosis eficaz 50% es, en general, un pará-metro con valor más bajo que KA puesto que

25

A. BAOfA, A. DOMÍNGUEZ - GIL, J. GARZÚN

10-7 10-6 ÍO-5 10-4 10-3Concentración (M)

Fig. 4. Representación teórica de la curva dosis-respuesta de un agonista dando diferentes valores asu eficacia (e). La función entre estímulo y respuestase ha definido como una hipérbola rectangular10.

la respuesta que observamos suele ser conse-cuencia de una amplificación del estímulo pro-ducido por el propio tejido estudiado. Mientrasque para Ariens la actividad intrínseca es unapropiedad del fármaco, para Stephenson la efi-cacia depende de éste y del tejido y una mis-ma substancia presenta distintas eficacias paradiferentes tejidos. En este modelo la potenciadepende de la afinidad y la eficacia; es posiblever que para un fármaco con una KA dada, lacurva concentración-respuesta varía en su situa-ción respecto de los ejes de coordenadas paradistintos valores de eficacia (fig. 4).

Furchgott revisó los anteriores planteamien-tos e introdujo el concepto de eficacia intrínse-ca como un valor dependiente de ia eficacia delfármaco y los receptores totales del tejido:e=e/R|. Así, la respuesta a un fármaco agonis-ta queda definida como una función de la con-centración de éste (A), los receptores del tejido(Rt), su capacidad para producir estímulos (e)y su afinidad por el receptor (1/KA).

Respuesta =f (e R,/1 + KA/[A])

Ésta es la ecuación básica que define la res-puesta a los fármacos según la teoría ocupacio-nal. Dicha respuesta va a depender de variablesdel tejido como concentración de receptores enel tejido y capacidad del mismo para transfor-mar estímulos en respuestas (f), y de variablesdel fármaco como su constante de disociacióny su eficacia intrínseca; estos valores son carac-terísticos para un agonista y es necesaria su

cuantificacion para poder clasificar fármacos yreceptores con independencia del tejido o deltipo de respuesta estudiados.

A continuación pasamos a describir las apro-ximaciones que se utilizan para la cuantificacionde KA Kp y a partir de la respuesta observadacon un fármaco en un tejido aislado.

Métodos para cuantificar la afinidad

Podemos distinguir dos casos distintos:1. Agonista total, ahora definido como fárma-

co capaz de producir respuestas con una bajaproporción de receptores ocupados. Se calculala KA mediante la comparación de curvas con-centración-respuesta, obtenidas en un tejidodado para el agonista solo y en presencia de unbloqueante irreversible de receptores. Cuandose obtienen respuestas iguales en ambas situa-ciones se produce la misma ocupación de re-ceptores y por tanto:

=(A')/(A')+KA-q

siendo (A) y (A') las concentraciones de fárma-co que producen igual respuesta en ausenciay presencia del bloqueante irreversible y q lafracción de receptores no ocupados irreversible-mente, es decir disponible para ejercer efectos.

La transformación doble recíproca de estaecuación se ajusta a una recta cuya pendientesería 1/q y su ordenada (l-q)/q KA y por tan-to KA se podría obtener así:

KA=pendiente — 1/ordenada

En la figura 3 se muestra la respuesta a his-tamina en colon aislado de cobayo en presen-cia del bloqueante irreversible fenoxibenzami-na, lo que permite calcular la KA de histamina(l,2xlO~5 M) mientras que el valor de DE50 es3,2xlCH5 M1. Estos resultados coinciden conlos descritos previamente en íleon de cobayo12.

2. Agonista parcial, entendido como el fárma-co capaz de producir respuestas máximas me-nores que las producidas por el agonista puro.Dada su baja eficacia deben ocupar la totalidadde los receptores para alcanzar ese efecto má-ximo; esta característica permite definirlos tam-bién como fármacos con pocos receptores dereserva en un tejido. En algunos casos la rela-ción entre fracción de ocupación y respuesta seaproxima a la lineaüdad y la DE50 es cercana ala KA.

Cuanto más se aleje de la linealidad la rela-ción entre fracción de ocupación y respuesta,

26


más inexacta será la estimación de KA a partirde la DE50 y habrá que emplear otros métodosde cálculo. Sería posible utilizar el sistema des-crito para agonistas puros, pero Waud13 desa-rrolla otro más simple basado en la compara-ción de respuestas iguales producidas por unoy otro agonista, las cuales corresponden a estí-mulos ¡guales. Por ello:

eA(A)/KA+(A) = ep(P)/Kp

donde eA y ep son las eficacias del agonista to-tal y parcial, (A) y (P) las concentraciones queproducen igual respuesta y KA y Kp las constan-tes de disociación en equilibrio.

Simplificando la anterior ecuación y hacien-do una transformación doble recíproca tenemosque: Kp=pendiente/ordenada, lo que permitesu cálculo aun sin conocer el valor de KA. Si loconociésemos es posible el cálculo por mediode la ecuación14:

KP=KA ([AP] - [Ai]) (Ai)

Siendo (Ai) y (Pi) las concentraciones deagonista total y parcial que producen el mismoefecto y (Ap) la concentración de agonista puroque produce efecto igual al máximo del parcial.

Métodos para calcular la eficacia

Anteriormente se ha comentado el cálculo deactividad intrínseca según Ariens. En el mode-lo de Stephenson nos encontramos con un pa-rámetro (capacidad para producir estímulos)sólo cuantificable por métodos indirectos; porello, este autor atribuye un valor arbitrario de1 al estímulo que produce una respuesta mi-tad de la máxima del tejido:

l=e A (DE5o)/(DE5o) + KA y por tantoeA = (DE5O) + KA/(DE5o)

Para los agonistas totales, la eficacia vendríaexpresada como la relación entre constante dedisociación y dosis eficaz 50. Estos valores pre-sentan los mismos inconvenientes que los deactividad intrínseca a la hora de emplearlos paraclasificar fármacos y receptores, puesto que enúltima instancia trabajamos con un parámetroque depende de fármaco y tejido.

Dado que el cálculo de la eficacia intrínsecatampoco se puede llevar a cabo por métodosdirectos, Furchgott calcula la eficacia relativa.

10-9 10-8 10-7 10-6 10-5

Concentración (M)

0 20 40 60 80 100

Ocupación (%)

100

80

60

40-

20-

C)

1 10 100

Ocupación (%)

Fig. 5. Efecto de 3 agonistas (F=fenilefrina,O=oximetazolina, N=nafazolina) en aorta aislada derata. A) Curvas dosis-respuesta; B) curvas ocupación-respuesta, y C) representación semílogarftmica de B11.

27


Para ello se requiere el conocimiento previo dela constante de disociación de los agonistas acomparar y la representación de la fracción deocupación frente a la respuesta, porcentuadasobre la máxima obtenida. El cociente entre lasfracciones de ocupación de los agonistas parauna respuesta dada, generalmente la 50%, delos agonistas determina la eficacia relativa(fig. 5).

Una estimación del «orden de eficacias rela-tivas» para 2 agonistas se puede obtener tam-bién a partir de la transformación doble-recípro-ca de la ecuación:

BIBLIOGRAFÍA

que corresponde a una línea de regresión cuyaordenada en el origen es

KA-(1-CB/ÍA)

cuando la ordenada tiene valor negativo ee > «Ay viceversa15.

Conclusión

La aproximación de Ariens para el cálculo delos parámetros que caracterizan la respuesta aun agonista es válida por su sencillez, pero esnecesario ser conscientes de sus limitacionespara clasificar fármacos y receptores.

Otros métodos más complicados para el cál-culo de KA y eficacia relativa resultan impres-cindibles para el estudio de receptores y tienenla ventaja de poder predecir el comportamien-to de un agonista en situaciones especiales deutilización en el organismo vivo. Un buen ejem-plo es el empleo a largo plazo de agonistas be-taadrenérgicos, cuya respuesta puede estar in-fluida por regulación a la baja (down-regulation)de su sistema receptor.

1. Kenakin TP. The classification of drugs and drugreceptors in isolated tissues. Pharmacol Rev 1984;36: 165-222.

2. Clark A l The antagonism of acetylcholine by atro-pine. J Physiol (Lond) 1926; 61: 547-556.

3. Ariens EJ. Affinity and intrinsic activity in the theoryof competitive inhibition. Arch Int PharmacodynTher 1954; 99: 32-49.

4. Rubio E, Morales-Olivas FJ. Mecanismo de acción(2a parte). En: Esplugues J, ed. Farmacología Ge-neral, Valencia, Saber 1982; 219-232.

5. Rubio E, Esplugues J, Morales-Olivas FJ, Morci-llo E. Interaction between histamine and clonidi-ne in isolated guinea-pig atria. J Pharmacol (Pa-rís) 1982; 13: 299-305.

6. Rubio E, Morales-Olivas FJ, Morcillo E, Esplu-gues J. Effect of clonídine in the isolated uterusof the rat. En: Botari S, Thomas JP, Vokaer A, Vo-kaer R, eds. Uterine contractility. Nueva York, Mas-son Publishing USA, 1984; 224-229.

7. Stephenson RR A modification of receptor theory.Br J Pharmac 1956; 11: 379-393.

8. Furchgott RF. The pharmacology of vascularsmooth muscle. Pharmacol Rev 1955; 7: 183-265.

9. Nickerson M. Receptor occupancy and tissue res-ponse. Nature 1956; 158: 697-698.

10. Kenakin TP. Drug receptor theory. En: Kenakin TPed. Pharmacologic analysis of drug-receptor in-teraction. New York, Raven Press, 1987; 1-30.

11. Aguilar MJ, Morales-Olivas FJ, Rubio E. Pharma-cological investigation into the effects of histami-ne and histamine analogueson guinea-pig and ratcolon in vitro. Br J Pharmac 1986; 88: 501-506.

12. Ruffolo RR. Importantconceptsof receptor theory.J Auton Pharmac 1982; 2: 277-295.

13. Waud DR. On the measurement of the affinity ofpartial agonists for receptors. J Pharmacol ExpTher 1969; 170: 117-122.

14. Tallarida RJ, Jacob I_S. Kinetics of drug-receptorinteraction: interpreting dose-response data. EnTallarida RJ, Jacob LS ed. The dose-response re-lation in Pharmacology. Nueva York, Springer-Verlag, 1979; 49-84.

15. Kenakin TP. Agonist efficacy. En: Kenakin TP, ed.Pharmacologic analysis of drug-receptor interac-tion. Nueva York, Raven Press, 1987; 183-204.

APÉNDICES

Unión fármaco-receptor

La unión fármaco-receptor puede ser descritacomo:

5 [AR]K2

donde Ki y K2 son las constantes de la veloci-dad de asociación y disociación, respectivamen-te; [A]: concentración de fármaco libre; [R]: con-centración de receptores libres; [A-R]: concentra-ción de complejos fármaco-receptor.

La velocidad de formación de complejosfármaco-receptor en un momento dado viene

28

expresada por:

1. « J A R U i A H R l - M A R ]5 t

en condiciones de equilibrio

<5[AR]

5t-=O y entonces

2. Ki [A][R]=K2[AR]

Si denominamos Rt a la concentración totalde receptores

3. [R,] = [R] + [AR]

y substituyendo en 2.

4. [A ] [R t ] - [A ] [AR] = K2/Ki [AR]

Si substituimos K2/Ki por KA y reducimos

5. [AR]_ [A]

[Rtl

Cálculo de la afinidad


haciendo una transformación doble recíprocay reduciendo:

J__J_ _̂ j_ l j4.

Si enfrentamos 1/[A'] con 1/[A] podremosajustar una recta cuya ordenada en origen es1/KA-l-q/q y la pendiente 1/q y portante KApuede calcularse como:

5. KA=pendiente - 1ordenada

Determinación de la KA de un agonista parcial

A) Si denominamos A y P al agonista total yparcial respectivamente, el estímulo producidopor estos fármacos según Furchgott sería:

c £A [A] [Rt]O.

7. SP =

[A] + KA

eP [P] [Rt]

[A] + KP

Cuando comparamos la respuesta de ambosagonistas en un mismo preparado, si elegimosrespuestas iguales, se debe cumplir que el es-tímulo producido por ambos fármacos es igual,

íasí:

Determinación de la KA de un agonistatotal, mediante el uso de bloqueantesirreversibles

El estímulo producido por un agonista segúnFurchgott, sería:

„ 6A [A] [Rt]1.

KA

Cuando se bloquea una cantidad de recep-tores, habrá una fracción «q» de receptores dis-ponibles y el estímulo producido ahora por elagonista sería:

'1 [Rtq]2.

Si comparamos respuestas iguales obtenidasantes [Rt] y después del bloqueo [Rt q] de re-ceptores, el estímulo debe ser el mismo y portanto igualando 1 y 2:

3. [A] [A1]

KA KA• q

6A [A] [R,]_eP [P] [Rt]

[A] + KA ~ [A] + KP

Si hacemos una transformación doble recípro-ca y reducimos:

9.J

[A] ~ eP • KA ' [P] + KA eP

Si enfrentamos 1/[P] con 1/[A] podemosajustar una recta cuya ordenada en origen es1/KA (CA/ÉP—1) y la pendiente eA/eP • KP/KA ypor tanto

10.ordenada

Este procedimiento tiene el inconveniente deque no permite el cálculo de KP si no conoce-mos las eficacias intrínsecas de ambos fárma-cos, el valor de Kp se calcula por aproximación:

pendiente11. Kp = — —

ordenada

29


El valor obtenido será tanto más próximo alreal cuanto la CA > > ep ya que la ecuación(10) quedaría multiplicada por un número muypróximo a 1.

B) Si conocemos por algún procedimiento laKA, el cálculo de Kp se puede realizar de for-ma más fácil comparando las concentracionesde fármaco agonista total que consigue un efec-to igual al máximo del agonista parcial y otraconcentración de ambos fármacos que produz-ca igual respuesta. Así:

agonista parcial y por tanto:

16.

17. o:

ep =6A [Ap]

[Ap] + KA

-= 1 +ep

KA

[AP]

12. Sp = ep[PR][R,]

Para otro punto de las curvas con igual nivelde respuesta, los estímulos serán iguales y

eA [A¡] eP [P,]

Asumiendo que el agonista parcial producela respuesta máxima cuando se ocupan todoslos receptores:

18.

despejando:

19. e

[A¡]+KA [P¡] + KP

13.

14. y

15. si

[PR]

[R.]

[PÍ]

[A,] il += 1

S A =eA [AP]

[AP] + KA

substituyendo:

20. 1+7 /7 =[AP][P¡]

siendo Ap la concentración de fármaco A queproduce una respuesta igual a la máxima del

DISCUSIÓN

por tanto:

21.

[A,] • [P,] + l

KA ([AP] - [A,]) [P¡]

[A,] ([AP] + KA)

J. GARZÓN: Quisiera comentar dos aspectos enrelación con la excelente presentación del Dr.Morales. El primero se refiere al hecho de queuna substancia puede comportarse como unagonista parcial frente a otra en un determi-nado sistema pero ser prácticamente indetec-table la diferencia entre ambas en un sistemadistinto. Es típico el caso de lo que ocurre des-pués de la ocupación de un receptor que pro-duce cambios a nivel de AMP cíclico y poste-riormente libera un neurotransmisor. Es muyposible que una substancia pueda actuarcomo agonista parcial en comparación conotras en cuanto a sus efectos sobre el AMPcy sin embargo comportarse como un agonis-ta total en cuanto a la liberación de neurotrans-misión. Por tanto, la eficacia va a ser muy re-lativa en función del sistema estudiado. Es muydifícil llegar a obtener los valores absolutos deese parámetro.

La otra cuestión es que aun cuando se tratede un compuesto considerado agonista par-cial, es arriesgado asumir que el efecto me-dio se corresponda con su KA.

F.J. MORALES: Respecto a la primera cuestión,estoy absolutamente de acuerdo con el Dr.Garzón. Indudablemente deben tenerse encuenta las influencias de los tejidos sobre lasrespuestas y la diferencia entre lo que se pro-duce en la interacción fármaco-receptor y loque después somos capaces de medir.En cuanto a la segunda cuestión, indudable-men asegurar que es posible encontrar unasubstancia que aunque sea un agonista parcialcoincida milimétricamente —si se me permitela expresión— su KA con la dosificación 50 esun poco arriesgado, pero parece fácilmenteasumible que en el caso de agonistas parcia-les con una baja actividad intrínseca, es decircon necesidades de ocupación del 100% opróximas al 100% con los cuales por tanto vaser imposible conseguir respuestas máximascomparables con las del agonista total, estamosen condiciones de teorizar que la respuesta má-xima producida por ese fármaco es consecuen-cia de la ocupación del 100% de los recepto-res y, por tanto, podemos asumir con bastantecerteza que la DE50 es muy próxima a la KA,

30


aunque ello no implica necesariamente quesean numéricamente coincidentes.

J. FLÓREZ: Una reflexión y una pregunta. Encuanto a la reflexión, da la impresión de que enla interpretación del término «eficacia» se vanteniendo en cuenta mecanismos molecularesde acciones de los fármacos. Evidentemente,éste es un terreno movedizo de conceptoscambiantes. Y ¿qué sucede en los sistemas enlos que se dispone de antagonistas irreversi-bles o de fijadores irreversibles para poder su-primir o valorar esos receptores de reserva?

FJ. MORALES: En cuanto a la reflexión estoyabsolutamente de acuerdo y es demostrativoel hecho de que el concepto de afinidad hapermanecido invariable en el tiempo durantemás de 60 años, mientras que el concepto deeficacia es cambiante, y cada vez está influi-do por más factores.Con respecto a la segunda pregunta, y segúnlos métodos que yo he podido revisar, no esposible calcular la KA en un experimento far-macológico de órgano aislado tradicional si nodisponemos de un bloqueante irreversible entanto que tenemos que conocer datos de quéocurre antes y después de la posible ocupa-ción de todos los receptores.

A. GARCÍA: Una pregunta de tipo práctico.¿Cómo cuantificar el efecto de un agonista, porejemplo la acción inotrópica positiva del iso-proterenol y de otro agonista que actúa sobreotro receptor distinto pero que produce tam-bién un efecto inotrópico positivo, por ejem-plo un activador de los canales de calcio, elBAY K 8644, que incrementa sobre el efectomáximo del isoproterenol la respuesta máxi-ma? No sería un agonista parcial sino un «su-praagonismo». Uno se queda con la duda decómo expresar o cómo cuantificar el efecto deeste otro agonista que, por supuesto, actúasobre otro receptor o la interacción entre 2agonistas que actúan sobre distintos recepto-res pero que producen una respuesta supraa-ditiva. Creo que este tipo de valoración esca-pa a los conceptos que usted ha expresado.

FJ. MORALES: Es indudable que ese tipo devaloración escapa a los conceptos que yo heexpresado aquí por una sencilla razón. Noso-tros partimos de un planteamiento estricta-mente ocupacional en el cual los fármacos seunen con receptores en unas condiciones, en-tre las cuales se incluyen que la unión entreel fármaco y el receptor no modifica al propioreceptor, que la unión del fármaco con el re-ceptor no modifica la unión de posteriores mo-léculas, es decir, nos basamos en la teoría

ocupacional clásica. Indudablemente la valoraciónde una interacción entre 2 substancias que es-tán actuando por dos mecanismos receptorialesdiferentes, teniendo en cuenta además queuno de los dos mecanismos receptoriales pue-de consistir en un aumento de permeabilidadiónica al calcio y que este catión probablementese aparta del concepto interacción fármaco-receptor en términos estrictos; por lo tanto, estavaloración escapa a nuestro planteamiento.

E. RUBIO: Al igual que comentaba el Prof. Fló-rez en su intervención sobre las interpretacio-nes cambiantes del término «eficacia», nocabe duda de que la interpretación de la teo-ría de receptores está también sometida acambios. En este sentido, me gustaría plan-tear una cuestión ¿cómo encajan lo que ac-tualmente denominamos «agonistas inversos»dentro de la teoría ocupacional?

A. BADÍA: Respecto a los agonistas inversos, loque se sugiere es que posiblemente el hechoque produzcan un efecto contrario al que pro-duce un agonista normal se explique por unestado inicial del tejido o preparación que con-dicione una respuesta inversa, y es posibleque estos nuevos conceptos, junto con argu-mentos clásicos básicos de la teoría ocupacio-nal, permitan explicar bien esto.

J.A. GARCÍA-SEVILLA: La pregunta va en el mis-mo sentido que la formulada por la Dra. Ru-bio. Quisiera señalar además que existen ago-nistas inversos que no parten de un dintelnecesario, por ejemplo ansiógenos puros queson agonistas inversos de los receptores debenzodiacepinas. Y mi cuestión en concretose refiere a si este tipo de hallazgos van a mo-dificar la propia estructura de estudio de lacurva dosis-respuesta, considerando que so-bre un mismo sistema puede actuar un ago-nista inverso, un agonista clásico y cómo ven-drán modificadas las eficacias respectivas. Ysi agonistas que denominamos «parciales» so-bre ciertos sistemas no pueden ser en reali-dad fármacos modulados por agonistas in-versos.

FJ. MORALES: Me da la sensación de que larespuesta nos la ha dado el Dr. Badía por an-ticipado. Es algo que indudablemente no setiene en cuenta hasta hace unos años en quese empieza a postular la existencia de los ago-nistas inversos y tímidamente se inicia un in-tento de adaptación de la teoría ocupacionalpara explicar este tipo de fenómenos. Pero to-davía no tengo datos de una formulación pre-cisa respecto a la aplicación de este tipo decálculos para los agonistas inversos.

31

Caracterización y cuantificación del antagonismofarmacológicoJ. Salles y A. Badía

Departamento de Farmacología y Psiquiatría. Universitat Autónoma de Barcelona.

Introducción

La inhibición o prevención de las respuestasinducidas por agonistas se denomina antago-nismo farmacológico, y a los agentes químicosque poseen estas propiedades se les denomi-na antagonistas. Los antagonistas se puedenclasificar de acuerdo con su cinética de interac-ción con los receptores. Así por ejemplo, un an-tagonista puede disociarse rápidamente del re-ceptor produciendo un antagonismo reversible,o bien formar un enlace covalente con el recep-tor (por ejemplo, agentes alquilantes) para pro-ducir un antagonismo irreversible. De forma si-milar, el antagonismo irreversible puede tam-bién conseguirse por antagonistas que si bienno alquilan los receptores, se disocian muy len-tamente de ellos (antagonismo seudoirreversi-ble). Sin embargo, se considera que la clasifi-cación de los antagonistas debe realizarse sobrela base de los mecanismos moleculares por losque antagonizan las respuestas de los agonis-tas. De acuerdo con esto se pueden establecercuatro mecanismos generales por los cuales unantagonista puede inhibir la respuesta de unagonista.

En primer lugar, un fármaco puede interac-cionar químicamente con el agonista y de estaforma prevenir la activación del receptor y portanto la respuesta subsiguiente asociada; estemecanismo se denomina antagonismo quími-co o neutralización.

En segundo lugar, el antagonista se puedeunir al mismo lugar de reconocimiento del re-ceptor que el agonista e inhibir las respuestasdel mismo; a este mecanismo se le denominaantagonismo competitivo.

En tercer lugar, el antagonista se puede unira un lugar del receptor distinto de la zona dereconocimiento del agonista, pero a través deun mecanismo alostérico u otro puede prevenirla activación del receptor por el agonista; a este

mecanismo se le ha denominado antagonismono competitivo.

Finalmente, el antagonista puede interferir enalgunos procesos subsiguientes a la activacióndel receptor por el agonista, inhibiendo la res-puesta; este mecanismo se denomina antago-nismo fisiológico o antagonismo funcional.

Las tres primeras categorías pueden ser des-critas mediante modelos matemáticos relativa-mente sencillos, mientras que la cuarta clase deantagonismo puede tener una amplia variedadde mecanismos y por tanto pueden manifestar-se diferentes efectos sobre las curvas concentra-ción-respuesta del agonista. En este capítulo seperfilarán brevemente estos tipos de antagonis-mo, y se hará especial hincapié en el antago-nismo competitivo reversible.

Antagonismo químico

El antagonista no produce sus efectos en vir-tud de una interacción con moléculas del orga-nismo, sino como resultado de una reacción quí-mica con el agonista. En consecuencia éstepierde su capacidad para desarrollar su efecto(«antagonismo por neutralización»). El antago-nismo de la actividad anticoagulante de la he-parina por la protamina puede servir comoejemplo: así la protamina, una proteína de bajopeso molecular con gran carácter básico, secombina con la heparina (de fuerte carácter áci-do) formando una sal estable, disminuyendo laconcentración libre de heparina y por tanto suactividad anticoagulante.

El principio del antagonismo por neutraliza-ción se ha utilizado extensamente en el trata-miento de las intoxicaciones causadas por me-tales pesados (por ejemplo, la acción del dimer-caprol frente a los compuestos de arsénico).

El modelo matemático que nos permitiría co-nocer la fracción de fármaco libre en presencia

33

A. 6A3ÍA, A. DOMÍNGUEZ • GIL, J. GARZÓN

de una determinada concentración de antago-nista es el de la interacción reversible entre unfármaco y sus lugares de unión en las proteí-nas plasmáticas.

Antagonismo competitivo reversible

La condición en la cual el agonista y el anta-gonista se unen reversiblemente a los mismossitios de reconocimiento del receptor, y de estemodo cuando ambos se encuentran presentescompiten por tales sitios, se denomina antago-nismo competitivo reversible. Gaddum1 propu-so las ecuaciones originales que predicen losefectos cuantitativos de un antagonista de estetipo sobre las curvas concentración-respuestade un agonista.

Si consideramos las reacciones en equilibrioque describen la interacción de un agonista [A]y un antagonista competitivo [B] con los recep-tores libres [R]:

l Af [AR]

KLBR].

2B

donde Ki y K2 son las constantes de velocidadde asociación y disociación de A o B por el re-ceptor, y [AR] y [BR] son los complejos forma-dos, receptor agonista y antagonista, respecti-vamente.

Por otro lado, si la población total de recep-tores viene dada por la suma de receptores li-bres [R] y receptores ocupados, tendremos:

1. [AR] + [BR]

Cuando se alcanza la situación de equilibrio,la velocidad de asociación o formación de loscomplejos será igual a la velocidad de disocia-ción de los mismos:

2. [A] • [R] = K2A • [AR]

despejando [R] en la ecuación j y substituyen-do en la ecuación 2 tendremos:

KIA • [A] • {[Rt] - [AR] - [BR]]=K2A • [AR]

ésta reordenada, da:

3. [BR]= 1-

[AR]

[Rtl [Rt]

donde KA=K 2 A /K IA

1 +_KA_

[A]

Una ecuación análoga a la ecuación 3 pue-de obtenerse para la interacción en el equilibrio

entre [B] y [R], y substituyendo la expresión deltipo [BR]/[Rt] en la ecuación 3 tenemos:

KB [AR][B] [Rt]

1 +[A]

1-KB

[B]- 1

donde KB es la constante de disociación en elequilibrio para el antagonista.

La reordenación de la ecuación anterior pro-porciona la ecuación clásica para el antagonis-mo competitivo derivada por Gaddum1:

4. [_m [A]

[Rt] ~~ [A] + KA(1+[B]/KB)

Ésta nos ofrece la fracción de receptores ocu-pados por un agonista ([AR]/[Rt]) para cual-quier concentración de agonista y antagonista.Esta ecuación predice que en presencia de unantagonista competitivo la fracción de recepto-res ocupados por el agonista será menor queen ausencia del antagonista, y esto es lógicopuesto que la condición definida es que ambosfármacos compiten por los mismos receptores.

En 1937, Clark y Raventós2 sugirieron paraestimar ia potencia antagonista de un fármaco«determinar la concentración de antagonistaque produce un aumento seleccionado de laconcentración de agonista necesario para in-ducir un determinado efecto». Esta sugerenciacontiene la base del método aplicado posterior-mente por Schild para el estudio del antagonis-mo competitivo de fármacos.

Medida de la potencia de un antagonista:regresión de Schild3

La estimación se realiza a partir de las con-centraciones de agonista necesarias para pro-ducir respuestas iguales en el tejido, en ausen-cia y presencia del antagonista. Para describirlos efectos de un antagonista competitivo sobrelas respuestas a un amplio rango de concen-traciones de agonista se utiliza el concepto derazón o razones de dosis, que se definen comolos múltiplos del incremento en la concentraciónde agonista requerida para alcanzar una res-puesta dada, al aumentar progresivamente laconcentración de antagonista.

Si consideramos la ocupación de un recep-tor por un agonista [A] en ausencia de antago-nista ([B] = 0) de acuerdo con la ley de acciónde masas tendremos:

JAR]_[Rt]

[A]KA + [A]

34

CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACIÚN DEL ANTAGONISMO FARMACOLÓGICO

En presencia de antagonista, y tomando unaconcentración de agonista [A'] que produzca unamisma respuesta que [A], puesto que presumi-blemente y de acuerdo con la teoría de la ocu-pación deberá ocupar la misma fracción de re-ceptores, tendremos:

[AR]

[Rt]

[A1]

K A ( 1 + [ B ] / K B )

La relación de concentraciones equiactivas deagonista en presencia y ausencia de antagonis-ta (razón de dosis) viene dada por [A']/[A]. Asíigualando las dos ecuaciones anteriores (igualesrespuestas igual fracción de receptores ocupa-dos) tendremos:

[A1]

1AT[B]

Esta ecuación cuantifica la relación existenteentre el incremento en la concentración de ago-nista requerida para producir respuestas igua-les en presencia de concentraciones crecientesde antagonista. Como puede observarse, la mag-nitud de la razón de dosis depende de dos fac-tores: a) la concentración del antagonista [B], yb) la constante de disociación en el equilibrio KB

o afinidad del antagonista por el receptor. Pues-to que la concentración de antagonista es cono-cida y la razón de dosis se determina experimen-talmente, es posible calcular la constante dedisociación del antagonista. Esto normalmentese realiza convirtiendo la ecuación en su formalogarítmica:

log (d r - l ) = l o g [ B ] - log KB

La recta definida por esta ecuación es deno-minada recta de Schild.

Este tipo de análisis tiene dos aplicaciones es-pecíficas; la primera tiene como finalidad deter-minar la naturaleza competitiva del antagonismoy el cálculo de la constante de afinidad del anta-gonista; la segunda sirve como indicador de es-tados estacionarios de no equilibrio con respec-to a la homogeneidad de la población dereceptores, los mecanismos de disposición de losfármacos en el tejido, o de múltiples propieda-des del fármaco. Estas últimas propiedades sediscutirán específicamente en la próxima sección.

Si una regresión de log (dr-1) sobre log [B]es lineal y tiene una pendiente de la unidadquiere decir que presumiblemente el antagonis-mo es competitivo, es decir el agonista y el an-tagonista compiten por los mismos sitios de re-

conocimiento en el receptor, y entonces la in-tersección de la recta con el eje de abscisas re-presenta —log KB (PKB); se trata de una esti-mación de la constante de afinidad delantagonista por el receptor. El término pKe esel valor de —log B cuando la razón de dosis esigual a 2; por lo tanto, esto corresponde al va-lor de pA2, un parámetro empírico definidocomo el logaritmo negativo de la concentraciónmolar de antagonista que produce una relaciónde dosis de 2. Como puede observarse de laecuación de Schild, el valor de pKs se corres-ponde con el valor de pA2, ahora bien, lo con-trario no siempre es cierto. Sólo cuando la re-gresión de Schild es lineal y tiene una pendienteigual a la unidad el valor de pA2 representa laestimación de la constante de disociación en elequilibrio del antagonista.

El mejor método para determinar la potenciade un antagonista se realiza valorando los efec-tos del mismo sobre la curva completa concen-tración-respuesta del agonista. De este modo,tras la obtención de la curva para el agonista,éste es eliminado por repetidos lavados del te-jido, y se incuba con una concentración cono-cida de antagonista y se vuelve a repetir la cur-va para el agonista. Normalmente, el antagonis-ta si es competitivo produce un desplazamien-to a la derecha de la curva concentración-res-puesta al agonista. Bajo estas circunstancias,la relación de dosis equiactivas es independien-te del nivel de respuesta. Estas razones de do-sis, expresadas como log (dr-1), si se enfren-tan a log [B] por un análisis de regresión lineal,se obtiene la llamada recta de Schild que nospermite calcular los valores de la pendiente yla constante de afinidad del antagonista por elreceptor (fig. 1).

Un aspecto práctico concierne al rango deconcentraciones de antagonista usado. Aunquees preferible usar un rango tan amplio como seaposible para obtener mayores fracciones de re-ceptores ocupados, y también definir los lími-tes del antagonismo competitivo, en general,concentraciones altas del antagonista puedenproducir efectos no específicos que interfierancon dicho antagonismo.

En determinados tipos de experimentos, enlos que es difícil poder realizar varias curvasconcentración-respuesta con el agonista, bienporque no se puede eliminar dicho agonista ensu totalidad tras sucesivos lavados, bien porquela corta vida del preparado no lo permite, sepuede utilizar el siguiente método alternativopreviamente descrito por Davis et al4 y poste-riormente desarrollado en nuestro laboratorio5.

35

A. BADiA, A. DOMÍNGUEZ • GIL, J. GARZÓN

Dicho procedimiento consiste en realizar unacurva concentración-respuesta con el agonistatras la cual se puede recuperar el estado basaldel preparado por la adición acumulativa del an-tagonista, con lo que se puede obtener a su vezuna curva concentración-respuesta de recupe-ración para el antagonista (fig. 2). Mediante elcálculo por interpolación en la curva control delas concentraciones de agonista equivalentes ala respuesta recuperada es posible determinarpara cada preparado varias razones de dosisque nos permitan elaborar la correspondienterecta de Schild, y con ello obtener los valoresde la pendiente y la constante de afinidad delantagonista por el receptor.

Regresiones con pendientes diferentesde la unidad

El hecho de que los datos experimentales seajusten a la ecuación de Schild con pendientesdiferentes de la unidad puede significar que nosencontremos en una de las siguientes situacio-nes: a) el antagonismo no es competitivo; b) lanaturaleza competitiva del antagonismo está en-mascarada por algún mecanismo de disposicióndel fármaco, o algún mecanismo que produzcaestados estacionarios fuera del equilibrio; c) seejerce el antagonismo competitivo sobre dos ti-pos de receptores (población heterogénea de re-

ñg. 1. Antagonismo delas curvas concentra-ción••respuesta de feni-letrina por prazosín enla porción epididimaldel conducto deferen-te de rata. ( • - • )control; (A—A) en pre-sencia de 3 nM deprazosín; ( • — • ) enpresencia de 10 nM deprazosín y (O- -O) enpresencia de 30 nM deprazosín. En el recua-dro aparece la regre-sión de Schild para elcálculo del pA2.

ceptores) los cuales desarrollan al activarse lamisma respuesta en el tejido, y d) otras propie-dades de los fármacos que dependen de lasconcentraciones utilizadas al realizar la valora-ción. En general, la primera alternativa se con-sidera sólo después de la eliminación de losotros supuestos.

Utilización del análisis de Schildpara detectar estados estacionariosde no equilibrio6 7

La ecuación de Schild, como comentamos an-teriormente, define la relación entre el despla-zamiento a la derecha de la curva concentra-ción-respuesta al agonista y la concentración deantagonista. De esta forma, puede ser un indi-cador muy sensible de los efectos secundarios(además de los efectos sobre el receptor) de losfármacos (el agonista y/o el antagonista).

En general, se sabe que muchos tejidos po-seen mecanismos de eliminación del agonistade la biofase, produciendo una subestimaciónde la potencia del agonista. La detección de es-tos mecanismos es fundamental en el análisisde receptores, y pueden obviarse farmacológi-camente por inclusión en el medio de incuba-ción de un inhibidor del proceso de eliminacióndel agonista. Un aspecto práctico es la detec-ción del proceso cuando no se dispone del in-hibidor. Si el proceso de eliminación (por ejem-

36

CARACTERIZACIÓN ¥ CUANTIFICACION DEL ANTAGONISMO FARMACOLÓGICO

pío la recaptación neuronal) es saturable, po-demos aproximarnos al problema mediante elanálisis de Schild. Así, en ausencia de antago-nista, en un tejido con mecanismos de elimina-ción del agonista, la curva concentración -respuesta se produce sobre la base de la con-centración remanente o residual de agonista.En presencia del antagonista al tener que utili-zar concentraciones más elevadas del agonis-ta, éstas pueden ser suficientes para saturar elproceso de eliminación del agonista, producién-dose una subestimación del antagonismo. Enefecto, la sensibilización del tejido al agonistaal saturarse el proceso de eliminación provocaque el antagonismo sea abolido parcialmente,lo cual produce razones de dosis más bajas quelas predecidas por la ecuación de Schild y pen-dientes menores de la unidad.

Existen estados estacionarios de no equilibrioque pueden producir regresiones con pendien-tes mayores de la unidad. Por ejemplo, la elec-ción inadecuada del período de tiempo de in-cubación del antagonista con el receptorproduce estas regresiones. Ello se debe a quela velocidad de asociación del antagonista al re-ceptor es concentración-dependiente, por lotanto las concentraciones bajas requieren unmayor tiempo de incubación que las concentra-ciones altas para alcanzar el equilibrio. Así, elefecto de las dosis bajas puede subestimarsede forma considerable mientras que esto no su-cede en las dosis altas. Este tipo de error se tra-duce en un aumento de la pendiente de la rec-ta de Schild.

De cualquier forma, existen también situaci-cones en las cuales estos estados estacionariosde no equilibrio pueden producir rectas deSchild con pendientes iguales a la unidad. Unasituación de este tipo se presenta cuando el pe-ríodo de incubación para el antagonista es in-suficiente debido a que la difusión del antago-nista a la biofase es un paso limitante. Lasregresiones son lineales, con pendientes de va-lor próximo a la unidad, pero desplazadas a laderecha.

Antagonismo de una poblaciónheterogénea de receptores67

El antagonismo competitivo asume que se en-cuentran en equilibrio el agonista, el antagonistay una población homogénea de receptores. Si,de cualquier forma, la población de receptoresresponsables de la respuesta es heterogéneacon respecto a la unión del agonista o antago-nista, o ambos, se pueden obtener desviacio-nes de la ecuación de Schild.

1

Clonidina

3

•

10 ID 30 1()0

•300 1.0(

Yohimbina

DOnM

100 n

50

- 9 - 8 - 7 - 6

Log concentración (M)

Fig. 2. Curvas concentración-respuesta del efecto in-hibidor de la respuesta contráctil inducida por esti-mulación eléctrica de la porción prostática del con-ducto deferente de rata tras la activación de losadrenoceptores <*,? presinápticos por clonidina y suantagonismo por yohimbina.

El caso más típico es aquél en el que la re-gresión de Schild para un antagonista varía alcambiar el agonista con el que se realiza lacurva.

Si consideramos, por ejemplo, un tejido condos tipos de receptores que al activarse produ-cen el mismo tipo de respuesta, un agonista queestimula ambos receptores con igual o diferen-te afinidad y/o actividad intrínseca, y asumimosque los estímulos son aditivos, la localización (alo largo del eje de las x) y la pendiente de la rectade Schild para un determinado antagonista de-penderá de: a) el estímulo relativo de los recep-

37


Porción prostética Porción epididimal

Respuestas (%)

1001

50

Respuestas (%)1001

Noradrenalina

A — A St-587

A A

6 5 4

-Log (M)

7 6 5-Log (M)

Fig. 3. Respuesta contráctil inducida por el agonista parcial de los adrenoceptores ai, St-587, y la noradrenali-na sobre las porciones prostática y epididimal del conducto deferente de rata.

tores activados por el agonista (la afinidad y ac-tividad intrínseca relativa del agonista por cadareceptor); b) la afinidad relativa del antagonistapor cada receptor, y c) las proporciones relati-vas de cada receptor (así como la eficiencia deacoplamiento).

En general, esto produce rectas de Schildcompuestas de porciones lineales con pendien-tes de la unidad y porciones no lineales de pen-dientes menores a la unidad. Dos hechos nota-bles destacan de estas regresiones: el primeroes que la localización de la recta de Schild de-pende de la importancia relativa de los dos ti-pos de receptores y esto no sólo está relaciona-do con la densidad de cada uno de ellos sinotambién con la eficacia de los mecanismos deacoplamiento a la respuesta de cada receptor;el segundo es que estas regresiones contienenuna porción considerable que es lineal, lo cualpuede producir errores de interpretación. Estetipo de error puede subsanarse midiendo razo-nes de dosis menores de 10 y así determinarla posible no linealidad.

Detección de otras propiedadesde los fármacos

Generalmente se asume que un fármaco tie-ne una actividad primaria y se le considera comoselectivo. Sin embargo, existen fármacos que tie-nen varias propiedades que son aparentes o ma-nifiestas en el mismo rango de concentraciones.La regresión de Schild puede ser útil para de-tectar este tipo de casos.

Un ejemplo claro es el de la amitriptilina, lacual en un mismo margen de concentración in-hibe la recaptación neuronal de ciertos agonis-tas a-adrenérgicos, y es un antagonista a-adre-nérgico. Como resultado de esto, la sensibiliza-ción del tejido al agonista que podría producirla amitriptilina (al inhibir el mecanismo de eli-minación del agonista) queda suprimida por lapotencia de este compuesto como antagonistaa-adrenérgico. La regresión de Schild puede serútil para diferenciar un mecanismo de otro. Así,si estudiamos el antagonismo de las curvas con-centración-respuesta para un agonista a-adre-

38

CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL ANTAGONISMO FARMACOLÓGICO

Fig. 4. Antagonis-mo de las curvasconcentración-res-puesta de fenilefri-na por el agonistaparcial de los adre-noceptores a¡, St-587, en la porciónprostética del con-ducto deferente derata. ( • — • ) con-trol; (Ó—O) en pre-sencia de 1 ¿iM deSt-587; ( A - A ) enpresencia de 3 fiMde St-587yA-Aen presencia delOfiM de St-587.En el recuadro apa-rece la regresiónde Schild para elcálculo del pA2.

i n n

rol

c

sta m

áxim

a co

nire

spue en O

Por

cent

aje

de

0 -

i/jl/i

- 6 - 5 - 4 - 3Log concentración (M)

i ,

í í 0,5-X

jf 0-

-0,5-

/

- 6 - 5

Log (antagonista)

nérglco por un antagonista conocido en presen-cia deamitriptilina, observaremos una disminu-ción de la potencia del antagonista conocido, locual nos estará indicando la segunda propiedadde la amitriptilina8.

Antagonismo competitivo por agonistasparciales

Los agonistas parciales se definen como fár-macos que producen respuestas del tejido sub-maximales y que antagonizan competitivamentelos efectos de los agonistas de mayor actividadintrínseca (véase el capítulo anterior de esta mo-nografía). Debe remarcarse que el efecto esti-mulante del agonista parcial debe obtenerse conlas mismas concentraciones que produce el an-tagonismo, puesto que ambas resultan de la in-teracción del agonista parcial con el receptor. Enla figura 3 se muestra la actividad agonista par-cial de una imidazolina, como el St-587, sobrelos adrenoceptores «i en la porción epidimidaldel conducto deferente de rata. En la misma fi-gura puede verse la ineficacia de este compues-to para estimular la porción prostática del mis-mo órgano. Este diferente comportamiento delSt-587 en cada una de las porciones del con-ducto deferente de rata es consecuencia de lasdiferencias en la eficiencia de los mecanismosde acoplamiento estímulo-respuesta en cada

uno de los tejidos. De este modo, en un tejidocomo la porción prostática, es posible determi-nar la constante de afinidad para el agonista par-cial mediante el análisis de Schild9 (fig. 4).

Un método utilizado para evitar los errores enla estimación de la constante de afinidad delagonista parcial a partir de la curva concentra-ción-respuesta que genera consiste en deprimirparcialmente la capacidad de respuesta del te-jido (por ejemplo, alquilación parcial de la po-blación de receptores) de forma que el agonis-ta parcial no produzca respuesta, mientras seconserve la respuesta a un agonista de mayoractividad intrínseca. Llegados a este punto esposible cuantificar la constante de afinidad delagonista parcial mediante el análisis de Schildya que se comportará como un antagonistacompetitivo10.

Antagonismo irreversible

Se considera antagonismo irreversible al queno puede ser revertido por sucesivos lavados deltejido con solución nutricia libre de antagonis-ta. Un efecto de este tipo se observa con los an-tagonistas que forman un enlace químico conel receptor; por ejemplo, las /3-haloalquilaminasforman especies reactivas cuando se encuen-tran en solución (iones aciridinio) que alquilandiversas proteínas. La característica del antago-nismo irreversible es su dependencia con res-

39


pecto al tiempo, de forma que cuanto mayor esel contacto del antagonista con el tejido mayores la magnitud del antagonismo observado. Yaque la velocidad de disociación de los comple-jos formados es insignificante comparada conla velocidad de asociación, el grado de alquila-ción del receptor es tiempo-dependiente. Porlo tanto, todas las estimaciones de la potenciadel antagonista han de tener en cuenta el tiem-po de incubación. Los antagonistas irreversiblesproducen efectos sobre las curvas concentra-ción-respuesta al agonista similares a los anta-gonistas no competitivos, una depresión delefecto máximo que no es remontable al aumen-tar la concentración de agonista. De cualquierforma, no puede hacerse una estimación de laconstante de afinidad del antagonista irreversi-ble por el receptor, puesto que no se llega a al-canzar el equilibrio termodinámico durante eltranscurso del experimento farmacológico. Ade-más, las estimaciones suelen ser también tejido-dependiente, no receptor-dependiente; debidoa la velocidad de difusión en el tejido, forma-ción especies reactivas, etc.

Antagonismo no competitivo

Otro tipo de antagonismo de la respuestadel agonista es la producida por la interaccióndel antagonista con un lugar íntimamente rela-cionado con el receptor, pero distinto del de re-conocimiento del agonista, con lo que anula laacción del agonista. Contrariamente al antago-nismo competitivo, en el cual un exceso en laconcentración de agonista permite una ocupa-ción máxima de los receptores en presencia delantagonista, el antagonista no competitivo pro-duce una depresión del efecto máximo de lascurvas concentración-respuesta al agonista, esdecir no es remontable. Esta depresión puedeutilizarse para determinar la afinidad del anta-gonista no competitivo. En cualquier caso, losefectos resultantes sobre las respuestas del ago-nista en diversos tejidos pueden diferir consi-derablemente, debido a ios efectos de la dis-tinta eficiencia de acoplamiento estímulo-res-puesta entre ellos.

La actividad de un antagonista no competiti-vo se expresa como el valor de pD'2, definidocomo el logaritmo negativo de la concentraciónmolar de antagonista que produce una reduc-ción del 50% de la respuesta del agonista.

Antagonismo funcional

Se habla de antagonismo funcional o fisioló-gico cuando 2 agonistas, ¡nteractuando con sus

propios receptores, causan efectos que se con-trarrestan, y éstos se producen sobre el mismosistema efector. El nombre de antagonismo fun-cional se utilizó originalmente para la relaciónantagónica de los impulsos nerviosos simpáti-cos y parasimpáticos sobre un órgano efector.El análisis cuantitativo de las interacciones fun-cionales es difícil y complicado, pero se puedeconseguir en algunos casos (para más informa-ción véase Kenakin, 198711). De todas formas,el uso de las interacciones funcionales se ha uti-lizado como estrategia para producir modifica-ciones importantes de la respuesta primaria aun agonista; en general la respuesta puede serbloqueada o potenciada. Frecuentemente seutiliza el antagonista funcional para deprimir larespuesta del órgano a un agonista parcial (perono a un agonista de mayor actividad intrínse-ca) de forma que en esta situación se compor-te como un antagonista competitivo y podamosdeterminar la constante de afinidad del mismomediante el análisis de Schild, tal y como se hacomentado en apartados anteriores.

BIBLIOGRAFÍA

1. Gaddum JH. The quantitative effects of antago-nistic drugs. J Physiol 1937; 89: 7-9.

2. Clark AJ, Raventós J. The antagonism of acety-Icholine and of quaternary ammonium salts. QuartJ Exp Physiol 1937; 26: 375-392.

3. Arunlakshana O, Schild HO. Some quantitativeuses of drug antagonists. Br J Pharmacol 1959;14: 48-58.

4. Davies C, Conolly ME, Greenacre JK. 0-adrenoceptors in human lung, bronchus andlymphocytes. Br J Clin Pharmacol 1980; 10:425-432.

5. Badía A, Bermejo P, Jane F. Pre- and postsynap-tic effects of sulpiride in the rat isolated vas defe-rens. J Pharm Pharmacol 1982; 34: 266-268.

6. Kenakin TP. Schild regressions as indicators ofnon-equilibrium steady-states and heterogeneousreceptor populations. Trends Pharmacol Sci 1985;6: 68-71.

7. Kenakin TP. The classification of drugs and drugreceptors in isolated tissues. Pharmacol Rev 1984;36: 165-221.

8. Kenakin TP, Beek D. The measurement of anta-gonist potency and the importance of selective ¡n-hibition of agonist uptake processes. J Pharma-col ExpTher 1981; 219: 112-120.

40

CARACTERIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL ANTAGONISMO FARMACOLÓGICO

9. Badía A, Salles J. Effects of St-587 on the a2 and«i-adrenoceptors in the bisected rat vas defe-rens. 1988 (en preparación).

10. Kenakin TP, Beek D. The measurement of the re-lative efficacy of agonists by selective potentiationof tissue responses: studies with ¡soprenaline and

prenalterol in cardiac tissue. J Auton Pharmacol1984; 4: 153-159.

11. Kenakin TP. Functional antagonism and syner-gism. En: Kenakin TP, ed. Pharmacological analy-sis of drug-receptor interaction. Nueva York, Ra-ven Press, 1987: 245-257.

DISCUSIÓN

J. GARZÓN: Está claro que de la exposición delDr. Salles se desprende que la utilidad de losantagonistas en la definición de las caracte-rísticas de los receptores queda bastante limi-tada a unas condiciones tipo. Un aspecto queme interesa particularmente es la determina-ción de la constante de afinidad. El métodoclásico del pA2 a través del cual puede cono-cerse esta constante ¿da resultados compara-bles a lo expuesto anteriormente con el blo-queo en situaciones de receptores de reserva?El interés de esta cuestión radica en que el usode antagonistas sólo es posible en determina-dos sistemas o preparaciones.

J. SALLES: La estimación de la potencia del an-tagonista no dependerá de la eficiencia de losmecanismos de acoplamiento del receptor ala respuesta, puesto que siempre medimosefectos iguales. Esto dependerá en todo casode la potencia del antagonista, de su constantede disociación y de la concentración utiliza-da; es decir, que el nivel de reactividad del te-jido no influirá la estimación de la constantede afinidad del antagonista.

A. GARCÍA: Yo vuelvo a insistir en cuestiones detipo práctico. Por ejemplo, cuando el agonis-ta es el calcio ¿se puede hacer un análisis si-milar de la valoración de varios calcioantago-nistas que actúan por distintos mecanismosaplicando la fórmula de Schild y determinan-do el pA2, por ejemplo en el caso del diltia-cem, el verapamil, la cinaricina o de una dihi-dropiridina como la nifedipina? Me imaginoque sí se podrá hacer, pero ¿es correcto eseanálisis?

J. SALLES: Solamente sería correcto si los di-versos antagonistas del calcio actuaran exac-tamente en el mismo lugar dentro de los me-canismos reguladores de la entrada de calcio.

A. GARCÍA: Es evidente que en este caso el con-cepto de receptor no se puede aplicar a estemecanismo farmacológico porque estos agen-tes actúan en distintos lugares dentro de la es-tructura macromolecular del canal del calcioque todavía no están muy precisados, y en rea-

lidad no son en rigor calcioantagonistas, sim-plemente favorecen la apertura o el cierre decanales del calcio, regulando de esta forma lacantidad de calcio accesible a la maquinariacontráctil. Por eso me preguntaba si éste se-ría un buen mecanismo para analizar farma-cológicamente.

A. BADÍA: Quisiera hacer un comentario. Creoque es bastante importante el que se puedanaplicar los conceptos básicos de la ley de ac-ción de masas a la interacción entre el fárma-co y el receptor. Me imagino que en el casode los antagonistas del calcio la complejidadde la interacción es bastante mayor. Esto nodescarta que pueda estimarse un pA2 apro-ximado y éste pueda ser utilizado como índi-ce de potencia, pero sin pretender afirmar querealmente exprese un concepto de afinidad delfármaco por el receptor.

P. SÁNCHEZ-BLÁZQUEZ: Simplemente unaaclaración. Es bien sabido que el uso de an-tagonistas es uno de los métodos más utiliza-dos para discriminar entre receptores y se hadescrito también que distintos receptores pue-den estar presentes en proporciones diferen-tes en los diversos tejidos. Quisiera saber enopinión del Dr. Salles ¿cuál sería el mejor abor-daje cuando existen varios tipos de recepto-res y se dispone de un antagonista que tam-bién es capaz de unirse a varios de ellos y condistintas afinidades?

J. SALLES: Creo que el mejor abordaje consis-tiría en recurrir a estudios de desplazamientode la fijación específica de un radioligando, porejemplo un antagonista que no fuera especí-fico por ninguno de los dos tipos de recepto-res, que marcara a ambos.

J.M. BAEYENS: Quisiera volver de nuevo a lacuestión suscitada por el Dr. García. Nosotrosen Granada llevamos a cabo un estudio dise-ñado para evaluar si los gráficos de Schild po-dían obtenerse valorando el antagonismo dela contracción inducida por calcio, en tejidodespolarizado con potasio, en presencia de ve-rapamil y diltiacem. Y los resultados fueron

41

A. 3ADÍA, A. DOMÍNGUEZ - SIL, J. GARZÓN

bastante curiosos porque aparentemente exis-te un antagonismo competitivo, puesto que seobserva un desplazamiento hacia la derechade la curva dosis-respuesta, pero al hacer unanálisis de Schild las pendientes no sonde 1 sino que son inferiores en los 2 casos es-tudiados, verapamil y diltiacem. Una revisiónde los estudios parecidos a nivel vascular conestos 2 fármacos reveló que curiosamente se

encontraban desde antagonistas competiti-vos prácticamente puros, con pendientesde 1, hasta antagonismos no competitivospero también con pendiente de 1. Indudable-mente este aspecto merece ser estudiado conmayor detalle.

J. SALLES: Posiblemente se trata de un anta-gonismo de tipo funcional cuyo análisis es máscomplicado.

42

Estudios de fijación y discriminaciónde receptores

J. GarzónInstituto Cajal, CSIC, Madrid.

Introducción

La teoría de los receptores, inicialmente pro-puesta y más tarde demostrada por la investi-gación farmacológica, ha servido de base al di-seño y realización de numerosos estudios. Sinembargo, la interpretación correcta de los da-tos experimentales está condicionada al cono-cimiento de los sucesos moleculares que tienenlugar entre el estímulo farmacológico (activacióndel receptor por el agonista) y la respuesta delsistema. En este sentido, la heterogeneidad deciertos receptores ha sido sugerida en base alorden de potencia de agonistas, estructuralmen-te relacionados, en diferentes sistemas experi-mentales. El estudio de las posibles causas deesta actividad diferencial, intra e intersistemas,de los agonistas ha sido objeto de numerosostrabajos, así en base a conceptos como «eficien-cia», «eficacia intrínseca» y «receptores de re-serva» se han justificado algunas de estas dife-rencias sin necesidad de asumir más de unúnico receptor1. Por otra parte, aunque los an-tagonistas competitivos son posiblemente las he-rramientas farmacológicas más eficaces en elestudio de los tipos de los receptores, si no po-seen la selectividad necesaria su utilización pue-de conducir a interpretaciones erróneas de losresultados2. Las interacciones entre sinergistasconstituyen una alternativa válida en situacio-nes semejantes3. Dentro de este marco, los es-tudios de fijación de radioligandos constituyen,junto con los farmacológicos, el procedimientomás adecuado para la demostración de los di-ferentes tipos de los receptores. Estos estudiospueden proporcionar una gran información; noobstante, a pesar de su aparente sencillez, conmucha frecuencia se cometen errores que re-percuten negativamente en el análisis e inter-pretación de los datos experimentales. En las si-guientes líneas describiremos sucintamente losdiferente pasos que deben seguirse hasta laeventual demostración de los tipos de un re-ceptor.

Estudios de fijación: requisitos básicos

Los elementos esenciales de estos estudiosson tres: el ligando, el receptor y las condicio-nes de incubación. En el apartado del ligandohay que considerar: criterios de selección, es-tabilidad metabólica, isótopo y pureza químicay física. Su selección debe realizarse a partir desu perfil farmacológico (potencia agonista o an-tagonista y selectividad), además ha de conser-var su integridad en el medio de incubación. Eltritio [3H] y el yodo [125I] se presentan como losisótopos más recomendables, el primero se be-neficia de su fácil incorporación, de no perturbarla actividad del ligando, de su alta estabilidad

y larga vida media, al tiempo que facilita activi-dades específicas superiores a los 50 Ci/mmol.El 125I proporciona actividades específicas muyelevadas, más de 1.000 Ci/mmol, se incorporaúnicamente a grupos hidroxiloaromáticos pu-diendo alterar el comportamiento de la molécu-la; además su vida media es de apenas unas4 semanas. Otros isótopos, 14C y 32S, no pro-porcionan niveles aceptables de actividad espe-cífica por lo que no son válidos para detectarlas pequeñas concentraciones en que los recep-tores se hallan en los tejidos biológicos. La pu-reza química del ligando debe conocerse conprecisión y no ser inferior a un 90-95 %, el gra-do de pureza física determina la fracción del ra-dioligando que es susceptible de unirse al re-ceptor (mezclas racémlcas). La actividadespecífica y la potencia (afinidad por el recep-tor) son propiedades del ligando que trabajanjuntas. Cuanto mejores sean estos parámetrosmenor será la calidad potencialmente detecta-ble del radioligando unido al receptor. Debeprestarse especial atención a aquellos experi-mentos en que se utilicen ligandos muy poten-tes a elevadas concentraciones y/o concentra-ciones de receptores igualmente elevadas(cercanas o superiores a la Kd); en estas circuns-tancias se aumenta extraordinariamente el me-noscabo de la forma libre del radioligando, y si

43


bien se favorece la detección de lo unido a re-ceptor (relación unido/libre elevada) se hace in-dispensable la determinación de la concentra-ción libre real, de otro modo el análisismatemático posterior tendría un inicio seriamen-te viciado.

Respecto al tejido portador del receptor, po-demos considerar la preparación y el fracciona-miento. La homogenización es el procedimien-to más utilizado para obtener una preparaciónsusceptible de distribuirse uniformemente conel radioligando en el medio de incubación. Espreciso realizarla sin alterar las propiedades delos componentes proteicos y entornos lipidíeosque determinan la estructura y función de losreceptores. Esta preparación se lava y preincu-ba a temperaturas medias (25° C) o altas (37°C)a fin de eliminar fracciones solubles y ligandosendógenos que pudieran interferir durante la In-cubación. El almacenamiento del homogenadosólo debe realizarse cuando no conlleva altera-ciones en sus propiedades. Así mismo, la can-tidad de receptores presentes en el medio deincubación ha de estar comprendida en la «zonalineal», es decir, en aquel rango de concentra-ciones de los receptores en el que la unión es-pecífica del radioligando varía según una rela-ción lineal. La utilización de concentracionesbajas de los receptores aleja el riesgo de secues-tro del ligando libre por el receptor, pero dismi-nuye la posibilidad de detectar la fracción uni-da al receptor. Por el contrario, las cantidadeselevadas favorecen la detección al tiempo quedisminuyen la adsorción del radioligando, sinembargo aumentan el secuestro específico einespecífico de la forma libre e incluso puedeninferir con el proceso de separación de las for-mas libre y unida al receptor (filtración lenta).Por otra parte, el patrón de fijación del radioli-gando ha de coincidir con la distribución delefecto farmacológico mediado por el receptor,siendo éste un criterio de gran importancia ala hora de conceptuar los lugares de unión comoreceptores. En este sentido, los receptores delos neurotransmisores son más abundantes en eltejido nervioso, en la substancia gris que en lablanca y dentro del fraccionamiento subcelular,su mayor densidad se asocia a la fracción ricaen sinaptosomas. Como criterios adicionales hayque señalar el de saturabilidad del receptor porconcentraciones crecientes del radioligando, y elde esteroselectividad en aquellos casos en quelos isómeros correspondientes sean disponibles.

Además de los factores considerados hastaahora, las condiciones de la incubación vienendeterminadas por el volumen total, pH, medio

iónico, temperatura y tiempo de incubación. Elvolumen se suele ajustar en función de las posi-bilidades de detección de la forma unida, igual-mente se puede recurrir a elevados volúmenescon la finalidad de reducir en lo posible el se-cuestro de la forma libre en favor de la unida.La mayoría de los ensayos tienen su pH óptimoen el rango 7-8. La temperatura más usual es22-25° C, la de 0o C es adecuada cuando seutilizan ligandos susceptibles de sufrir degrada-ción enzimática, 37° C es poco utilizada ya quelas afinidades suelen ser peores que a 25° C.La elección del medio iónico se justifica en fun-ción del fin perseguido, por ejemplo optimizarla formación del complejo ligando-receptor, di-ferenciar diferentes clases de ligandos aunqueesto conlleve pérdida de afinidad (caso de ago-nistas y antagonistas con el Na+ y el GTP). Delos tres tipos básicos de experimentos de fijación(saturación, competición y cinéticos), en los dosprimeros se precisa alcanzar el equilibrio, es de-cir que la formación por unidad de tiempo, delcomplejo ligando-receptor iguale a la disociación,mientras que los estudios cinéticos consisten enun seguimiento de la formación o desaparicióndel complejo dependiente del tiempo. El tiem-po de incubación necesario para alcanzar el equi-librio es tanto menor cuanto mayor sea la tem-peratura (mayor movilidad molecular) y mayorla concentración de radioligando y/o receptor(mayor probabilidad de encontrar una moléculade ligando disponible o un receptor vacío). Paraunas determinadas condiciones de incubación,el tiempo requerido para alcanzar el equilibriodebe determinarse estudiando la menor de lasconcentraciones a utilizar. La separación de lasformas libre y fijada al receptor, antes de alcan-zar el equilibrio, implica la determinación erró-nea de las Kds y Kis. A fin de establecer la vali-dez de ias Kds es conveniente comparar lashalladas en los estudios de saturación con el co-ciente k_i/ki que se obtiene en estudios de aso-ciación y disociación.

Las técnicas principales de separación de laforma libre de la fijada se pueden resumir en tres:diálisis en equilibrio, centrifugación y filtración.Las dos primeras son recomendables en situa-ciones en que el radioligando presenta baja afi-nidad por el receptor. La diálisis requiere eleva-das cantidades de tejido a fin de poner demanifiesto la unión específica sobre el fondo dela forma libre de ambas células en el equilibrio.La centrifugación, presenta la desventaja de unosblancos elevados debido a la imposibilidad deeliminar la forma libre atrapada en el entrama-do del «pellet», por tanto, la relación específi-

44

ESTUDIOS DE FIJACIÓN Y DISCRIMINACIÓN DE RECEPTORES

co/inespecífico no es muy favorable. La filtra-ción es el método más utilizado, por su mayorsimplicidad y sencillez, la relación específi-co/inespecífico es más favorable que en los ca-sos anteriores. Como desventaja se puede ar-gumentar la pérdida de una fracción dereceptores a través de los filtros, además se re-quiere que el ligando tenga buena afinidad porel receptor (intervalo medio-bajo nanomolar)puesto que la utilización de elevadas cantida-des de homogenado enlentece la filtración fa-voreciendo la disociación del complejo ligando-receptor durante los lavados del filtro para eli-minar la forma libre residual.

Demostración de los tipos de un receptor:diseño experimental

Son varias las aproximaciones experimenta-les potencialmente útiles a este fin: 1. Utiliza-ción de un radioligando que posea prácticamen-te afinidades idénticas por los receptores enestudio. Para soslayar las dificultades inheren-tes a la posible formación por los agonistas delcomplejo ternario en la membrana celular(ligando-receptor-trasductor) es deseable queéste sea un antagonista. La validez de esta apro-ximación depende del cumplimiento de los re-quisitos hasta ahora enunciados y en particu-lar que: a) el radioligando y los competidoresse unan al receptor de forma reversible y sin al-terar las propiedades de ambas partes; b) que lacinética de unión obedezca los principios bási-cos de la ley de acción de masas; c) que las con-diciones experimentales favorezcan la conser-vación de la forma libre del radioligando porencima del 95 % de la cantidad inicial total enel sistema; e) que, siempre que pueda dispo-nerse de ellas, es recomendable utilizar prepa-raciones que contengan un único tipo de recep-tor para poder verificar que en éstas se cumplenlos requisitos anteriores. 2. El uso de radioligan-dos altamente selectivos de uno u otro tipo delreceptor es adecuado cuando se conoce la exis-tencia de los diferentes tipos y lo que se deseaes determinar su distribución en diferentes ór-ganos y estructuras. 3. Si el interés se centraen la distribución o demostración de un únicotipo en una especie animal o estructura, se uti-liza un radioligando no selectivo al que se le im-pide el acceso a los otros tipos mediante el blo-queo secuencia!*. Los ligandos bloqueantes noprecisan ser muy potentes pero sí deben poseeruna gran selectividad (al menos dos órdenes demagnitud) para reducir el riesgo de competicióncon el radioligando por el receptor en estudio. 4.Los ligandos irreversibles son difíciles de mane-

jar en el bloqueo secuencial, es difícil llegar abloquear completamente un tipo del receptorsin que se produzca la reducción de otro dis-tinto. No obstante, son de gran utilidad en es-tudios de autoprotección y protección cruzadadirigidos a demostrar la multiplicidad de recep-tores5'6.

Análisis matemático de los datosexperimentales

Este análisis, asistido por ordenador, presentala ventaja de su rapidez y precisión, al tiempoque se evita la subjetividad de las aproximacio-nes gráficas tradicionales. Se precisa: a) un mo-delo matemático que describa la situación ex-perimental; b) un procedimiento que facilite elproceso del ajuste de los datos experimentalesal modelo, ye) unos métodos objetivos que per-mitan verificar la validez del ajuste. Los pará-metros que generalmente se ajustan son las afi-nidades (Kd) y densidades de receptores (Bmax);sus valores se modifican dentro de la expresiónmatemática hasta que la curva teórica alcanzala mayor proximidad a los datos experimenta-les. El procedimiento más general es el análisisno lineal de los mínimos cuadrados de las dife-rencias entre datos experimentales y teóricos7.Esta técnica, en su versión no ponderada, ad-mite cualquier modelo matemático. Los pará-metros se determinan con mayor precisióncuando los datos originales se utilizan sin sufrirtransformación alguna. En el caso particular delos estudios de fijación, se conoce que los da-tos (cpms de radioligando unido) presentan unavarianza variable que aumenta con su magni-tud, por consiguiente es necesario recurrir a laponderación estadística. En este sentido, son va-rios los métodos propuestos para determinar elmodelo más adecuado8'9. La comprobación dela validez del modelo se inicia con la inspeccióngráfica de los residuales (diferencias entre da-tos experimentales y teóricos) y se continúa conla aplicación de diferentes tests estadísticos, pa-ramétricos y no paramétricos, a fin de detectaruna posible carencia de azar en la distribuciónde residuales alrededor de la curva de regresión(bondad del ajuste). Los paramétricos propor-cionan unos valores objetivos, (suma de los cua-drados de las desviaciones, la media del cua-drado de las desviaciones y la desviaciónestándar de los puntos alrededor de la curva deajuste); los no paramétricos examinan la distri-bución de los puntos experimentales alrededorde la curva de ajuste, el número de veces quese alternan grupos de puntos a ambos lados desu trazado. El «runs text» y el «Robust test» son

45


muy sensibles cuando se maneja un númeroelevado de puntos (>20), cuando el número deobservaciones es más reducido, se aplica la co-rrelación seriada de residuales o la media delos cuadrados de las diferencias sucesivas10. Elprograma ha de proporcionar la representacióngráfica de los datos experimentales y teóricosen diferentes sistemas de coordenadas: curvasde saturación, curvas de competición, gráficasde Scatchard. Como ventaja adicional ciertosprogramas ofrecen la posibilidad de sobreim-poner los límites de confianza del 95 % de cual-quier observación (ayuda a la detección de da-tos anómalos) y el error estándar y/o límites deconfianza del 95 % de la curva de ajuste. Deesta forma, y mediante un criterio estadístico(t de Student o de la F)11, es posible determi-nar el grado de confianza en la existencia dela fijación específica, es decir, si la densidad dereceptores es o no diferente de cero. Por otraparte, la fijación inespecífica puede ser integra-da en el modelo como un parámetro más en elajuste, evitando posibles errores al sustraerla dela cantidad total de radioligando fijado.

La situación en la que están implicados va-rios ligandos y diferentes receptores está con-venientemente descrita en el modelo N por Mformulado por Feldman12, posteriormente ex-pandido por Munson y Rodbard9, De Lean13

y otros.Este modelo permite el diseño de experimen-

tos en los que se varían simultáneamente lasconcentraciones de varios ligandos. Así, en lu-gar de curvas dosis respuesta se analizan su-perficies o hipersuperficles en tres dimensiones.En este sentido, los estudios más frecuentes pa-san a ser considerados como casos particula-res del modelo N por M, por ejemplo, una grá-fica de Scatchard o curva de saturación (1 li-gando 1 receptor; 1 ligando 2 receptores), com-petición (2 ligandos 1 receptor; 2 ligandos 2 re-ceptores). Las representaciones gráficas tipoScatchard o Hofstee evidencian la existencia demás de un tipo de receptor mediante la apari-ción de una curvatura cóncava. Este fenómenorequiere que la relación de afinidades del ligan-do por los receptores (caso de dos) sea de almenos 10. Por otra parte, la relación entre lasdensidades de receptores no ha de ser mayorde este valor, de lo contrario su visualización re-sulta muy difícil y únicamente un diseño expe-rimental adecuado seguido de un análisis ma-temático riguroso puede llegar a demostrar supresencia. Las curvas de competición tambiéndelatan la presencia de diferentes receptores,si el radioligando no es selectivo, entonces la re-

lación de afinidades del competidor es el de-terminante de la aparición de pendientes mássuaves (respecto a la autocompetición)14 o in-cluso en situaciones de elevada selectividadpueden aparecer «hombros» o zonas en las quela competencia cesa para comenzar de nuevoa mayores concentraciones del competidor15.La mayoría de los análisis matemáticos, seansobre datos transformados o no, precisan deunos valores iniciales de los parámetros que sequieren estimar, algunos programas admiten in-cluso unos intervalos dentro de los cuales se es-pera encontrar el valor final del parámetro. Losmétodos más utilizados se basan en la repre-sentación de los datos experimentales, general-mente en Scatchard para visualizar la curvatu-ra, y mediante diferentes procedimientos, comoel «pelado» de la gráfica o la determinación dela intersección de las asíntotas con los ejes, sedeterminan estos datos iniciales16.

Ventajas e inconvenientes del análisismatemático

En sus versiones más completas, se analizala distribución del error experimental, propor-cionando una ponderación adecuada a cada va-lor dentro del conjunto. Así evita los artefactosen la transformación de los datos; proporcionauna medida de los errores estándar y límites deconfianza para cada uno de los parámetros, porseparado y en parejas (covarianza); facilita unosíndices objetivos que permiten valorar la bon-dad del ajuste, así como representaciones grá-ficas que posibilitan la detección de aquellos va-lores anómalos que pudieran interferir con laeficiencia del ajuste global; permite la compa-ración estadística entre los ajustes correspon-dientes a diferentes modelos matemáticos al-ternativos, pudiéndose seleccionar el más ade-cuado en base a criterios objetivos. Así mismo,permite el análisis simultáneo de datos gene-rados en diferentes experimentos para así veri-ficar la consistencia de los resultados o para dis-poner del número suficiente de observacionesa la hora de abordar el análisis de un modelocomplejo y obtener valores más fiables.

El análisis matemático, por muy sofisticadoque sea, es sin embargo incapaz de transfor-mar malos resultados en resultados útiles. Al-gunos de los problemas se originan ante la mis-ma dificultad de satisfacer ciertos supuestos delos modelos basados en la ley de acción de ma-sas: obtención del equilibrio; determinación pre-cisa del radioligando libre y del unido al recep-tor; separación perfecta de ambas formas sinperturbar el equilibrio inicial, ausencia de de-

46

ESTUDIOS DE FIJACIÓN Y DISCRIMINACON DE RECEPTORES

gradación del ligando y/o del receptor; ausen-cia de interacciones cooperativas entre recep-tores; ausencia de reacciones enzimáticas;ausencia de internalización de los receptores;determinación precisa de la unión inespecífica;conocimiento de la identidad química del ra-dioligando, su pureza y homogeneidad (ausen-cia de mezclas racémicas); ausencia de cam-bios de conformación del receptor inducidos porel ligando, agregación desgregación; interaccio-nes del receptor con otros componentes demembrana (proteínas reguladoras G, fosfolípidoso enzimas); el ligando y el receptor deben estaren solución no presentando gradientes o distri-buciones en capas. Los errores sistemáticos co-metidos antes del análisis matemático, talescomo imprecisiones en la actividad específica,impurezas del radiolígando, desconocimiento dela eficacia del contador, o de la eficacia del pro-cedimiento de separación del radioligando libredel unido, afectan en gran medida a los valo-res estimados de los parámetros. Es por tantoprobable que su imprecisión sea mayor que loserrores estándar calculados por los programas,puesto que estos últimos se calculan únicamen-te en base a la dispersión de los puntos experi-mentales alrededor de la curva de ajuste. Va-hos autores han realizado simulaciones asistidaspor ordenador a fin de valorar los aspectos cua-litativos y cuantitativos asociados con el incum-plimiento de alguno de los requisitos antes enu-merados; su lectura es muy recomendable17"23.

En estos trabajos se demuestra cómo determi-nadas situaciones pueden originar falsas imágenesde heterogeneidad de receptores, por ejemplocurvaturas en las representaciones de Scatchard ocurvas de competición que se extienden más alláde dos órdenes de magnitud. Las causas más co-munes son: definición incorrecta de la fijación es-pecífica y/o forma libre del radioligando, formacióndel complejo ternario, heterogeneidad del ligandoe interacciones receptor-receptor (cooperaciónnegativa)15. Algunas de estas circunstancias pue-den ser detectadas o descartadas mediante apro-ximaciones experimentales sencillas. Como reglageneral, la forma no marcada del radioligandodesplaza más fijación que otro ligando relaciona-do, si sistemáticamente una parte de la fijaciónno fuese desplazada por los competidores o és-tos lo hiciesen muy débilmente y/o con un or-den de potencia ¡lógico, podría tratarse de unafijación inespecífica desplazada por el ligandoque define ia unión específica25. En este caso,se observaría un patrón similar en aquellas estruc-turas donde se conoce la ausencia de receptorfarmacológico. Si el artefacto se debiese a la de-

terminación deficiente de la forma libre del li-gando (secuestro), entonces la curvatura delScatchard debería amortiguarse al realizar el ex-perimento en volúmenes del orden de 10 ve-ces superiores al inicial, pero manteniendo lacantidad de receptores en el medio de incuba-ción22. La descripción del modelo ternario, asícomo su formulación matemática, ha sido revi-sada y ampliada recientemente23. Son nume-rosas las observaciones en que los agonistascompiten por la unión de radioligandos antago-nistas siguiendo un patrón bifásico9. Esta ima-gen desaparece en presencia de GTP. Por con-siguiente, sólo en aquellas situaciones en las queel radioligando sea un antagonista y los com-petidores agonistas es esperable esta situación,además si el GTP no altera el patrón bifásicose podría considerar como indicativo de diferen-tes receptores. Una última precaución consis-te en la realización del experimento en diferen-tes estructuras. La consistencia del patrónbifásico apoyaría la existencia del complejo ter-nario puesto que es muy poco probable que ladistribución de los diferentes tipos del receptorsea uniforme.

Otro tipo de problemas se originan por la utili-zación inadecuada de las posibilidades del análisismatemático: 1. Antes de aceptar como válidosunos parámetros, es preciso verificar su consis-tencia en diferentes experimentos. 2. La correcióndel diseño experimental es igualmente verificable,en este sentido, la dispersión de los puntos hade ser mínima puesto que aumentando su nú-mero o expandiendo el rango de concentracionesapenas se contrarresta su influencia negativa. Ladistribución de los puntos es decisiva en la cali-dad del ajuste, como caso general los puntos de-ben colocarse espaciados abarcando el mayorrango de saturación posible. Saturaciones del 70-80 % son satisfactorias para el análisis matemá-tico, evidentemente si no se alcanza el 50 % desaturación las curvas son inservibles. General-mente se precisan experimentos preliminares an-tes de abordar los definitivos. 3. Influencia de losvalores iniciales de los parámetros, unos valoresinadecuados pueden llevar a la rutina de ajustelejos de la zona de convergencia, o incluso a unosparámetros finales que determinen unos residua-les mínimos relativos, pero no a aquéllos que co-rresponden al menor residual posible. Por con-siguiente, el conocimiento del sistema en estudioy la provisión de unos valores adecuados de losparámetros condicionan extraordinariamente labondad del ajuste. 4. En general se conside-ra que se precisan 6 puntos por cada paráme-tro que se ajusta, así pues, cuanto más com-

47


piejo es el modelo matemático mayor es el núme-ro de puntos que se precisan. La relación entre elerror experimental (estimado a partir de la varia-bilidad de los replicados de los puntos experi-mentales) y el residual (diferencias entre datosexperimentales y teóricos) proporciona una me-dida de la bondad del ajuste; si el primero es con-siderablemente menor que el segundo, se puedecuestionar la validez del modelo matemático utili-zado. Por el contrario, si el residual es claramenteinferior al experimental, el modelo adolece de so-breparametrización de forma que la curva deajuste resulta tan flexible que prácticamente bus-ca a los puntos experimentales allí donde se en-cuentren. Es conveniente considerar como ade-cuado aquel modelo cuya bondad de ajuste noes estadísticamente peor que el inmediatamentesiguiente en complejidad (un parámetro adicio-nal). Ambas medidas de error no deben ser idén-ticas pero sí comparables8'25. 5. Independenciade las observaciones, es imprescindible realizaral menos duplicados para disponer de un núme-ro elevado de grados de libertad (concentracio-nes diferentes), al tiempo que se estima el errorexperimental necesario para seleccionar el mode-lo más apropiado de ponderación estadística.

La realización correcta de los experimentosde fijación, el diseño experimental adecuado alestudio de diferentes receptores, la elección co-rrecta del modelo matemático y el análisis rigu-roso de los datos experimentales, pueden lle-gar a proporcionarnos un cierto grado de con-fianza en la existencia de los tipos de un recep-tor, sin embargo únicamente el contraste de es-tos datos con los de origen farmacológico y/ofisiológico, nos puede reafirmar en este supues-to. Por consiguiente, se debe correlacionar elorden de potencia de los agonistas en los dife-rentes tipos farmacológicos del receptor con sucapacidad de competir por la fijación de los ra-dioligandos a los tipos definidos bioquímicamen-te. Así mismo, la distribución de los tipos obte-nida en base de estudios de fijación, ha decoincidir con aquellas áreas y estructuras en lasque los agonistas manifiestan sus efectos y nopresentarse allí donde son inactivos.

La complejidad de los procedimientos mate-máticos utilizados en los programas de ordena-dor pudiera llevar al experimentador a una ciertapérdida de contacto con el problema en estu-dio. En este sentido, es preciso conocer el mo-delo matemático que describe la situación ex-perimental o en su defecto elegir aquel pro-grama que permita la comparación de las cali-dades de ajuste a los diferentes modelos queel experimentador considere posibles a su situa-

ción particular. La validez y eficacia del proce-dimiento de ajuste debe estar fuera de todaduda (base bibliográfica). Así mismo, se debehacer uso no sólo de sus potencialidades esta-dísticas sino también de las gráficas para así po-der valorar la apariencia del ajuste. Los progra-mas que cumplen estos requisitos son varios yúnicamente se debe exigir que, independien-temente de su potencialidades, sus procedi-mientos conduzcan a conclusiones similares.

BIBLIOGRAFÍA

1. Kenakin TP. The relative contribution of affínityand efficacy to agonist activity: organ selectivityof noradrenaline and oxymetazoline with referenceto trie classification of drug receptors. Br J Phar-macol 1984; 81:131-141.

2. Garzón J, Schulz R, Herz A. Evidence for the etype of opioid receptor in the rat vas deferens. MolPharmacol 1985; 28:1-9.

3. Sánchez-Blázquez P, Garzón J, Lee NM. Func-tional opiate receptor ¡n mouse vas deferens: evi-dence for a complex interaction. J Pharmacol ExptTher 1983; 226:706-711.

4. Garzón J, Sánchez-Blázquez P, Lee NM. [3H]Ethylketocyclazonice binding to mouse brainmembranes: evidence for a kappa opioid recep-tor type. J Pharmacol Expt Ther 1984; 321:33-37.

5. Smith JR, Simón EJ. Selective protection of ste-reospecific enkephalin and opiate binding againstinactivation by N-ethylmaleimide: evidence for twoclasses of opiate receptors. Proc Nati Acad Sci,EE.UU. 1980; 77:281-284.

6. Robson LE, Kosterlitz HW. Specific protection ofthe binding sites of D-Ala2-D-Leu6-enkephalin(á receptor) and dihydromorphine 0¿ receptor).Proc R Soc Lond B Biol Sci 1979; 205:425-432.

7. Bard Y. Nonlinear parameter estimation. NuevaYork, Academic Press, 1973.

8. Rodbard D, Lenox RH, Wray HL, Ramseth D. Sta-tistical characterization of the random errors inthe radioimmunoassay dose-responde variable.Clin Chem 1976; 22:350-358.

9. Rodbard D, Munson PJ, Thakur AK. Quantitativecharacterization of hormone receptors. Cáncer1980; 46: 2.907-2.918.

10. Bennet CA, Franklin NL. Statistical analysis ¡n che-mintry and the chemical industry. Nueva York, Wi-ley, 1954.

11. Draper N, Smith H. Applied regression analysis.Nueva York, Wiley, 1966.

12. Feldman HA. Mathematical theory of complexlingand-binding systems atequilibrium: some met-hods for parameter fitting. Anal Biochem 1972;48:317-338.

13. DeLean A, Hancock AA, Lefkowitz RJ. Validationand statistical analysis of a computer modelingmethod for quantitative analysis of radioligand bin-ding data for mixtures of pharmacological recep-tor subtypes. Mol Pharmacol 1982; 21:5-16.

48

ESTUDIOS DE FIJACIÓN V DISCRIMINACIÓN DE RECEPTORES

14. Garzón J, Sánchez-Blázquez P. Biochemical ap-proach to the study of the opioid receptor ¡n themouse brain. Rev Farmacol Clin Exp 1987;4:25-34.

15. Molinoff PB, Wolfe BB, Weiland GA. Quantitativeanalysis of drug-receptor interactions: II determi-nation of the properties of receptor subtypes. LifeSel 1981; 29:427-443.

16. Rosenthal HE. Agraphical methodforthedermi-nation and presentation of bindlng parameters ¡na complex system. Anal Biochem 1967;20:525-532.

17. Rodbard D, Catt KJ. Mathematical theory of ra-dlollgand assays: the kinetics of separation ofbound and free. J. Sterold Biochem 1972; 3:255-273.

18. Ketelslegers JM, Knott GD, Catt KJ. Klnetics ofgonadotropin by receptors of the rat testis: analy-sis by a non-linear curve fitting method. Bioche-mistry 1975; 14: 3.075-3.083.

19. Buergisser E, Hancock AA, Lefkowitz RJ, DeLean

A, Anomalous equilibrium binding properties ofhigh-affinity racemic radioligands. Mol Pharma-col 1981; 19: 205-216.

20. Buergisser E, Lefkowitz RJ, DeLean A. Alternati-ve explanation for the apparent «two step» bin-ding kinetics of high affinity antagonist radioli-gands. Mol Pharmacol 1981; 19:509-512.

21. Munson PJ. Experimental artifaets and the analysisof ligand bindig data: results of a computer simu-lation. J. Recept Res 1983; 3:249-259.

22. Goldstein A, Barret RW. Ligand dissociation cons-tants from competition binding assays: errors as-sociated with ligand depletion. Mol Pharmacol1987; 31:603-609.

23. Abramson S, McGonigle P, Molinoff PB. Evalua-tion of models analysis of radloligand binding data.Mol Pharmacol 1987; 31:103-111.

24. Laduron P, More binding, morefaney. TIPS 1983;4:333-335.

25. Rodbard D. Agonist versus antagonists. TIPS1980; 1:222-225.

DISCUSIÓN

A. GÓMEZ-LUQUE: Quisiera plantear al Dr. Gar-zón un par de cuestiones. La primera de ellasse refiere a la importancia del error experimen-tal en relación con el error residual. La segun-da se centra en la importancia de los experi-mentos cinéticos en el estudio de la posibleexistencia de subtipos o estados de afinidaddistintos de receptores.

J. GARZÓN: Respecto a la primera cuestión setiende a considerar que cuando el error expe-rimental es muy superior al residual debenadoptarse ciertas precauciones ya que pode-mos estar trabajando con un modelo que po-sea un número excesivo de parámetros, es de-cir, podemos estar generando una curvateórica que prácticamente sea tan flexible quevaya hacia los puntos experimentales allí don-de estén. Esto es llevar las condiciones expe-rimentales a un límite que debe evitarse. Dehecho hay un criterio que se suele aplicar queconsiste en desestimar aquel modelo que nomejora a aquel diseñado con un parámetromenos. En el caso inverso, cuando el error re-sidual es mucho mayor que el experimental,lo primero que hay que pensar es que el mo-delo matemático elegido no es el correcto.En relación con los procesos cinéticos, espe-cialmente disociativos, personalmente, opinoque donde tienen mayor relevancia es enaquellos casos en que se discuten fenómenos

de multiplicidad de receptores o cooperativi-dad negativa de fijación. En teoría, un proce-so de disociación adecuadamente realizadopodría damos información sobre en qué situa-ción nos encontramos, puesto que si la diso-ciación se realiza por aumento de volumen opor introducción de la forma no marcada delligando, el patrón obtenido debería ser distin-to si estamos en un caso de cooperatividad ode multiplicidad de receptores. Considero quelos estudios cinéticos como tales son bastan-te difíciles de controlar por lo que la impreci-sión de sus resultados (error experimental)puede dificultar su ajuste a cualquier modelomatemático.

S. ERILL: Estoy totalmente de acuerdo en quehay que comparar siempre los datos de fija-ción con los datos de respuesta fisiológica.Pero lo que quisiera plantear no es una pre-gunta ni un comentario sino una provocación.¿Cómo se interpretan los resultados de las ben-zodiacepinas periféricas en los que los datosde fijación son extraordinariamente robustosy en cambio prácticamente no hay datos so-bre actividad?

J. GARZÓN: Creo que todavía es pronto para res-ponder a este planteamiento que sin duda re-presenta una interesante línea de investiga-ción.

J. MARTÍNEZ-LANAO: El Dr. Garzón ha aborda-

49


do un tema tan interesante como el de la trans-formación de variables, procedimiento bastan-te habitual en estudios cuantitativos, tanto enfarmacología como en farmacocinética. Comomuy bien ha señalado el ponente, cuandoexiste una gran variabilidad en estudios cuan-titativos es preferible recurrir a una línea di-recta, es decir, obtenida directamente porajuste de todos los datos a la función medianteun programa de los que se han comentado.Pero personalmente quisiera defender unpoco la transformación de variables porquecreo que ésta tiene algunas aplicaciones siem-pre y cuando se adopten ciertas precaucio-nes. Por poner un ejemplo, en la década delos sesenta se propuso un método de trans-formación de variables para la conocida ecua-ción hiperbólica de Michaelis-Menten hacien-do una transformación también de los pesosestadísticos. Se trataba pues de un métodomatemático que mediante la transformacióndel peso estadístico validaba los métodos dedoble recíproca en la utilización de la trans-formación de variables. Además, opino queeste método también tiene aplicaciones cla-ras en los análisis por ordenador a la hora deseleccionar las primeras estimaciones paraaportar datos iniciales que nos permitan rea-lizar el ajuste.

J. GARZÓN: Evidentemente. La transformaciónde variables que se ha aplicado desde hacemucho tiempo estaba justificada, entre otrasrazones, por la representación gráfica de losresultados. Posteriormente, dicha transforma-ción, como ha puntualizado el Dr. Martínez La-nao, ha pasado a ser útil únicamente en la ob-tención de valores iniciales para el ajuste,puesto que todos los que trabajamos con es-tos programas informáticos hemos tenido queaceptar que no siempre los resultados obte-nidos aplicando la transformación son coinci-dentes con los que se obtienen en la actuali-dad sin transformación. Estos últimos sonbastante más precisos y reproducibles, al me-nos en mi experiencia.

J. MARTÍNEZ-LANAO: Lo que es evidente esque aquí surge otro problema, el de la com-plejidad de la función. Cuando manejamosfunciones complejas necesariamente tenemosque recurrir muchas veces a métodos mate-máticos como la transformación de variablespara obtener estimaciones porque no tenemosotro método matemático. Al final recurrimosa una optimización fina de métodos informá-ticos. Es decir, la transformación de variablespuede tener bastante utilidad en el método ex-

perimental. No creo que sea obligado renun-ciar a ella a priori.

J. GARZÓN: Estoy completamente de acuerdo.A. GARCÍA: En relación con la correlación en-

tre los datos de fijación de radioligandos enmembranas aisladas y los parámetros farma-cológicos obtenidos en órganos o células in-tactas —pienso que casi todos estamos deacuerdo en que es necesario establecer estacorrelación para validar los datos de fijaciónde ligandos— me gustaría plantear al Dr. Gar-zón la posibilidad de realizar estos estudios encélulas intactas donde en muchos modelos sepuede observar simultáneamente la correla-ción. Mi pregunta concreta se refiere a quéfactores pueden influir en la valoración de losdatos de fijación de ligandos a células intac-tas y si la aproximación experimental y mate-mática que ha representado puede aplicarsea células intactas al igual que a membranasaisladas.

J. GARZÓN: Por supuesto. Las células intactasconstituyen el campo menos malo donde pue-de estudiarse la fijación descendiendo desdeel organismo en su conjunto. Y digo menosmalo porque la mayor dificultad que se nospuede plantear es la no obtención de una si-tuación de equilibrio. Si pueden eliminarse laspérdidas continuas de la forma libre por in-corporación o procesos de absorción inespe-cífica en las células, ya habremos ganado bas-tante. En lo que concierne a la comparaciónentre datos bioquímicos y farmacológicos, evi-dentemente lo que es más importante es quelos órdenes de potencias sean comparables,no potencias absolutas puesto que como he-mos visto y en el caso de agonistas están ocu-rriendo tantísimas cosas entre el receptor y elefecto medido que es muy difícil llegar a pre-cisar tanto. En cuanto a la utilización de célu-las en este contexto hay alguna referencia enla literatura. Lo que ocurre es que la célula,como ser vivo, puede admitir a lo mejor unantagonista sin excesivas variaciones, perocuando utilizamos un agonista me temo quela situación puede ser más complicada, pue-de haber desensibilización, etc., fenómenosque pueden complicar mucho la interpreta-ción de los datos.

A. PAZOS: Quisiera señalar que particularmentesólo conozco un estudio que utilice técnicasde autorradiografía de receptor en célula in-tacta y realmente desde el punto de vista me-todológico el estudio era muy correcto perolos investigadores fueron incapaces de repro-ducir las propiedades farmacológicas del re-

50

ESTUDIOS DE FIJACIÓN Y DISCRIMINACIÓN DE RECEPTORES

ceptor. Tengo la impresión de que no se dis-pone todavía de métodos que respeten lascondiciones de equilibrio al menos en lo queconcierne a técnicas autorradiográficas en cé-lulas.

J.A. GARCÍA-SEVILLA: Quisiera hacer un par decomentarios sobre la bondad de utilizar unanálisis no lineal frente al clásico Scatchard.Es verdad que hoy en día todos utilizamos yaprogramas no lineales de ajuste de la hipér-bola pero creo que el Scatchard todavía tieneun valor indudable en el sentido de plasmarel resultado en forma de un típico gráfico quepermite apreciar giobalmente los cambios dedensidad y sobre todo de afinidad que puedatener el radioligando. Además, cuando el ex-perimento está bien hecho, es decir, cuandose ha controlado rigurosamente todo el pro-

ceso, creo que puede afirmarse, por ejemploen el caso del receptor que nosotros estudia-mos, que los datos del Scatchard se ajustanperfectamente a los datos que proporcionacualquier programa iterativo de ajuste no li-neal.

J. GARZÓN: Quería solamente apuntar que unade las ventajas del análisis que nosotros utili-zamos es que los modelos siguen la ley de ac-ción de masas y los diferentes lugares deunión son esencialmente independientes, porconsiguiente, no barajamos un abanico de po-sibilidades y vemos cuál se ajusta mejor opeor. En realidad se parte del modelo mássencillo hacia el más complejo en una únicadirección y nos detenemos cuando no se ob-serva mejoría en la calidad del ajuste mate-mático al asumir un lugar de unión adicional.

51

El pf oblema de los receptores de reservaen el análisis de datos farmacológicos

F. Barturen y J.A. García-SevillaDepartamento de Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad del País Vasco.

Introducción

En su formulación inicial1-3 la teoría ocupa-cional de receptores asume que el efecto far-macológico (E) inducido por una concentraciónde agonista [A] es directamente proporcional ala concentración del complejo agonista recep-tor [AR]

1. (E)=« [AR]

siendo a. una constante de proporcionalidad, detal modo que los receptores no ocupados no de-sarrollarían respuesta y que la máxima respuestase alcanzaría sólo cuando todos los receptoresestuvieran ocupados.

Sin embargo, ya en 1956, Stephenson4 intro-dujo una importante modificación conceptual enla teoría clásica al proponer que si bien la res-puesta biológica es dependiente de la ocupa-ción fraccional del receptor, la relación entre am-bas variables no debe, forzosamente, ser lineal.Así:

2. -J^=f )=f (E[AR]J

donde Em es el efecto que provoca una con-centración [A] de agonista, Em es el efecto má-ximo, (s) el estímulo y E la actividad intrínsecadel complejo fármaco-receptor, de tal modo queuna ocupación inferior a la totalidad de los re-ceptores podría ser suficiente para lograr la res-puesta máxima del sistema.

La relación no lineal entre la ocupación de re-ceptores y el efecto promovido, descrita en tér-minos teóricos por Stephenson, obtuvo un im-portante apoyo experimental cuando Nickerson(1956)5 demostró en íleo de cobayo que el blo-queo irreversible del receptor histaminérgico conconcentraciones crecientes de dibenamina pro-voca un desplazamiento importante hacia la de-recha de la curva concentración-efecto antes deinducir una reducción en el efecto máximo

(fig. 1). El desplazamiento hacia la derecha trasbloqueo irreversible parcial sin variación en elefecto máximo parece indicar que una propor-ción de la población de receptores puede serinactivada sin que el sistema pierda la capaci-dad de desarrollar su efecto máximo. Surge asíel concepto de receptor de reserva para definiraquella proporción de receptores cuya ocupa-ción no es requerida para lograr el efecto má-ximo.

Resultados similares a los descritos porNickerson5 fueron pronto aportados por otrosautores, utilizando dibenaminas y análogos, parareceptores muscarínicos, histamínicos y adre-nérgicos alfai en diversos tejidos6'7 confirman-

0,01 0,1 1,0 10,0 100,0

Histamina (/¿g/ml)

Fig. 1. Curvas dosis-efecto para la histamina en fleo decobayo. En ordenadas se expresa el porcentaje de res-puesta control para una concentración de 0,1 fig/mide histamina y en abscisas el (—) logaritmo de la con-centración (/jg/ml) de histamina.Nótese cómo el bloqueo irreversible del receptor con0,0006 /ig/ml (O) y 0,01 /ig/ml ( • ) de dibenami-na provocó un importante desplazamiento de la cur-va control (%) hacia la derecha antes de que se pro-dujera pérdida de efecto máximo (A) ([dibenami-na]=0,l fig/ml). Tomada de Nickerson (1956)5.

53

A. BADIA, A. DOMÍNGUEZ

Ecuación 6

- GIL, J. GARZÓN

TABLA 1Forma general

Forma hiperbólica directa

a) I A 1 ___ZL_J " [A'] + KA/(l-q)

Formas lineales1 1 (1-q)b) w

c) 1 A T =

d) [A] = KA-

KA q q [A*]

1 1 (1-q)q KA q

q KA [A]

Y =MX

X + K

= "¡vi

M

_K_Y

(1-q) (1-q) [A*]

do la no linealidad de la relación ocupación delreceptor-respuesta funcional.

Sin embargo, ha sido preciso el desarrollo detécnicas de fijación específica de radioligandospara la confirmación del carácter irreversiblede ciertos antagonistas, así como el desarrollo demétodos efectivos para el cálculo de la constan-te de disociación en equilibrio del complejo ago-nista-receptor (KA) y en consecuencia de laocupación fraccional para cada concentraciónde agonista, con el fin de acumular mayores evi-dencias experimentales en relación con la dis-paridad entre ocupación del receptor y respues-ta funcional.

Cálculo de receptores de reserva

El hecho de que la interacción fármaco-receptor es bimolecular y reversible y cumplela ley de acción de masas constituye un presu-puesto clásico en farmacología. Según esto8, laocupación fraccional del receptor ([AR]/[RT]) enequilibrio para una concentración de agonista[A] viene dada por la expresión:

3.[A][AR]_

[RT] " [A] + KA

donde [AR] es la concentración del complejoagonista receptor, [RT] es la concentración to-tal de receptores y KA es la constante de diso-ciación. De tal modo que conociendo el valorde KA es posible estimar el valor de la fracciónde receptores ocupada para cada concentra-ción, y por contraposición con el efecto promo-vido, evaluar la posible existencia de recepto-res de reserva. Así, en el supuesto de que

concentraciones de agonista capaces de pro-mover efecto máximo ocupen tan sólo una frac-ción q de receptores hablaremos de una frac-ción (1-q) de receptores de reserva.

Estima del valor de KA

Hasta la fecha, la estima de la constante dedisociación del complejo agonista-receptor, apartir de estudios funcionales, se ha abordadodesde tres planteamientos:

1. A partir de la comparación de curvas dosis-efecto antes y después del bloqueo irreversiblede una fracción de receptores7.

2. A partir de las curvas dosis-efecto logra-das por un agonista completo y un agonistaparcial9'10.

3. A partir del uso de un agonista parcial comoantagonista competitivo tras el bloqueo parcialdel receptor por un antagonista irreversible11.

En el presente capítulo consideraremos y de-sarrollaremos la primera posibilidad.

De acuerdo con la teoría propuesta porStephenson4 (ecuación 2) y siendo la eficacia delfármaco (e) igual al producto de la eficaciaintrínseca del complejo agonista-receptor (E)por la concentración de receptores totales [RT]y asumiendo la ley de acción de masas (véaseecuación 3) obtenemos:

4.Em

•=fe[A]

En el caso de presencia de un antagonista quebloquee de forma irreversible una proporción de

54

EL PROBLEMA DE LOS RECEPTORES DE RESERVA EN EL ANÁLISIS DE DATOS FARMACOLÓGICOS

receptores la ecuación 4 puede expresarsecomo:

5.EA*

- = fe q [AR*

q[RT]= f

e g [A*][A*

donde (q) es la fracción de receptores totalesno inactivada tras tratamiento con el antagonistairreversible y siendo el resto de los términos si-milares a los de la ecuación 4 pero con un as-terisco (*) para indicar que un antagonista haactuado sobre el sistema.

En el caso de que (q) tenga un valor suficien-te que permita alguna respuesta al agonista Ay para [A] y [A*] equiefectivas (esto es, siendoEA=EA*) podemos igualar las expresiones 4 y5, de tal modo que:

[A] _ q [A*][A]+KA~ [A*] + KA

La ecuación 6 puede ser expresada en lascuatro formas que se recogen en la tabla I, enla que la ecuación a) corresponde a la relaciónhiperbólica directa entre las concentraciones [A]y [A*] mientras que las formas b), c) y d) co-rresponden a distintos modelos de transforma-ciones lineales de a).

La ecuación b) corresponde a la transforma-ción lineal de la hipérbola a) por el método dedobles recíprocos y ha constituido hasta la fe-cha la función más utilizada para el cálculo delos valores de q y KA. El método, descrito porFurchgott7, consiste en la obtención de la rec-ta de ecuación:

1[A] KA [A*

por regresión lineal simple a partir de los pun-tos (1/[A*], 1 /[A]) obtenidos del análisis de lascurvas dosis-efecto antes y después* de la inac-tivación, del tal modo que:

q = l /pendiente

KA=d-q)/q-Y(x = O)

Sin embargo, y pese a partir de errores ex-perimentales pequeños, la varianza de las esti-maciones de KA cuando^se utilizan métodos detransformación lineal simple adquiere, general-mente, valores importantes. Estudios realizados

con experimentos simulados con ordenador12

demuestran cómo la precisión estadística de laestima de KA puede verse mejorada utilizandoregresiones lineales ponderadas, si bien los es-quemas adecuados de ponderación exigen aná-lisis interactivos de complejidad no inferior a mo-delos de análisis no lineal13. Sobre la base deeste hecho, diversos autores13'14 han sugeridoel análisis directo de la relación hiperbólica en-tre concentraciones equiefectivas por regresiónno lineal como método para reducir la varianzade la estima de KA, obteniéndose resultadosmuy satisfactorios cuando se utilizó la regresiónlineal propuesta por Furchgott7 para la obten-ción de estimas iniciales.

Relación ocupación fraccional-respuestafracciona I

A partir de la estima del valor de KA y con laaplicación de la ecuación3 es posible determi-nar el valor de la ocupación fraccional para cadaconcentración de agonista, de efecto conocido,para a partir de estos valores construir la rela-ción ocupación-respuesta.

Patón y Rothschild (1965)15 demostraroncómo la función resultante de la combinaciónde dos o más funciones de Langmuir es igual-mente una función de Langmuir. De tal modo,y dado que tanto la relación dosis-efecto comola relación dosis-ocupación siguen una distribu-ción hiperbólica, la relación ocupación-efectoseguirá igualmente una distribución hiperbóli-ca según la ecuación genérica:

7.[AR]"

[AR]n + KEn

siendo KE el valor de la ocupación fraccionalque logra un efecto del 50% y n un factor quedefine la pendiente de la hipérbola, de tal modoque para n = 1 la distribución corresponde a unahipérbola rectangular. La posibilidad de que nadquiera valores distintos de 1 hace extensibleel modelo para aquellos sistemas en los que larelación dosis-efecto presente una pendientedistinta de 1.

El ajuste no lineal de los valores conocidos dela relación ocupación-efecto a la ecuación 7 per-mitirá obtener una estima del valor de KE y apartir de aquí calcular el valor de la ocupaciónfraccional para cada nivel de respuesta. Final-mente, el valor de la reserva de receptores paracada nivel de respuesta podrá calcularse comola diferencia entre respuesta fraccional y ocu-pación fraccional.

55


Significado funcional de los receptoresde reserva: adrenoceptores «2 de reservaen conducto deferente de ratay su modulación por antidepresivos

La presencia de receptores de reserva ha po-dido ser demostrada para una amplia variedadde receptores y sistemas. Así, ha podido demos-trarse la existencia de una importante reservafuncional para receptores oploides del subtipok en íleo de cobayo16, para receptores a la an-giotensina II en vena porta de rata17, para re-ceptores a la substancia P en el íleo de Coba-yo18 para receptores dopaminérgicos delsubtipo D2 en cuerpo estriado de rata19, adre-noceptores az en córtex cerebral de rata20 ypara receptores /3 adrenergicos en ventrículocardíaco de conejo21.

Sin embargo, la presencia o ausencia de re-ceptores de reserva no parece ser una carac-terística propia de los distintos subtipos de re-ceptores sino que parece depender además delsistema en que se encuentren o incluso de larespuesta que mediaticen. Así, la existencia dereserva funcional para el adrenoceptor ai hasido ampliamente demostrada para el conduc-to deferente de rata22'23 la aorta y el bazo deconejo24'25 mientras que no parece existir enarteria mesentérica y renal de perro26.

Recientemente y en un intento de aproximaciónal significado funcional de los receptores de re-serva19 se ha demostrado cómo para el receptordopaminérgico D2 presináptico del cuerpo estria-do de rata existe una importante reserva funcio-nal que contrasta con la ausencia de receptoresde reserva D2 posinápticos en el mismo sistema.

Sin embargo, existen pocas evidencias rela-cionadas con el posible papel que pueda de-sempeñar la modulación del fenómeno dereceptores de reserva en los procesos de sen-sibilización o desensibilización de los diversossistemas por tratamiento farmacológico.

En este contexto se consideró de interés de-terminar la posible existencia de adrenocepto-res «2 de reserva en conducto deferente derata y en su caso la modulación de esta pobla-ción por tratamiento crónico con antidepresivos.

El conducto deferente aislado de rata estimu-lado eléctricamente, constituye un modelo óp-timo para la valoración funcional de adrenocep-tores ai ya que además de presentar una muyimportante inervación noradrenérgica27, sutransmisión motora, con independencia de sunaturaleza noradrenérgica o no noradrenérgi-ca28, es modulada por adrenoceptores «2 pre-sinápticos29.

Para el presente estudio se utilizaron ratasmacho de la cepa Sprague-Dowley (280-330 g)que fueron sacrificadas por dislocación cervicaly sección carotídea bilateral. Tras su disección,el conducto deferente fue sumergido en bañode órgano aislado (7 mi) a 31+0,5°C enKrebs bicarbonato conteniendo (en mM):NaCI 112, KCI 4,7, CaCI2 2,5, KH2PO4l , l ,MgS04 l ,2, NaHCO3 25,0 y glucosa 11,1,y gaseado con 95% 02-5% CO2. Los tejidosfueron sometidos a una tensión basal de 0,5 gy lavados cada 10 minutos durante un períodode 30 minutos previos a la estimulación, pro-cediendo durante este tiempo a la preincuba-ción o no con el antagonista irreversible, y sien-do posteriormente estimulados eléctricamentemediante ondas cuadradas de 3 mseg de du-ración con una frecuencia de 0,1 Hz y un vol-taje supramaximal de 25-30 V.

El análisis de las curvas dosis-efecto se reali-zó por regresión no lineal de los valores de res-puesta para cada concentración según laecuación13:

E=-Emax [A]"

[A]n+Ec50n

utilizando una adaptación para análisis conmicroordenador30 del algoritmo de Marquardt.

El resto de los cálculos para la evaluación dela posible presencia de reserva funcional se rea-lizaron tal y como se detalla en el apartado decálculo de receptores de reserva del presentecapítulo, realizándose la estima del valor Ke porajuste no lineal de los puntos de la relaciónocupación-respuesta a la ecuación 6-a utilizan-do igualmente el algoritmo de Marquardt.

Como antagonista irreversible se utilizóN-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-dihidroquinolina(EEDQ) (10-8-10-6 M) cuya potencia comobloqueante no competitivo del adrenoceptor a.2ha sido ampliamente demostrada tanto a par-tir de estudios con fijación específica de radio-ligandos como a partir de estudios funcionalesin wVo31.

Como agonista completo se empleó UK14304 (5 bromo-6-[2-im¡dazolín-2-yl-amino]-quinoxalina), para el que se ha podido demos-trar en diversos sistemas, tanto periféricos comocentrales, su carácter de agonista completo yselectivo para el adrenoceptor a232-33.

La preincubación (15 minutos) del conductodeferente aislado de rata con distintas concen-traciones de antagonista irreversible EEDQ(10~8-10-6 M) provocó un importante despla-zamiento hacia la derecha de las curvas dosis-

56


TABLA IIEFECTO DE LA PREINCUBACIÓN (15 MIN) CON EEDQ SOBRE LA INHIBICIÓN MEDIADAPOR UK 14304 DE LA RESPUESTA CONTRÁCTIL DEL CONDUCTO DEFERENTE DE RATA*

ControlEEDQ 10- 8 MEEDQ 10- 7 MEEDQ 2.10-7 M

EEDQ 3.10-7 M

EEDQ 10- 6 M

% Emax/Emax control

100,0 + 1,296,8 ± 1,80

103,2 ± 1,64101,1+1,0160,7 ±0,92***28,2 ±1,22***

Ec50

0,64 ±0,060,92 ±0,08**

11,78+0,64***27,21 ±1,4***62,43 + 5,2***139,1 ±29,7***

(N)

(12)(4)(6)(6)(6)(4)

*Se representan valores medios ±EEM de (n) experimentos.En todos los casos se realizaron curvas dosis-efecto completas para el agonista UK 14304 (0,1 -104 nM).La Ec50 representa la concentración de agonista para producir en cada caso un 50% del efecto máximo.**p<0,05; ***p<0,001 (test t de Student).Resultados no publicados.

TABLA IIIRELACIÓN OCUPACIÓN FRACCIONAL-

RESPUESTA FRACCIONAL PARA DISTINTASDOSIS DE UK 14304 EN CONDUCTO

DEFERENTE DE RATA*

[A] nM % Ocupación % Respuesta máxima

o,0,13

1030

,1,3

0,165 ±0,0170,495 ±0,05

1,63 ±0,174,73 ±0,49

14,11 +1,2832,85 ±2,18

8,3 ±1,530,4 ±3,863,2+3,385,0+2,295,0 ± 1,099,8+0,72

*Se repesentan valores medios ± EEM de (6-12)experimentos.Los valores de ocupación fraccional se obtuvierona partir de la ecuación 3 utilizando el valor de KAobtenido por comparación de las curvas dosis-efecto tras inactivación parcial con EEDQ 3.10-7

M con la curva promedio control.Los valores de % de respuesta máxima seobtuvieron a partir de las curvas control dosis-efecto completas para el agonista UK 14304 (0,1-10~4 nM).Resultados no publicados.

efecto para el agonista UK 14304 antes de quese produjera reducción en el efecto máximo(fig. 2).

Así, el bloqueo Irreversible del adrenoceptora2 con 10~8, ÍO-7 y 2,10-7 M de EEDQ provo-có Incrementos Importantes y significativos(p<0,001) en los valores de EC5o (10-8 MEc5o=O,92±O,O8nM; 10-7 M EC5o = H,78±0,64 nM y 2,10-7 M Ec5o = 27,21 + 1,4 nM)para la inhibición por UK 14304, cuando secompararon con los valores de la curva control(Ec50=0,64+ 0,06 nM) sin que se redujera elefecto máximo, cuyo valor sólo se vio reducidocuando se incrementó el grado de inactivación

10-10 ÍO-8 10-6

[UK 14304]M

io-4

Fig. 2. Curvas dosis-efecto correspondientes a la in-hibición por UK 14304 de la respuesta contráctil delconducto deferente de rata estimulado eléctricamente,antes (%) y después de su preincubación (15 min)con 10-s M (O), 10-7 M(M), 2.10-7 M (D), 3.10-7

M (A) y 10-6 (A) del antagonista irreversible EEDQ.Cada punto representa la media ± error estándar de4-12 experimentos. Nótese cómo el bloqueo progre-sivamente creciente del adrenoceptor 02 provocó re-ducción en el efecto máximo solamente tras despla-zamiento importante de la curva dosis-efecto haciala derecha. (Resultados no publicados).

del adrenoceptor a2- Así, la preincubación deltejido con EEDQ 3,10~7 M provocó un mayordesplazamiento hacia la derecha de la curvadosis-efecto (EC5o = 62,43+ 5,2 nM, p<0,001)y una reducción significativa del efecto máximo(A = 39,3±5,2%, p<0,01), que fue mayortras preincubación con 10~6 M (A=71,8 ±1,2%, p<0,01) (tabla II).

57

A. BADI'A, A. DOMÍNGUEZ - GIL, J. GARZÓN

ooX

E

100-

80-

60-

40-

20-

00-

iIé0

/

i

2 4

[AR]

6 10

/ÍRT]xl00

15

Fig. 3. Relación ocupación fracciona!-respuesta frac-cional del adrenoceptor c/2 en conducto deferente derata para el agonista completo UK-14304. Cada puntorepresenta la media terror estándar de 6 experi-mentos. Puede apreciarse la naturaleza hiperbólicade la relación ocupación-respuesta y cómo con unaocupación inferior al 15 % de la población total de re-ceptores pueden lograrse valores porcentuales de res-puesta superiores al 90 % del efecto máximo. (Resul-tados no publicados).

Fig. 4. Curvas dosis-efecto correspondientes a lainhibición por UK 14304 de la respuesta contráctil delconducto deferente de rata estimulado eléctricamen-te en animales control (0) y tras tratamiento crónicocon desipramina (10 mg/Kg/24 h i.p., 14 días) (O).Cada punto representa la media t error estándar de8-12 experimentos. Fl tratamiento crónico con desi-pramina provocó un desplazamiento significativo dela curva dosis-efecto hacia la derecha sin modifica-ción en el efecto máximo. (Resultados no publicados).

A fin de estimar el valor de KA para el com-plejo agonista UK 14304-adrenoceptor a2 secompararon las distintas curvas obtenidas traspreincubación del tejido con 3,10~7 M deEEDQ con la curva promedio control, obtenién-dose las concentraciones equiefectivas (30, 40,50, 60 y 70% del efecto máximo tras inactiva-ción) antes y después de la inactivación.

El valor promedio de KA obtenido por ajusteno lineal de estos valores equiefectivos a la ecua-ción (6-a) fue de 63,2 + 5,2 nM, lo cual sugie-re por discordancia con el valor Ecso de la cur-va control la presencia de una importanteproporción de receptores de reserva «2 en con-ducto deferente de rata.

A partir del valor de KA y aplicando la ecua-ción 3 se obtuvieron valores de ocupación frac-cional del adrenoceptor «2 para las distintasconcentraciones de éste (tabla III) de tal modoque, y siendo conocido el efecto promovido porcada concentración, se pudo «construir» la re-lación ocupación-efecto (fig. 3) y por ajuste ala ecuación 7, el valor de Ke. El valor del por-centaje de receptores cuya ocupación es reque-rida para lograr el 50% del efecto máximo (Ke),así obtenido, fue de 1,05 + 0,11 %.

Como aproximación al valor del porcentaje dereceptores de reserva se estimó, a partir del va-lor Ke, la ocupación fraccional que promueve el98% del efecto máximo, obteniéndose un va-lor de 28,4 + 3,1 %, de donde podríamos asig-nar con un mínimo error un valor del 71,6 ±3 ,1% para la población de receptores de re-serva «2 en conducto deferente de rata.

A fin de evaluar el posible papel funcional deesta importante población de receptores de re-serva y su posible modulación por tratamientofarmacológico, se estudió el efecto sobre elladel tratamiento crónico con desipramina(10 mg/kg/24 h i.p. 14 d), realizándose, en ani-males tratados, curvas dosis-efecto para UK14304 antes y después de la inactivación par-cial del adrenoceptor «2 con EEDQ (3,10~7 M).

El tratamiento crónico con desipramina pro-vocó una importante desensibilización del adre-noceptor «2 inhibitorio en conducto deferentede rata (fig. 4), observándose un incremento im-portante del valor de la EC5o para UK 14304(Ec5oControl=0,64+0,06nM; Ec5oDMI = l,9O +0,18 nM, p<0,001, n = 6), en concordancia conresultados publicados por otros autores34.

La preincubación del conducto deferente trastratamiento con desipramina con una concen-tración de 3,10~7 M de EEDQ provocó un im-portante desplazamiento de la curva de inhibi-ción hacia la derecha (EC5o = 195,6+22,7,

58


Fig. 5. Relación ocupación fracciona!-respuesta frac-cional del adrenoceptor a2 en conducto deferente derata para el agonista completo UK-14304 en anima-les control (%) y tras tratamiento crónico con desipra-mina (10 mg/Kg/24 h i.p., 14 días) (O). Cada puntorepresenta la media ± error estándar de 6-8 experi-mentos. El tratamiento con desipramina provocó undesplazamiento hacia la izquierda de la curva ocu-pación fraccional-respuesta fraccional lo cual sugie-re un incremento en la reserva funcional del adreno-ceptor cu. (Resultados no publicados).

p< 0,001) con una reducción en el efecto má-ximo (A=31,7 ±4,9%) ligeramente inferior a laque se indujo en animales control y permitió ob-tener estimas del valor de la constante de diso-ciación en equilibrio (KA=468,1 +93,5 nM).

Así, la desensibilización inducida por desipra-mina se acompañó de un incremento importantedel valor de la constante de disociación del com-plejo agonista-receptor (KA = 468,1 +93,5 nM)y de una reducción significativa en la ocupaciónfraccional requerida para lograr el 50% del efec-to máximo (Ke=0,53+ 0,09%, p<0,001). Detal modo que para este nivel de respuesta pue-de afirmarse que el tratamiento crónico con de-sipramina provoca un incremento en la reservafuncional de adrenoceptores «2 en conductodeferente de rata (fig. 5), si bien, y en contra-posición, la población de receptores de reservaa un nivel de respuesta del 98% no presentódiferencias significativas frente a control. Así, laocupación fraccional requerida para lograr el98% del efecto máximo tras tratamiento con elantidepresivo fue de 23,10 + 5%.

Los resultados presentes demuestran la exis-tencia de una importante población de recep-tores de reserva para el adrenoceptor a2 en

conducto deferente de rata y apuntan la posibi-lidad de modulación farmacológica de la rela-ción ocupación-efecto en los procesos de de-sensibilización.

El hecho de que la población de receptoresde reserva pueda ser modulada por tratamien-to farmacológico refuerza la dificultad que suexistencia plantea para la extrapolación de re-sultados funcionales a partir de estudios bioquí-micos, o, en sentido inverso, la estima de pará-metros bioquímicos a partir de estudiosfuncionales. En un plano teórico, el significadofuncional de modificaciones inducidas por tra-tamiento farmacológico en los parámetros bio-químicos de densidad y afinidad del receptorpodría verse amortiguado o potenciado por va-riaciones en la relación ocupación-efecto del sis-tema.

La valoración del acoplamiento receptor-efector a partir de la relación ocupación-efectoy de su modulación farmacológica puede sinduda ser de gran valor en el conocimiento delos procesos de neurotransmisión y aportar da-tos importantes para la mejor comprensión delos mecanismos de acción farmacológica.

BIBLIOGRAFÍA

1. Clark AJ. The reaction between acetylcholineandmuscle cells. J Physiol (Lond) 1926; 61: 530-546.

2. Gaddum JH. The action of adrenalin and ergota-mine on the uterus of the rabbit. J Physiol (Lond)1926; 61: 141-150.

3. Gaddum JH. The quantitative effects of antago-nistic drugs. J Physiol (Lond) 1937; 89: 7-9.

4. Stephenson RP. A modification of receptor theory.Br J Pharmacol 1956; 11: 379-393.

5. Nlckerson M. Receptor occupancy and tissue res-ponse. Nature 1956; 178: 679-698.

6. Ariens EJ, Beld AJ, Demiranda JFR, Simonis AM.The pharmacon-receptor-effector concept. A ba-sis for understanding the transmission of informa-tion in bllogical systems. En: O'BRIEN RD, ed. Thereceptors, a comprehensive treatise. Nueva York,Plenum Press, 1979; 33-91.

7. Furchgott RF. The use of 0-h alloalkylamines inthe differentlation of receptors and ¡n the deter-mlnation of dissociation constants of receptor-agonlst complexes. Advan Drug Res 1966; 3:21-55.

8. Ruffolo RR Jr. Review: important concepts of re-ceptor theory. J Auton Pharmacol 1982; 2:277-295.

9. Barlow RB, Scott NC, Stephenson RP. The affinityand efficacy of onium salts on the frog rectus ab-dominis. Brit J Pharmacol 1967; 31: 188-196.

10. Waud DR. On the measurement of the affinity ofpartial agognists for receptors. J Pharmacol ExpTher 1969; 170: 117-122.

59


11. Furchgott RF, Bursztyn P. Comparison of diso-ciación constants and of relative efficacies of se-lected agonists acting on parasympathetic recep-tors. Ann NY Acad Sci 1967; 144: 882-899.

12. Thron CD. Graphical and weighted regressionanalysis for the determination of agonist dissocia-tion constants. J Pharmacol ExpTher 1970; 175:541-553.

13. Parker RB, Waud DR. Pharmacological estima-tion of drug-receptor dissociation constants. Sta-tistical evaluation. I. Agonists. J Pharmacol ExpTher 1971; 177: 1-12.

14. McPherson GA, Molenaar P, Raper C, Malta E.Analysis of dose-response curves and calculationof agonist dissociation constants using a weigh-ted nonlinear curve fitting program. J PharmacolMeth 1983; 10: 231-241.

15. Black JW, Leff FRS. Operational models of phar-macological agonism. Proc R Soc Lond 1983;B220: 141-162.

16. Cox BM, Chavkin C. Comparison of dynorphin-selective kappa receptors in mouse vas deferentsand guinea pig ileum: spare receptor fraction asa determinant of potency. Mol Pharmacol 1983;23: 36-43.

17. Know YC, Moore GJ. Photoaffinity labeling of ratisolated portal veim determinants of affinity cons-tants and spare receptors for angiotensins II andIII. J Pharmacol Exp Ther 1984; 231: 137-140.

18. Lin CW, Musacchio JM. The determination of dis-sociation constants for substance P and substan-ce P analogues in the guinea pig ileum by phar-macological procedures. Mol Pharmacol 1983;23: 558-562.

19. Meller E, Bohmaker K, Namba Y, Friedhoff AJ,Goldstein M. Relationship between receptor oc-cupancy and response at striatal dopamine auto-receptors. Mol Pharmacol 1987; 31: 592-598.

20. Alder CHH, Meller E, Goldstein M. Receptor re-serve at the alpha2-adrenergic receptor ¡n the ratcerebral cortex. J Pharmacol Exp Ther 1987; 240:508-515.

21. Siegl PK, McNeill JH. Antagonism with dibena-mine D-600 and Ro 3-7894 to estímate dissocia-tion constants and receptor reserves for cardiacadrenceptors in ¡solated rabbit papillary muscles.Can J Physiol Pharmacol 1982; 60:1.131-1.137.

22. Minneman KP, Fox AW, Abel PW. Occupancy ofalphai-adrenergic receptors and contraction of

rat vas deferens. Mol Pharmacol 1983; 23: 359-368.23. Minneman KP, Abel PW. Spare alphai-adrenergic

receptors and the potency of agonists in rat vasdeferens. Mol Pharmacol 1984; 25: 56-63.

24. Besse JC, Furchgott RF. Dissociation constantsand relatives efficacies of agonists acting on alp-ha adrenergic receptors in rabbit aorta. J Phar-macol Exp Ther 1976; 197: 66-78.

25. Sheys EM, Green RD. A quantitative study of alphaadrenergic receptors in the spleen and aorta ofthe rabbit. J Pharmacol Exp Ther 1972; 180:317-325.

26. Guimaraes S, Paiva MQ. Postsynaptic alpha-adrenoceptor reserve and the shift of theconcentration-response curves to the right, as cau-sed by the irreversible alpha-adrenoceptor anta-gonist phenoxybenzomine. Br J Pharmacol 1987;92: 505-512.

27. Zieherlm, Jaim-Etcheverry G. Regional variationsin the distribution of noradrenaline along the ratvas deferens. J Pharm Pharmacol 1971; 23:61-62.

28. Farmer SG. Noradrenaline and ATP-Cotrans-mitters? Trends Pharmacol Sci 1985; 6: 10-11.

29. liles P, Dorge L. Mechanism of alpha2-adrenergicinhibition of neuroeffector tranmission in the mou-se vas deferens. Naunyn Schmiedeberg's ArchPharmacol 1985; 328: 241-247.

30. Yamoaka K, Tanigawara Y, Nakawa T, Uno T. APharmacokinetic analysis program (MULTI) for mi-crocomputer. J Pharm-Dyn 1981; 4: 879-885.

31. Adler CH, Meller E, Goldstein M. Recorvery ofalpha2-adrenoceptor binding and function afterirreversible inactivation by N-ethoxycarboxy-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ). EurJ Phar-macol 1985; 116: 175-178.

32. Cambridge D. UK-14304 a potent and selectivealpha2-agonist for the characterization of alpha-adrenoceptor subtypes. EurJ Pharmacol 1981;72: 413-415.

33. Berridge TL, Gadie B, Roach AG, Tulloch IF.Alpha2-adrenoceptor agonists induce midriasis inthe rat by an action within the central nervoussystem. Br J Pharmacol 1983; 78: 507-515.

34. García-Sevilla JE, Zubieta JK. Activation and de-sensitization of presynaptic alpha2-adrenoceptorsafter inhibition of neuronal uptake by antidepres-sant drugs in the rat vas diferents. Br J Pharma-col 1986; 89: 673-683.

DISCUSIÓN

E. MORCILLO: En primer lugar quisiera pedir alDr. Barturen que comentara su punto de vis-ta sobre la posible relación entre receptoresde reserva y receptores silentes, es decir, aque-llos receptores en los cuales se supone quehabría una fijación del fármaco y que ésta, sinembargo, no resultaría eficiente.

Otro aspecto que me gustaría que comenta-se, si es posible, es cuál sería el significadode la N que aparece en la ecuación de Wand,que supongo guarda alguna relación con elcoeficiente de Hill, una de las transformacio-nes lineales que por alguna razón ha caído enun relativo desuso.

60


En tercer lugar querría preguntar en relacióncon los experimentos que ha presentado síademás de los datos con desipramina en untratamiento crónico dispone también de da-tos utilizando otros inhibidores pero in vitro, esdecir, directamente en un órgano aislado, notras un tratamiento in vivo prolongado; y cuálpodría ser el mecanismo de desensibilización.

F. BARTUREN: Empezando por la última pre-gunta, éstos son los resultados piloto y toda-vía no están publicados. El único tratamientoensayado ha sido la desipramina. En un futu-ro intentaremos inducir desensibilización porotros métodos para ver si este aumento de laeficacia del sistema es algo que acompaña deforma general a distintos procesos de desen-sibilización.Con respecto a la primera pregunta quisieraindicar que receptores de reserva y receptoressilentes son conceptos diferentes que merecela pena diferenciar puesto que la terminolo-gía puede inducir a error. Así, por receptoresde reserva se entiende la proporción de re-ceptores cuya ocupación por el agonista no esnecesaria para lograr el efecto máximo ya queéste se alcanza con una ocupación fraccionalinferior a la unidad, mientras que, como haindicado el Dr. Morcillo, por receptores silen-tes se entiende aquella población cuya ocu-pación no desencadena respuesta funcionalalguna. Estos conceptos, aunque práctica-mente contrapuestos, guardan una estrecharelación por cuanto ambos suponen aceptarla no linearidad de la función ocupación-efecto.En lo referente a la relación del parámetro Nde la ecuación de Wand con el coeficiente deHill quisiera señalar que si bien existe una pro-ximidad numérica entre ellos, existen diferen-cias matemáticas y conceptuales que los dis-tinguen. La ecuación de Hill pretende estimarel grado de alejamiento de la interacciónfármaco-receptor de la clásica hipérbola rec-tangular que predice la ley de acción de ma-sas. En ella, el parámetro N, que se definecomo la potencia a la que se eleva la variableindependiente (concentración de fármaco) enuna distribución de tipo hipérbola rectangu-lar, representa el número de lugares de fija-ción por molécula de receptor. Frente a ella,la constante N de la ecuación de Wand surgede asumir la no necesaria relación lineal en-tre ocupación y efecto y por lo tanto la no obli-gatoriedad de que la función ocupación-efectosiga una distribución hiperbólica rectangular,en un intento de dar flexibilidad al ajuste nolineal. La N de la ecuación de Wand se define

como la potencia a la que se eleva tanto la va-riable independiente como el parámetro Ecsoen la ecuación hiperbólica clásica. En nues-tro caso y en una primera fase, estimamos lashipérbolas sin la potencia N y comprobamosque la introducción de este factor reducía engran medida el error estándar.

E. MORCILLO: Sólo por curiosidad, ¿qué valo-res de N se obtenían?

F. BARTUREN: Muy próximos a uno. El valormás lejano a 1 fue 1,19, pero sin embargo,aun con valores comprendidos entre 0,87 y1,16, la bondad de ajuste era muy superior.

J. GARCÍA RAFANELL: Quisiera plantear unacuestión de tipo general. En mi opinión existeun cierto paralelismo entre la interacciónagonista-receptor y lo que ocurre en bioquí-mica cuando se estudia la interacción entreel substrato y la enzima mediante estudios deinhibición enzimática. Hay un aspecto básicopara plantear cualquier estudio de inhibicióno de interacción entre enzima y substrato, yes que para poder aplicar cualquier modelomatemático, uno debe asegurarse de queexiste saturación de la enzima por el substra-to, es decir, que el número de receptores ode centros activos que hay reales, es siempreinferior al número real de moléculas físicas desubstrato. SI previamente esto no puede de-mostrarse, no tiene sentido aplicar ninguna ci-nética enzimática o por lo menos la cinéticaclásica de Michaelis Menten. Hay un experi-mento muy sencillo a nivel bioquímico queconsiste en doblar la concentración de enzi-ma y ver si la actividad enzimática se doblaexactamente. Ello demuestra que existen con-diciones de saturación de la enzima por elsubstrato y si estas condiciones no se cum-plen el experimento es incorrecto.¿Existe en los estudios de interacción entreagonista y receptor, algún tipo de experimen-to previo que permita afirmar que se estáncumpliendo estas condiciones?

F.J. MORALES-OLIVAS: No es que la interacciónfármaco-receptor y la cinética enzima-substra-to sean parecidas, es que son idénticas y elproblema es idéntico. Con alguna frecuenciatambién nos encontramos estudios que des-de el punto de vista farmacológico son inco-rrectos porque se intenta hacer inferencias apartir de curvas dosis-respuesta que no estánsaturadas. Y esto es especialmente frecuentecuando después se utiliza un antagonista detipo competitivo, situación en la que lógica-mente es necesario utilizar dosis mucho másaltas del agonista para conseguir la saturación.

61


Quisiera además hacer una reflexión sobre elproblema de la desensibilización de los recep-tores en los tratamientos crónicos y la relaciónentre proceso de desensibilización y númerode receptores de reserva en el sentido de queello tiene un interés muy superior al del puroacademicismo farmacológico, ya que desdeel punto de vista terapéutico puede tener unagran influencia. Pensemos, por ejemplo, enel problema muchas veces descrito de la pér-dida de respuesta a los betamiméticos en pa-cientes asmáticos. Es posible que este fenó-meno guarde relación con ese tipo de proce-sos. Es decir, en tratamientos crónicos en losque está descrita la desensibillzaclón el nú-mero de receptores de reserva en el tejido dia-na del agonista podría condicionar una ma-yor o menor duración de la eficacia terapéutica.

F. BARTUREN: Esta es una observación muyinteresante. Hasta tiempos muy recientes seha Intentado explicar todo en función de dosparámetros principales: la densidad de recep-tores y la afinidad del receptor por el agonis-ta. Y quizá exista un tercer parámetro o inclu-so otros que también puedan estar alteradosy se nos escapan cuando utilizamos exclusi-vamente estudios de .fijación con radioll-gandos.

E. RUBIO: Quería volver al aspecto comentadopor el Dr. Morcillo en el sentido de que en losdatos presentados por el Dr. Barturen la In-terpretación de la N en este caso es un pocodistinta de la interpretación de la N en la ecua-ción de Hill en cuanto a coeficiente represen-tativo del grado de cooperatividad de la uniónfármaco-receptor o incluso de la posibilidadde unirse varias moléculas a un mismo re-ceptor.

F. BARTUREN: Efectivamente, IntroducírnoslaN en la curva dosis-efecto. Es decir, estamospresuponiendo que hay una serie de casca-das enzimáticas o reacciones químicas pos-teriores que desconocemos, que podrían apar-tarse mucho de una distribución matemáticasimple.

S. ERILL: ¿Existe algún dato sobre posible va-riación de la dotación de receptores de reser-va con la edad? ¿Sería relativamente fácil es-tudiarlo en animales?

F. BARTUREN: Yo no he encontrado nada. Enrealidad lo único que he encontrado en la bi-bliografía son algunos datos sobre modulaciónde los receptores de reserva en tratamientocrónico con morfina. No se ha valorado real-mente como un parámetro que pueda ser mo-dificado por la edad, situaciones patológicas,o tratamientos farmacológicos.

S. ERILL: De hecho, la pregunta surgía a partirde un comentario anterior sobre el receptoradrenérgico. Hay datos en la literatura sobremodificaciones en la sensibilidad del recep-tor beta-adrenérgico con la edad, pero los da-tos no son concluyentes. Inicialmente se pensóque la sensibilidad y la afinidad del receptorbeta-adrenérgico tanto a agonistas como a an-tagonistas disminuía con la edad, en el hom-bre, pero posteriormente aparecieron algunosdatos contradictorios. Quizá el carácter con-tradictorio de los hallazgos se deba en buenamedida a que no se ha considerado el papelde los receptores de reserva y sería muy inte-resante disponer de datos para poder inter-pretar estas observaciones.

F. BARTUREN: Estoy totalmente de acuerdo.J. GARZÓN: Quisiera hacer una reflexión sobre

la población de receptores de reserva y el usode substancias agonistas en tratamientos cró-nicos. Creo que en muchos casos se planteala siguiente pregunta: ¿Qué es más convenien-te, utilizar una substancia muy potente queocupe pocos receptores o una substancia me-nos potente? Lo digo porque muchas veceslo que importa es el efecto que se intenta con-seguir, el cual va a condicionar posiblementela desensibilización más que la ocupación pro-piamente dicha. Esto implica que cuando seutiliza una substancia muy potente que enprincipio tiene muchos receptores de reser-va, la reducción de ésta es más rápida. Enciertos sistemas, especialmente cultivos celu-lares, se ha podido demostrar que substan-cias que tienen muy poco nivel de ocupación,que son muy potentes, producen, sin embar-go, una pérdida de receptores rapidísima encomparación con otras que precisan ocuparmucho más. Sin embargo, no sé hasta quépunto esto puede significar una ventaja deprincipio o no. Es un comentario simplemente.

62

Análisis de datos en estudios de receptorespor autorradiografía

A. Pazos y A.M. GonzálezDepartamento de Fisiología y Farmacología. Sección de Farmacología. Facultad de Medicina. Universidad de Cantabria.

Santander.

Introducción

El desarrollo de las técnicas de mareaje dereceptores mediante el uso de radioligandos es-pecíficos, habitualmente conocidas como téc-nicas de binding, ha permitido identificar y ca-racterizar bioquímicamente la amplia variedadde receptores para neurotransmisores hastaahora descritos1. Esta caracterización se haproducido tanto en el sistema nervioso centralcomo en el periférico. Sin embargo, desde unpunto de vista anatómico, la resolución de es-tos métodos es muy limitada. Las técnicas demareaje autorradiográfico de receptores tienencomo objetivo primordial superar esta limitación.Para ello combinan los principios metodológicosde la autorradiografía para substancias difusi-bles2'3, con las bases del mareaje por fijaciónde radioligandos4. Por esta razón, la autorradio-grafía de receptores comparte con los análisisde binding toda una serie de requisitos, tantolos relativos al ligando —afinidad, especifici-dad—, como los inherentes a las condiciones deincubación —tiempo, temperatura, pH— oaquellos referentes a la especificidad de la fija-ción —definición del «no específico»4"6. Meto-dológicamente, el mareaje se realiza mediantela incubación con el radioligando de seccioneshísticas obtenidas por microtomía de congela-ción. Tras una fase de secado, los tejidos se cu-bren con una emulsión fotográfica rígida radio-sensible cuyo revelado, tras un adecuado tiempode exposición, permite obtener una imagen hís-tica: el autorradiograma. En esta imagen, com-puesta de granos de plata originados en la emul-sión por la emisión de electrones por parte dela molécula radiactiva, la intensidad de gris —densidad óptica— es, por tanto proporcional ala cantidad de radiactividad fijada47 (fig. 1).Como se discutirá ampliamente más adelante,mediante la utilización de curvas de calibracióny sistemas computadorizados de análisis ópti-co es posible cuantificar la densidad de recep-

tores en cada área con el nivel de resolución delmicroscopio óptico841. El procedimiento descri-to constituye lo que habitualmente se conocecomo autorradiografía in vitro, a diferencia delmareaje in vivo, en el cual se administra el li-gando radiactivo al ser vivo, sacrificándolo pos-teriormente y obteniendo el tejido problema quees entonces cortado y expuesto a la emulsiónbajo las condiciones ya citadas. El procedimientode mareaje autorradiográfico in vivo presentagrandes limitaciones4 y es poco usado, por loque no nos referiremos específicamente a él enesta revisión.

Cb

Fig. 1. Distribución autorradiográfica de receptores se-rotonérgicos 5-HTi en el cerebro de rata (A) y de re-ceptores muscarínicos colinérgicos en cerebro huma-no, a la altura de los ganglios básales (B). Las áreasoscuras son aquéllas ricas en fijación radiactiva. Nó-tese la alta densidad de receptores 5-HTj en el hipo-campo (H) y las láminas IV-VI del neocórtex (Cx) derata, en contraste con la escasa densidad en las lá-minas cerebelosas (Cb). En el ser humano, se ilustrala riqueza de receptores muscarínicos en el caudado(C), putamen (P) y claustro (Cl), frente a su esca-sez en el globo pálido (GP). Imágenes magnificadas1x7 (A) y 1x2 (B).

63


ro

n~O- 0co

Den

1.000500

200

10050

2010

5

2

A

J/

//

1 5 10120Espesor

//

/

tica

Q-O"O

sida

a>O

50100200 500sección

200

100

50-

B

J 5 10 20 40 100Espesor sección

Fig. 2. Densidades óp-ticas obtenidas al expo-ner a la emulsión unaconcentración determi-nada de 14C (A) y de3H (B), en función delespesor de la secciónhística expuesta. Seobserva que pequeñasmodificaciones en elespesor generan gran-des cambios de densi-dad óptica para el 14C,mientras no hay varia-ciones relevantes parael3H. (Tomada de J.M.Alexander et alu, conautorización.)

Valoración de resultadosautorradiográficos: análisis farmacológicosy análisis densitométricos

De lo expuesto hasta aquí, se deduce que latécnica de mareaje autorradiográfico de recep-tores proporciona un alto nivel de informaciónmorfológica, manteniendo las posibilidades decaracterización bioquímica. Ello ha dado lugara la aplicación de esta técnica desde dos pers-pectivas muy diferentes: el uso de los principiosde binding como nueva herramienta para iden-tificar la distribución anatómica microscópica deun receptor (estudios de mapeo)4, y el aprove-chamiento de la mayor resolución morfológicacomo un factor más en el momento de analizarcon detalle las propiedades del receptor11 (es-tudios farmacológicos). Por otra parte, la obten-ción de autorradiogramas está íntimamente li-gada a los problemas de la densitometría, del

análisis de imágenes y de la microscopía12. Portanto, al abordar los problemas relacionados conel análisis de datos en estudios de autorradio-grafía, es inevitable hacerlo a dos niveles dife-rentes: el nivel de la información sobre las ca-racterísticas farmacológicas del receptor mar-cado y el nivel óptico de la interacción radioli-gando-emulsión y las diversas variables densito-métricas que aparecen a partir de dicha interac-ción y que permiten la cuantificación del auto-rradiograma.

Factores diferenciales en la generacióndel autorradiograma: radioligandosy emulsiones

El proceso de formación del autorradiogramadepende en gran medida del tipo de isótopo uti-lizado. Como queda reflejado en la tabla I, exis-ten importantes diferencias entre los isótopos en

TABLA IPROPIEDADES FÍSICAS DE LOS ISÓTOPOS RADIACTIVOS

i en TD ODloU lUrU

3H14C

3 5 S

125|

32p

n(días)

4,5 x 103

19,6 x 105

87,460,0

14,3

PARTÍCULAEMITIDA

/30

e. extranucl.Radiología

ENERGÍA(KE V)

18,6156167

2,7 (28 %)3,6 (49 %)

22,5 (14 %)31,0 (7%)34,3 (2%)

1.709Vida media.

64

ANÁLISIS DE DATOS EN ESTUDIOS DE RECEPTORES POR AUTORRADIOGRAFIA

lo referente a la vida media, tipo de emisión y,lo que es más importante, energía máxima. Unaalta energía implica un gran poder de penetra-ción a través del tejido y, en virtud de ello, unmenor nivel de resolución anatómica13'14. Estosupone una seria limitación para utilizar isóto-pos tales como 14C, 35So, 32P. Además, su ele-vada capacidad de penetración origina que mí-nimas variaciones en el espesor de la secciónhística pueden dar lugar a errores importantesen el proceso de cuantificación (véase más ade-lante). En contraste con esto, los radioligandostritiados, por poseer una energía muy baja,tienen un escaso poder de penetración—alrededor de 5-7 /tm— lo que les confiere unalto nivel de resolución anatómica y un ampliomargen de seguridad en cuanto a variacionesen el espesor de la sección1 (fig. 2). De todo loanteriormente expuesto se deduce que, desdeel punto de vista de resolución, el 3H presentaindudables ventajas para los estudios autorra-diográficos. Sin embargo, el empleo de ligan-dos tritiados presenta dos limitaciones impor-tantes: a) la necesidad de exponer los tejidosa la emulsión durante largos períodos de tiem-po, debido a su baja energía, y b) la atenuacióndiferencial de la emisión energética en funciónde la composición química del tejido que emi-te la partícula /3, por ejemplo, substancia grisfrente a substancia blanca en el sistema ner-vioso. Ambos problemas se comentarán en pro-fundidad más adelante.

Estos problemas han sido parcialmente re-sueltos con el uso de radioligandos yodados,cuya energía máxima (tabla I) permite todavíaun nivel de resolución adecuado. Estos radioli-gandos requieren períodos de exposición mu-cho más cortos y no presentan el problema dela diferente absorción en función de la compo-sición química hística9.

En cuanto a la emulsión fotográfica rígida dondese genera la imagen autorradiográfica, puedetratarse de colocar en un portaobjetos muestrasindividuales impregnadas en emulsiones líquidas,por ejemplo, Kodak NTB3 (coverslip) o de filmesradiosensibles especialmente diseñados para fa-vorecer la autorradiografía con tritio. Aunque elmétodo del coverslip parece poseer un gradode resolución ligeramente mayor al obtenido conel filme4'7, la necesidad de procesar individual-mente cada sección enlentece extraordinaria-mente el proceso de generación de autorradio-gramas y dificulta su cuantificación. Por ello, eneste momento la gran mayoría de estudios demareaje de receptores por autorradiografía serealizan utilizando el método del filme.

sica

o.•o• D03

'tñcÍD

Q

:¡ca

•o

sid

cQ

A

100

80

60

40

20

100 300 500 700

Exposición (dpmxdías / mg tejido) xlO~3

B

120-

100-

80

60-

40

20-

\% - - - r

yi*rT7

1wy •

4 5 6 7Log exposición (dpmxdías / mg tejido)

Fig. 3. A) Relación entre el nivel de radiactividad ex-puesto por unidad de tiempo y la densidad óptica ob-tenida. B) Transformación logarítmica de la relaciónanterior. (Tomada de J.R. Unnerstall12, con autoriza-ción.)

Debido a la escasa energía de los ligandos tri-tiados, no es posible utilizar filmes radiológicosconvencionales, porque las partículas beta noatraviesan la película protectora externa de di-chos filmes. Por ello se recurre a láminas espe-ciales, sin película protectora, de las cuales exis-ten solamente dos en el mercado: el 3H-Ultro-film (LKB)10'15 y el Hyperfilm3H (Amersham).Las propiedades de ambos filmes son muy si-milares, consiguiendo una resolución muy altaen tejidos incubados con ligandos tritiados.

En 1982 Unnerstall et al12 estudiaron el com-portamiento o respuesta del filme a la cantidadde radiactividad, es decir, la relación entre la

65

A, BADIA A. DOMÍNGUEZ - GIL, J. GARZÓN

H

..'/<'

Fig. 4. Imagen autorradiográfica de una serie de es-tándares de pasta cerebral de materia gris montadossobre portaobjetos gelatinizados y expuestos a 3H-Ultrofilm durante 5 días. A-H corresponden a las can-tidades de radiactividad descritas del 1 al 8 en la ta-bla II. I representa el background del filme. (Tomadade J.R. Unnerstall et al12, con autorización.)

concentración de la radiactividad presente enel tejido y la densidad óptica (DO) generada enel filme. Para ello, expusieron, a diversos tiem-pos, secciones hísticas que contenían diferen-tes cantidades de una substancia tritiada (me-didas previamente por centelleo en seccionesconsecutivas a las anteriores), y valoraron pordensitometría el mareaje obtenido. Como semuestra en la figura 3, la relación existente en-tre la densidad óptica y el factor «exposición»(radiactividad/mg tejido x tiempo) es una hipér-bola que se transforma en recta cuando se re-laciona con el log exposición (DO = 0,0017 xexposición0'8090).

Sin embargo, dicha transformación no es váli-da en las zonas de densidad óptica muy alta ymuy baja. Este hecho ilustra la peculiar respues-ta del filme a la radiactividad12. Estos estudiospermitieron desarrollar ecuaciones para calcularel período de exposición de un tejido determina-do, pero, sobre todo, fueron el inicio de los siste-mas de estandarización y cuantificación autorra-diográfica que revisamos a continuación.

Problemas ligados a la cuantificaciónde autorradiogramas

El proceso de cuantificación de autorradiogra-mas se basa en la asunción del principio segúnel cual, el nivel de densidad óptica —fácilmentevalorable con un densitómetro— está relaciona-do con la cantidad de radiactividad presente enel tejido. Como se ha expuesto anteriormente,esta relación empezó a estudiarse al valorar larespuesta del filme a la radiactividad12. Sin em-bargo, un intento serio de cuantificación reque-ría la existencia de tejidos patrón, es decir, teji-dos que contuviesen concentraciones conocidasde radiactividad que pudieran exponerse al fil-me conjuntamente con los tejidos experimen-tales, permitiendo la realización de un calibra-do. Por esta razón, Unnerstall et al12, en 1982,diseñaron una serie de estándares o patroneselaborados con una mezcla de pasta de cere-bro y concentraciones crecientes de un radioli-gando tritiado volátil. Tras su desecación y com-pactación, estos bloques fueron cortados ymontados sobre portas, lo que permitió su ex-posición al filme y el análisis densitométrico desu respuesta (fig. 4). Al mismo tiempo, se con-taron por centelleo las concentraciones realesde radiactividad y se determinó el contenido deproteínas. En la figura 5 se observa que existeuna relación lineal entre el In de la densidad óp-tica y el In de la concentración de radiactividadpresente en los estándares. De esta forma, laaplicación combinada de la densitometría cuan-titativa y el manejo de patrones estándar supu-so el comienzo de la verdadera autorradiogra-fía cuantitativa de receptores9'12.

Sin embargo, existe una serie de limitacionesy problemas en el proceso de cuantificaciónautorradiográfica. Estas limitaciones se refierenfundamentalmente a los fenómenos de autoab-sorcíón diferencial (quenching), estados de so-bre o ¡nfraexposición y homogeneidad del grisde base.

Como ya se ha comentado, debido a la bajaenergía de emisión del tritio se produce un fe-nómeno de absorción por parte del tejido y esta

66


Fig. 5. Relación linealentre el ln de la den-sidad óptica y el ln dela radiactividad conte-nida en los patrones(estándares) de pastacerebral de substan-cia gris y substanciablanca. Relación co-rrespondiente al tritioen función de la su-perficie (A) y en fun-ción de la masa (B),y relación correspon-diente al yodo-125,en función de la su-perficie (C) (Modifica-da de M.J. Kuhar yJ.R. Unnerstall9, conautorización.)

caóp

t•ora

c:

73

1

0

-0 ,2

- 0 , 4

-0 ,6

- 0 , 8

-1,0

1 2

A

• Tritio

'• / . /

1 / /' /' Á

6 8

Ln dpm

V/

•Gris•Blanca

10

m m ~ 2

• Tritio

/

• Á

7,,8

Ln dpm

B

/•

10

mg

C

•Gris•Blanca

0,6

0,2

-0,2

-0,6

-1,0

-1,4

-1,8

- Yodo-125

: f¿f

12 2 4- 1 tejido Ln dpm

y/

• Gris•Blanca

6mm^2

absorción depende de la densidad hística9. Enel cerebro, dado que la substancia blanca esmás densa que la gris, esta última absorberáproporclonalmente menos rayos /3 que la prime-ra. Como consecuencia de ello, no es posibleanalizar cuantitativamente las densidades auto-rradiográficas en substancia gris y substanciablanca con un mismo patrón de calibración(fig. 5), lo que ha obligado a la fabricación depatrones selectivos de ambas substancias9. Sinembargo, esta medida no resuelve totalmenteel problema de la Influencia del quenching di-ferencial sobre la cuantificación de autorradio-gramas, ya que a lo largo del cerebro se encuen-tran núcleos que presentan diferentes propor-ciones de substancia gris y blanca. Para obviaresto, se han propuesto diversos sistemas:1. Eliminación de los lípidos hísticos previa a la

incubación, mediante extracción con clorofor-mo16, tratamiento con alcohol17'18, etc. Al mo-dificar la densidad hística, estos procesos redu-cen la absorción diferencial9'16-18. Sin embargo,los métodos de desllpidación no pueden apli-carse a veces a los tejidos, dependiendo del li-gando con el que se pretenda Incubarlos.2. Obtención, mediante los procedimientos an-teriores, de un mapa de factores de correcciónpara cada núcleo cerebral que refleje las varia-ciones anatómicas18.3. Pretratamiento radiactivo de los portaobjetossobre los que van a montarse los tejidos, redu-ciendo así la atenuación diferencial9.

Mediante estos procedimientos se ha palia-do en gran medida el fenómeno del quenchingregional al usar ligandos trltiados. Por supues-to, este problema no existe con el empleo de ra-

TABLA IICONCENTRACIÓN DE RADIACTIVIDAD EN LOS DIVERSOS PATRONES (DPM/MG x 103)

N.

12345678

PASTA CEREBRAL(SUBSTANCIA GRIS)

113312012,22,10,90,70,6

POLÍMERO

242202165121

744227

7

Polímero plástico

EQUIVALENTE MÍSTICOTEÓRICO

72,663,453,941,427,117,210,82,9

EQUIVALENTE MÍSTICOCALIBRADO'

73,361,052,836,325,819,314,44,3

COEFICIENTE DEEQUIVALENCIAS"

0,991,041,021,141,050,890,750,67

Calibrados con los patrones de pasta gris.Relación equivalente hístico teórico/equivalente hístico calibrado.

67

A. BADÍA, A. DOMÍNGUEZ - GIL, .. GARZÓN

Fig. 6. Ilustración de desplazamientos selectivospor autorradiografía. A muestra la fijación de 3H-5-HTen una sección de cerebro de rata. B corresponde auna sección consecutiva, incubada en presencia de10-8M (-J21009 y C, una tercera incubada con1CT7M 8-OH-DPAT. Se observa en B cómo (-)21009inhibe la fijación de 3H-5-HT en el subículo (S), lasubstancia negra (SNR) y el colículo superior (SuG),sin afectar al giro dentado del hipocampo (DG). EnC. 3-OH-DPAT presenta el patrón opuesto. Áreas comoel hipocampo son áreas ricas en receptores 5-HT¡A,mientras que el subículo y la substancia negra estánenriquecidos en receptores 5-HT¡B. Tomada de A.Pazos y J.M. Palacios19, con autorización.)

dioligandos yodados pues, debido a su mayorenergía, sufren un nivel de absorción casi des-preciable (fig. 5 c).

Recientemente, se ha añadido un nuevo fac-tor a tener en cuenta en relación con la autoab-sorción diferencial: la dificultad de fabricar re-

petidamente patrones (estándares) de pasta cere-bral ha dado lugar a la aparición de diversas se-rles de patrones comerciales, realizados mediantela mezcla de cantidades crecientes de radiactivi-dad con un polímero de metacrilato pulverizado.Mientras que la aparición de estos patrones co-merciales ha hecho posible la elaboración adicio-nal de estándares de 1 2 5 I , ha planteado en cam-bio el problema de su falta de sensibilidad frentea los fenómenos de quenching para el 3H yaque el polímero no posee substancia gris ni blan-ca8'9. En un intento de obviar esto se ha inten-tado extrapolar su valor de equivalencia tisular abase de recalibrarlos con patrones de pasta. Sinembargo, los valores obtenidos en estas extrapo-laciones no son siempre equiparables, puestoque dependen del grupo de patrones cerebralesusado, tal y como se ilustra en la tabla II.

Otro factor que puede interferir en el procesode cuantificacion autorradiografica es el hechode que el período de exposición sea demasia-do corto (¡nfraexposición) o demasiado largo (so-breexposición), ya que, como ya se ha reseña-do, cuando la densidad óptica se encuentra enniveles extremos, la respuesta del filme es dife-rente (fig. 3). Estos errores pueden evitarse conel cálculo previo del período de exposición teó-rico a partir de la fórmula:

exposición (días) =•2,5 xlO5

DPM/mg tejido

obtenida a partir de la ecuación de respuestadel filme12.

El último factor que debe tenerse en cuentaal proceder la cuantificación densitometrica deun autorradiograma es el nivel de gris basal delfilme, habitualmente conocido como back-ground, que puede variar sensiblemente de unfilme a otro. Estas variaciones deben cuantifi-carse siempre con el fin de corregir adecuada-mente las medidas de densidad.

En la actualidad todos los procesos y cálcu-los citados en este apartado se realizan habitual-mente mediante el uso de sistemas computa-dorizados de análisis de imágenes46. Estossistemas constan esencialmente de un densi-tómetro, un macroscopío acoplado a una cáma-ra de alta resolución y un ordenador. Una vezlocalizada y amplificada el área a medir, ésta esseleccionada mediante un lápiz o tablero sen-sible a la luz, procediendo a cuantificar su den-sidad óptica, a partir de una escala de gris cuyanumeración de 0 a 256 valora la transmitancia(inversa a la densidad óptica). La previa cuanti-ficación de los patrones (estándares) y del gris


basal, permite la cuantificación absoluta en mo-les/unidad de tejido o de proteína en cada áreamicroscópica4'5. Existen complejos programasde ordenador que realizan todas las transforma-ciones secuenciales con un alto grado de velo-cidad y precisión.

El uso de estos sistemas de análisis de imá-genes permite igualmente la conversión de losautorradiogramas en imágenes en escala de co-lores. De esta forma se substituye el patrónblanco-negro, por una gama opcional de colo-res, que permite una mejor diferenciación delos distintos niveles de densidad, y una cuanti-ficación más selectiva.

Análisis de datos autorradiográficosen relación con problemas farmacológicos

Como se ha comentado al principio, las téc-nicas autorradiográficas de receptores compar-ten los mismos principios fundamentales quelas de fijación a membranas (binding). Esto quie-re decir que, aparte de la aplicación meramenteanatómica de realización de mapeos microscó-picos de receptores, bien sea en el animal4'19

o en el ser humano4'20, estas técnicas permi-ten la realización de estudios de saturación, ci-nética y competición con el mismo desarrolloque en binding, ganando además el factor deresolución morfológica. La aplicación de los sis-temas computadorizados de análisis de imáge-nes permite además el tratamiento simultáneode los datos con los programas existentes paravalorar representaciones de Scatchard, curvasde desplazamiento, etc. Por tanto, para cadaárea microscópica se obtendrán valores de KD,Bmax, K|, etc. La realización de estos estudiosy el análisis de los datos resultantes plantea todauna serie de problemas que, por ser totalmen-te similares a los de estudios de binding y ha-ber sido ya tratados por otros autores en estacontribución, no pasaremos a comentar. Sinembargo, hay un aspecto donde la aplicaciónde técnicas autorradiográficas ha permitido nosólo reproducir los estudios de fijación sino me-jorarlos de forma relevante: la discriminación desubtipos de receptores.

Como ejemplo, se puede describir el tipo deestudios que permitió la caracterización deta-llada de los diversos subtivos de receptores se-rotonérgicos 5-HTi en el cerebro de rata. Me-diante estudios de fijación se había propuestola existencia de tres subtipos diferentes de estereceptor (5-HTiA, 5-HTIB, 5-HTIC). Sin embar-go, la información facilitada por dichos estudiosen cuanto a propiedades farmacológicas y dis-

Fig. 7. Curvas de competición frente a la 3H-5-HT ensecciones de cerebro de rata, medidas por autorra-diografía en el giro dentado del hipocampo (O), elsu-bículo dorsal ( • ) y el plexo coroideo (D). A: Despla-zamientos por 8-OH-DPAT; B: (~)21009; C: mesulergi-na. (Tomada de A. Pazos y 1M. Palacios6, con auto-rización.)

tribución de cada subtipo era muy limita-dau'19<21. Por esta razón, se diseñaron experi-mentos de competición autorradiográfica incu-bando secciones consecutivas de una misma re-

69

A. BAOIA, A. DOMÍNGUEZ - GIL, J. GARZÓN

TABLA IIIAFINIDADES (K¡*) DE DIVERSOS FÁRMACOS FRENTE A 3H-5HT EN DIFERENTES ÁREAS

DEL CEREBRO DE RATA, MEDIDAS POR AUTORRADIOGRAFÍA* *

ÁREA CEREBRAL

FÁRMACO SUBÍCULO SUBSTANCIA NEGRA SEPTO LATERAL HIPOCAMPO, CA¡ PLEXOS COROIDEOS

8-OH-DPAT(-) 21 009LSDMianserinaMesulergina

> 3.0000,6

29,9143,7

> 5.000

> 5.0000,9

44,9ND

> 3.000

19,26,0

N D ' "> 1.000> 1.000

4,87,23,6

269,8> 1.000

> 4.000> 4.000

4,113,611,8

*nM."Tomada de A. Pazos y J.M. Palacios19, con modificaciones.

*** No determinado.

gión anatómica en presencia de 3H-5-HT y deconcentraciones crecientes de substancias nomarcadas que habían sido propuestas como«selectivas de subtipo»19. Mediante este dise-ño se pudieron construir curvas cuantitativas decompetición en las diferentes áreas microscó-picas, identificando así núcleos o estructuras en-riquecidas en un solo subtipo de receptor5-HTi11'19. La construcción de estas curvasmediante densitometría computadorizada per-mitió además la identificación selectiva de cadasubtipo. En la figura 6 se muestra una imagenpuntual densitométrica de dos de estos despla-zamientos, mientras que en la figura 7 se reco-gen las curvas completas en diferentes áreascerebrales. En ambas puede observarse cómola fijación de la 3H-5-HT en el giro dentado hi-pocampal fue desplazada con buena afinidadpor la 8-OH-2-d¡-n-propilam¡no-tetral¡na (8-OH-DPAT), un compuesto propuesto como 5-HTIA-selectivo, pero no por el (—)21009 (4-3-ter-butil-amino-2-hidroxipropoxi-indol-isopropilester) nipor la mesulergina, propuestos como 5-HTiB y5-HTic-selectivos, respectivamente. En el subí-culo dorsal, el bindingíue inhibido con alta afi-nidad por (—) 21009 pero no por los otros2 compuestos. Finalmente, en los plexos conoi-deos, mientras la mesulergina desplazó con afi-nidad nanomolar la fijación de 3H-5-HT, tantola 8-OH-DPAT como el (—)21009 fueron inac-tivos. De esta forma, se pudieron identificar re-giones anatómicas exclusivamente enriquecidasen un subtipo de receptor, permutando así elestudio detallado de sus propiedades farmaco-lógicas (tabla III), con una precisión difícil deconseguir al realizar estudios de binding en te-jidos disecados manualmente11'19. Este ejem-plo ilustra, pues, la contribución de las técnicas

autorradiograficas a la resolución de problemastípicamente farmacológicos, como es la discri-minación de subtipos de receptores.

Los límites de resolución en el mareajeautorradiográfico de receptores

Un último aspecto íntimamente ligado a la va-loración de los datos cuantitativos en estudiosautorradiográficos es el que hace referencia alnivel máximo de resolución alcanzable. A pe-sar de los intentos realizados, hasta ahora estenivel máximo se corresponde con la resolucióndel microscopio óptico4. La localización auto-rradiográfica de receptores a nivel de micros-copia electrónica, además de estar limitada porla reversibilidad de la unión ligando-receptor, seenfrenta con la dificultad en adscribir las zonasde fijación detectadas a una determinada regiónsináptica, debido a la amplitud de las áreas deprobabilidad de localización de la radiactividad.Aunque se están desarrollando métodos quepermiten la resolución de estos problemas, esrazonable pensar que una mayor resoluciónanatómica en la localización de receptores ven-drá fundamentalmente de la mano de estudiosinmunohistoquímicos4.

BIBLIOGRAFÍA

1. Yamamura Hl, Enna SJ, Kuhar MJ. Neurotrans-mitter receptor binding, Nueva York, Raven Press,1985.

2. Roth LJ, Stumpf WE. Autoradiography of Diffusi-ble substances. Nueva York, Academic Press,1969.

70


3. Stumpf WE, Roth U. High resolution autoradio-graphy with dry-mounted, freeze-dried frozen sec-tions: comparative study of six methods using twodiffusible compounds, 3H-estrad¡ol and 3-meso-bilirubinogen. J Histochem Cytochem 1982; 14:274-287.

4. Kuhar MJ. Receptor localization with the micros-cope. En: Yamamura Hl, Enna SJ, Kuhar MJ, eds.Neurotransmitter receptor binding. Nueva York,Raven Press, 1985; 153-176.

5. Palacios JM. Receptor autoradiography: the lastten years. J Receptor Res 1984; 4: 633-644.

6. Pazos A, Palacios JM. New imaging techniquesin receptor studies. En: Assandri A, Fumero S, eds.Receptors in Pharmacology. Ivrea, RBM Press,1986; 51-65.

7. Palacios JM. Pazos A. Receptor autoradiography.En: Van Leeuwen FW. ed. Immunocytochemistryand Neurotransmitter Binding. Amsterdam, ENA,1984; 40-81.

8. Hall MD, Davenport AP, Clark CR. Quantitativereceptor autoradiography. Nature 1986; 324:493-494.

9. Kuhar MJ, Unnerstall JR. Quantitative receptormapping by autoradiography: some current tech-nical problems. Trends Neurosci 1985; 8: 49-53.

10. Palacios JM, Niehoff DH, Kuhar MJ. Receptorautoradiography with tritiumsentive film: potentialfor computerized densitometry. Neurosci Lett1981; 25: 101405.

11. Pazos A, Cortés R, Palacios JM. Quantitative re-ceptor autoradiography: application to the charac-terízation of múltiple receptor subtypes. J ReceptorRes 1984; 4: 645-656.

12. Unnerstall JR, Niehoff DL, Kuhar MJ, Palacios JM.Quantitative receptor autoradiography using 3H-

Ultrofilm: application to múltiple benzodiacepinereceptors. J Neurosci Meth 1982; 6: 59-73.

13. Alexander GM, Schwartzman RJ, Bell RD, Yu J,Renthal A. Quantitative measurement of local ce-rebral metabolic rate for glucose utilizing triated2-deoxy-glucose. Brain Res 1981; 223: 59-67.

14. RogersAW. Techniques of Autoradiography. Nue-va York, Elsevier, 1979.

15. Unnerstall JR, Kuhar MJ, Niehoff DL, Palacios JM.Benzodinncepine receptors are coupled to a sub-population of GABA receptors: evidence from aquantitative autoradiographic study. J PharmacolExpTher 1981; 218: 797-804.

16. Herkenham M, Sokoloff L. Quantitative receptorautoradiography: tissue defatting eliminates dif-ferential self-absorption of tritium radiation in grayand white matter of brain. Brain Res 1984; 321:363-368.

17. Kuhar MJ, Unnerstall JR. In vitro labeling recep-tor autoradiography: loss of label during ethanoldehydratation and preparative procedures. BrainRes 1982; 244: 178-181.

18. Geary WA, Wooten GR. Regional tritium quenchingin quantitative autoradiography of the central ner-vous system. Brain Res 1985; 336: 334-336.

19. Pazos A, Palacios JM. Quantitative autoradiograp-hic mapping of serotonin receptors ¡n the rat brain.I. Serotonin-1 receptors. Brain Res 1985; 346:205-230.

20. Palacios JM, Cortés R, Probst A. Mapping recep-tors in the human brain. Trends Neurosci 1986;9: 284-289.

21. Pazos A, Dietl MM, Hoyer D, Palacios JM. Auto-radiography of serotonin receptors. En: Hamon M,Osborne NN, eds. Neural Serotonin, Londres, JWilley & Sons, 1988. (En prensa.)

DISCUSIÓN

J.M. PEINADO: Quisiera preguntar al Dr. Pazossi esta técnica distingue bien los distintos ti-pos de receptores y si permite diferenciar en-tre receptores y sistemas recaptación.

A. PAZOS: Depende del radioligando que se uti-lice. Si el tejido se incuba con un radioligandoque reconoce un sistema de captación, comopodría ser, aunque esto también es motivo decontroversia, la imipramina, que marca el sis-tema de captación serotoninérgico, se marca-ría el lugar de recaptación. Lo mismo ocurrecon el binding. Todo depende de la selectivi-dad del radioligando por el que se pretendemarcar.

F. BARTUREN: Quería plantear tres preguntas.Desde el punto de vista anatómico está claroque la autorradiografía aporta, en comparacióncon el binding, datos más fiables en cuanto

a la resolución. ¿Hasta qué punto se han de-sarrollado técnicas de microscopia electróni-ca? Cabe pensar que teóricamente podríanaportar muchos datos orientados a la locali-zación de la hendidura sináptica, por ejemplo,aunque esto a su vez entrañaría muchos pro-blemas técnicos en cuanto a la preparaciónde las muestras. La segunda pregunta tieneun enfoque farmacológico. La autorradiogra-fía obliga a congelar el tejido en secciones.¿Hasta qué punto, dependiendo de los siste-mas, esto puede reducir la fijación específicay llegar a enmascarar alteraciones que podríanobservarse en fresco?

La tercera cuestión que quería plantear es quela autorradiografía se está empleando de caraa discriminar posibles implicaciones etiopato-génicas de receptores.

71


De hecho, usted la está utilizando en el estu-dio de enfermedades degenerativas. Estostrastornos degenerativos muchas veces impli-can alteraciones de la densidad celular o in-cluso de la distribución de la grasa, lo cual po-dría alterar los resultados con respecto a lasituación basal.

A. PAZOS: Empezando por la última, efectiva-mente, cuando uno realiza un estudio auto-rradiográfico de receptores en un tejido afec-to de una enfermedad degenerativa debedisponer al mismo tiempo de un estudio ana-tomopatológico que le permita conocer cuálera la integridad de dicho tejido, por ejemplosi el contenido en grasa estaba o no conser-vado y en general hay que estar muy segurode que el trastorno degenerativo no ha modi-ficado características del tejido que a su vezpuedan alterar la respuesta de receptor. Esoa veces es complicado pero desde luego esfactible, ya que cuando se hacen este tipo deestudios siempre hay una parte del tejido quese utiliza para el estudio autorradiográfico yotra parte que se utiliza para estudios de tipoanatomopatológico, incluso neuroquímico.En cuanto a la pregunta relativa a la micros-copia electrónica, éste es un aspecto sobre elcual diversos grupos llevan varios años traba-jando para lograr localizar el receptor no sóloa nivel óptico sino también a nivel subcelular,y por ahora la respuesta no es satisfactoria de-bido a dos tipos de problemas. En primer lu-gar existen problemas técnicos ligados al ra-dioligando; por ejemplo, sólo se podría hacercon radioligandos irreversibles debido al tipode manipulación a que posteriormente se so-meten las muestras para su observación conmicroscopía electrónica; hay también otros

problemas ligados a la obtención de las mues-tras de tejidos. Además, la propia técnica dela microscopía electrónica localiza las estruc-turas con un límite de probabilidad y, segúnmi información, no se ha llegado todavía a te-ner una imagen precisa del receptor justo anivel de la sínapsis.En cuanto a la congelación, efectivamente éstees un problema a tener en cuenta. Lo únicoque puedo decirle es que para bastantes re-ceptores se han comparado en un mismo terri-torio las técnicas de binding y de autorradio-grafía y los valores de Kd son absolutamentecomparables mientras que los valores deBmax muestran una discreta variación a favordel estudio autorradiográfico, lo cual tampo-co resulta sorprendente teniendo en cuentaque el proceso de preparación de la membra-na en el binding puede no tener una efectivi-dad del 100%. En cualquier caso no puededescartarse que para algún receptor el pro-ceso de congelación sea crítico.

A. SÁNCHEZ-GARCÍA: Los experimentos auto-rradiográficos tienden a utilizarse aparente-mente para localizar la zona concreta dondese encuentra uno y otro tipo de receptor. ¿Quéopinión le merece esta práctica?

A. PAZOS: Todos los sistemas de análisis ópticoque aquí se han comentado se basan en ladigitalización de la imagen, es decir, lo primeroque hace el sistema después de medir los es-tándares es digitalizar la imagen autorradio-gráfica que uno le proyecta en el monitor conel nivel de amplificación elegido, y a partir deahí los sistemas cambian: algunos permitenseleccionar microáreas concretas dentro deesta imagen digitalizada, en otros ocurre al re-vés, es decir, se digitalizan primero microáreas.

72

£1 tratamiento de datos en los estudiosde biodisponibilidad

R. ObachSubunídad de Biofarmacia y Farmacocinética. Departamento de Farmacia. Universidad de Barcelona.

Introducción

Las dosis de medicamento administradas porvía extravascular no siempre se correspondencon las cantidades que alcanza la circulaciónsistémica, siendo, por lo general, fracciones deaquéllas, por otro lado de magnitud generalmen-te desconocida. Este hecho ha sido motivode preocupación desde hace tiempo debido ala repercusión terapéutica que este aprove-chamiento «parcial» del medicamento puedaacarrear. Las causas por las cuales sólo una frac-ción de la dosis llega a acceder a la circulaciónsistémica son variadas, atribuibles unas a laspropiedades fisicoquímicas del principio activo,otras a factores tecnológicos y de formulacióny las restantes a determinados factores fisiopa-tológicos del paciente. Se necesita, pues, cono-cer cuál es en cada caso la fracción de princi-pio activo que de hecho accede a la circulaciónsistémica y cuál es su velocidad'de acceso trassu administración, lo que, en términos biofar-macéuticos, se conoce como biodisponibilidad,de acuerdo con la definición mundialmenteaceptada de la American Pharmaceutical Asso-ciation (APhA).

Parámetros farmacocinéticos paracaracterizar la biodisponibilidad

De acuerdo con las normativas de la Food andDrug Administration (FDA), quizá las únicas ofi-cializadas y aceptadas más allá de su ámbitoestricto de aplicación obligada en EE.UU., losestudios de biodisponibilidad deben abordarseprioritariamente mediante el estudio de la evo-lución frente al tiempo de los niveles plasmáti-cos, estimando los oportunos parámetros(AUCgV Cmax, Tmax, MRT y VRT).

AUCo , el área bajo la curva de niveles plas-máticos/tiempo desde cero hasta infinito, es unparámetro directamente relacionado (salvo al-

gunas excepciones) con la fracción de dosis ab-sorbida, caracterizando, por consiguiente, la bio-disponibilidad en magnitud, mientras que Cmax,el nivel plasmático máximo, y Tmax, el tiempo alque se alcanza dicho nivel, son parámetros, ge-neralmente experimentales, más relacionadoscon la biodisponibilidad en velocidad. Los mo-mentos estadísticos MRT, tiempo medio de re-sidencia y su varianza, VRT, son parámetros teó-ricos y amodelísticos relacionados con la bio-disponibilidad en velocidad1.

Estimación de los valores de AUCp°

En la estimación de los valores de AUCo° ca-bría considerar dos posibles situaciones, en fun-ción de que se disponga o no de una funciónteórica de ajustado a los datos experimentales.Cabe considerar el primer caso como poco fre-cuente en los estudios de biodisponibilidad enel hombre, puesto que difícilmente puede inter-pretarse satisfactoriamente el número más bienescaso de niveles obtenidos tras una adminis-tración extrabasal mediante modelos cinéticoscompartimentales sencillos o medianamentecomplejos. En cualquier caso, en la tabla I seexponen las ecuaciones teóricas de un ajusta-do mono o multicompartimental.

En las situaciones, por lo demás muy frecuen-tes, en que no se dispone de una función teóri-ca que se ajuste a los datos experimentales, sedetermina AUCo° normalmente en dos etapas:primero se estima el área hasta el último tiem-po experimental (AUCQ), normalmente por inte-gración numérica, mediante alguno de los mé-todos que figuran en la tabla II y, en segundolugar, el área desde tiempo t hasta infinito(AUCt°°), por aplicación de la ecuación 1.

1.

73


TABLA IECUACIONES PARA EL CÁLCULO DE AUCo A PARTIR DE LAS ECUACIONES TEÓRICAS

YA AJUSTADAS

Modelo monocompartimental i.v.

C = C0-e Ke ^

ke

Modelo monocompartimental e.v.K

l ( l e K i - t ° )r\i l\2 r\l r\2

Modelo bicompartimental i.v.C=A0 • e-« - t - Bo • e-0-'

+

Modelo bicompartimental e.v.- B 3 • e ' ^ 1

(1 e k i - l o ) (1 e- k2'to) ^ (1 — e^ [ p (1 e i o ) + (1 e ) ^k3 ki k2 k3

TABLA IIMÉTODOS NUMÉRICOS PARA LA ESTIMACIÓN DE AUCo

Método Observaciones

Método trapezoidal Independiente del modelo farmacocinético; subestima elárea durante la fase de absorción y la sobreestima en lafase descendente

Método log-trapezoidal Independiente del modelo. Utiliza la transformaciónlogarítmica entre cada par de concentraciones. Métodode elección en la fase monoexponencial terminal de lacurva de niveles plasmáticos

Método mixto Utiliza el método trapezoidal hasta la fasemonoexponencial terminal y el método log-trapezoidalen esta última fase

Método de Lagrange2 Utiliza una interpolación polinómica de orden superiorentre cada par de concentraciones experimentales quesuministra mayor precisión en la estimación de AUC

Método de los esplines3 Yeh y Kwan lo aplican a la determinación de las áreas.Utilizan esplines cúbicos. En general, podríaconsiderarse como uno de los métodos menosdistorsionables cuando se utiliza en combinación con ellog-trapezoidal

Método de Yeh et al4 Yeh et al han publicado recientemente un nuevo métodode interpolación que utiliza funciones polinominalescúbicas a partir de tres puntos adyacentes. Evita lasoscilaciones que se observan en determinados casoscon el método de los esplines

en la que /? es la pendiente de la supuesta fase Determinación de Cma» y Tma>

monoexponencial terminal de los niveles frente La determinación de Cmax y Tmax, parámetrosal tiempo y Ct la concentración teórica estima- quizá más representativos de la biodisponibili-da de la ecuación correspondiente a esta fase dad en velocidad que en magnitud, se realiza,para el último tiempo experimental, t. en general, a partir de los datos experimenta-

74

EL TRATAMIENTO DE DATOS EN LOS ESTUDIOS DE BIODISPONIBIUDAD

les. En este caso, la precisión y exactitud de lasdeterminaciones dependerá mayoritariamentedel propio diseño experimental, concretamen-te del número de puntos de que se dispongaen los alrededores del nivel máximo que se pre-tende estimar y de los intervalos entre losmismos.

Por otro lado, en los casos en que resulta fac-tible el ajuste de las ecuaciones poliexponen-ciales representativas de los modelos fármaco-cinéticos de uno y de dos compartimientos a losdatos experimentales, los valores de Tmax yCmax se estiman, de las ecuaciones de las cur-vas teóricas, mediante las siguientes expre-siones:

siendo AUMMC= o t2 • C dt. Los valores delas integrales ot • C dt y ot2 • C dt puedenestimarse mediante cualquiera de los métodosde integración señalados para las áreas en latabla II. La parte final de la misma, desde elintervalo t hasta infinito, se determinará asu-miendo que el último tramo de la curva es re-presentativo de un proceso monoexponencialmediante las ecuaciones 8 y 9 respectivamente.

8. ? t • c dt= - i - T •-b.T

i-^-T -ea-b.T

Modelo monocompartimental en las que a es la ordenada en origen y b la pen-diente de la curva correspondiente.

2. I max — ~ka - k

3. C m a x = B 0 • e-k-Tma* - A o - e ^ 3 ' 1

Modelo bicompartimental

En este caso Tmax debe estimarse iterativa-mente a partir de la siguiente función derivada:

_dC

~dT -=—«Ao • e- a t — j Po • e,-kOl-t

Cmax se obtiene por aplicación directa de laecuación 5:

5.

Determinación de los momentosestadísticos MRT y VRT

Los valores de MRT y VRT se estiman a par-tir de los niveles plasmáticos mediante las ecua-ciones 6 y 7 de Yamaoka et al1:

6.

7.

VRT =

/ o C dt AUCo

/ o (t-MRT2)Cdt AUMMC/ Ó C d t AUCo

—MRT2

Estimación de la biodisponibilidad

Tras esta breve revisión de la metodología em-pleada en la estimación de los parámetros másrepresentativos de la biodisponibilidad, tratare-mos más concretamente de la estimación de labiodisponibilidad en magnitud, haciendo hinca-pié en los casos en los que la cinética no es li-neal y considerando la estimación tras la admi-nistración de dosis únicas y de dosis múltiples.

Si la farmacocinética es lineal, la expresiónmás frecuente para estimar la biodisponibilidadtras la administración de dosis únicas es la si-guiente:

10. F =AUCg • Cl

D

en la que F representa la fracción de dosis (D)que alcanza inalterada la circulación sistémica,y Cl el aclaramiento plasmático del fármaco.

Si se puede asumir que tras la administraciónintravenosa el 100% de la dosis administradaalcanza la circulación sistémica, se estima la bio-disponibilidad absoluta en magnitud de la si-guiente relación:

F oral (AUCo • Cl/D) oral1 " F Lv. = (AUCo • Cl/D) i.v.

en la cual, si se asume que el aclaramiento plas-mático resulta constante para cada Individuo,durante la administración del fármaco por am-bas vías, la ecuación 11 se simplifica a:

(AUC&7D) oral12. F=-

(AUCgVD) i.v.

75


Cuando la administración intravenosa no esfactible o cuando se desea realizar un estudiode biodisponibilidad comparativo respecto a unaformulación de referencia, se determina la bio-disponibilidad relativa mediante ecuaciones aná-logas a las utilizadas para la determinación dela biodisponibilidad absoluta, pero en las cua-les se substituyen los valores de AUC¡.V. por loscorrespondientes a la formulación de referencia.

13. F =(AUCQ/D) problema

(AUCo/D) referencia

Por lo general, en los estudios de biodisponi-bilidad relativa las dosis administradas suelenser idénticas, por lo que la normalización de lasdosis no resulta necesaria.

La existencia de ciertas modificaciones intrain-dividuales en la disposición del fármaco, másconcretamente en su aclaramiento plasmático,puede incrementar notablemente la varianza re-sidual utilizada en los ensayos de biodisponibi-lidad.

La supuesta invariabilidad del aclaramientoplasmático entre administraciones no es siem-pre evidente, por lo cual en caso de fluctuacio-nes importantes en el aclaramiento plasmático laecuación 11 resulta más fiable que la ecuación12, puesto que tiene en cuenta aquella varia-bilidad del aclaramiento. De hecho, es difícil dis-poner de una información veraz de los aclara-mientos plasmáticos en cada una de las situa-ciones experimentales.

No obstante, en aquellas ocasiones en lascuales no existen diferencias notorias en el vo-lumen de distribución, puede utilizarse el valorde la constante lenta de disposición /3 (estima-da por regresión semilogarítmica de la fase mo-noexponencial terminal) como indicador válidoe indirecto de aquellas fluctuaciones.

La ecuación en estos casos sería la siguiente:

14. F =(AUCo • /3/D) oral

(AUCo • /3/D) i.v.

La utilización de los productos de AUC™ por(3 en lugar de AUCo se considera oportunacuando es patente que la varianza intraindivi-dual de In(ÁUCo), estimada del análisis de va-rianza del diseño cruzado correspondiente, re-sulta superior a la varianza intraindividualestimada cuando la variable utilizada esln(AUCo • 13).

La biodisponibilidad puede estimarse tambiéna partir de un régimen de dosificación múltiple.Para ello se utilizan usualmente los niveles plas-máticos tras haberse alcanzado el estado de

equilibrio estacionario; la determinación en es-tas condiciones presenta ciertas ventajas: a) labiodisponibilidad se estima en una situaciónmás próxima a la aplicación clínica del fárma-co; b) se requieren menos muestras de plasmapara determinar el valor de AUC para un inter-valo de dosificación, respecto a las necesariastras la administración de una dosis única, y c)los niveles plasmáticos obtenidos son superio-res a los de una dosis única, lo cual permite,frecuentemente, una mayor fiabilidad de la me-todología analítica.

Las principales desventajas de la estimaciónde la biodisponibilidad en condiciones de esta-do de equilibrio estacionario radican en: a) laobligatoriedad de adaptarse estrictamente al ré-gimen posológico; b) la duración del estudio,más prolongada en comparación con la estima-ción tras dosis únicas, y c) se obtiene escasainformación acerca de la biodisponibilidad envelocidad.

En condiciones de estado de equilibrio esta-cionario, se determina la cantidad absorbidapromedio (F • D) en un intervalo de dosificación(r=Í2-ti) de la siguiente ecuación:

15. F • D = CI dt

en la que el término integral representa el áreabajo la curva de niveles plasmáticos frente altiempo durante el intervalo de dosificación.

La biodisponibilidad absoluta se estima deacuerdo con:

p _ C • d t ] oral]/Dora

• dtkvl Div.

Si se asume que el aclaramiento plasmáticose mantiene constante a lo largo de los regíme-nes posológicos tras las administraciones orale intravenosa, la ecuación anterior puede sim-plificarse:

17.~

C • dtloral/ Doral¡¡\

En la determinación de la biodisponibilidadrelativa, la estimación se efectuará de acuerdocon una expresión análoga a la ecuación 13, enla cual se utiliza el área bajo la curva de nivelesplasmáticos para un intervalo de dosificacióntras ambas administraciones (problema y refe-rencia).

Si puede asumirse constante el aclaramientoplasmático tras ambos regímenes posológicos, yse administran las mismas dosis para cada uno

76

EL TRATAMIENTO DE DATOS EN LOS ESTUDIOS DE BIODÍSPONIBILIDAD

de ellos, la ecuación a utilizar es, en este caso,la siguiente:

18. F = -[ / } i C • dt] problema

[ft2 C • dt] referenciaJ t i

La determinación de la biodisponibilidad enpresencia de una cinética de eliminación satu-rable —cinética no lineal— en las condicionesdel ensayo es más compleja, al no ser aplica-ble la metodología convencional expuesta an-teriormente y al no mantenerse constante elaclaramiento plasmático total dentro del inter-valo de concentraciones plasmáticas extremastras la administración. Así, para los fármacosque presentan una cinética de eliminación deMichaelis-Menten, el aclaramiento plasmáticodependerá en cada momento, y de forma noproporcional, de la concentración existente enel lugar de eliminación; por consiguiente, trasla administración de sendas dosis, iguales, porvía oral y por vía intravenosa, el valor de AUCotras la administración oral tenderá a ser menorque el correspondiente al obtenido por vía in-travenosa.

Es posible estimar el aclaramiento intrínseco,en función de los niveles plasmáticos tras dosisúnicas (Ct), si se conocen los parámetros deMichaelis-Menten (Vmax y Km), de acuerdo conla siguiente expresión:

19. Cl¡nt = "V,r

Km + Ct

Si el comportamiento cinético no es lineal trasla administración i.v. del fármaco a distintas do-sis, y estimadas las constantes Vmax y Km, (y,por lo tanto, conocido el aclaramiento intrín-seco), puede determinarse la biodisponibilidadsegún el método de Martis y Levy5 modificadopor Rubin y Tozer6 mediante la ecuación:

20. F = — ED ' i = l (Cl, • AUC¡)

Si existe un proceso de excreción renal satu-rable, al tiempo que el aclaramlento no-renalse mantiene constante, la biodisponibilidad pue-de estimarse de acuerdo con la siguiente expre-sión:

21. F = -+ (Clno-renal • AUCg)

D

en la que Q" es la cantidad de fármaco excre-tado por riñon a tiempo infinito. Tras la adminis-tración de dosis múltiples, la biodisponibilidadde un principio activo que presenta una cinéti-

ca de Michaelis-Menten puede determinarsepor aplicación de la ecuación:

Vmax ' Css22. F =(D/T) • (Km + Cs

los parámetros de la cinética de Michaelis-Menten se estiman de la administración intra-venosa y Css es la concentración plasmáticapromedio en condiciones de estado de equili-brio estacionario.

Evaluación estadística en los ensayosde biodisponibilidad

El tratamiento estadístico en los estudios debiodisponibilidad consiste, principalmente, enla comparación de los principales parámetrosque la caracterizan, en magnitud y en veloci-dad; básicamente, AUCo, Cmax y Tmax, estima-dos tras la administración de las formulaciones.Cuando la comparación se efectúa respecto auna formulación estándar, cuya eficacia vieneavalada por la experiencia clínica, se trata deun ensayo de bioequivalencia. En este caso, eltratamiento estadístico dependerá del diseñoefectuado; si bien el más frecuente es el dise-ño randomizado y cruzado. Cuando se compa-ran más de dos formulaciones, los diseños másusados son el diseño en cuadrado latino y el di-seño en bloques equilibrados e incompletos.

El análisis estadístico de partida en casode existencia de normalidad en la distribuciónde las variables, homogeneidad de las varian-zas y aditividad de los factores considerados (o,mejor dicho, en caso de haber evidencia en con-tra) es el análisis de varianza, ANOVA, de 3 vías,en el que los factores o fuentes de variación son:los individuos, las formulaciones y los períodos.

De acuerdo con las recomendaciones de laFDA, el nivel de significación a adoptado es de0,05 y la potencia del ensayo debe ser igual osuperior a 0,8, para lo cual deberá disponersede un tamaño muestral adecuado.

En el caso de los ensayos de bioequivalen-cia, el tamaño de la muestra dependerá de lossiguientes factores: a) de la diferencia mínimaque se pretende detectar, A; b) de a2, la va-rianza residual del ensayo (normalmente des-conocida a príori); c) de a, el nivel de significa-ción adoptado, y d) de 1-/3, la potencia delensayo (0,80).

El número mínimo de voluntarios (n) en el en-sayo viene determinado por la siguiente expre-sión:

23.(T2

n>-^(ta

77


TABLA IIIMÉTODOS ESTADÍSTICOS UTILIZADOS EN LAS TOMAS DE DECISIÓN

DE LOS ENSAYOS DE BIOEQUIVALENCIA

Método ObservacionesANOVA de 3 vías

Ensayo de Westlake7

Ensayo de Mandallaz y Mau8

Ensayo de Rodda y Davis9

Ensayo de Fluehler et al10

Ensayo Hauck y Anderson11

Ensayo de Schuirman12

Ensayo necesario, para estimar la varianza residual,parámetro indispensable en aquellos ensayos quedeterminan los límites fiduciales de las diferencias entremedias

Criterio en vigor en EE.UU. (FDA) basado en la estimaciónde los límites fiduciales de la diferencia simétricos respectoa la media de la formulación de referencia

Aproximación bayesiana al tratamiento estadístico de losensayos de bioequivalencia. Estudio de la probabilidadposterior de que la biodisponibilidad relativa de unaformulación problema está comprendida entre unos límitesespecificados

Aproximación bayesiana de la probabilidad posterior de queuna determinada diferencia entre las dos formulacionesensayadas sobrepase un determinado límite predefinidoque conllevaría una implicación clínica relevante

Método bayesiano de la probabilidad posterior de que labiodisponibilidad relativa de la formulación problema estécomprendida entre unos límites especificados

Ensayo «t» orientado para demostrar la hipótesis alternativapara aceptar la bioequivalencia y no la hipótesis nula, co-mo en el ANOVA

Procedimiento a base de dos ensayos «t» de una cola.Determina dos estadísticos «t» para comprobar si ladiferencia entre las dos formulaciones no sobrepasa los doslímites prefijados; en tal caso se rechaza la hipótesis nula yse acepta la hipótesis alternativa de bioequivalencia

a pesar de ello, normalmente se acostumbra autilizar un número inferior de voluntarios.

La comparación estadística de los resultadosobtenidos tras el diseño experimental, basadoexclusivamente en el ANOVA, no es apropia-do para demostrar la bioequivalencia entre dosformulaciones. En efecto, el hecho de que noaparezcan diferencias significativas entre los va-lores medios de los parámetros ensayados noes indicativo de que las dos formulaciones en-sayadas sean bioequivalentes, puesto que unaelevada variabilidad (dentro de uno o de los2 grupos) puede ser causa suficiente para quesea imposible demostrar la existencia de dife-rencias significativas.

Actualmente, está plenamente aceptado queen los estudios de biodisponibilidad resulta demayor utilidad el establecimiento de los límitesfiduciales de las diferencias entre medias, pues-to que cuantifican mejor el concepto de la va-riabilidad entre parámetros.

Westlake7 introdujo el uso de los límites si-métricos de las diferencias respecto a la formu-

lación de referencia, proponiendo como crite-rio de bioequivalencia el que los límites fiducia-les simétricos de la formulación problema, res-pecto a la formulación de referencia, no fuesensuperiores al 20%. Este ensayo, todavía en vi-gor en EE.UU., ha sido criticado largamente des-de su implantación por la FDA, a causa de laasimetría de aquellos límites, especialmentecuando los valores promedio de los parámetrosde las dos formulaciones se diferencian bastan-te. Desde entonces han surgido nuevos méto-dos, como los bayesianos, que determinan laprobabilidad «posterior» de que la verdadera di-ferencia entre las dos formulaciones sobrepaseun límite predefinido con criterio clínico840.

Hauck y Anderson11 han contribuido a la in-terpretación de los resultados de los estudios debioequivalencia con un enfoque muy original ba-sado en el planteamiento de una hipótesis nulacontraria a la usualmente establecida; así, pro-ponen que de partida hay una diferencia entrelas dos formulaciones y que lo que se trata decomprobar es que ésta no sobrepase determi-

78

EL TRATAMIENTO DE DATOS EN LOS ESTUDIOS DE BIODISPONIBIUDAD

nados límites. En caso de rechazar la hipótesisnula, la aceptación de la alternativa equivale aaceptar la bioequivalencia de los preparados.

Recientemente Schulrman12 ha propuestopara los ensayos de bioequlvalencia la aplica-ción de los ensayos t de una cola, a los ensa-yos de bioequivalencia, con una filosofía simi-lar al ensayo de Hauck y Anderson pero quizácon mayor potencia.

En la tabla III se resumen los métodos másusados en la interpretación de los resultados delos ensayos para la toma de decisión de bioe-quivalencia o bioinequivalencia. Su diversidady número prueban claramente las dificultadesinherentes a la toma de decisión tras la evalua-ción estadística y también es indicativo de quela homologación correcta de dichos métodospor parte de las autoridades sanitarias es unanecesidad apremiante, en particular para la eva-luación de la bioequlvalencia de especialidadesgenéricas.

BIBLIOGRAFÍA

1. Yamaoka K, Nakagawa T, Uno T. Statistical mo-merits in pharmacokinetics. J PharmacokinetBiopharm 1978; 6: 546-558.

2. Roed ML, Jusko WJ. LAGRAN program for áreaand moments in pharmacokinetic analysis. Com-put Programs Biomed 1983; 16: 203-216.

3. Yeh KC, Kwan KC. Acomparison of numerical ¡n-tegrating algorithms by trapezoidal Lagrange andspline aproximation. J Parmacokinet Biopharm1978; 6: 79-88.

4. Yeh KC, Small RD, Winchell GA. Pharmacokine-tic evaluation of stable piecewise cubic polyno-mials as numerical integration functions. J PharmSci 1987; 76: S104.

5. Martis L, Levy RM. Bioavailability calculations fordrugs showing simultaneous first-order capacity-limited eümination kinetics. J Pharmacokinet Biop-harm 1973; 1: 283-294.

6. Rubin GM, TozerTN. Theoretical considerations¡n the calculation of bioavailability of drugs exhi-biting Michaelis-Menten elimination kinetics. JPharmacokinet Biopharm 1984; 12: 437-450.

7. Westlake WJ. Symmetrical confidence intervalsfor bíoequivalence triáis. Biometrics 1976; 32:741-744.

8. Mandallaz D, MauJ. Comparisonofdifferentmet-hods for decision-making in bioequivalence as-sessment. Biometrics 1981; 37: 213-222.

9. Rodda BE, Davis RL. Determining the probabi-lity of an important difference ¡n bioavailability. ClinPharmacol Ther 1980; 28: 247-252.

10. Fluehler H, Hirtz J, Moser HA. An aid to decision-making ¡n bioequivalence. J Pharmacokinet Biop-harm 1981; 9: 235-243.

11. Hauck WW, Anderson S. A new statistical proce-dure for testing equivalence in two-groups com-parative bioavailability triáis. J PharmacokinetBiopharm 1984; 12: 83-91.

12. Schuirmann DJ. A comparison of the two one-sided test procedure and the power approach forassessing the equivalence of average bioavai-lability. J Pharmacokinet Biopharm 1987; 15:657-680.

DISCUSIÓN

M. ARBOIX: Quisiera hacer una pregunta. El Dr.Obach se ha referido a los errores que pue-den aparecer en aquellos casos donde la ab-sorción muestra una dependencia de la do-sis. Quisiera preguntarle en concreto qué tipode análisis aplicaría cuando dos formulacio-nes administradas por vía oral son bioequiva-lentes pero ia absorción es dosisdependiente.

R. OBACH: Mi opinión es que en la actualidadno podemos partir de parámetros obtenidosde ajustes teóricos que comportan una varia-bilidad muy superior a la estimación del pro-pio parámetro, es decir, si tenemos modelosno lineales cuyas constantes no pueden obte-nerse con fiabilidad a partir de nuestros da-tos experimentales, me parece que lo más pru-dente es hacer un seguimiento lo más estricto

posible de los niveles plasmáticos hasta el lí-mite de la sensibilidad del método y utilizarlas áreas originales sin más, ya que de lo con-trario introducimos fuentes de variabilidad quenos van a distorsionar después las tomas dedecisión.

J. MARTÍNEZ-LANAO: En este sentido, los ex-perimentadores en el campo de la biofarma-cia tenemos un reto desde el punto de vistadel diseño experimental y de la optímizacióndel tratamiento de datos a fin de calcular lasconstantes de absorción con una menor va-riabilidad. ¿Cuál es su opinión al respecto?

R. OBACH: Particularmente soy pesimista yaque llevamos trabajando en este campo casi5 años utilizando infusiones intravenosas conuna cinética de orden 1 que nos permite si-

79


mular experimentalmente una curva de nive-les plasmáticos con una constante de absor-ción conocida a priori. Hemos aplicado másde 20 métodos con unos errores que, sin exa-gerar, oscilan entre el 30 y el 40% en el me-jor de los casos. Por tanto creo que tiene másvalor comparar el valor de Cmax crudo o Tmaxcuando se ha planificado correctamente elmuestreo espaciando las tomas que intentarvalidar biodisponlbilidades a partir de las cons-tantes de absorción.

J. MARTÍNEZ-LANAO: Estoy de acuerdo, peropodría intentarse buscar un diseño experimen-tal que redujera el error asociado a la deter-minación de las constantes de absorción.

R. OBACH: Yo me basaría preferentemente enun diseño experimental que reduzca el errorpor buena toma de puntos en los máximosmás que en modelos que a priori y según miexperiencia no se ajustan.

80

Tratamiento de datos farmacocinéticos en estudiosexperimentales

J. Martínez-La naoDepartamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Universidad de Salamanca.

Introducción

La farmacocinética constituye una ciencia na-cida al amparo de la farmacología, con impor-tantes implicaciones terapéuticas, que ha expe-rimentado un enorme desarrollo en las últimasdécadas. El carácter típicamente cuantitativo deesta ciencia hace que la metodología implica-da en el análisis de datos farmacocinéticos cons-tituya uno de los aspectos metodológicos másinteresantes que se plantean en este tipo de es-tudios.

Sheiner1 establece que los pasos a seguir enexperimentos farmacocinéticos pueden resumir-se en los siguientes:a) selección del modelo preliminar; b) diseño delexperimento; c) recogida de datos; d) estima-ción de los parámetros del modelo; e) estimala precisión de los parámetros, f) crítica y dis-criminación del modelo.

Planteamiento del modelo

En estudios farmacocinéticos, y una vez ob-tenida la información sobre la evolución de losniveles del fármaco, habitualmente concentra-ciones, en diferentes fluidos biológicos (plasma,orina, tejidos, etc.), debe plantearse el diseñode un modelo matemático apropiado que per-mita cuantificar los procesos implicados. Gene-ralmente, los niveles de fármaco en diferentesfluidos biológicos constituyen la variable o va-riables dependientes del sistema y en las quese asume error en su determinación, siendo lavariable independiente el tiempo de obtenciónde la muestra.

Los modelos que pueden plantarse en estu-dios farmacocinéticos varían de acuerdo con lanaturaleza y objetivos del estudio (tabla I)2.

Desde el punto de vista matemático, estosmodelos pueden construirse como sistemas deecuaciones diferenciales, habitualmente de pri-mer orden, si bien en modelos más complejos

pueden llegar a utilizarse sistemas de ecuacio-nes diferenciales parciales de segundo orden,etc. Estos sistemas pueden resolverse analítica-mente mediante la utilización de transformadasde Laplace o de Fourier3 obteniéndose ecua-ciones integradas de tipo pol¡exponencial en mo-delos compartimentales, potencial en ciertosmodelos de difusión, hiperbólicas en determi-nados modelos no lineales de liberación, absor-ción, distribución, eliminación, respuesta farma-cológica, etc.46.

Ajuste de resultados experimentalesa modelos farmacocinéticos

Durante la última década, y aplicado a nume-rosas ciencias experimentales —entre ellas lafarmacocinética—, se han desarrollado extraor-dinariamente los métodos computadorizados enel tratamiento de datos, fundamentalmente me-diante la utilización de programas estadísticosmatemáticos, especialmente los conocidos pro-gramas de regresión no lineal, que permiten el

TABLA IMODELOS Y FUNCIONES MATEMÁTICAS

UTILIZADAS HABITUALMENTE EN ESTUDIOSFARMACOCINÉTICOS

Modelos compartimentales: funcionespol ¡exponenciales

Modelos no lineales: funciones hiperbólicasModelos fisiológicos: sistema diferencial de

balance de masaSistemas modelo-independiente: momentos

estadísticosSistemas modelo-independiente: funciones de

convoluciónModelos de difusión: funciones de potenciaModelos estocásticos

81

A. BADIA, A. DOMÍNGUEZ - GIL. J GARZÓN

ajuste de datos experimentales a distintos tiposde modelos y constituyen una poderosa herra-mienta de trabajo para el análisis de datos far-macocinéticos con sorprendente rapidez en re-lación con los métodos clásicos utilizados porla farmacocinética en sus inicios79.

Daniel y Wood10 establecen que el ajusteadecuado de datos experimentales a modelos,implica:

1. Utilizar todos los datos relevantes.2. Utilizar razonablemente el número de cons-

tantes o parámetros implicados.3. Establecer la medida de la precisión de las

estimadas de los parámetros.4. Permitir localizar desviaciones sistemáticas

de los datos experimentales de las ecuacionesde los modelos propuestos.

5. Establecer la capacidad de predicción delmodelo del comportamiento del sistema en con-diciones futuras según las ecuaciones finales.

Como acabamos de comentar, los modeloshabituales en farmacocinética pueden formular-se utilizando sistemas de ecuaciones diferencia-les o las correspondientes funciones integradas.Desde el punto de vista computacional, puederecurrirse al ajuste de ambos tipos de sistemas,si bien en la práctica se plantean algunas dife-rencias en la regresión de uno u otro sistema.

En determinadas ocasiones, especialmen-te cuando se manejan sistemas relativamentecomplejos y con gran número de ecuaciones di-ferenciales, como pueden ser ciertos modelosde distribución, puede recurrirse directamenteal ajuste de los datos al sistema de ecuacionesdiferenciales sin utilizar ecuaciones integradas.Desde el punto de vista matemático resulta máscómodo, ya que no deben integrarse previamen-te las ecuaciones, lo cual en algunos casos re-sulta tedioso y complejo. Sin embargo, se plan-tea, por otra parte, la limitación de tener queutilizar conjuntamente con el algoritmo de re-gresión no lineal un algoritmo de integración nu-mérica que puede plantear algunos problemas.Numerosos programas de regresión no linealusados en farmacocinética incorporan simultá-neamente un algoritmo de gradiente o búsque-da directa que permite optimizar la función me-diante regresión no lineal y una subrutina deintegración numérica, habitualmente métodosde Runge-Kutta o de Euler, entre otros, que per-miten trabajar con sistemas diferenciales11.

Ponderación estadística

En sistemas ideales, la varianza o el error aso-ciado a la variable dependiente debería ser si-

milar, sin embargo, en la práctica no lo es y enconsecuencia el ajuste de los datos debe reali-zarse de acuerdo con su propia varianza. Esteaspecto resulta fundamental en todos los estu-dios de tipo cuantitativo y muy especialmenteen losfarmacocinéticos, considerando que la va-riable dependiente, habitualmente la concen-tración del fármaco en sangre u orina, puedeencontrarse en un intervalo muy amplio en eltranscurso de un experimento al igual que elerror implicado en su determinación. La rela-ción entre la variable dependiente (Ci) e inde-pendiente (Ti) en un experimento farmacociné-tico puede expresarse como:

Ci = M (0,T¡) + Ei

siendo M el modelo farmacocinético, 8 la nota-ción paramétrica del modelo en forma vectorial,Ti la variable independiente y Ei el error esta-dístico, que puede interpretarse como la dife-rencia entre la concentración medida (Ci) y lapredicha por el modelo M(0,T¡).

Si bien la técnica analítica utilizada para la de-terminación cuantitativa del fármaco suele con-siderarse la fuente habitual de error asociadoa la determinación de la variable, no deben des-cartarse otras posibles fuentes de error experi-mental.

En cualquier caso, resulta fundamental esta-blecer cuál es la evolución del error o la varian-za de los datos paralelamente con la modifica-ción cuantitativa de los mismos. En este sentido,y como paso previo en cada experimento,deberá establecerse la función matemática querelaciona la variable dependiente y su varian-za, lo que en términos estadísticos se denomi-na «modelo de varianza».

En estudios farmacocinéticos, el modelo devarianza más frecuente se establece como unarelación potencial del tipo:

a2 = a . cb

Siendo o2 la varianza, c el valor de la varia-ble dependiente y a y b constantes.

El modelo de varianza, una vez conocido, per-mite establecer el factor de ponderación másapropiado para el ajuste de los datos experimen-tales objeto de estudio. El factor de pondera-ción equivale al inverso de la varianza asocia-da al valor de la variable dependiente. Pedrazet al12, en un estudio realizado con paraceta-mol, demuestran cómo el factor de ponderaciónutilizado puede influir significativamente en elajuste final de los datos.

82

TRABAMIENTO DE DATOS FARMACOCINETICOS EN ESTUDIOS EXPERiMENTALES

Algoritmos denominados como «mínimos cua-drados pesados»13 y «mínimos cuadrados ex-pandidos»14'15, se orientan hacia la solución deesta problemática, habitual en estudios farma-cocinéticos.

El problema de las estimadas iniciales

Una vez seleccionado el modelo farmacoci-nético y establecido el factor de ponderaciónadecuado, se plantea el problema de seleccio-nar unas estimadas iniciales de los parámetrosadecuadas al modelo o función que se preten-de optimizar.

En este sentido puede recurrirse, en mode-los no excesivamente complejos, a la utilizaciónde ciertos métodos matemáticos o gráficos,como linearización, transformación de ecuacio-nes, etc., con el fin de obtener valores aproxi-mados de las estimadas iniciales16. Sin embar-go, la complejidad matemática de determinadosmodelos farmacocinéticos, como ocurre en cier-tos modelos de distribución, dificulta extraordi-nariamente el cálculo de las estimadas inicia-les de ciertos parámetros farmacocinéticos. Estasituación aconseja la utilización de algoritmospoderosos, habitualmente algoritmos de bús-queda directa, útiles en la selección de estima-das iniciales. El conocido método Simplex cons-tituye un algoritmo ampliamente utilizado enfarmacocinética con este objetivo17,

Bondad del ajuste

Una vez seleccionado el modelo de trabajo,la ponderación estadística, las estimadas inicia-les de los parámetros y el algoritmo de minimi-zación, se realiza el ajuste computacionai ob-teniéndose unas estimaciones finales de losparámetros. Considerando que los datos expe-rimentales sometidos al ajuste poseen error ensu determinación, los parámetros del modelosólo pueden ser estimados. Sin embargo, de-pendiendo de los datos utilizados, estimadas ini-ciales, modelo predictivo, etc., los parámetrosson estimados con una cierta precisión que esnecesario evaluar con el fin de validar el mode-lo o discriminar entre modelos experimentalesrivales.

En modelos lineales, la desviación estándarde cada parámetro puede ser calculada si seconoce la ¡ncertidumbre de los datos. En mo-delos no lineales, habituales en farmacocinéti-ca, se calcula una desviación estándar «aproxi-mada» a partir de la matriz covarianza evaluadamediante la utilización de un algoritmo de gra-

diante, que generalmente es un método deNewton18.19.

La desviación estándar individual del paráme-tro optimizado constituye una información muyeficiente relativa a la validez no sólo del pará-metro estimado sino también del modelo utili-zado. En un estudio realizado con el anestési-co Ketamina20, se utilizan criterios basados enla precisión del parámetro para establecer elmodelo de biotransformación más apropiado.

Una desviación estándar elevada de deter-minados parámetros farmacocinéticos puedeatribuirse a alguna de las siguientes causas.

1. Utilización de un tiempo de muestreo ina-decuado que origina la estimación de paráme-tros con baja precisión.

2. Utilización de datos sometidos a un errorestadístico considerable.

3. Insuficiencia de datos experimentales enrelación con la complejidad del modelo.

En general, cuando el coeficiente de variacióndel parámetro es superior al 50% se consideraque la precisión del mismo es mínima.

Otros criterios utilizados para evaluar la bon-dad del ajuste de sistemas farmacocinéticosson21'22:

1. Coeficiente de correlación: mide el gradode correlación entre los valores predichos conel modelo y los observados experimentalmente.

2. Test de Kolmogorof-Smirnov: verifica silos valores observados experimentalmente y loscomputados siguen la misma o diferente distri-bución,

3. Test de x2-. evalúa la proximidad entre va-lores observados (Yobs) y calculados (Ycalc) enbase a la siguiente expresión:

? (Yobs - Ycalc)2

X Ycalc

Discriminación de modelosfarmacocinéticos

Un problema frecuente en el análisis de re-gresión de modelos biológicos con base mate-mática, y concretamente en los modelos far-macocinéticos, es la selección de un modeloapropiado a ciertos datos experimentales entrevarios modelos que presumiblemente ajustanla función,

En general, cuando se ajusta una serie de da-tos a un modelo experimental, deben plantear-se dos cuestiones:

1. ¿Describe el modelo adecuadamente losdatos?

2. ¿Existe un modelo alternativo superior?

83

•i HADIA. A. DOMÍNGUEZ GIL. .1. GARZÓN

4.000-§ 3.000£ 2.000c 1.000-§- 0.00™-1.0002-2.000£-3.000

-4.000-1 2 3 4 6 8 10 12 16

Variable independiente (tiempo)

Fig. 1. Análisis de residuales trente a la variable inde-pendiente en estudios farmacocinéticos.

En relación con «bondad del ajuste» y «discri-minación de modelos» existe una serie de crite-rios que pueden utilizarse conjuntamente13'23:

1. Convergencia: la convergencia obtenidamediante la utilización de un programa de re-gresión no lineal constituye una medida indirec-ta, aunque no la mejor de la bondad o eficaciadel ajuste.

2. Valoración de parámetros: el valor del pa-rámetro y su estadística asociada constituyenuna interesante información cuando se preten-de validar modelos farmacocinéticos.

3. Análisis de residuales: cuando se ajustanresultados experimentales a modelos farmaco-cinéticos concretos, obtenemos una estimaciónde los parámetros implicados. Estos parámetros,de acuerdo con la función del modelo, permi-ten reproducir el proceso. La superposición en-tre datos experimentales y la función predichapermiten obtener una información útil en rela-ción con la validez del modelo propuesto, pu-diendo a su vez utilizarse en la discriminaciónde modelos. Esta técnica se conoce como aná-lisis de residuales13'23.

Un análisis completo de residuales aplicadoa estudios farmacocinéticos debe permitir rea-lizar las siguientes consideraciones:

1. Que se han violado algunas de las asun-ciones realizadas en el modelo.

2. Que las asunciones realizadas no se vio-lan aparentemente. Esto no significa necesaria-mente que el modelo sea correcto, sino que úni-camente, y partiendo de los datos observados,el modelo no parece ser incorrecto.

Los principales métodos de estudio de los re-siduales son:

i . Media.

2. Por secuencia de tiempo, si se conoce elorden.

3. Frente a los valores predichos de la varia-ble dependiente. Habitualmente, concentracióndel fármaco en sangre u orina.

4. Frente a los valores de la variable indepen-diente. Habitualmente el tiempo de obtenciónde la muestra (fig. 1).

Una de las principales ventajas del análisis deresiduales, es que permite detectar la existen-cia de los llamados outliers. Un outlier puededefinirse como un residual alejado en valor ab-soluto del resto de los residuales, generalmen-te con un valor que supera en tres o cuatro ve-ces la desviación estándar del valor medio delos residuales restantes18. Este tipo de residua-les indican la existencia de una desviación delcorrespondiente dato experimental en relacióncon el modelo propuesto.

La existencia de outliers ha originado un tipode regresión no lineal por mínimos cuadradosque recibe el nombre de «robusta» y que bási-camente consiste en dar un peso estadístico in-ferior o eliminar aquellos datos que se alejan deun ajuste provisional o previo de la función co-rrespondiente al modelo de trabajo, existiendodiversas alternativas computacionales de estemétodo24.

5. El valor de la función objetivo (SS): la utili-zación de la suma de los cuadrados de los resi-duales obtenidos en un mismo set de datos paravarios modelos distintos constituye, sin duda al-guna, el mejor camino para comparar modelos,considerando que al evaluar parámetros indivi-duales, unos pueden mejorar o empeorar su es-tadística de un modelo a otro de forma compen-sada y plantean problemas de evaluación.

Si se comparan dos modelos con un númerodiferente de grados de libertad, puede utilizar-se un test F de significancia para comparar losvalores de las sumas de cuadrados de los resi-duales ponderados (WSS) obtenidas para cadauno de los modelos y a partir de la siguienteecuación18:

WSSj - WSSkWSSk

GLkGLj-GLk

Siendo WSS la suma de los cuadrados pesa-dos para modelos farmacocinéticos con j y k pa-rámetros y GL el número de grados de libertad(GL = número de datos — número de paráme-tros) para los modelos j y k, respectivamente.

La F calculada puede compararse con el va-lor crítico obtenido en tablas para un nivel deprobabilidad del 95%.

TRATAMIENTO DE DATOS FARMACOCINETICOS EN ESTUDIOS EXPERIMENTALES

En el caso de modelos cinéticos lineales, elcriterio de la información del Akaike (AIC)25

combina simultáneamente la bondad del ajus-te y el número de parámetros cuando se com-paran modelos:

AIC = N . InSS + 2 . P

siendo N el número de datos experimentales,P el número de datos de parámetros y SS lasuma de los cuadrados de los residuales. Estemétodo supone que la distribución de la varian-za es de tipo Gaussiano. La interpretación deltest radica en que el modelo más apropiado po-see un mínimo valor de AIC.

Identificabilidad de modelos

Cuando se manejan modelos farmacocinéti-cos de complejidad relativa (por ejemplo, unmodelo de 3 o 4 compartimientos), puede ocu-rrir que dispongamos de varios modelos mate-máticos equivalentes con un número similar deparámetros en los que no podamos establecerdiferencias en base a los datos obtenidos poranálisis de regresión.

Así por ejemplo, un modelo de 2 comparti-mientos presenta tres posibles combinacionesde parámetros referentes a los procesos de dis-tribución y eliminación. Si resolvemos matemá-ticamente el sistema de ecuaciones correspon-diente a cada uno de los modelos, se obtienentres ecuaciones biexponenciales similares quepresentan una equivalencia diferente entre ma-croconstantes y coeficientes con microconstan-tes, pero que numéricamente dan valores simi-lares en las pendientes (fig. 2). Si sólo se poseendatos experimentales a nivel de compartimien-to central, no se puede discriminar matemáti-camente entre ninguno de los tres modelos, sinembargo sí pueden realizarse aproximacionesa uno de los tres modelos sobre la base de con-sideraciones fisiológicas relativas a los procesosde distribución y eliminación.

En el caso del modelo cinético tricomparti-mental se plantea una problemática similar, sibien el número de modelos considerados «equiva-lentes estructurales» puede llegar a ser de 2726.

La selección de un modelo concreto entre ungrupo de los denominados estructuralmenteequivalentes requiere la utilización conjunta decriterios matemáticos, fisiológicos y de optlmi-zación.

Así, por ejemplo, recurrir a información expe-rimental adicional basada en el muestreo delmedicamento tras su administración por diferen-

FD

FD

FD

Ka

Ka

Ka

1

11

1

Kl3

Kl3

Kl2

•

K21

K12

^

K21

K12

K21

2

2

2

1

A

B

K23

K23

C

Fig. 2. Equivalentes estructurales del modelo cinéti-co bicompartimental extravasa!. A: eliminación des-de el compartimiento central; B: eliminación desdeel compartimiento periférico; C: eliminación desde am-bos compartimientos.

tes vías, el muestreo de más de un comparti-miento o el asignar valores a los parámetros delmodelo previamente conocidos, unido a la uti-lización apropiada de métodos matemáticos ba-sados en las transformaciones de Laplace uotros contribuyen decisivamente a la resolucióndel problema2729.

BIBLIOGRAFÍA

1. Sheiner LB. Analysis of pharmacokinetic datausing parametric models 1: Regression models.J Pharmacokin Biopharm 1984; 12: 93-118.

2. Lanao JM. Domínguez-Gil A. Modelos matemáti-cos en farmacocinética. Cien Ind Farm 1987; 6:209-216.

3. Glantz SA. Mathematics for biomedical applica-tions. Ed: Universityof California Press. Berkeleyand Los Angeles, 1979.

4. Riegelman S, Loo JCK, Rowland M. Shortcomingsin pharmacokinetic analysis by conceíving thebody to exhibit properties of a single compartment.J Pharma Sci 1968; 57: 117-123.

5. Shaw NP. Area-dose relationships ¡n nonlinear mo-dels. J Pharmacokin Biopharm 1976; 4: 537-551.

6. Morino A, Kitamura K, Katayama K, Kakemi M,Koizumi T. Kinetics of d-tubocurarine disposition

85


and pharmacologic response in rats. J. Pharma-cokin biopharm 1983; 11: 47-61.

7. Yamaoka K, Tanigawara Y, Nakagawa T, Uno T.A pharmacokinetic analysis program (Multi) for m¡-crocomputer. J Pharm Dyn 1981; 4: 879-885.

8. Metzler GM, Elfring GL, McEwen AJ. A packageof computer programs for pharmacokinetic mo-delling. Biometrics 1974; 30: 562.

9. Veng-Pedersen P. Curve fitting and modeling ¡npharmacokinetics and some practical experien-ces with Nonlin and a new program Funfit. J Phar-macokin Biopharm 1977; 5: 513-531.

10. Daniel C, Wood FS. Fitting equations to data. Nue-va York, Wiley, 1971.

11. Pachner J. Handbook of numerical analysis ap-plications. Nueva York, McGraw-Hill Book Com-pany, 1984.

12. Pedraz JL, Calvo MB, Lanao JM, Domínguez-GilA. Choice of optimum pharmacokinetic model oforallyadministered paracetamol. Biopharm DrugDisp 1988. (En prensa.)

13. Mannervik B. Desing and analysis of kinetic ex-perimentsfor discrimination between rival modelsEn: Endreny; L, ed. Kinetic data analysis. NuevaYork, Londres, Plenum Press, 1981; 235-271.

14. Peck CC, Beal SL, Sheiner LB, Nichols AJ. Ex-tended least squares noniinear regression: a pos-sible solution to the choice o weight problem inanalysis of individual pharmacokinetic data. JPharmacokin Biopharm 1984; 12: 545-558.

15. Sheiner LB, Beal SL. Pharmacokinetic parame-ter estimates from several least squares proce-dures: superiority of extended least squares. JPharmacokin Biopharm 1985; 13: 185-201.

16. Lam CF, Chung A. The upper and lower boundsof rate constans for general mammillary compart-ment systems. J Pharmacokin Biopharm 1983;11: 289-301.

17. Nelder JA, Mead R. A Simplex method for func-tion minimization. Computer J 1965; 7: 308-313.

18. Boxembaum HG, Riegelman S, Elashoff RM. Sta-tistical estimation in pharmacokinetics. J Pharma-cokin Biopharm 1974; 2: 123-147.

19. Hartley HO. The modified Gauss-Newton methodfor the fitting of non-linear regression functions byleast squares. Technometrics 1961; 3: 269-280.

20. Lanao JM, Pedraz JL, Domínguez-Gil A. Análisisde datos en cinética de biotransformación. Pri-mer simposium sobre diseño de experimentos ytratamiento de datos en cinética química, cinéti-ca enzimática y farmacocinética. Salamanca 4-6 de septiembre, 1986.

21. Dadakis S. Goodness-of-fit tests for discrete data,a review and application to health impairment sca-le. Biometrics 1977; 33: 237-248.

22. Gomeni R, Gomeni C. Automod. a polyalgorithmfor an ¡ntegrated analysis of linear pharmacoki-netic models. Comput Biol Med 1979; 9: 33-48.

23. Draper N, Smith H. Applied regression analysis.Nueva York, John Wiley and sons, 1981.

24. Cornish-Bowden A. Robust estimation in enzymekinetics. En Kinetic data analysis. Endrenyi L, ed.Nueva York, Londres, Plenum Press, 1981;105-135.

25. Yamaoka K, Nakagawa T, Uno T. Application ofAkaike's information criterion (AIC) in the evalua-tion of linear pharmacokinetic equations. J Phar-macokin Biopharm 1978; 6: 165-185.

26. Wagner JG. Do you need a pharmacokinetic mo-del, and if so, which one? J Pharmacokin Bipharm1975; 3: 457-478.

27. Godfrey K. The concept of identifiability in com-partmental models and their applications. LondresAcademic Press, 1983; 92-98.

28. Delforge J. New results on the problem of identi-fiability of a linear system. Math Biosci 1980; 52:73-96.

29. Delforge J. Necessary and sufficient structural con-dition for local identifiability of a system with linearcomapartments. Math Biosci 1981; 54: 159-180.

DISCUSIÓN

R. OBACH: Me gustaría que el Dr. Martínez La-nao comentara su opinión acerca de la discri-minación de modelos cuando se utilizan diver-sos métodos que no siempre son coincidentes,lo cual dificulta la decisión.

J. MARTÍNEZ-LANAO: Evidentemente. Ademáshay que tener en cuenta que no todos los mé-todos de este tipo que combinan grados delibertad y valores residuales tienen la mismaapreciación estadística. A mi juicio, la mejoralternativa consiste en recurrir a un test de F,

con un 95% de probabilidad, que suele seruna prueba más precisa aunque es bien sa-bido que los criterios de discriminación de mo-delos son variables, y por tanto, como se dis-pone de una gama muy amplia de criteriospara discriminar modelos, lo mejor es no uti-lizar nunca un criterio aislado sino recurrir ini-cial mente a una batería de pruebas para discri-minar modelos y el propio diseño experimentales el que indica en cada caso la selección deuno u otro método. No debe caerse en el error

TRATAMIENTO DE DATOS FARMACOCINÉTICOS EN ESTUDIOS EXPERIMENTALES

de utilizar de forma sistemática la misma prue-ba de discriminación de modelos prescindien-do del diseño experimental.

M. ARBOIX: Mi pregunta iba en el mismo sen-tido. A veces uno se encuentra con un mode-lo mono o bicompartimental con una fase ini-cial muy variada y aplicando varias pruebas secomprueba que entre ellas las diferencias sonprácticamente nulas, o sea, que los coeficien-tes son muy similares. ¿Cuál elegir? A vecesuno se plantea optar por un modelo no com-partimental porque le soluciona el problema.

J. MARTÍNEZ-LANAO: Ésta es una buena pre-gunta. Aquí entramos en una cuestión relati-vamente habitual en estudios farmacocinéti-cos directamente relacionado con los gradosde libertad. Y el problema de los grados delibertad es que el investigador tiende a recu-rrir a modelos multicompartimentales que sonmás exponenciales y a príorí ajustan mejor losdatos. Pero precisamente en este caso, la des-viación estándar del parámetro individual per-mite obtener modelos con coeficiente de co-rrelación próximos a la unidad. Sin embargo,esa fase inicial que usted comentaba es muydifícil de cuantificar en muchos estudios far-macocinéticos por su rapidez, que implicatambién un problema de muestreo. Es decirse obtiene una buena correlación en los pun-tos iniciales pero con una precisión mínima.De ahí que muchas veces ese modelo tricom-partimental o tetracompartimental que podría-mos utilizar y que evidentemente muestra unbuen grado de correlación sea inaceptable de-bido a que la precisión de los parámetros esmuy mala, especialmente en las primeras fases.

M. ARBOIX: Es evidente que uno de los elementosdiscriminatorios es justamente las desviacionesde parámetros. Incluso cuando se obtienenmuchos puntos en la primera fase aunque evi-dentemente esto siempre es limitado y se utilizael criterio de la desviación de los parámetrospara descartar uno u otro modelo, uno se que-da con la duda y opta por aplicar un modelono compartimental para evitar esos problemas.

J. MARTI NEZ-LANAO: Estoy de acuerdo, perotampoco debe renunciarse a príorí a un deter-minado tipo de análisis. Soy de la opinión deque el problema radica en el diseño experimen-tal. Es decir, existen métodos que permiten se-leccionar el tiempo de muestreo más adecua-do especialmente cuando se vislumbra una ci-nética compleja. De esta forma, se aplican cri-terios estadísticos a príorí y no a posteríori.

J.L. GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ: Me ha parecidoentender que lo que se intenta ajustar dentro

de los distintos modelos es una suma de ex-ponenciales en sistemas compartimentales.¿Trabajan así generalmente los algoritmos deltratamiento de modelos farmacocinéticos opor el contrario abordan, o deberían abordarel problema resolviendo la serie de ecuacio-nes diferenciales numéricamente?

J. MARTÍNEZ-LANAO: El planteamiento mate-mático del modelo representa un paso impor-tante. Evidentemente se plantean dos proble-mas, el propiamente farmacocinético delmodelo y el propiamente matemático, es de-cir, ¿cuál es el camino matemático para ajus-tar de forma más adecuada la función? De-pende del sistema farmacocinético y guardatambién relación el método de minimización.

J.L. GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ: Evidentemente,pero quisiera profundizar un poco más en estacuestión. Imaginemos que estamos proban-do un sistema generalizado tricompartimen-tal y que simplemente por inexperiencia des-conocemos los valores de las cinco, siete ohasta veinte constantes que pueden existir,¿se obtienen valores de un orden de magni-tud similar? ¿No sería mejor abordar el pro-blema directamente con un algoritmo robus-to de resolución de ecuaciones diferenciales?

J. MARTÍNEZ-LANAO: En general, el orden demagnitud es similar pero esto depende del tipode parámetros, ya que no es exactamenteigual en todos los casos, aunque se muevenen unos límites parecidos. Lo que es obvio esque si bien desconocemos el valor de la esti-ma inicial lo que normalmente sí se conocesobre la base de la naturaleza biológica, fisio-lógica del parámetro, es el orden de magni-tud en el que teóricamente debería moverse.En cualquier caso podemos también tratar di-rectamente con el sistema. Ambos enfoquestienen ventajas e inconvenientes en cada si-tuación concreta.

R. OBACH: Entiendo que en este contexto de losmodelos cinéticos jugamos con una gran des-ventaja y ya que sólo disponemos de informa-ción experimental sobre uno de los comparti-mientos. Ésta es una de las grandes pegas parala resolución de muchos modelos cinéticos.

J. MARTÍNEZ-LANAO: Exactamente. Un pro-blema típico en farmacocinética es la limita-ción de la información experimental, especial-mente en estudios en humanos dondedisponemos de una cierta cantidad de mues-tras con la que debemos trabajar a la hora deelaborar el diseño experimental. De nada sir-ve recurrir a métodos muy sofisticados si lainformación experimental es insuficiente.

87

Tratamiento de datos en farmacocinética clínicaA. Domínguez-Gil y D. Santos

Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica. Universidad de Salamanca.

Introducción

La proyección de la farmacocinética clínica enla terapéutica farmacológica presenta dos áreasde gran interés: el desarrollo de nuevos medi-camentos y la optimización de las pautas de do-sificación.

En las distintas fases de la investigación clíni-ca, la legislación sanitaria establece los estudiosque deben realizarse para llegar a definir el perfilfarmacocinético de un nuevo medicamento. Así,el Food and Drug Admisnistration (FDA) señalacómo debe ser establecida la cinética en dosisúnica y múltiple en los ensayos en fase I, iden-tificados los posibles metabolitos y estudiada labiodisponibilidad de la forma de dosificación.Los resultados obtenidos, conjuntamente con losaportados por los estudios de tolerancia, efica-cia y efectos adversos, van a permitir estable-cer las bases para la utilización de un medica-mento en la práctica clínica. El diseño y lametodología de estos estudios es similar a la es-tablecida en la farmacocinética experimental,con las limitaciones propias de un ensayo clínico.

El balance beneficio/riesgo puede ser consi-derado un parámetro adecuado para evaluar lacalidad de un tratamiento. La farmacocinética,conjuntamente con otras especialidades, con-tribuye a garantizar la eficacia y seguridad dela terapéutica farmacológica. Así, durante los úl-

timos años, los principios farmacocinéticos sehan incorporado a otros criterios clínicos quepresidían tradicionalmente la implantación deun tratamiento.

La aplicación de la farmacocinética en el con-trol de la terapéutica farmacológica se apoya endos hechos que han sido verificados experimen-talmente:

1. Existe una correlación aceptable entre lasconcentraciones séricas que alcanza un medi-camento en el curso de un tratamiento y su efi-cacia y/o toxicidad1. Así, la individualización po-sológica ha permitido un mejor control de lascrisis epilépticas, una evolución más favorablede los pacientes asmáticos o una menor inci-dencia de nefrotoxicidad en pacientes tratadoscon antibióticos aminoglucósidos. Ello ha lleva-do a establecer un margen terapéutico de con-centraciones séricas para diferentes medica-mentos, asociado a la máxima eficacia con unamínima incidencia de efectos tóxicos.

2. Existe una gran variabilidad interindividualen los parámetros farmacocinéticos2, especial-mente en medicamentos ampliamente metabo-lizados como los antiepilépticos o los antidepre-sivos tricíclicos.

Como consecuencia de estos hechos existengrandes diferencias en las dosis necesarias paraobtener una respuesta clínica óptima2. Por tan-to, la selección de las pautas de dosificación so-

TABLA IRESULTADOS CON TRES MÉTODOS

DE PROGRAMACIÓN DE LA POSOLOGÍADETEOFILINA

MÉTODO DEDOSIFICACIÓN

Sawchuk-ZaskePiafsky-OgilvieKoup-Jusko(nomograma)

NIVELESSUBTERAPÉUTICOS

111019

PACIENTES (%)

NIVELESTERAPÉUTICOS

854268

NIVELESTÓXICOS

44812

89

RADIA, A. DOMINGUr,7 • GIL, J. GARZÓN

Propiedades farmacocinéticasdel fármaco

tCaracterísticas del paciente

f

Farmacocinética clínica

Parámetros farmacocinéticospoblacionales

1

r

Parámetros farmacocinéticosindividuales.

Determinación de niveles séricos

1

Diseño y optimización de los regímenesde dosificación (D*, D, t)

1

Predicción de concentraciones séricas:

^máx Cmín C^^

Determinaciónde niveles ser eos.Margen terapéutico

Evolución clínica

Monitorización

Fig. 1. Esquema para establecer o corregir la posologia de medicamentos sobre la base de sus característicasfarmacocinéticas.

bre la base de los parámetros farmacocinéticospoblacionales y de las características del pacien-te (edad, peso, función renal, etc.) no garantizaque las concentraciones séricas se encuentrendentro del margen terapéutico. Por ello, es pre-ciso determinar las concentraciones séricas delmedicamento o de sus metabolitos para poderoptimizar las pautas de dosificación en funciónde las características farmacocinéticas indivi-duales3.

En la tabla I están recogidos los resultados deun estudio en el que se componen tres méto-dos de programación de la posología de teofili-na. Los mejores resultados se han obtenidocuando la individualización posológica se ha rea-

lizado a partir de la determinación de los nive-les séricos.

En la figura 1 se recoge un esquema para es-tablecer o corregir la posología de medicamen-tos utilizando información sobre sus caracterís-ticas farmacocinéticas.

Los métodos de individualización posológicautilizados en clínica emplean una informaciónmuy limitada, habitualmente sólo de uno a tresdatos de concentración sérica obtenidos a tiem-pos no siempre programados. Así mismo, estosmétodos deben permitir establecer rápidamentela dosis óptima, evitando interferencias en el tra-tamiento e inconvenientes para el paciente ypersonal sanitario.

90

TRATAWIFNTO DF DATOS FN FARMACOCINFTirA r i

Selección del tiempo de muestreo

Debido a la limitada información habitualmentedisponible debe realizarse una cuidadosa elec-ción de los tiempos de muestreo basada en el co-nocimiento de los parámetros farmacocinétlcosde la población. Esta elección dependerá de sise desean monitorizar las concentraciones séri-cas en el máximo, en el mínimo o en algún tiempointermedio4, así como de si se pretende carac-terizar la cinética de eliminación del medicamentoo solamente predecir un régimen de dosificación.

Cuando se proceda a controlar las concen-traciones mínimas, la obtención de muestrasdebe ser realizada en la fase de posdistribución.Sólo después de alcanzado el equilibrio de dis-tribución, las concentraciones séricas puedenreflejar la evolución de las concentraciones enlos distintos compartimientos corporales.

Cuando se pretende determinar los paráme-tros farmacocinéticos individuales (aclaramien-to, volumen de distribución o semivida de eli-minación) deben obtenerse dos o más muestrasde suero en la fase terminal de eliminación. Lavariación del aclaramiento es mínima cuandoel tiempo medio de muestreo (t*) es igual al in-verso de la constante de eliminación (1/Ke) y portanto t* = 1,44 tVi, independientemente delnúmero de muestras obtenidas (Dossing et al,1983, citado por J.T. Slattery et al2). No obs-tante, el tiempo óptimo de muestreo solamen-te puede ser estimado de una forma aproxima-da debido a la necesidad de utilizar parámetrosfarmacocinéticos poblacionales. Los valores es-tablecidos para los parámetros farmacocinéti-cos individuales se utilizan para modificar, si fue-se necesario, el régimen posológico establecido.

Con objeto de reducir el número de muestrasnecesarias para poder predecir las concentra-ciones séricas alcanzadas en el transcurso de untratamiento y poder corregir las pautas de do-sificación, se han propuesto diferentes métodosaplicables en clínica. Todos ellos se basan enla relación existente entre la concentración sé-rica mínima que se alcanza después de la ad-ministración de una dosis inicial y la que se al-canza en el estado de equilibrio estacionario.Este hecho fue aplicado inicialmente a medica-mentos como el litio y la nortriptilina que pre-sentaban valores elevados de la semivida de eli-minación. Posteriormente, esta relación fuecomprobada con medicamentos de semividamás corta como teofilina y cloramfenicol4'5. Es-tas relaciones permiten predecir, utilizando lasecuaciones farmacocinéticas clásicas, la dosisde mantenimiento necesaria para alcanzar una

eKet7Ke

120110-100-90-80-70.60-5040-130

Ke (rr1)•-} c\j m sf _. _ .o o o o o o oo" o"

- o_cS o~ o" o~ o o" o o o

gs

Fig. 2. Trazado de ehrl/Ke trente a Ke para un tiem-po de muestreo de 24 horas tras la administración dela primera dosis en una población de 22 niños trata-dos con imipramina.

Determinada concentración en el estado deequilibrio estacionario.

La relación entre la concentración sérica enel estado de equilibrio (Css) y la obtenida trasla administración de una dosis (Dm) es lasiguiente2:

Cjf _ Dm.eKet 'C " Ke.r.D

siendo D la dosis inicial, Ke la constante de eli-minación, T el intervalo de dosificación y t* eltiempo.

Debe señalarse que aunque Css y C* estáncondicionadas por el volumen de distribución,la relación entre ambas es independiente de di-cho parámetro. En la ecuación anterior, las va-riaciones interindividuales solamente pueden ve-nir condicionadas por las variaciones de Ke. Paraque las fluctuaciones del término (EXP[Ke.t])/Kesean mínimas, el tiempo de muestreo t* debeser igual a 1/Ke. En efecto el término permane-ce razonablemente constante para un margende valores de Ke de tres a cuatro veces.

En la figura 2 se muestra el trazado deeKet/Ke frente a Ke para un tiempo de muestreode 24 horas después de la administración dela primera dosis en una población de 22 niñostratados con imipramina. En la figura se ilustranlos límites teóricos de un 20% de error en la pre-dicción de los valores de la semivida de elimi-

91


nación comprendidos entre 9 y 34 horas. Paraaquellos niños en los que la semivlda de elimina-ción sea inferior a 8 horas será difícil predecirlas concentraciones séricas a partir de un únicodato tras la administración de la primera dosis6.

La selección de este tiempo de muestreo pre-senta algunas limitaciones4: a) la relación utili-zada es modelo dependiente; b) no es posiblepredecir las concentraciones máximas o míni-mas en el estado de equilibrio, ye) asume quelos procesos de absorción y distribución sonmás rápidos.

Con el fin de salvar estas limitaciones, Loveet al7 desarrollaron una base teórica general,válida para medicamentos que se ajustan a unacinética lineal, independiente del modelo y dela vía de administración y que permiten prede-cir concentraciones séricas en el estado de equi-librio estacionario diferentes a la concentraciónmedia, Este método no está limitado por la se-mlvlda del medicamento y es menos sensible alas variaciones interindividuales de este pará-metro con respecto a los valores de la población.

Métodos de predicción de dosis

Los diferentes métodos propuestos utilizan unnúmero escaso de datos de nivel sérico, deter-minados en la iniciación del tratamiento o unavez alcanzado el estado de equilibrio. Esta in-formación permite caracterizar los parámetrosfarmacocinéticos individuales y, por tanto, op-timizar la posología.

El método propuesto por Ritschel10 permiteestimar la dosis necesaria para alcanzar una de-terminada concentración mínima en el estadode equilibrio, utilizando un único dato de nivelsérico obtenido tras la administración de unadosis inicial. Este método puede ser aplicadoa medicamentos que sigan una cinética lineal,que se ajusten a un modelo mono o bicompar-timental y que se administren por vía intrave-nosa o extravasal. La principal limitación de estemétodo es que no permite calcular los paráme-tros farmacocinéticos individuales, utilizando unvalor de Ke poblacional con fines predictivos.

Ritschel y Thompson9 propusieron el métododenominado del «punto repetido» que, basán-dose en el principio de superposición, permitedeterminar el valor de Ke en un paciente y es-tablecer el régimen de dosificación utilizandodos datos de concentraciones séricas obtenidasen los dos primeros intervalos. Las muestras de-ben obtenerse en la fase monoexponencial deeliminación y estar separadas por un intervalode dosificación. En estas condiciones, el valor

de Ke se obtiene a partir de la siguiente ecua-ción:

K e = .lnr C2-C1

En 1980, Slattery8 propuso un método depredicción de dosis, utilizando dos o tres datosde concentraciones séricas obtenidos tras la ad-ministración de una dosis inicial, permitiendoel cálculo de los parámetros cinéticos individua-les. El método basado en las ecuaciones farma-cocinéticas clásicas, es aplicable a medicamen-tos que se ajustan a una cinética lineal, y amodelos mono y bicompartimentales con admi-nistración intravenosa o extravasal.

En este caso, la concentración sérica (C) seajusta a la siguiente ecuación general:

C = D (Z) . e*>

siendo D la dosis administrada, /3 la constanteque define la fase se eliminación terminal y t eltiempo transcurrido desde la administración,una vez que se han completado los procesosde absorción y distribución, y Z el factor que de-pende del modelo cinético y de la vía de admi-nistración utilizada.

A partir de tres concentraciones determina-das en la fase de eliminación, es posible esta-blecer la constante /3 y predecir las concentra-ciones séricas que se alcanzarán en el estadode equilibrio. Por tanto, puede establecerse ladosis de mantenimiento para alcanzar un valordeseado de concentración sérica en el estadode equilibrio, mediante la siguiente ecuación:

Dm = Cmindes (1 - e - 0 ' ) . e*3'

La validez de este método está condiciona-da por la exactitud en la determinación de losvalores de ¡3 y Z.

La capacidad predictiva del método fue eva-luada en un estudio realizado en 95 pacientesasmáticos que recibían teofilina por vía oral. Elerror medio de predicción fue establecido en—0,005 ± 1,44 /ig/ml, que pone de manifies-to una excelente correlación entre las concen-traciones predichas y observadas3.

Los métodos anteriormente descritos permitenestimar el régimen de dofisicación óptimo en unpaciente a partir de la información obtenida enla iniciación del tratamiento, situación plantea-da habitualmente con aminoglucósidos, teofili-na o lidocaína. En otras situaciones, como ocu-

92

TRíJAMIENTO 3E DATOS EN FARMACOCINÉTICA CLÍNICA

rre con los antiepilépticos o antidepresivos, lacorrección de la dosis debe realizarse frecuen-temente una vez alcanzado el estado de equili-brio. En estos casos se recomienda, de formageneral, realizar la extracción de la muestra alfinal del intervalo de dosificación. La concentra-ción sérica se correlaciona con la dosis admi-nistrada mediante la siguiente ecuación:

Css = F. DmClp . r

Lógicamente, la precisión del método aumen-ta cuando los parámetros han sido establecidosen una población análoga, pero pueden ser muyinexactos cuando se utilizan otros grupos de po-blación. Por ello, es preciso comprobar la bon-dad de las predicciones mediante nuevas de-terminaciones de las concentraciones séricas.

De esta forma se va acumulando informaciónsobre el comportamiento cinético del medica-mento en el paciente, lo que permitirá deter-minar los parámetros individuales y ajustar deforma más precisa el régimen de dosificación.

La combinación de la información proceden-te del paciente conjuntamente con datos pobla-cionales se realiza en la actualidad mediante laaplicación del método bayesiano. De esta for-ma se atenúa la escasa precisión de los pará-metros determinados de forma individualizadaa partir de un número limitado de datos de con-centraciones séricas.

Mediante el método bayesiano, los paráme-tros de población predichos, asociados a unadeterminada varianza, actuarán como factor decorrección en la optimización de la posología.

Un algoritmo de regresión no lineal basadoen el método bayesiano estima los parámetrosminimizando la siguiente función objetivo:

(Cobs - Cp)2 (Pobs - Pp)2

De2Cobs + D E 2 P P

Siendo Cobs la concentración sérica obser-vada, Cp la concentración sérica predicha, Pobslos parámetros farmacocinéticos observados delmodelo, Pp los parámetros predichos, calcula-dos en cada interacción y de DE2cObs y DE2PPlas varianzas de las concentraciones séricas yde los parámetros poblacionales, actuandol/DE2cobs y l/DE2pp como factores ponderalesde ambos tipos de variables.

En este método es preciso fijar la contribu-ción cuantitativa de cada término mediante laintroducción de un factor de ponderación (FF)que puede ser evaluado estadísticamente en elcaso de que exista información suficiente de una

TABLA IIPARÁMETROS FARMACOCINÉTICOS MEDIOS

Y VARIANZA EN UN ESTUDIOCON GENTAMICINA EN MUESTRAS

DE PACIENTES CON DISTINTOS GRADOSDE DISFUNCIÓN RENAL

Clcr Ke CV CÍ CV(ml/min) (h-1) (%) (i/h) (%)> 100 0,284 36,62 4,160 29,60

60-100 0,228 19,29 3,742 32,5720-60 0,088 38,63 2,227 62,2810-20 0,054 79,630 0,720 56,66< 10 0,021 71,429 0,467 57,02

amplia población de pacientes. Su cálculo serealiza a partir de la varianza de las concentra-ciones séricas determinadas, de acuerdo conla siguiente expresión:

FF = 11 + DE2,Cobs

siendo DE2cObs la varianza de la población, cal-culada a partir de la ecuación:

DE2 = 1N - mK

kSSi

siendo N el número total de datos de paciente,m el número de parámetros de la ecuación delmodelo, K el número de pacientes y SSi la sumade cuadrados residual obtenida en la curva deajuste de los datos de cada paciente.

El valor de FF oscila entre 0 y 1. Cuando nose dispone de ningún dato de concentraciónplasmática, los métodos bayesianos ignoran elcomportamiento cinético individual y los pará-metros del paciente coincidirán con los de la po-blación en la cual se encuadra. Cuando el va-lor de FF tiende a 1, el peso de los datosindividuales de! paciente aumenta frente a losparámetros farmacocinéticos de la población,Por tanto, el grado de utilidad del método ba-yesiano es limitado, aceptándose su validez paraun número restringido de muestras.

Otra cuestión de interés es la correcta carac-terización de los grupos poblaclonales, ya queuna incorrecta selección de la población cuyosparámetros van a ser utilizados como informa-ción previa puede conducir a importanteserrores.

En la tabla II se muestran los parámetros far-macocinéticos medios, así como la varianza enun estudio sobre gentamicina en poblacionescon diferente grado de función renal11.

93

A BADIA. A. DCMINGUEZ - GIL, J. GARZÓN

Estos resultados demuestran que en situacio-nes de fallo renal no solamente se modifican losparámetros farmacocinéticos que expresan laeliminación sino también la varianza de dichosparámetros, lo que implica una mayor variabi-lidad interindividual en el comportamiento far-macocinético de la gentamícina y que afecta alajuste de los datos por un método bayesiano.

La caracterización farmacocinética poblacio-nal exige la determinación de tres tipos deparámetros1216:

1. Parámetros farmacocinéticos de efectosfijos, que cuantifican el comportamiento cinéti-co medio de un medicamento en una población(por ejemplo, valores medios del aclaramiento,volumen de distribución, etc) y su relación conparámetros fisiológicos (por ejemplo, variaciónde la constante de eliminación con el aclara-miento de creatinina).

2. Parámetros de efectos aleatorios inten'n-dividuales, que cuantifican la magnitud típicade la variabilidad cinética ¡nterindividual alea-toria de los parámetros. Son aleatorias porquelas desviaciones se ajustan a una distribuciónde probabilidad.

3. Parámetros de efectos aleatorios intraino¡vi-duales, que cuantifican la magnitud n'pica de lavariabilidad residual incluyendo errees de me-dida y errores en la especificación del modelo.

La exactitud y precisión en la estimación deestos parámetros, fijos y aleatorios, es impor-tante, por razones de trascendencia clínica.

Mientras que los valores medios de los pará-metros son útiles en el desarrollo de pautas dedosificación, la variabilidad de estos parámetrospermite estimar el grado de confianza del régi-men propuesto y determinar la urgencia y la fre-cuencia del seguimiento del paciente. Además,la interpretación de los niveles séricos y el pos-terior ajuste de la dosis con el uso de técnicasde predicción bayesiana requieren el conoci-miento de ambos tipos de parámetros.

Métodos de estimación de parámetroslarmacocinéticos poblacionales

Tradicionalmente se han utilizado dos méto-dos para determinar los parámetros farmaco-cinéticos de un medicamento en una po-blación12^15.16.

1. Método de Naive poded data (NPD) queconsidera en conjunto todos les datos de con-centración de todos los individuos. Este méto-do es inexacto e impreciso, e ignora las diferen-cias cinéticas existentes entre individuos de unapoblación. Por tanto, no puede distinguir la va-

riabilidad interindividual de la variabilidad resi-dual debida tanto a la variabilidad intraindivi-dual como al error de medida.

2. IVétodo Standard two-stage (STS) es el másutilizado y que, como su nombre indica, se rea-liza er dos etapas.

En la primera se estiman los parámetros bá-sicos individuales correspondientes al modeloadoptado y obtenidos por métodos de regresiónlineal o no lineal.

En la segunda se combinan los resultados dela primera para obtener los parámetros farma-cocinéticos de población. La media geométri-ca de las estimadas individuales de los distin-tos parámetros del modelo es utilizada paraestimar el parámetro medio de la población.

Este método, de forma opuesta al anterior,considera a cada individuo totalmente aisladode los demás y la elección de la forma de com-binación de los parámetros individuales debeser cuidadosa para que puedan obtenerse es-timadas razonables de los parámetros de efec-tos fijos. Un problema que se presenta frecuen-temente es la sobrestimación de los parámetrosde efectos aleatorios individuales, debido a quese acumulan errores de diverso origen. Estaaproximación es de gran utilidad en farmacoci-nética experimenta!, donde pueden hacerse ex-haustivos muéstreos de acuerdo con métodosexperimentales, a diferencia de las limitacionesya comentadas en la práctica clínica.

En el caso de que se disponga de muchos da-tos por individuo y cuando el error residual seabajo, puede utilizarse este método de cálculo.En caso contrario, el error contaminará de for-ma aprecia ble los valores estimados de la va-riabilidad interindividual que serán más impre-cisos a medida que dicho error aumente.

Los datos procedentes del cuidado rutinariode¡ paciente requieren, dadas sus característi-cas, métodos de análisis muy sofisticados. Hayque considerar que dichos datos están someti-dos a los efectos de variables concomitantesdesconocidas, por lo general poco fiables encuanto a tiempo de toms de dosis, muestreo,g'ado de cumplimiento, etc., y por otra partesuele existir correlación de variables, lo queconstituye un problema desde el punto de vis-ta estadístico.

Para salvar el problema de obtener unas es-timadas razonables (exactas y precisas) de losparámetros farmacocinéticos poblacionales apartir de los datos de rutina clínica, se han pro-puesto algunas alternativas a los métodos tra-dicionales. De éstas, quizá las de mayor proyec-ción son ios programas Nonmen (acrónimo de

94

TRATAMIENTO DE 3ATOS EN FARMACOCINÉTICA CLÍNICA

Non-Linear Mixed Effect Model) (Sheiner y Beal,1980) y MULTI (ELS)17 para su uso en macroy microordenadores, respectivamente. Ambosutilizan el método de regresión no lineal con mí-nimos cuadrados expandidos y permiten eva-luar en conjunto los datos de todos los pacien-tes pero con diferenciación expresa de cada unode ellos, por lo cual estiman de forma más pre-cisa los parámetros de efectos fijos aleatorios.

El problema de estos programas, y en gene-ral de los mínimos cuadrados expandidos, re-side en el uso del modelo a utilizar, puesto queal introducir un modelo de varianza aumenta elnúmero de «candidatos». Si el modelo se selec-ciona incorrectamente se pueden producir con-siderables errores en la estimación de los pa-rámetros que son muy difíciles de identificar.

BIBLIOGRAFÍA

1. Domínguez-Gil A, García Sánchez MJ. Monitori-zación de niveles séricos de medicamentos. El far-macéutico 1984; 9: 33-45.

2. Slattery JT, Gibaldi M, Koup JR. Prediction ofmaintenance dose required to attain a desireddrug concentration at steady-state from a singledetermination of concentration after an initial dose.Clin Pharmacokin 1980; 5: 377-385.

3. Otero MJ. Eficacia del control de niveles séricosde teofilina en pacientes con asma bronquial cró-nica. Tesis doctoral. Universidad de Salamanca.Salamanca, 1987.

4. Schumacher GE. Choosing optimal sampling timesfor therapeutíc drug monitoring. Clin Pharm 1985;4; 84-92.

5. Koup JR, Sack CM, Smith AL, Gibaldi M. Hypo-tesisfor the individualisation of drugdosage. ClinPharmacok 1979; 4: 460-469.

6. Fernández de Gatta MM, Tamayo M, Rey F, Gar-cía MJ, Domínguez-Gil A. Design of a nomogramfor dosage individualization on starting treatmentwith imipramine in eneuretic children. TroisiémeJournées Mediterranéennes de Pharmacocinéti-que. Montpellier 19-21 de mayo, 1988.

7. Love BL, Tsueí JE, Thomas J, Nation RL. Thesingle-point method of dosage prediction; parma-

cokinetics basis and method optimization. Bio-pharm Drug Dlspos 1982; 3: 191-201.

8. Slattery JT. A pharmacokinetics model-indepen-dent approach for estimating dose required to givedesired stady-state troungh concentrations of drugin plasma. J Pharmacokin Biopharm 1980; 8:105-110.

9. Ritschel WA, Thompson GA. The one-point methodfor prediction dosage régimen in case of hepatícand/or renal failure ¡n presence or absence ofchangeof volumen of distribution. J Clin Pharma-cokin 1979; 19; 350-356.

10. Ritschel WA. The one-point method as clinical toolto calcúlate and/or adjust dosage régimen. DrugDevelopment and industrial pharmacy 1977; 3:547-553.

11. Berrocal A, Lanao JM, Domínguez-Gil A. Diseñoy aplicación de un método bayesiano en la indivi-dualización posológica de gentamicina en pacien-tes renales. XXXII Congreso Nacional de la Aso-ciación de Farmacéuticos de Hospitales.Salamanca 23-26 de septiembre, 1987. .

12. Sheiner LB, Beal SL. Evaíuation of methods forestimating population pharmacokinetic parame-ters. I. Míchaelis-Menten model: routine clinicalpharmacokinetic data. J Pharmacokin Biopharm1980; 8: 553-571.

13. Sheiner LB, Beal SL. Evaíuation of methods forestimating populations pharmacokinetic parame-ters. II. Biexponential model and experimentalpharmacokinetics data. J Pharmacokin Bio-pharma 1981; 9: 635-651.

14. Sheiner LB, Beal SL. Evaluation of methods forestimating population pharmacokinetic parame-ters. III. Monoexponential model: routine clinicalpharmacokinetic data. J Pharmacokin Biopharm1983; 11: 303-319.

15. Grasela TH. Population pharmacokinetic: Appli-cation of clinical triáis. En: Smith RB, Kroboth PD,Juhl RP, eds. Pharmacokinetics and phamacody-namics. Research desing and analysis. Cincinati,Harvey Whitney Books, 1986.

16. Sheiner LB. The population approach to pharma-cokinetics data analysis and standard data analysismethods. Drug Metab Rev 1984; 15: 153-171.

17. Yamaoka K, Tanaka H, Okumura K, Yasuhara M,Hori R. An anafysis program MULTI (ELS) basedon extended nonlinear least squares method formicrocomputers. J Pharmacobiodyn 1986; 9:167-173.

DISCUSIÓN

J. DOMÉNECH: Es obvio que existen diversosmétodos de monitorización de fármacos, porejemplo, métodos de un punto, de dos pun-tos, de tres puntos o de un punto repetido. Ellocondiciona la cronología de la toma de mues-tras y aplicando los conceptos fármacocinéti-

cos se desarrollan fórmulas distintas para larealización del cálculo de las dosis de man-tenimiento. ¿Qué criterio cree usted que de-bería seguirse a la hora de elegir un tipou otro de método para un determinado fár-maco?

95


A. DOMÍNGUEZ-GIL: Depende fundamental-mente de las características según se trate demedicamentos con una semivida relativamen-te corta, como por ejemplo la teofillna o la gen-tamicina o con una semivida larga, como porejemplo algunos antldepresivos tricíclicos. Esobvio que no podemos tener un paciente es-perando durante 24o 48 horas en el hospitalpara hacer tres determinaciones. Entonces lametodología aconseja recurrir, por ejemplo,al método del punto repetido que es el queutilizamos inicialmente en la monitorización deantidepresivos. Por supuesto existen tambiénotros condicionantes como la presencia demetabolitos activos, etc., que pueden compli-car mucho más el tratamiento. Otro factor adi-cional a tener en cuenta es la precisión de latécnica analítica teniendo en cuenta el límitede concentraciones séricas en las cuales nostenemos que mover para caracterizar con pre-cisión los parámetros correspondientes.

J. DOMÉIMECH: Este hecho limita en gran me-dida la utilización del método de un punto, queen principio sería el más versátil en cuanto afacilidad y maniobrabilidad hospitalaria.

A. DOMÍNGUEZ-GIL: Indudablemente. Hayque adaptarse a condicionamientos posible-mente prosaicos y poco científicos como ho-rarios de enfermería, viajes desde la periferiade la ciudad, que deben ser tenidos en cuenta.

R. OBACH: ¿Tienen ustedes experiencia en es-tudios comparativos para un mismo fármacoutilizando distintos métodos? Me refiero a laparadoja del esfuerzo que representa la mo-nitorización cuando se trata de fármacos quedeben administrarse por vía oral con una for-ma de dosificación, la dificultad ulterior enadaptar esta posología. Si las diferencias noson muy notables, y el esfuerzo es muy dis-tinto según los métodos, quizás no sea tan dis-criminativo utilizar un método u otro.

A. DOMÍNGUEZ-GIL: Nosotros intentamos gra-dualmente simplificar al máximo los métodosporque la carga asistencial es brutal. Téngaseen cuenta que la realización de 100 determi-naciones diarias de fármacos exige no sola-mente una tecnología sino que tiene tambiénuna incidencia económica muy importante.Un equipo de monitorización funcionando en unhospital supone al año entre 15 y 30 millonesde pesetas, aunque lógicamente hay que eva-luar los costes. Nosotros hemos comprobadoque en pacientes asmáticos monitorizados elnúmero de episodios agudos disminuye drás-ticamente. Es una cuestión de coste-beneficio.

J. FLÓREZ: Por no hablar del beneficio para elpropio paciente, que es Independiente delcoste.

A. DOMÍNGUEZ-GIL Obviamente, pero inclu-so hablando en términos de economía hospi-talaria es un hecho que un elevadísimo por-centaje de pacientes asmáticos que ingresanen las unidades de urgencia presentan con-centraciones séricas de teofilina subterapéu-ticas. Esto tiene implicaciones no tan sólo sa-nitarias sino también sociales.

F. BARTUREN: Quisiera hacer una pregunta detipo práctico ¿Cómo aborda la farmacologíaclínica, tanto en el hospital como especialmen-te a nivel de asistencia primaria, el problemadel incumplimiento de la terapéutica y su re-lación con las pautas de tratamiento?

A. DOMÍNGUEZ-GIL: Creo que una aplicaciónmuy importante de la farmacocinétlca es la de-tección del grado de incumplimiento aunquelógicamente lo más importante es la evoluciónclínica del paciente.

J. FLÓREZ: Ahondando un poco más en estacuestión, pienso que no ha habido todavía unaaproximación al médico práctico por parte delos laboratorios de farmacocinética clínica. Locual no es de extrañar teniendo en cuenta quela situación tampoco es satisfactoria a nivelhospitalario, a escala nacional.

A. DOMÍNGUEZ-GIL: Estoy de acuerdo, pero encualquier caso hay que tener presente quepara favorecer el cumplimiento conviene queexista siempre una concordancia entre los in-tervalos posológicos y los hábitos de la per-sona.

S. ERILL: Quería solamente hacer un comenta-rio anecdótico. Quizá debería contemplarse notan sólo la falta de cumplimiento sino tambiénel sobrecumplimlento en determinados casos.Me estoy refiriendo en concreto a una cartaque apareció en British Medical Journal en laque un distinguido farmacólogo de aquel paíscomentaba que con algunos medicamentosde reciente introducción que se administranuna vez al día se ha planteado un problemaderivado de la actitud de! gobierno británicocon respecto a los gastos del National HealthService. Dado que ha habido recortes impor-tantes promovidos por el gobierno, algunos pa-cientes han pensado que cuando el médicoles prescribía un medicamento a razón de unadosis diaria el motivo era el ahorro económi-co, con lo cual se han detectado casos de so-bredosificación al decidirse el paciente a norespetar esta presunta restricción.

96

FUNDACIÓN! ¡DR. ANTONIOI ESTEVE

monografÍas dr. antonio esteve tratamiento de …elección de la metodología de optimización una...

Documents