Microscopia de Fluorescencia

Magaly Herrera GarcíaLuis Rolando Boza Peralta

IntroducciónDescubierto en

1908 por Köhler y Siedentopf

Se basa en que una sustancia natural o un colorante aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida

Introducción

Siendo pocas las moléculas

autofluorecentes, su aplicación

mas difundida es para revelar una

fluorescencia agregada como en la detección de antígenos y

anticuerpos

Anticuerpos Anti-ADN nativo por el método de Inmunofluorescencia Indirecta

Principio

El espécimen es iluminado con luz de una determinada longitud de onda que es absorbida por los fluoróforos haciendo que emitan luz de longitud de onda mayores. La luz de iluminación se separa de la fluorescencia mucho más débil emitida a través del uso de un filtro de emisión espectral

Constitución FundamentalFuente Luminosa:

Lámpara de mercurio o halógena

Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultravioleta

Filtros: Retienen la luz ultravioleta dejando pasar solo la visible. Hay diversos tipos de excitación y emisión

Constitución Fundamental Filtro de excitación: ubicado

entre la fuente de luz y el preparado Permite el paso de ondas de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.

Filtro de emisión: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo.

Constitución FundamentalEspejo Dicroico:

Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa.

Constitución Fundamental

Microscopios de Fluorescencia

Microscopio de Fluorescencia

Invertida AMG EVOS flMicroscopio de

Fluorescencia Nikon TE2000

Aplicaciones:1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moléculas de la muestra misma.

2. Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser observadas selectivamente, mediante métodos de tinción.

3. Sobre objetos bastante más pequeños Que la limitación del poder de resolución,siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, un virus.

Técnicas de Tinción Fluorescente

1. DAPI: tiñe el DNA de color azul brillante. Permite enumerar microorganismos.

2. Tinción de Viabilidad: permite discriminar entre células vivas y muertas

3. Green Fluorescent Protein: Detección y rastreo de organismos introducidos en ambientes naturales.

Fluorescencia MúltipleEs posible combinar, sobre una misma muestra, dos o más colorantes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.

Diferencias entre Microscopia Ultravioleta y Fluorescencia

Ultravioleta Fluorescencia

Utiliza una longitud de onda de 200 nm por lo tanto alcanza una resolución de 100nm.

No se puede observar directamente con un ocular porque la luz UV daña la retina.

Depende de la absorción de luz de las moléculas.

La lente que usualmente es de vidrio es sustituida por cuarzo y la iluminación es por lámparas de mercurio.

Usa filtros para detectar diversas absorciones de luz y la observación es directa por poseer otro filtro que retira la luz UV.

FOTOGRAFÍAS MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

Título: Ya es primavera en el cerebeloAutor: Nagore PuenteDepartamento: NeurocienciasTécnica: Microscopía confocal

Cerebelo de un ratón transgénico fluorescente (en verde) junto a la localización de un receptor metabotrópico (en rojo)

Título: La noche estrelladaAutor: Mª Rocío Fernández SuárezDepartamento: Biología Celular e HistologíaTécnica: Microscopía de fluorescencia

En la imagen se muestran folículos pilosos de ratón recién nacido.

En medio de un universo de células cuyos núcleos vemos en azul,

por el marcaje con DAPI, encontramos unos puntos de color que

se corresponden al marcaje con nestina, proteína típica de las

células nerviosas y que es actualmente empleada como marcador

de células madre

Vástago de Alfalfa

Vegetal perenne profundamente arraigado en la región mediterránea cerca de Irán, crece también en América del Norte y Asia Occidental

Cultivo de células de riñón

de un mono verde africano

Se marco con anticuerpos primarios de ratón y anticuerpos secundarios conjugados con rodamina Red-X

Células de riñón de un mono

verde africano transformadas

con el virus Simian 40

Cultivo adherente de COS-7 de fibroblastos que fue marcado con Oregon Green 488 conjugado con aglutinina de soya

Tejido pulmonar humano.

Se marcó con aglutinina de germen de trigo (WGA) conjugado con Texas Red-X. WGA, que se une selectivamente a N-acetilglucosamina y N-acetilneuramínico residuos (ácido siálico)

Tejido de un riñón de ratón.

La muestra fue marcada triplemente antes de tomar la imagen con Alexa Fluor 568 conjugada con faloidina y Alexa Fluor 488 conjugada con aglutinina de germen de trigo.

Tejido de lengua de oveja.

La muestra fue marcada con Alexa Fluor 350 conjugado con faloidina, Oregon Green 488 conjugado con aglutinina de germen de trigo. Los nucleos celulares se tiñeron con Steve Orange

Algodón.

Sección trasversal de algodón manchado con Rodamina B.

Células de Mamífero.

Fluorescencia de células de mamífero doblemente marcadas. El ADN en el núcleo de la célula es mostrado en azul. Las estructuras citoplasmicas (Micro filamentos) están mostrados en verde

Células endoteliales.

Triple tinción de fluorescencia de células endoteliales de una arteria de pulmón.

Cromosomas y núcleos.

Fluorescencia de tres niveles de células humanas. El ADN en la segunda interface del núcleo celular y los cromosomas de una tercera célula son mostrados en azul. Secuencias especificas del ADN fueron marcadas en verde y rojo

Cromosomas.

Tinción de doble fluorescencia de cromosomas.

Triple tinción de células humanas

Fluorescencia de triple tinción de células humanas. Los micro filamentos son mostrados en rojo , componentes del núcleo celular son mostrados en azul y verde.

Células epiteliales

Tinción de Inmunofluorescencia de una célula epitelial (Hep-2) Mitocondria.

Bibliografía MicroscopyU: The source for microscopy education

http://www.microscopyu.com/galleries/fluorescence/index.html http://www.microscopyu.com/galleries/confocal/index.html

Nobelprize.org: The Flourescence Microscope Photo Gallery http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/fluorescence/gallery/index.html

Microscopio de Fluorescencia http://morfoudec.blogspot.mx/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html

Wikipedia: The Free Encyclopedia - Fluorescence Microscope Article http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope