UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas

METABOLITOS DEL ETANOL CON EFECTOS EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL: SEPARACIN DE LOS REGIOISMEROS SALSOLINOL E ISOSALSOLINOL Y SUS RESPECTIVOS ENANTIMEROS R Y STesis para optar al grado acadmico de Magster en Bioqumica, rea de especializacin Toxicologa y Diagnstico Molecular y Memoria para optar al Ttulo de Bioqumico por:

Mara de los ngeles Juricic Urza

Directores de Tesis: Dr. Yedy Israel J. Dr. Bruce K. Cassels

Santiago, Chile Julio, 2010

UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACUTICAS

INFORME DE APROBACIN TESIS DE MAGSTER

Se informa a la direccin de posgrado de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas que la Tesis de Magster presentada por la candidata:

Mara de los ngeles Juricic Urzaha sido aprobada por la Comisin Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Magster en Bioqumica, rea de especializacin Toxicologa y Diagnstico Molecular y al Ttulo de Bioqumico, en el examen de defensa de Tesis rendido el da _____ de __________________ de 2010.

Directores de Tesis: Dr. Yedy Israel Jacard Dr. Bruce K. Cassels __________________________ __________________________

Comisin Informante de Tesis: Dr. Marcelo Kogan Bocian (Presidente) Prof. Asoc. Diego Bustamante Cdiz Dr. Hernn Pessoa Mahana __________________________ __________________________ __________________________

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A mi familia: Victor, Bernardita, Mara Paz, Joaqun y Sebastin.

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AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, quisiera agradecer al Dr. Yedy Israel por haberme dado la oportunidad de hacer mi tesis bajo su direccin, pero sobre todo por haber confiado en m en todo momento y por haber ido ms all de sus deberes como director de tesis, apoyndome y preocupndose siempre de potenciar mi desarrollo como cientfica y como persona. Quisiera dar tambin las gracias al Dr. Bruce Cassels, por haber dirigido mi tesis y haberme guiado con paciencia durante todo este tiempo, aportando con su vasta experiencia, sus consejos y correcciones que siempre ayudaron a mejorar mi trabajo. A los miembros de la Comisin Informante de Magster, los profesores Marcelo Kogan, Diego Bustamante y Hernn Pessoa. Sus consejos y ayuda fueron muy importantes para el desarrollo de esta tesis. Tambin quisiera agradecer a la Dra. Amalia Sapag por ensearme el valor de hacer las cosas bien hechas, por formarme en el trabajo de un laboratorio del rea biolgica y sobre todo por animarme a salir de las dificultades, aconsejarme y estar presente cada vez que lo necesit. Al profesor Julio de la Fuente, por haberme enseado a trabajar en un laboratorio y por haberme acompaado desde entonces hasta hoy. Junto a l, quisiera agradecer tambin a los profesores Claudio Saitz, Ramiro Araya, Carolina Jullian y Claudio Olea por haberme apoyado siempre y estar siempre presentes. Quisiera agradecer especialmente a los profesores Diego Bustamante, Germn Gunther y Jos Parada por su desinteresada ayuda para sobrellevar las dificultades tcnicas que se me presentaron. A mis compaeros de laboratorio -Benjamn, Carlos, Mario, Mnica, Robel y Thergiory- y a mis compaeros de universidad Alvaro, Andrea, Caro, Chepo, Italo y Nacho-, por ser siempre un apoyo en lo cientfico y, an ms importante, un apoyo en lo personal. A mi familia, muchas gracias a todos por animarme, apoyarme y soportarme durante todo este largo camino que ha sido mi tesis y desde mucho antes tambin, sin ustedes nada de esto habra sido posible. Finalmente, quisiera agradecer a Sebastin, por ayudarme tantas veces, por aguantarme, consolarme y animarme. Gracias mi amor por estar siempre conmigo, por recibirme siempre con un abrazo y por sacarme siempre una sonrisa.

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FINANCIAMIENTO Esta tesis se desarroll en el Laboratorio de Farmacoterapia Gnica del Departamento de Qumica Farmacolgica y Toxicolgica de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas de la Universidad de Chile. Fue financiada por los proyectos FONDECYT 1095021 (Ethanol as a prodrug 2009-2012) e Iniciativa Cientfica Milenio P-05-001F.

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NDICE GENERAL

FINANCIAMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NDICE GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . NDICE DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SUMMARY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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1. INTRODUCCIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1 Efectos del etanol en el sistema nervioso central . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Salsolinol generado por acetaldehdo: efectos reforzantes y motivacionales . . . . 1.3 Desarrollo de metodologas para determinar los regioismeros y enantimeros generados en la condensacin de acetaldehdo y dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1 Cromatografa de pares inicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2 Columnas con -ciclodextrina: separacin de ismeros pticamente activos 1.3.3 Mtodos de deteccin de los analitos separados por HPLC . . . . . . . . . . . . . 1.3.4 Metodologas reportadas para la separacin y cuantificacin de los enantimeros R y S del salsolinol mediante HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 2 4

8 8 9 11

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2. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1 Objetivo General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Objetivos Especficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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3. MATERIALES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 Reactivos Qumicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Columnas para HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4. MTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.1 HPLC de pares inicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4.2 HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina . . 4.3 Curvas de calibracin de la dopamina y el salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1 Sistema de HPLC de pares inicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 Sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 Recoleccin de salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 Espectrometra de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6 Estabilidad de la dopamina y el salsolinol en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7 Anlisis estadstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18 18 18

19 19 20 20 22

5. RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1 Resultados objetivo especfico 1: Separacin salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . 5.1.1 Optimizacin de las condiciones de separacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 Curvas de calibracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2.1 Curva de calibracin de la dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.1.2.2 Curva de calibracin del salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2 Resultados objetivo especfico 2: Confirmacin de las estructuras del salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3 Resultados Objetivo Especfico 3: Determinacin de la estabilidad de la dopamina y del salsolinol comercial en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.1 Estabilidad de la dopamina en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2 Estabilidad del salsolinol comercial en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2.1 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 14,4 minutos y que posiblemente corresponde a salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.3.2.2 Estabilidad de la sustancia que eluye a los 26,1 minutos y que posiblemente corresponde a isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4 Resultados objetivo especfico 4: Separacion de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.1 Optimizacin de las condiciones de separacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.2 Curvas de calibracin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.2.1 Curva de calibracin de la dopamina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.4.2.2 Curva de calibracin de los enantimeros R y S del salsolinol . . . . . . . . .

23 23 23 26 26 26

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32 32 36

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44 44 47 47 48

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6. DISCUSIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.1 Separacin de salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC de pares inicos acoplada a detector electroqumico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2 Confirmacin de la identidad de los picos que corresponden a salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3 Estudio de la estabilidad de la dopamina en solucin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.4 Estudio de la estabilidad del salsolinol e isosalsolinol en solucin . . . . . . . . . . . 6.5 Separacin de los enantimeros R y S del salsolinol e isosalsolinol mediante HPLC de reparto en columna quiral de -ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6 Proyecciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.1 Purificacin de la enzima (R)-salsolinol sintasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.2 Sntesis de (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.3 Administracin intrategmental de (R)-salsolinol y (S)-salsolinol, (R)isosalsolinol y (S)-isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.6.4 Formacin de isosalsolinol in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51 52

58 60 64

67 72 72

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73 74

7. CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8. REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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NDICE DE FIGURAS Figura 1. Naturaleza quiral del salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 2. Reaccin de condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 3. Sistema de HPLC de pares inicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 4. Estructura de la -ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 5. Separacin de la dopamina y el salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 6. Estructura del salsolinol y el isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 7. Curva de calibracin de la dopamina para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 8. Curva de calibracin del salsolinol comercial para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 9. Espectros de masas de los compuestos eluidos en la HPLC del salsolinol comercial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 10. Reaccin de oxidacin de la dopamina a aminocromo . . . . . . . . . . . . . . . Figura 11. Oxidacin de la dopamina a temperatura ambiente y a 37C . . . . . . . . . . Figura 12. Porcentaje de dopamina remanente en la solucin tras cinco horas de oxidacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 13. Productos de oxidacin del salsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 14. Estabilidad del salsolinol a temperatura ambiente y a 37C . . . . . . . . . . . Figura 15. Porcentaje de salsolinol remanente en la solucin tras cinco horas de oxidacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 16. Estabilidad del isosalsolinol a temperatura ambiente y a 37C . . . . . . . . Figura 17. Porcentaje de isosalsolinol remanente en la solucin tras cinco horas de oxidacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 18. Separacin de dopamina, (S)-salsolinol, (R)-salsolinol e isosalsolinol . . Figura 19. Separacin de los enantimeros R y S del sasolinol e isosalsolinol mediante HPLC en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina a partir de las fracciones colectadas de salsolinol e isosalsolinol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 20. Curva de calibracin de la dopamina para sistema de HPLC de reparto en columna quiral de -ciclodextrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Figura 21. Curva de calibracin de los enantimeros R y S del salsolinol para sistema de HPLC de reparto en columna quiral de gel de slice--ciclodextrina . . . . Figura 22. Estructura de las catecolaminas: dopamina, salsolinol e isosalsolinol . . . 5 6 9 10 24 26 27 28 30 33 34 35 36 38 40 42 43 45

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RESUMEN Las propiedades reforzantes del etanol en el sistema nervioso central (SNC), que se postula son responsables de la auto-administracin repetida de alcohol, se deben al aumento de la liberacin de dopamina, inducido por el etanol, en el ncleo accumbens, rea del sistema mesolmbico inervada por neuronas del rea tegmental ventral. Esta accin parece estar mediada por su metabolito primario, el acetaldehdo, producido en el cerebro por la oxidacin del etanol a travs de dos sistemas enzimticos alternativos: la catalasa cerebral y el citocromo p450 2E1 (CYP2E1). Las ratas se autoadministran tanto etanol como acetaldehdo directamente en el rea tegmental ventral. La concentracin necesaria para producir efectos reforzantes es menor para el acetaldehdo que para el etanol, indicando que este metabolito del alcohol es un agente reforzante ms potente que el etanol.

El acetaldehdo se puede condensar con la dopamina formando una mezcla de salsolinol e isosalsolinol. Las ratas se autoadministran salsolinol comercial (que contiene entre un 8 % y un 15 % de isosalsolinol) directamente en el rea tegmental ventral. Las concentraciones autoadministradas son an menores que las de acetaldehdo, indicando una mayor potencia del salsolinol (y/o del isosalsolinol) como agente reforzante.

Tanto el salsolinol como el isosalsolinol tienen un centro quiral y existen como los enantimeros R y S. En el cerebro, el salsolinol sera producido por al menos tres vas: 1) condensacin no enzimtica del acetaldehdo con dopamina, que produce la mezcla racmica de (R,S)-salsolinol y, posiblemente en menor proporcin, una mezcla racmica de (R,S)isosalsolinol; 2) condensacin enzimtica del acetaldehdo con la dopamina, que producira preferencialmente (R)-salsolinol y 3) condensacin enzimtica del cido pirvico con dopamina seguido de descarboxilacin del producto, lo cual producira preferencialmente (R)-salsolinol. No existe claridad acerca de cul de los ismeros, salsolinol o isosalsolinol (o la mezcla de ambos), es responsable de las propiedades reforzantes observadas ni, especficamente, cul de los enantimeros - R o S - de estos compuestos es el que tiene una mayor actividad biolgica.

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Para poder determinar cul de los ismeros presentes en el salsolinol comercial -(R)salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol o (S)-isosalsolinol- es el que tiene una mayor actividad biolgica y para poder profundizar en los efectos que tiene el consumo de etanol sobre la produccin de ellos in vivo, es necesario poder contar con metodologas que permitan la produccin de estos ismeros en forma separada y a su vez que permitan cuantificarlos en muestras de origen biolgico. En este sentido, los principales resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis fueron los siguientes:

(i)

Se desarroll una metodologa de HPLC de apareamiento inico en columna de gel de slice-C18 acoplada a detector electroqumico capaz de separar y cuantificar dopamina, salsolinol e isosalsolinol en aproximadamente 30 min. En este sistema, la dopamina eluye primero (13,0 min. aprox.) seguida del salsolinol y el isosalsolinol (14,4 min. aprox y 26,1 min. aprox), permitiendo una buena separacin y cuantificacin de estos analitos en concentraciones desde 10-8 M.

(ii)

Se estableci que las sustancias separadas mediante HPLC de apareamiento inico a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, corresponden efectivamente a salsolinol (tiempo de retencin 14,4 min. aprox.) e isosalsolinol (tiempo de retencin 26,1 min. aprox) sobre la base de que: a) El tiempo de retencin de SC1 (14,4 min. aprox.) es menor que el tiempo de retencin de SC2 (26,1 min. aprox.) y, tericamente, cabe esperar que el salsolinol eluya antes que el isosalsolinol por tener sus grupos hidroxilo ms disponibles para interactuar con la fase mvil. b) La razn entre las reas de los picos del salsolinol comercial SC1 (tiempo de retencin 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retencin 26,1 min. aprox.) se corresponde con los porcentajes de salsolinol (92%) e isosalsolinol (8%) en el salsolinol comercial determinados por 1H-RMN. c) El peso molecular de las sustancias separadas a partir del salsolinol comercial, SC1 y SC2, se corresponde con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol (179 g/mol).

x

(iii)

Se determin que la dopamina se degrada (posiblemente por autoxidacin) en solucin a pH 7,4 de acuerdo a una cintica de orden cero, mientras que el salsolinol y el isosalsolinol lo hacen de acuerdo a una cintica de orden uno, siendo la velocidad de oxidacin del isosalsolinol 10 veces mayor que la del salsolinol.

(iv)

Se desarroll una metodologa de HPLC de fase inversa en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina capaz de separar y cuantificar dopamina, (R)salsolinol y (S)-salsolinol en aproximadamente 40 minutos. En este sistema, la dopamina eluye primero (22,9 min. aprox) seguida de (S)-salsolinol (26,9 min. aprox.), (R)-salsolinol (29,9 min. aprox.) y el (R) y (S)-isosalsolinol (31,3 y 32,9 min. aprox), permitiendo una buena separacin y cuantificacin de dopamina, (S)salsolinol y (R)-salsolinol en concentraciones desde 10-8 M. Si bien el isosalsolinol pudo ser separado de dopamina y de los enantimeros R y S del salsolinol, no se logr separar completamente los enantimeros R y S del isosalsolinol entre s.

A futuro, estas metodologas permitirn la deteccin y cuantificacin de los enantimeros en muestras de origen biolgico y la administracin selectiva de un enantimero especfico directamente en el cerebro de las ratas, ampliando as los conocimientos que se tienen sobre las propiedades reforzantes del etanol como una prodroga y cmo stas pueden ser mediadas por el salsolinol.

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SUMMARY

ETHANOL METABOLITES WITH EFFECTS ON THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM: SEPARATION OF THE REGIOISOMERS SALSOLINOL AND

ISOSALSOLINOL AND THEIR CORRESPONDING R AND S ENANTIOMERS The reinforcing properties of ethanol in the central nervous system (CNS), believed to be responsible for the repeated self-administration of ethanol, are due to the increase of dopamine release -induced by ethanol- in the nucleus accumbens, a part of the mesolimbic system innerved by neurons from the ventral tegmental area. This action of ethanol seems to be mediated by its primary metabolite, acetaldehyde, which is produced in the brain from ethanol oxidation by two alternative enzymatic systems: brain catalase and cytochrome p450 2E1 (CYP2E1). Rats selfadminister both ethanol and acetaldehyde directly into the ventral tegmental area. The concentration needed to produce the reinforcing effects is lower for acetaldehyde than for ethanol, suggesting that this metabolite is a more powerful reinforcing agent than ethanol.

Acetaldehyde can condense with dopamine to form salsolinol and isosalsolinol. Rats selfadminister commercially available salsolinol (which contains between 8% to 15% of isosalsolinol) directly in the ventral tegmental area. The concentrations of salsolinol selfadministered are even lower than acetaldehyde concentrations, suggesting that salsolinol (and/or isosalsolinol) is an even more powerful reinforcing agent.

Both salsolinol and isosalsolinol have a chiral center and exist as the R and S enantiomers. In brain, salsolinol could be produced by at least three pathways. 1) non-enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine, which produces a racemic mixture of R and S salsolinol and possibly, to a lesser extent, a racemic mixture of R and S isosalsolinol; 2) enzymatic condensation of acetaldehyde with dopamine which would produce, preferentially, (R)-salsolinol and 3) enzymatic condensation of pyruvic acid with dopamine followed by decarboxylation of the condensation product wich would produce, preferentially, (R)-salsolinol. There is no clarity about which of the isomers, salsolinol or isosalsolinol (or both), is primarily responsible for the

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observed reinforcing properties, nor, specifically, about which of the enantiomers R or S- of these compounds has a greater biological activity.

In order to determine which of the isomers present in comercially available salsolinol (R)salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol and (S)-isosalsolinol- has stronger biological activity and in order to better understand the effects of ethanol consumption on the in vivo synthesis of these isomers, methodologies that allow us to produce these substances independently and methodologies that allow us to quantify them in biological samples are needed. In relation to this, the main results obtained in this thesis were the following:

(i)

An ion pairing HPLC methodology using a silicagel-C18 column coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, salsolinol and isosalsolinol in approximately 30 min., was developed. By this methodology, dopamine elutes first (13.0 min. approx.) followed by salsolinol and isosalsolinol (14.4 min. approx. and 26.1 min. approx.), allowing a good separation and quantification of these analytes in concentrations above 10-8 M.

(ii)

The substances separated by ion pairing HPLC from commercially available salsolinol correspond to salsolinol (retention time of 14.4 min. approx.) and isosalsolinol (retention time of 26.1 min. approx.). This was established on the basis that: a) The retention time of SC1 (14.4 min. approx.) is lower than the retention time of SC2 (26.1 min. approx.) and, theoretically, it is expected that salsolinol elutes before than isosalsolinol because salsolinol has its hydroxyl groups more available to interact with the mobil phase than isosalsolinol. b) The ratio between the areas of the peaks observed for commercially available salsolinol SC1 (retention time of 14.4 min. approx.) and SC2 (retention time of 26.1 min. approx.) is in agreement with the expected percentages of salsolinol (92%) and isosalsolinol (8%) in the commercially available salsolinol as determined by 1H-NMR.

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c) The molecular weight of the substances separated from commercially available salsolinol, SC1 and SC2, is the same as the molecular weight of salsolinol and isosalsolinol (179 g/mol).

(iii)

It was determined that dopamine degradation (possibly by autoxidation) at pH 7.4 follows zero order kinetics, while salsolinol and isosalsolinol oxidations follow first order kinetics. The rate of oxidation of isosalsolinol is about 10 times higher than the rate of oxidation of salsolinol.

(iv)

A reversed phase HPLC methodology using a silicagel--cyclodextrin coupled to an electrochemical detector, able to separate and quantify dopamine, (R)-salsolinol and (S)-salsolinol in about 40 minutes, was developed. In this methodology, dopamine elutes first (22.9 min. approx.), followed by (S)-salsolinol (26.9 min. approx.), (R)salsolinol (29.9 min. approx.) and (R) and (S)-isosalsolinol (31.3 and 32.9 min. approx.), allowing a good separation and quantification of dopamine, (S)-salsolinol and (R)-salsolinol in concentrations above 10-8 M. Although this methodology succeeded in separating isosalsolinol from dopamine and from the R and S enantiomers of salsolinol, it was unable to completely resolve (R)-isosalsolinol from (S)-isosalsolinol.

In the future, these methodologies will allow the detection and quantification of these regioisomers and enantiomers in biological samples and will allow the selective administration of a specific enantiomer directly into rat brain, extending our knowlegde on the reinforcing properties of ethanol as a prodrug and on how these properties may be mediated by salsolinol.

xiv

1. INTRODUCCIN El alcoholismo, o sndrome de dependencia alcohlica, es una enfermedad crnica cuyo desarrollo y manifestaciones estn influenciadas por factores genticos, psicosociales y ambientales (ASAM, 1990). Se caracteriza por un conjunto de sntomas fisiolgicos y de comportamiento que se desarrollan tras el consumo sostenido de alcohol y que indican que un individuo contina su consumo sin importar los problemas reconocidos por l mismo y relacionados a esta sustancia (Cottler et al., 2000; WHO (OMS), 2009). Tpicamente, incluye tolerancia y sntomas de dependencia fsica (sndrome de privacin) y/o de dependencia psicolgica (falta de control sobre el consumo, mayor prioridad puesta en el consumo que en otras actividades y ocupaciones, consumo persistente a pesar de las consecuencias dainas y gran uso de tiempo en las actividades relacionadas al consumo) (ASAM 1990; Cottler et al., 2000; WHO (OMS), 2009).

El consumo crnico de alcohol est asociado a una serie de patologas. Puede producir dao heptico (hgado graso, hepatitis alcohlica y cirrosis heptica), inmunodeficiencia, enfermedades cardiovasculares (cardiomiopata, enfermedad de la arteria coronaria,

hipertensin, arritmias e infartos), cncer (cabeza y cuello, tracto digestivo y mamas), etc. (Alcohol and Health, 2000).

El alcoholismo constituye un problema de salud pblica a nivel mundial. En Chile, un 12% de los usuarios de alcohol de entre 12 y 64 aos presenta dependencia alcohlica (600 mil de un total de 5 millones de usuarios) y un 23,8% de la poblacin general cae en el criterio de bebedor problema (CONACE, 2003).

El etanol es absorbido en el estmago y, principalmente, en el intestino, distribuyndose a travs del organismo hasta alcanzar concentraciones idnticas en el agua de todos los tejidos, incluyendo el cerebro (Wallgren y Barry, 1970a). El metabolismo perifrico del etanol es llevado a cabo principalmente en el hgado donde es oxidado a acetaldehdo por la enzima deshidrogenasa alcohlica (alcohol dehydrogenase, ADH) (Wallgren y Barry, 1970b), particularmente por la isoforma ADH1 (Galter et al., 2003). En el cerebro, donde no se expresa

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la isoenzima ADH1 (Galter et al., 2003), la oxidacin del etanol a acetaldehdo es llevada a cabo principalmente por la enzima catalasa (Aragon et al., 1992; Gill et al., 1992; Zimatkin et al., 2006; Zimatkin y Buben, 2007) y en menor medida por la isoforma CYP2E1 del citocromo P450 (Zimatkin et al., 2006), la cual es inducida por el consumo crnico de etanol (Sanchez-Cataln et al., 2008). La contribucin de la catalasa y el citocromo P450 a la oxidacin perifrica del etanol es slo marginal (Lieber, 2005). Tanto a nivel perifrico como central, el acetaldehdo generado es oxidado a acetato por la enzima deshidrogenasa aldehdica (aldehyde dehydrogenase, ALDH) (Wallgren y Barry, 1970b). Es importante sealar que el acetaldehdo en condiciones metablicas normales no cruza la barrera hematoenceflica debido a que es transformado completamente a cido actico gracias al alto contenido de ALDH en la microvasculatura del cerebro (Tabakoff et al., 1975).

Los efectos aversivos del alcohol son mediados por los niveles de acetaldehdo en plasma. Entre ellos se incluyen vasodilatacin perifrica, taquicardia, dolor de cabeza y nuseas (Heilig y Egli, 2006; Johnson, 2008). Estos efectos son la base de los tratamientos farmacolgicos tradicionales contra el alcoholismo, como el disulfiram, el cual -al inhibir la enzima ALDHconduce a altos niveles plasmticos de acetaldehdo tras la ingesta de alcohol, niveles que son capaces de producir efectos aversivos hacia el consumo de esta droga (Heilig y Egli, 2006; Johnson, 2008). Tambin se han reportado variantes genticas tanto en humanos (Chen et al., 1999; Thomasson et al., 1991) como en ratas que, ya sea por una produccin aumentada de acetaldehdo (Quintanilla et al., 2007; Rivera-Meza et al, 2010) o por una degradacin disminuida de ste (Sapag et al., 2003), constituyen un factor protector contra el alcoholismo en humanos o podran ser la base de la abstinencia del consumo de alcohol de las lneas de ratas no bebedoras.

1.1 Efectos del etanol en el sistema nervioso central El etanol en el sistema nervioso central (SNC) tiene dos tipos de propiedades generales: (i) sedantes/anestsicas y (ii) reforzantes (Alcohol and Health, 2000). Los efectos sedantes del alcohol parecen estar mediados por un aumento de las acciones inhibitorias del cido gammaaminobutrico (GABA), en particular mediante la activacin de los receptores GABAA

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(Huidobro-Toro et al., 1987; Lobo y Harris, 2008). Por otra parte, los efectos anestsicos del alcohol parecen estar mediados por una reduccin de los efectos excitatorios del glutamato, en particular a travs de la inhibicin de los receptores NMDA de este neurotransmisor (Lovinger et al., 1989; Wirkner et al., 1999).

El etanol, al igual que otras drogas de abuso, produce efectos reforzantes en los individuos que las consumen. Estos se refieren a aquellos efectos eufricos, placenteros o motivacionales que se asocian al alcohol y llevan a repetir su consumo. Se cree que las propiedades reforzantes de muchas drogas, como la cocana y la morfina, son causadas por su accin estimuladora de la transmisin dopaminrgica en el sistema mesolmbico (Bozarth, 1986), sistema tradicionalmente relacionado con el aprendizaje de la expresin de comportamientos motivados (Wise, 2004).

El sistema mesolmbico est constituido por las clulas dopaminrgicas del rea tegmental ventral (ventral tegmental area, VTA) que se proyectan fundamentalmente hacia el ncleo accumbens (NAc) (Wise, 2004). Tanto el VTA como el NAc han sido involucrados en la adiccin a drogas como las anfetaminas, la cocana, la morfina, la nicotina y el alcohol. Todas estas drogas aumentan la transmisin dopaminrgica en el NAc actuando ya sea en este mismo sitio o en las neuronas del VTA (Bozarth, 1986). La administracin sistmica de etanol en dosis bajas e intermedias aumenta la liberacin de dopamina (DA) en el NAc (Imperato y Di Chiara, 1986; Bustamante et al., 2008). Los efectos del etanol en la liberacin de DA parecen relacionarse con un aumento en la actividad de las neuronas dopaminrgicas del VTA inducido por el etanol (Imperato y Di Chiara, 1986; Diana et al., 1992; Melis et al., 2007).

Se ha sugerido que las propiedades reforzantes del etanol se deben a la accin de su metabolito el acetaldehdo. Esta teora es apoyada por abundantes estudios (Amit et al., 1977; Brown et al., 1979; Amit y Smith, 1985; Aragon y Amit, 1992; Foddai et al., 2004; Rodd et al., 2005; Melis et al., 2007; Peana et al., 2008; Diana et al., 2008). En primer lugar, la administracin sistmica de acetaldehdo o etanol aumenta la actividad de las neuronas dopaminrgicas del VTA (Foddai et al., 2004). En segundo lugar, las ratas se auto-administran acetaldehdo directamente en el cerebro (Amit et al., 1977; Brown et al., 1979; Amit y Smith, 1985; Rodd et al., 2005). De hecho, las ratas se auto-administran tanto etanol como acetaldehdo directamente en el VTA. Sin embargo, las concentraciones de acetaldehdo (6 x 10-6 M)

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necesarias para la manifestacin de efectos reforzantes son 1000 veces menores que las necesarias de etanol (17 x 10-3 M) para ver los mismos efectos (Rodd et al., 2005). Finalmente, la administracin directa de acetaldehdo en el VTA, en dosis conocidas por ser autoadministradas, aumenta la concentracin extracelular de DA en el NAc (Melis et al., 2007).

Por otra parte, la inhibicin de la oxidacin del etanol a acetaldehdo, usando el inhibidor de la catalasa 3-aminotriazol, inhibe el efecto del etanol sobre la actividad de las neuronas dopaminrgicas del VTA (Melis et al., 2007) y resulta en una disminucin del consumo voluntario de etanol en ratas (Aragon y Amit, 1992). El acetaldehdo (sistmico a altas dosis o intraventricular) es capaz de inducir una preferencia de lugar condicionada en ratas (Amit y Smith, 1985; Melis et al., 2007; Peana et al., 2008). Adems, al ser inyectado directamente en el VTA, aumenta la actividad locomotriz de estos animales (Snchez-Cataln et al, 2009). Se ha visto tambin que el acetaldehdo es capaz de inducir una preferencia de lugar condicionada y aumentar el consumo voluntario de alcohol en las ratas bebedoras UChB (Quintanilla y Tampier, 2003).

1.2 Salsolinol generado por acetaldehdo: efectos reforzantes y motivacionales. En estudios ms recientes se ha sugerido que parte de los efectos del acetaldehdo en el sistema nervioso central pueden estar mediados por el producto de la condensacin de ste con dopamina: el salsolinol (Nakahara et al., 1994; Jamal et al., 2003; Rodd et al., 2008).

El salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina) es un alcaloide que se produce naturalmente en mamferos. El salsolinol tiene un centro quiral en el carbono 1 y existe como los enantimeros R y S (Figura 1) (Naoi et al., 2004).

En ratas, el salsolinol se encuentra fundamentalmente en el cuerpo estriado (Matsubara et al., 1987; Jamal et al., 2003) e hipotlamo (Matsubara et al., 1987) y, en bajos niveles, en el hipocampo y el mesencfalo (Matsubara et al., 1987). Se ha informado que la administracin crnica de etanol en el cerebro aumenta los niveles de salsolinol en el estriado (Sjoquist et al., 1982; Matsubara et al., Collins et al., 1990; 1987; Jamal et al., 2003; Rojkovicova et al., 2008) y

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el hipotlamo (Matsubara et al., 1987). Sin embargo la administracin crnica de etanol parece no afectar los niveles de salsolinol en el ncleo accumbens (Baum et al., 1999; Lee et al., 2010).

Figura 1: Naturaleza quiral del salsolinol.La figura muestra la estructura qumica de los enantimeros R y S del salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi-1,2,3,4tetrahidroisoquinolina).

En humanos, el (R,S)-salsolinol se encuentra principalmente en el ncleo accumbens, el ncleo caudado, el putamen, la sustancia nigra y el hipotlamo. En todos estos tejidos la razn (R)-salsolinol/(S)-salsolinol es cercana a 2 (Musshoff et al., 2000).

El salsolinol sera producido en el cerebro por al menos tres vas independientes: 1) Condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo, la cual produce una mezcla racmica de (R)-salsolinol y (S)-salsolinol (Bates et al, 1986; Dostert et al., 1988; Naoi et al., 2004); 2) Condensacin enzimtica de dopamina con acetaldehdo ((R)-salsolinol sintasa), la cual producira el enantimero (R)-salsolinol y se relacionara con el consumo de etanol (Naoi et al., 1996) y 3) Condensacin enzimtica de dopamina con cido pirvico ((R)-salsolinol sintasa) seguida de la descarboxilacin enzimtica. Esta reaccin producira el enantimero (R)salsolinol y putativamente dara cuenta de la mayor sntesis endgena de este compuesto (Naoi et al., 1996). Sin embargo no se ha descrito un mecanismo de descarboxilacin.

En estudios in vitro, se ha visto que la condensacin no enzimtica de acetaldehdo con dopamina genera, como producto secundario, el isosalsolinol (1-metil-7,8-dihidroxi-1,2,3,4tetrahidroisoquinolina) (King et al., 1974), el cual tambin es un compuesto quiral (Figura 2). La cantidad relativa que se produce de cada ismero in vitro depende en gran medida del pH al cual

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se lleva a cabo la reaccin (Bates et al., 1986). A pH 7, la condensacin de dopamina con acetaldehdo genera un 50% aproximadamente de cada ismero (Bates et al., 1986).

Figura 2: Reaccin de condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo.El acetaldehdo se condensa con la dopamina para formar una mezcla de salsolinol e isosalsolinol, ambos compuestos con un centro quiral en el carbono 1 (King et al., 1974).

Mediante 1H-RMN se ha determinado que el salsolinol distribuido comercialmente (Sigma) contiene entre un 85% y un 92% de (R,S)-salsolinol y entre un 8% y un 15% de (R,S)isosalsolinol (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels). No se puede descartar que este ltimo compuesto sea tambin formado in vivo y tenga una accin reforzante (o incluso que sea la sustancia que genere los efectos reforzantes del salsolinol disponible comercialmente; vide infra).

Se ha observado que el salsolinol (comercial) tambin es capaz de ejercer efectos reforzantes en el sistema mesolmbico. De hecho las ratas se autoadministran salsolinol (3 10-8 M a 3 107

M) directamente en el VTA posterior (Rodd et al., 2008). Adems, el salsolinol es capaz de

inducir una preferencia de lugar condicionada (Matsuzawa et al., 2000) y aumentar la actividad locomotriz en ratas (Hiplito et al., 2010), ambos efectos que parecen ser mediados por la activacin de los receptores -opioides. En este sentido, el uso de antagonistas de los receptores opioides (naltrexona o naloxona) o el uso de un antagonista especfico de los receptores opioides (-funaltrexamina) permite suprimir la preferencia de lugar condicionada (Matsuzawa et al., 2000) y el aumento de la actividad locomotriz (Hiplito et al., 2010) inducidos por el salsolinol.

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Es importante considerar que el salsolinol utilizado para estos experimentos es el disponible comercialmente y contiene tanto salsolinol como isosalsolinol (y sus respectivos enantimeros R y S). Por lo anterior, es imposible asegurar cual(es) de estos cuatro ismeros ((R)-salsolinol, (S)salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-salsolinol) genera(n) los efectos reforzantes observados.

Segn algunos autores, los efectos reforzantes del salsolinol estaran mediados por su enantimero R (Nakahara et al., 1994; Naoi et al., 2004). De hecho, la perfusin con altas concentraciones de (R)-salsolinol (10-3 M) en el estriado de ratas aumenta los niveles de DA y serotonina (5-HT) y disminuye los niveles de sus metabolitos DOPAC, HVA y 5-HIAA (Nakahara et al., 1994; Naoi et al., 2004) debido a que inhibe en forma competitiva la monoamino oxidasa A (MAO-A) y la catecol-O-metiltransferasa (COMT), enzimas involucradas en la generacin de los citados metabolitos (Naoi et al., 2004). Estos efectos son inducidos en forma ms potente por el enantimero (R)-salsolinol que por el enantimero S (Naoi et al., 2004). El salsolinol en altas concentraciones tambin inhibe la tirosina hidroxilasa (enzima involucrada en la sntesis de L-DOPA) y los derivados del salsolinol, como el N-metil salsolinol, inhiben en forma no competitiva la triptofano hidroxilasa (enzima involucrada en la sntesis de serotonina) (Naoi et al., 2004).

Hasta ahora, no se conoce con exactitud el mecanismo de accin por el cual el salsolinol comercial ejerce sus acciones reforzantes en el cerebro. Sin embargo, como ya se mencion, diversas investigaciones sugieren que el salsolinol podra actuar como agonista de los receptores -opioides (Matsuzawa et al., 2000; Snchez-Cataln et al., 2009; Hiplito et al., 2010).

A pesar de la mayor importancia que pareciera tener el (R)-salsolinol por sobre su enantimero S, en ratas expuestas en forma crnica a etanol se observa un aumento tanto del (R)salsolinol como del (S)-salsolinol en el mesencfalo, ncleo caudado y putamen junto con una disminucin de la razn (R)-salsolinol/(S)-salsolinol. Esto parece indicar que la mayor sntesis de salsolinol debida al consumo de alcohol ocurre a travs de la condensacin no enzimtica de la dopamina con acetaldehdo (Rojkovicova et al., 2008). Queda, sin embargo por entender si esta condensacin no enzimtica es la que genera los efectos motivacionales y determinar si la enzima salsolinol sintasa, que produce preferencialmente el enantimero R, tiene una localizacin que haga que este producto sea preferencialmente motivacional. Es por consiguiente

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importante determinar con certeza cual de los compuestos, salsolinol o isosalsolinol, y cual de sus enantimeros, R o S, es el que posee una mayor actividad biolgica.

1.3 Desarrollo de metodologas para determinar los regioismeros y enantimeros generados en la condensacin de acetaldehdo y dopamina. No existe claridad en que los mtodos reportados por Naoi et al. (1996) separen eficientemente las formas (R/S)-salsolinol. Adems, ni estos autores ni los otros que han estudiado el tema han abordado el anlisis del (R/S)-isosalsolinol. Por todo lo anteriormente expuesto, es necesario poder cuantificar los ismeros estructurales salsolinol e isosalsolinol y sus respectivos enantimeros, esto con el fin de poder detectar y cuantificar cada uno de estos ismeros en cerebro (por microdilisis) y tambin con el fin de poder a futuro purificar cada uno de estos ismeros para administrarlos en forma pura.

1.3.1 Cromatografa de pares inicos La cromatografa de lquidos de alta eficacia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) es uno de los mtodos analticos de separacin de compuestos ms ampliamente utilizados para compuestos no voltiles. En ella, la muestra se inyecta en una fase mvil lquida y, mediante la presin aplicada por una bomba, alcanza una columna que contiene la fase estacionaria. De esta manera, en la HPLC, los componentes de una muestra se separan en virtud de las diferencias en su distribucin entre la fase mvil lquida y la fase estacionaria. La HPLC de reparto en fase inversa (fase estacionaria no polar y fase mvil relativamente polar) en su modalidad de cromatografa de pares inicos, permite la separacin de especies inicas mediante el uso de un contrain lipoflico de carga opuesta a la del analito en la fase mvil. La combinacin del analito con el contrain forma una especie neutra que es retenida por la fase inversa estacionaria (Skoog et al., 2001a). Este sistema permite aumentar el tiempo de retencin, en columnas de fase inversa, de analitos cargados que de otra manera seran pobremente retenidos. La HPLC de pares inicos es comnmente utilizada para la separacin de catecolaminas y sus metabolitos (Bustamante et al., 2002; Acworth y Cunningham, 1999),

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puesto que estos compuestos a pH cido (3,0-3,5) se encuentran protonados. El salsolinol y el isosalsolinol tambin se encuentran protonados a pH cido lo que les confiere una carga positiva que puede ser neutralizada usando el contrain cargado negativamente octilsulfato, permitiendo que sean retenidos por una columna de fase inversa (Figura 3).

Figura 3: Sistema de HPLC de pares inicosLa figura muestra el mecanismo de retencin de los analitos mediante HPLC de pares inicos. En ella se observa como los analitos salsolinol e isosalsolinol protonados en su grupo amino, tal como se encontraran a pH cido, forman una especie neutra al asociarse con el contrain octilsulfato y como es esta especie neutra la que es retenida por la columna de gel de slice-C18 mediante la interaccin de la cadena lipoflica del octilsulfato y la cadena de 18 carbonos de la columna. Tambin pueden apreciarse las diferencias en la posicin de los grupos hidroxilo del salsolinol y el isosalsolinol que hacen que el grupo hidrxilo en la posicin 8 del isosalsolinol est estricamente impedido para interactuar con la fase mvil por el grupo metilo en la posicin 1.

1.3.2 Columnas con -ciclodextrina: separacin de ismeros pticamente activos Los mtodos ms exitosos para separar ismeros pticos (enantimeros) se basan en explotar las interacciones diferenciales que pueden tener lugar como resultado de su orientacin espacial nica. Esto se puede lograr introduciendo al sistema, ya sea en la fase mvil o la estacionaria, un material quiral para inducir una selectividad particular (Scott, 2003a). En la cromatografa de

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reparto con fases estacionarias quirales, la interaccin diferencial de cada enantimero del analito con el enantimero unido qumicamente a la fase estacionaria produce una diferencia en los tiempos de retencin de cada uno de ellos (Scott, 2003a; Skoog et al., 2001a).

Las ciclodextrinas son oligosacridos producidos por la degradacin parcial del almidn seguida del acoplamiento enzimtico de unidades de D(+)-glucosa, unidos entre s por enlaces -(1,4)-glicosdicos. Las ciclodextrinas son estructuras toroidales y el tamao de su cavidad depende del nmero de unidades de D(+)-glucosa que posean. La -ciclodextrina (Figura 4) tiene 7 unidades de D(+)-glucosa y una cavidad de 6,0 a 6,5 de dimetro (Menges y Armstrong, 1991; Scott, 2003a).

Figura 4: Estructura de la -ciclodextrina.La figura muestra las 7 unidades de D(+)-glucosa de la -ciclodextrina formando una estructura toroidal.

Las ciclodextrinas son capaces de formar complejos de inclusin, es decir pueden incluir sustancias dentro de su cavidad hidrofbica central interactuando con ellas mediante fuerzas de Van der Waals, puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas, etc (Menges y Armstrong, 1991; Huang et al., 2009).

Las unidades de D(+)-glucosa le confieren a esta macromolcula su naturaleza quiral, permitiendo su utilizacin para la separacin de enantimeros. Los soportes de gel de slice

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unidos qumicamente a molculas de ciclodextrina se encuentran entre las fases estacionarias quirales ms usadas para la separacin de ismeros pticos (Scott, 2003a).

1.3.3 Mtodos de deteccin de los analitos separados por HPLC Existen muchos mtodos que permiten la deteccin y el anlisis cualitativo (por los tiempos de retencin) o cuantitativo (por las reas bajo la curva del pico correspondiente) de los analitos separados por HPLC (Skoog et al., 2001b).

Entre ellos se encuentran la deteccin por espectrofotometra de UV, la deteccin electroqumica, la deteccin por espectrometra de masas, etc. (Skoog et al., 2001b). El detector electroqumico es ampliamente utilizado por su gran aplicabilidad y sensibilidad y registra el paso de sustancias oxidables o reducibles (Scott, 2003b). Un tipo de detector electroqumico es el detector amperomtrico. En l la diferencia entre el potencial del electrodo de trabajo y el electrodo de referencia es constante. Al pasar una sustancia oxidable por el electrodo se origina una corriente medida en amperes debida a la oxidacin del analito y que es proporcional a la concentracin de ste en la solucin (Tth et al., 2004). Esta corriente es detectada por el equipo y transformada en un potencial de salida correspondiente a la corriente producida en el electrodo de trabajo y dependiente de la sensibilidad a la que se ha puesto el detector. Posteriormente, este potencial es graficado (eje y) versus el tiempo de elucin de la sustancia (eje x), dando origen a los picos cromatogrficos (Bioanalytical Systems Inc., 2000).

Este sistema de deteccin ha sido utilizado tradicionalmente para la deteccin y cuantificacin de catecolaminas (Bustamante et al., 2002; Tsunoda, 2006) y tambin de salsolinol (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al, 1989b; Pianezzola et al., 1989; Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997).

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1.3.4 Metodologas reportadas para la separacin y cuantificacin de los enantimeros R y S del salsolinol mediante HPLC Existen varios mtodos descritos en la literatura para la separacin de los enantimeros R y S del salsolinol mediante HPLC (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al, 1989b; Pianezzola et al., 1989; Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008 y Cai et al., 2008). De estas metodologas, todas a excepcin de las desarrolladas por Strolin Benedetti et al. (1989a y b) y Pianezzola et al. (1989), quienes derivatizan el salsolinol para formar diasteroismeros- usan un compuesto quiral en la fase mvil o en la fase estacionaria para permitir la separacin. La mayora usa una fase estacionaria unida qumicamente a un compuesto quiral, por ejemplo la ciclodextrina (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Rojkovicova et al., 2008 y Cai et al., 2008). Sin embargo, Deng et al. (1997) describieron un mtodo que usa una columna de fase inversa (columna de gel de slice-C18) y -ciclodextrina en la fase mvil para separar ambos enantimeros.

En los mtodos que usan -ciclodextrina, el salsolinol forma complejos de inclusin con este compuesto quiral. La estabilidad de los complejos de inclusin formados entre el R o S salsolinol y la ciclodextrina es diferente para cada enantimero, siendo mayor la estabilidad del complejo formado entre el (R)-salsolinol y la -ciclodextrina (Huang et al., 2009). De esta manera, cuando se usa -ciclodextrina en la fase mvil el tiempo de retencin es menor para el (R)-salsolinol que para el (S)-salsolinol (Deng et al., 1997), mientras que cuando se usa -ciclodextrina unida qumicamente a la fase estacionaria, el tiempo de retencin es menor para el (S)-salsolinol que para el (R)-salsolinol (Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al, 1996; Liu et al., 2000; Cai et al, 2008; Rojkovicova et al, 2008; Huang et al, 2009).

Se han descrito fundamentalmente dos mtodos para la deteccin y cuantificacin de cada enantimero, R o S salsolinol, separados por HPLC: mediante detector electroqumico (Strolin Benedetti et al., 1989a; Strolin Benedetti et al., 1989b; Pianezzola et al., 1989; Baum y Rommelspacher, 1994; Deng et al., 1995; Naoi et al., 1996; Deng et al., 1997) y mediante espectrometra de masas (Haber et al., 1995; Liu et al., 2000; Musshoff et al., 2000; Lee et al., 2007; Rojkovicova et al., 2008; Cai et al., 2008).

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Hasta la fecha slo se ha descrito someramente una metodologa para separar (R,S)-salsolinol del (R,S)-isosalsolinol, utilizando una columna de gel de slice-C18 y como fase mvil KH2PO4 0.01 M (pH 4,5), al parecer sin agregado de un contrain lipoflico (Bates et al., 1986). En ninguno de los artculos citados anteriormente en relacin con la separacin de los enantimeros del salsolinol se hace referencia a la formacin de isosalsolinol producto de la condensacin de dopamina con acetaldehdo. Esto podra ser consecuencia de la incapacidad de estos sistemas quirales de separar los regioismeros o de la baja concentracin de isosalsolinol en las muestras utilizadas. Sin embargo, cabe esperar que el uso de -ciclodextrina unida qumicamente a la fase estacionaria permita tambin la separacin de los enantimeros R y S del isosalsolinol.

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2. OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECFICOS

2.1 Objetivo General Implementar mtodos analticos que permitan la separacin de los ismeros estructurales salsolinol e isosalsolinol y sus respectvos enantimeros R y S formados en la condensacin de dopamina con acetaldehdo in vitro.

2.2 Objetivos Especficos: 1) Desarrollar metodologas para separar mediante HPLC de pares inicos el salsolinol de su ismero estructural isosalsolinol.

2) Confirmar que las estructuras de las sustancias separadas a partir de salsolinol comercial mediante HPLC de pares inicos corresponden a los ismeros estructurales, salsolinol e isosalsolinol.

3) Determinar la estabilidad de la dopamina y del salsolinol comercial en solucin.

4) Desarrollar metodologas para separar mediante HPLC de pares inicos en columnas de ciclodextrina, o eventualmente otra fase estacionaria, los ismeros (R)-salsolinol, (S)-salsolinol, (R)-isosalsolinol y (S)-isosalsolinol

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3. MATERIALES

3.1 Reactivos qumicos

Merck (Darmstadt, Alemania): metanol grado HPLC, acetonitrilo grado HPLC, cido fosfrico 85% (H3PO4) (p.a.), cido actico glacial (p.a.), fosfato de sodio dibsico heptahidratado (Na2HPO47H2O) (p.a.), acetato de amonio (p.a.). J.T. Baker (Ecatepec, Estado de Mxico, Mxico): isopropanol grado HPLC.

Sigma (St. Louis, MO, EE.UU): clorhidrato de ()-salsolinol, clorhidrato de dopamina, cido etilendiaminotetraactico (EDTA) (sal disdica), octil sulfato de sodio, hidrxido de sodio (NaOH).

Winkler (Santiago, Chile): cido perclrico 70% (HClO4) (p.a.), fosfato de sodio monobsico monohidratado (NaH2PO4H2O) (p.a.).

3.2 Soluciones Soluciones de dopamina y salsolinol: Las soluciones madre de los clorhidratos de dopamina y salsolinol comercial (que contiene tanto salsolinol como isosalsolinol) se prepararon en cido perclrico 0,1 M, para prevenir la oxidacin de estos compuestos. En el caso de la dopamina se prepar una solucin 1,37 10-2 M y, en el caso del salsolinol comercial, se disolvieron 27 mg de esta sustancia en 10 ml de cido perclrico 0,1 M. Considerando que el salsolinol comercial contendra, de acuerdo a estudios realizados por 1H+-RMN, un 92% de salsolinol y un 8% de isosalsolinol (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels), la solucin de salsolinol comercial preparada sera 1,15 10-2 M en salsolinol y 1,00 10-3 M en isosalsolinol. Las diluciones que se usaron para los distintos experimentos fueron preparadas en cido perclrico 0,1 M o fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4 segn se necesitara prevenir la oxidacin o emular condiciones fisiolgicas, respectivamente.

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Tampn de fosfato de sodio 0,1 M pH 7,4: El tampn de fosfato de sodio se prepar en agua destilada y desionizada. Contiene fosfato de sodio dibsico 0,08 M y fosfato de sodio monobsico 0,02 M. El pH de la solucin fue ajustado a pH 7,4 usando hidrxido de sodio 1M.

Otra soluciones: Todas las soluciones acuosas usadas se prepararon en agua destilada y desionizada mediante el purificador de agua NANOpure Infinity UF de Barnstead-Thermolyne (Dubuque, IA, EE.UU.).

3.3 Columnas para HPLC Supelco (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.): columna de gel de slice-C18 SUPELCOSIL LC-18 de 250 mm de largo, 4,6 mm de dimetro interno y partculas de 5 m.

Macherey-Nagel (Dren, Alemania): columna de gel de slice modificada con -ciclodextrina NUCLEODEX -OH de 200 mm de largo, 4 mm de dimetro interno y partculas de 5 m.

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4. MTODOS

4.1 HPLC de pares inicos.

La separacin de dopamina, salsolinol e isosalsolinol se llev a cabo mediante HPLC de pares inicos acoplada a detector electroqumico. Para ello se us una bomba isocrtica Shimadzu LC-10AD (Kyoto, Japn) acoplada a un detector amperomtrico BASi LC-4C (West Lafayette, IN, EE.UU). Las muestras, de un volumen de 50 l, se inyectaron a la columna a travs de un inyector Rheodyne (Rohnert Park, CA, EE.UU.). Como fase estacionaria se us una columna de gel de slice-C18 Supelcosil LC-18 (Supelco, Sigma-Aldrich) de 250 mm de largo, 4,6 mm de dimetro interno y un tamao de partcula de 5 m. La temperatura de la columna fue de 30C, para lo cual se us un horno Shimadzu CTO-10A (Kyoto, Japn). Como fase mvil se utiliz tampn de fosfato de sodio 0,1 M pH 3,4 con un 20% de metanol como modificador orgnico; adems la fase mvil contiene EDTA 0,03% y octilsulfato como contrain (141 mg/L). Se us una velocidad de flujo de la fase mvil de 0,4 mL/min. El potencial de oxidacin del electrodo fue fijado en 700 mV y la sensibilidad del detector electroqumico en 20 nA. Los resultados fueron analizados mediante el programa computacional CLASS CR10 Versin 1.2 (Shimadzu Corporation, 1993).

La capacidad del sistema para separar dopamina, salsolinol e isosalsolinol fue evaluada mediante el clculo del coeficiente de resolucin (R) entre cada par de analitos, el cual est determinado por los tiempos de retencin (tr) de cada sustancia y el ancho de la base del pico (W) correspondiente de acuerdo a la frmula: R = 2(trA trB)/(WA + WB). Mientras mayor es el coeficiente de resolucin, mayor es la separacin de los analitos. Para un pico cromatogrfico ideal (simtrico), un coeficiente de resolucin mayor o igual a 1 indica una separacin esencialmente completa de los analitos (Skoog y Leary, 1994).

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4.2 HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina La separacin de los enantimeros R y S salsolinol se llev a cabo mediante HPLC de reparto en columna quiral acoplada a detector electroqumico. Para ello se us una bomba isocrtica Shimadzu LC-10AD (Kyoto, Japn) acoplada a un detector amperomtrico BASi LC-4C (West Lafayette, Indiana, EE.UU). Las muestras, de un volumen de 50 l, se inyectaron a la columna a travs de un inyector Rheodyne (Rohnert Park, CA, EE.UU.). Como fase estacionaria se us una columna de gel de slice--ciclodextrina NUCLEODEX -OH de Macherey-Nagel (Dren, Alemania) de 200 mm de largo, 4,0 mm de dimetro interno y un tamao de partcula de 5 m. La temperatura de la columna fue de aproximadamente 2C, para lo cual se puso en contacto directo con la columna una compresa de fro-calor Nexcare (St.Paul, MN, EE.UU.), enfriada durante 80 minutos en el congelador hasta alcanzar 2C. Para cada muestra se us una compresa de fro-calor recin enfriada. Como fase mvil se utiliz acetato de amonio 25 mM de pH 3,8 con un 10% de acetonitrilo como modificador orgnico. Se us una velocidad de flujo de la fase mvil de 0,2 mL/min. El potencial de oxidacin del electrodo fue fijado en 700 mV y la sensibilidad del detector electroqumico en 20 nA. Nuevamente, la capacidad del sistema para separar los analitos fue medida mediante el clculo del coeficiente de resolucin (R).

4.3 Curvas de calibracin de la dopamina y el salsolinol comercial

4.3.1 Sistema de HPLC de pares inicos

Se hicieron curvas de calibracin para la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol con el fin de determinar la relacin entre la concentracin de cada sustancia y el rea del pico correspondiente a ella en el cromatograma. Para la dopamina, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de dopamina 1,37 10-3 M preparada a partir de la solucin madre de esta sustancia, usndose para la realizacin de la curva de calibracin seis concentraciones de dopamina comprendidas en el rango de 1,37 10-7 M a 2,74 10-6 M. Para el salsolinol y el isosalsolinol, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de salsolinol comercial 1,15 10-3 M de salsolinol y 1,00 10-4 M de isosalsolinol preparada a partir de la solucin madre de salsolinol comercial. Para la realizacin de la curva de calibracin del salsolinol se usaron seis

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concentraciones de salsolinol comprendidas en el intervalo de 2,88 10-7 M a 5,30 10-6 M. Para la realizacin de la curva de calibracin del isosalsolinol se usaron seis concentraciones comprendidas en el rango de 2,50 10-8 M a 5,00 10-7 M. El clculo de las concentraciones de salsolinol e isosalsolinol se hizo suponiendo que el clorhidrato de salsolinol comercial contiene un 92% de salsolinol y un 8% de isosalsolinol. Todas las curvas de calibracin se hicieron por triplicado.

4.3.2 Sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice modificado con -ciclodextrina Se hicieron curvas de calibracin para la dopamina, el (R)-salsolinol y el (S)-salsolinol con el fin de determinar la relacin entre la concentracin de cada sustancia y el rea del pico correspondiente a ella en el cromatograma. Para la dopamina, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de dopamina 1,37 10-3 M preparada a partir de la solucin madre de esta sustancia, usndose para la realizacin de la curva de calibracin seis concentraciones comprendidas en el intervalo de 1,37 10-7 M a 2,74 10-6 M. Para el (R) y (S) salsolinol, se realizaron diluciones sucesivas de una solucin de salsolinol comercial 1,15 10-3 M de salsolinol y 1,00 10-4 M de isosalsolinol preparada a partir de la solucin madre de salsolinol comercial. Para cada curva, se usaron seis concentraciones de (R) y (S) salsolinol comprendidas en el intervalo de 1,44 10-7 M a 2,88 10-6 M. Los clculos de la concentracin de (R) y (S) salsolinol se hicieron considerando que del total de salsolinol contenido en el clorhidrato de salsolinol comercial, un 50% corresponde a (R)-salsolinol y un 50% a (S)-salsolinol. No se realiz curva de calibracin para el isosalsolinol en el sistema de HPLC de reparto en columna de gel de slice--ciclodextrina por no haberse logrado resolver completamente los respectivos enantimeros R y S. Todas las curvas de calibracin se hicieron por triplicado.

4.4 Recoleccin de salsolinol e isosalsolinol Para los experimentos en los que fue necesario recolectar las fracciones separadas a partir del salsolinol comercial por el mtodo de HPLC de pares inicos antes descrito y que se presume corresponden a salsolinol e isosalsolinol, se desconect el sistema del detector amperomtrico y

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se recolectaron en forma manual fracciones de aproximadamente 0,6 ml cada una. Luego se analiz el contenido de cada una de estas fracciones evaluando su tiempo de retencin en el sistema de HPLC de pares inicos acoplado a detector electroqumico. Posteriormente, slo se utilizaron aqullas fracciones en las que se encontr una sola sustancia.

4.5 Espectrometra de masas Los anlisis de espectrometra de masas fueron llevados a cabo por el Centro de Estudios para el Desarrollo de la Qumica (CEPEDEQ) de la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas de la Universidad de Chile. Para los anlisis de espectrometra de masas se us un espectrmetro de tipo electrospray-trampa inica ESI-IT Esquire 4000 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Alemania). La nebulizacin mediante electrospray se realiz usando nitrgeno a una temperatura de 300C, una presin de 10 psi y un flujo de 5 L/min. La adquisicin de los espectros se realiz en polaridad positiva. El control del espectrmetro se realiz a travs del programa esquireControl Versin 5.2 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Alemania).

4.6 Estabilidad de la dopamina y el salsolinol en solucin La estabilidad de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol en solucin a pH 7,4 se evalu dejando una solucin de la sustancia respectiva expuesta al aire durante al menos 8 horas a temperatura ambiente y a 37C. Para estudiar la estabilidad de la dopamina se us una solucin con una concentracin inicial de 3,43 10-6 M. Para estudiar la estabilidad del salsolinol comercial se usaron dos soluciones: a) una solucin 2,88 10-6 M de salsolinol y 2,50 10-7 M de isosalsolinol para estudiar la estabilidad de la sustancia que eluye a los 14,4 min y se supone que corresponde a salsolinol y b) una solucin 1,15 10-4 M de salsolinol y 1,00 10-5 M de isosalsolinol para estudiar la estabilidad de la sustancia que eluye a los 26,1 min y se supone que corresponde a isosalsolinol. En todos los casos, las soluciones fueron preparadas a partir de la respectiva solucin madre y diluidas en tampn fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4.

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La concentracin de cada sustancia en la solucin se determin mediante HPLC de pares inicos de acuerdo al mtodo ya referido y usando las curvas de calibracin de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol, que relacionan el rea del pico correspondiente con la concentracin del analito en la solucin. Para determinar cual es la cintica de desaparicin de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol, se grafic la disminucin de la concentracin de cada sustancia en el tiempo y se determin el orden de la reaccin como de orden cero1 u orden uno2 dependiendo de si la grfica corresponda a una funcin lineal o a una funcin exponencial, respectivamente. La determinacin de las ecuaciones integradas de velocidad que representan la cintica de desaparicin de la dopamina, el salsolinol y el isosalsolinol se hizo usando los datos obtenidos para las distintas mediciones independientes realizadas para cada sustancia. Para ello se determin mediante una regresin lineal, usando el programa Microsoft Office Excel 2003, la ecuacin de la recta que mejor se ajusta a la disminucin de la concentracin de la sustancia en tiempo o a la disminucin del logaritmo natural de la concentracin de la sustancia en el tiempo segn se tratara de una reaccin de orden cero u orden uno, respectivamente.

Para determinar los porcentajes de dopamina, salsolinol e isosalsolinol remanentes tras 5 horas de oxidacin, se calcul primero la concentracin de cada sustancia remanente en la solucin a las 5 horas interpolando el valor en la curva que relaciona la concentracin de la sustancia correspondiente con el tiempo de reaccin. Luego se calcul el porcentaje remanente de cada sustancia en la solucin considerando la concentracin inicial de la sustancia como un 100%. Este clculo se hizo para cada uno de los experimentos realizados para cada sustancia. Los resultados se presentan como el promedio desviacin estndar.

Orden de reaccin cero: Corresponde a una reaccin en la que la velocidad es constante y no depende de la concentracin de los reaccionantes. En ella la concentracin de los reaccionantes es una funcin lineal del tiempo de reaccin de acuerdo a la siguiente ecuacin integrada de velocidad: [A] = -kt + [A]o Donde [A] corresponde a la concentracin del reaccionante A, k a la constante de velocidad y t al tiempo de reaccin (Logan, 2000). 2 Orden de reaccin uno: Corresponde a una reaccin en la que la velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin de uno de los reaccionantes. En ella el logaritmo natural de la concentracin de uno de los reaccionantes es una funcin lineal del tiempo de reaccin de acuerdo a la siguiente ecuacin integrada de velocidad: Ln [A] = -kt + ln [A]o Donde [A] corresponde a la concentracin del reaccionante A, k a la constante de velocidad y t al tiempo de reaccin (Logan, 2000).

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4.7 Anlisis estadstico Todos los experimentos se realizaron como mnimo dos veces y los resultados se expresaron como el promedio de los resultados la desviacin estndar de la media (SD). Las diferencias se consideraron significativas a p < 0,05. El clculo de la significancia de los resultados para cada experimento se realiz mediante el anlisis t de Student usando el programa SISA (www.quantitativeskills.com/sisa/statistics/t-test).

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5. RESULTADOS

5.1 Resultados objetivo especfico 1: Separacin del salsolinol y el isosalsolinol.

5.1.1 Optimizacin de las condiciones de separacin Para la separacin y cuantificacin de las especies dopamina, salsolinol e isosalsolinol se us HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica.

Se observ que alguna sustancia contenida en la solucin de cido perclrico 0,1 M (PCA) usada para preservar las soluciones de dopamina y salsolinol comercial es retenida por la columna, eluyendo a los 5,770 0,007 min (n = 22) (Figura 5A). Una situacin similar se observ para la solucin de tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 usada para emular condiciones fisiolgicas, donde alguna sustancia contenida en la solucin es retenida por la columna eluyendo a los 6,029 0,006 min (n = 21) (Figura 5B). Por otra parte, la dopamina (DA), sustancia precursora del salsolinol e isosalsolinol, es retenida por la columna eluyendo a los 13,015 0,174 min (n = 18) (Figura 5C).

Para el salsolinol comercial (SC), que contiene entre un 8% y un 15% de isosalsolinol, se observan dos picos en el cromatograma: SC1, con un tiempo de retencin (tr) de 14,397 0,015 min (n = 18) y SC2, con un tiempo de retencin (tr) de 26,137 0,025 min (n = 18) (Figura 5D), reflejando la presencia de al menos dos sustancias oxidables en la solucin.

Bajo las condiciones de operacin anteriormente detalladas se consigui separar dopamina de los dos picos de salsolinol (Figura 5E) con coeficientes de resolucin de 1,783 para la separacin de dopamina de SC1, 14,018 para la separacin de dopamina de SC2 y 10,743 para la separacin de los dos picos del salsolinol comercial entre s. Estos resultados indican que el sistema de HPLC de apareamiento inico implementado es capaz de separar eficientemente dopamina y ambos picos del salsolinol comercial en aproximadamente 30 minutos.

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Figura 5: Separacin de la dopamina y el salsolinol comercial.La figura muestra los cromatogramas que se obtienen usando HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica bajo las condiciones descritas anteriormente. Sobre cada pico se indica a que sustancia corresponde: DA, dopamina; SC1, primer pico salsolinol comercial y SC2, segundo pico salsolinol comercial. A) cido perclrico 0,1 M. B) Tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4. C) Solucin de dopamina 1,37 10-6 M en cido perclrico 0,1 M. D) Solucin de salsolinol comercial (2,88 10-6 M de salsolinol y 2,50 10-7 M de isosalsolinol) en cido perclrico 0,1 M. E) Cromatograma de una solucin que contiene dopamina 1,37 10-6 M y salsolinol comercial (2,88 10-6 M de salsolinol y 2,50 10-7 M de isosalsolinol) en cido perclrico 0,1 M, se observa una buena resolucin de los picos correspondientes al cido perclrico (5,759 min), la dopamina (13,498 min) y el salsolinol comercial (14,996 min y 27,635 min).

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Existen dos factores que llevan a especular que SC1 corresponde a salsolinol mientras que SC2 corresponde a isosalsolinol: (i) Los tiempos de retencin de SC1 y SC2 y (ii) la abundancia relativa de SC1 y SC2.

Con respecto a los tiempos de retencin de SC1 y SC2, se cree que SC1 corresponde a salsolinol y SC2 a isosalsolinol porque se espera que el salsolinol sea retenido menos tiempo en la columna que el isosalsolinol, puesto que los grupos hidroxilo del salsolinol estn ms disponibles para interactuar con el solvente que los del isosalsolinol, donde uno de los grupos hidroxilo est impedido estricamente por el grupo metilo en la posicin 1 (Figura 6).

Con respecto a la abundancia relativa de SC1 y SC2, el clorhidrato de salsolinol comercial contiene entre un 85-92% de salsolinol y un 8-15% de isosalsolinol (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels), por lo que cabe esperar que el rea del pico en el cromatograma correspondiente a salsolinol sea mucho mayor que la del correspondiente a isosalsolinol. Si se supone que una misma cantidad de dos sustancias estructuralmente muy similares producen corrientes tambin muy similares al ser oxidadas en el detector electroqumico, entonces se puede inferir que la razn entre las reas de los picos correspondientes es equivalente a la razn entre las concentraciones de dichas sustancias. Si se aplica lo anterior a los picos observados para el salsolinol comercial y se observa que las reas de stos estn en la razn de 11,5 1,6 (n = 18), se puede inferir que SC1 corresponde a un 91,91 1,01% del total de sustancias oxidables (con un potencial de oxidacin de 700 mV) del salsolinol comercial, mientras que SC2 corresponde al 8,09 1,01%. Estos porcentajes se corresponden en forma bastante aproximada con el contenido estimado por 1H-RMN de salsolinol e isosalsolinol en el clorhidrato de salsolinol comercial (8592% y 8-15%, respectivamente) (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels).

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Figura 6: Estructura del salsolinol y el isosalsolinol.La figura muestra las estructuras y las numeraciones de los tomos de carbono del salsolinol (1-metil-6,7-dihidroxi1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina) y del isosalsolinol (1-metil-7,8-dihidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina). Se observa como el grupo hidroxilo en la posicin 8 del isosalsolinol est estricamente impedido por el grupo metilo en la posicin 1, mientras que en el salsolinol ambos grupos hidroxilo estn libres para interactuar con el solvente.

5.1.2 Curvas de calibracin Se realizaron curvas de calibracin para la dopamina y el salsolinol comercial, con el fin de determinar como se relaciona la concentracin de cada una de estas sustancias con la seal entregada por el detector electroqumico en trminos de rea del pico correspondiente en el cromatograma.

5.1.2.1 Curva de calibracin de la dopamina

En la Figura 7 se observa que el rea del pico correspondiente a dopamina se relaciona en forma lineal con la concentracin de dopamina en la solucin de acuerdo a la ecuacin: rea pico = 1235,4 [DA] (10-7 M). Esta relacin se mantiene en el intervalo de 1,37 10-7 M a 2,74 10-6 M, sobre esta concentracin la seal se satura.

5.1.2.2 Curva de calibracin del salsolinol comercial Como ya se mencion, se observ que en el sistema de HPLC de apareamiento inico implementado el salsolinol comercial se separa en dos sustancias con tiempos de retencin promedio de 14,397 min y 26,137 min. Si bien la identidad de los picos no ha sido confirmada,

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como se indicara anteriormente, se sospecha que el que eluye primero (SC1) es el salsolinol y el segundo (SC2) el isosalsolinol y as se considerar para los efectos de la curva de calibracin.

40000 rea pico (unidades arbitrarias) 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 0 5 10 15 20 25 30 concentracin dopamina (10-7 M) rea pico = 1235,4 [DA] (10-7 M) R2 = 0,9917

Figura 7 Curva de calibracin de la dopamina para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18.La curva de calibracin para dopamina en sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 fue realizada por triplicado inyectando un volumen de 50 l de muestra. En ella se observa que el rea del pico de dopamina se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9917) con la concentracin de dopamina ([DA]), expresada en 10-7 M, de acuerdo a la ecuacin: rea del pico = 1235,4 * [DA] (10-7 M). El rea de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de rea entregados por el programa computacional de anlisis (CLASS CR10)

La Figura 8 muestra que las reas de los picos que corresponden a SC1 y SC2 se relacionan en forma lineal con la concentracin de salsolinol (rea pico = 1074,1 [Sal] (10-7 M)) e isosalsolinol (rea pico = 1036,4 [Isal] (10-7 M)) en la solucin, respectivamente. Para el primer pico (Figura 8A), correspondiente a SC1 y que se supone que es salsolinol, esta relacin se mantiene en el intervalo de 2,88 10-7 M a 5,75 10-6 M de salsolinol. Para el segundo pico (Figura 8B), correspondiente a SC2 y que se supone es isosalsolinol, esta relacin se mantiene al menos en el intervalo de 2,50 10-8 M a 5,00 10-7 M de isosalsolinol.

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A60000 area pico (unidades arbitrarias) 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 10 20 30 40 50 60 70 concentracin salsolinol (10-7 M) rea pico = 1074,1 [Sal] (10-7 M) R2 = 0,9956

B6000 rea pico (unidades arbitrarias) 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 1 2 3 4 5 6 concentracin isosalsolinol (10-7 M) rea pico = 1036,4 [Isal] (10-7 M) R2 = 0,9913

Figura 8: Curva de calibracin del salsolinol comercial para sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18.La curva de calibracin para el salsolinol comercial en el sistema de HPLC de pares inicos en columna de gel de slice-C18 fue realizada en triplicado inyectando un volumen de 50 l de muestra. Para los efectos de la curva de calibracin se considera que SC1 corresponde a salsolinol y SC2 a isosalsolinol A) El rea del pico de SC1 se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9956) con la concentracin de salsolinol ([Sal]), expresada en 10-7 M, mediante la ecuacin rea del pico = 1074,1 * [Sal] (10-7 M). B) El rea del pico SC2 se relaciona en forma lineal (r2 = 0,9913) con la concentracin de isosalsolinol ([Isal]), expresada en 10-7 M, mediante la ecuacin rea del pico = 1036,4 * [Isal] (10-7 M). El rea de los picos se expresa en unidades arbitrarias que se corresponden con los valores de rea entregados por el programa computacional de anlisis (CLASS CR-10)

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5.2 Resultados objetivo especfico 2: Confirmacin de las estructuras del salsolinol e isosalsolinol. Como ya se mencion, se supone que las dos sustancias separadas a partir del clorhidrato de salsolinol comercial por el sistema de HPLC de pares inicos implementado, SC1 y SC2, corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente.

El salsolinol y el isosalsolinol tienen ambos un peso molecular de 179 g/mol. Por esta razn y como primera aproximacin a la identificacin de los picos que se observan mediante HPLC de apareamiento inico para el salsolinol comercial, se colectaron las fracciones correspondientes a cada uno de los picos y a cada una se le registr un espectro de masas en un espectrmetro de tipo electrospray-trampa inica ESI-IT Esquire 4000 (Bruker Daltonik GMBH, Alemania).

En polaridad positiva, la ionizacin del analito produce un ion precursor que corresponde al analito protonado y que se designa por (M+H+), indicando que su masa corresponde a la del analito ms la de un protn. En los espectros de ambas fracciones (Figura 9) se observa que el ion precursor (M+H+) tiene una relacin masa/carga de 180, indicando que corresponden a sustancias cuyo peso molecular es de 179 g/mol. Esto refuerza la hiptesis de que las sustancias aisladas y designadas como SC1 y SC2 corresponden a salsolinol e isosalsolinol y no a otra sustancia oxidable que pudiera estar presente en el salsolinol comercial.

Luego, el ion precursor es fragmentado en la trampa inica produciendo un espectro de fragmentacin que es nico para cada sustancia en trminos de la relacin masa/carga de los fragmentos producidos y/o en la abundancia relativa de cada uno de estos fragmentos. As, para dos sustancias muy similares, como es el caso de los regioismeros salsolinol e isosalsolinol, cabe esperar que el espectro de fragmentacin sea similar en cuanto a la relacin masa/carga de los fragmentos producidos, dado que la fragmentacin del ion precursor puede producirse en sitios anlogos generando algunos fragmentos que sern iguales para ambos compuestos y otros que sern distintos. Sin embargo, cabe esperar tambin que la abundancia relativa de los fragmentos observados para ambos compuestos sea diferente, puesto que la probabilidad de generar cada fragmento ser distinta para cada compuesto (Silverstein et al, 2005).

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Figura 9: Espectros de masas de los compuestos eluidos en la HPLC del salsolinol comercial.Los espectros de masas se obtuvieron en un espectrmetro de masas tipo electrospray-trampa inica. El ion precursor de m/z 180 se design con la letra a y los fragmentos principales de m/z 163, m/z 145, m/z 137 y m/z 117 se designaron con las letras b, c, d y e, respectivamente. Los espectros corresponden a las dos sustancias aisladas a partir del salsolinol comercial mediante HPLC de pares inicos: el primer pico obtenido (SC1, tr promedio = 14,397 min) y al segundo pico (SC2, tr promedio = 26,137). A) Espectro de masas de SC1 donde se observa el ion precursor de m/z 180 (a) aislado ([M+H+]) y el espectro de fragmentacin (MS/MS), en el cual se observan los fragmentos principales de m/z 163 (b), m/z 145 (c), m/z 137 (d) y m/z 117 (e). B) Espectro de masas del SC2 donde se observa el ion precursor de m/z 180 (a) aislado ([M+H+]) y el espectro de fragmentacin (MS/MS), en el cual se observan los fragmentos principales de m/z 163 (b), m/z 145 (c), m/z 137 (d) y m/z 117 (e).

En los espectros de fragmentacin del ion precursor (MS/MS) de las fracciones correspondientes a SC1 (Figura 9A) y a SC2 (Figura 9B) del salsolinol comercial se observa que los fragmentos de relacin masa/carga 163, 145, 137 y 117 estn presentes en ambos espectros de fragmentacin aunque su abundancia relativa es distinta (Figura 9).

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La Tabla 1 muestra la abundancia relativa de cada uno de los fragmentos anteriores en el espectro de fragmentacin. Al fragmento ms abundante, que en ambos espectros result ser el de m/z 163, se le asign un valor de abundancia de 100. La abundancia de los dems fragmentos de cada espectro fue expresada con un valor relativo al fragmento ms abundante. Para SC1, la abundancia relativa de los fragmentos de relacin m/z 145, 137 y 117 es de un 55%, 44% y 7%, respectivamente. En el caso de SC2, la abundancia relativa de estos mismos fragmentos es de un 20%, 4% y 9%, respectivamente.

Tabla 1: Abundancia relativa de cada uno de los fragmentos observados en los espectros de masas MS/MS del primer y segundo pico observados para el salsolinol comercial.La abundancia de cada fragmento se expresa en trminos relativos al fragmento ms abundante de cada espectro (m/z = 163) al cual se le asigna arbitrariamente el valor 100. Los fragmentos provienen de las sustancias aisladas a partir de salsolinol comercial mediante HPLC de pares inicos, SC1 y SC2, que se cree corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente. La abundancia de cada fragmento fue registrada por el programa esquireControl Versin 5.2 de Bruker Daltonik GmbH (Bremen, Alemania).

Abundancia Relativa Relacin SC1 SC2 m/z (Sal) (Isal) 100 100 163 55 20 145 44 4 137 7 9 117

En definitiva, los iones moleculares que se observan para el salsolinol comercial tienen ambos la misma masa y esta masa es igual al peso molecular del salsolinol y el isosalsolinol. Adems, algunos de los fragmentos que se producen a partir de cada una de estas sustancias tienen la misma relacin masa/carga, lo que se condice con la similitud de las estructuras del salsolinol y el isosalsolinol.

De esta manera, se puede concluir que las sustancias SC1 (tiempo de retencin 14,4 min. aprox.) y SC2 (tiempo de retencin 26,1 min. aprox.) corresponden a salsolinol e isosalsolinol, respectivamente, en base a las siguientes evidencias: (i) las reas de los picos SC1 y SC2 se encuentran en una razn de 11,5:1, lo cual se corresponde con los porcentajes de salsolinol

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(92%) e isosalsolinol (8%) que se espera se encuentren en el salsolinol comercial de acuerdo con su espectro de 1H-RMN (comunicacin personal Dr. Bruce Cassels) y (ii) los espectros de masas de SC1 y SC2 indican que ambas sustancias tienen un peso molecular de 179 g/mol, coincidente con el peso molecular del salsolinol e isosalsolinol, y que ambas sustancias se fragmentan en forma similar tal cual se esperara para sustancias estructuralemente muy relacionadas, como lo son los regioismeros. Estas evidencias concuerdan adems con el menor tiempo de retencin que se espera para el salsolinol con respecto al isosalsolinol, puesto que en el salsolinol los grupos hidroxilo estn ms disponibles para interactuar con las molculas de la fase mvil de lo que lo estn en el isosalsolinol (ver Figura 3).

5.3 Resultados Objetivo Especfico 3: Determinacin de la estabilidad de la dopamina y del salsolinol comercial en solucin.

5.3.1 Estabilidad de la dopamina en solucin Usualmente, la sntesis in vitro de salsolinol se lleva a cabo en solucin acuosa mezclando clorhidrato de dopamina con acetaldehdo (King et al., 1974; Bates et al., 1986), lo que da una solucin de un pH aproximado de 4-5. En estas condiciones, se produce tambin entre un 1020% de isosalsolinol (King et al., 1974; Bates et al., 1986). Por otra parte, si esta reaccin se lleva a cabo en presencia de oxgeno, la dopamina puede tambin oxidarse para formar aminocromo (Figura 10) (Ochs et al., 2005). De esta manera, parte de la desaparicin de dopamina en el tiempo se deber a la formacin de salsolinol y parte se deber a la formacin de aminocromo. Por esta razn, es importante determinar la estabilidad de la dopamina en solucin en las condiciones que se usarn para producir salsolinol e isosalsolinol.

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Figura 10: Reaccin de oxidacin de la dopamina a aminocromo.La dopamina se oxida a aminocromo en una reaccin que tiene cuatro pasos y tiene como intermediarios la dopamina semquinona, la dopamina quinona y el leucoaminocromo (Ochs et al., 2005).

La desaparicin de dopamina en el tiempo, atribuible a su oxidacin, puede ser seguida mediante HPLC de apareamiento inico usando el mtodo desarrollado en el objetivo especfico nmero uno. Con este fin, se us una concentracin inicial de dopamina de 3,43 10-6 M y se evalu la cintica de la oxidacin de dopamina a pH fisiolgico (pH 7,4) tanto a temperatura ambiente como a 37C. Luego se calcul el porcentaje de dopamina remanente tras 5 horas de oxidacin para usarlo como un indicador de la dopamina perdida por oxidacin en el contexto de una reaccin de sntesis de salsolinol y/o isosalsolinol.

Se observ que la concentracin de dopamina disminuye conforme transcurre el tiempo, comportamiento que se ajusta a una recta (Figura 11). La disminucin a velocidad constante de la dopamina podra indicar que se trata de una reaccin de orden cero. Independientemente del orden de la reaccin, en el intervalo de tiempo estudiado (0-500 min) la concentracin de dopamina en el tiempo se puede determinar mediante las siguientes ecuaciones: [DA] (10-7 M) = - 0,018 t (min) + 35,819 a temperatura ambiente (aproximadamente 20 C) [DA] (10-7 M) = - 0,083 t (min) + 36,306 a 37C Donde [DA] = concentracin de dopamina expresada en 10-7 M t = tiempo de reaccin expresado en minutos

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40 concentracin de dopamina (10-7 M) 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 0 -10 100 200

[DA] (10-7 M) = -0,0182 t (min) + 35,819 R2 = 0,8561

[DA] (10-7 M) = -0,0828 t (min) + 36,306 R2 = 0,961

20C 37C

300

400

500

600

tiempo (min)

Figura 11: Oxidacin de la dopamina a temperatura ambiente (20C) y a 37C.En la figura se observa la disminucin de la concentracin de dopamina con el tiempo (min) en una solucin de dopamina (concentracin inicial 3,43 10-6 M) en tampn de fosfato de sodio 0,1 M de pH 7,4 a 20 C () y a 37 C ().La medicin de la concentracin de dopamina se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica. Para cada temperatura, el experimento fue realizado por triplicado y los resultados de cada una de estas mediciones independientes se representan en blanco, gris y negro. Las rectas corresponden al mejor ajuste considerando los datos obtenidos para los tres experimentos realizados para cada temperatura. En los recuadros se observan las ecuaciones integradas de velocidad que describen la desaparicin de dopamina en el tiempo a 20 C (lnea continua) y a 37 C (lnea punteada).

Se observa que la reaccin es ms rpida a 37C que a temperatura ambiente, lo cual se refleja en las respectivas constantes de velocidad: 0,018 (10-7 M/min) a temperatura ambiente y 0,083 (10-7 M/min) a 37C. Esta diferencia en la velocidad se traduce en que, a esta concentracin inicial de dopamina, el tiempo de vida media de la dopamina es de 16,4 horas a 20C y 3,7 horas a 37C. Por esta razn, se encuentra una diferencia significativa (p < 0,005) en el porcentaje de dopamina remanente en la solucin tras 5 horas, la cual es 2,7 veces mayor cuando la oxidacin se lleva a cabo a temperatura ambiente (84,1 4,1 %, n = 3) que cuando se lleva a cabo a 37C (31,4 2,5 %, n = 3) (Figura 12).

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100 90 % dopamina remanente 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20 C 84,1 %

p = 0,0046

31,4 %

37C

Figura 12: Porcentaje de dopamina remanente en la solucin tras 5 horas de oxidacin.En la figura se observa el porcentaje de dopamina remanente en la solucin (concentracin inicial de dopamina 3,43 10-6 M) tras 5 horas de oxidacin a temperatura ambiente (20C) y 37C. El porcentaje de dopamina remanente a las 5 horas de oxidacin se determin interpolando el valor de concentracin correspondiente a las 5 horas de oxidacin en las rectas que describen la disminucin de sta conforme transcurre el tiempo.Luego este valor se compar con la concentracin inicial de dopamina utilizada. Las mediciones fueron realizadas por triplicado. La medicin de la concentracin de dopamina se realiz mediante HPLC de pares inicos acoplada a deteccin electroqumica.

Dados los resultados anteriores, las condiciones ms favorables para la formacin de salsolinol e isosalsolinol son aqullas en las que la oxidacin de dopamina se ve menos favorecida y que permiten la formacin de salsolinol e isosalsolinol. Estas condiciones son una temperatura de reaccin de 20C y pH fisiolgico (pH