manual de laboratorio cultivos de apoyo 2013

Manual de Prcticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo

Dr. Enrique Valenzuela Espinoza

Responsable de la elaboracin del manual de Cultivos de Apoyo

Universidad Autnoma de Baja California

Facultad de Ciencias Marinas

[Avalado, Validado] el [fecha] por Consejo Tcnico

Directorio

Dr. Felipe Cuamea Velzquez Rector UABC

Dr. Oscar Roberto Lpez Bonilla

Vicerrector, UABC Campus Ensenada

Dr. Juan Guillermo Vaca Rodrguez Director FCM

Dr. Victor Antonio Zavala Hamz

Subdirector, FCM

Universidad Autnoma de Baja California

Facultad de Ciencias Marinas

ndice

Introduccin 5

Encuadre del sistema de prcticas 6

Introduccin 6

Competencia a las que contribuye 7

Nivel de desempeo 7

Ubicacin dentro del mapa curricular 8

Criterios de evaluacin 9

Programa del sistema de prcticas 10

Contenido de Prcticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo 11

Prctica No. 1. PREPARACIN DE SOLUCIONES DE NUTRIENTES 12

Prctica No. 2. TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR Y PREPARACIN DE MEDIO PARA EL

CULTIVO DE FITOFLAGELADOS Y DIATOMEAS MARINAS

16

Prctica No. 3. OBSERVACIN, RENOVACIN DE CULTIVOS PRIMARIOS Y TRANSFERENCIA DE

MICROALGAS MARINAS

20

Prctica No. 4. MANTENIMIENTO Y PRODUCCIN DE MICROALGAS MARINAS 24

Prctica No. 5. MANTENIMIENTO Y CUANTIFICACIN CELULAR DE MICROALGAS MARINAS MEDIANTE MICROSCOPIO PTICO

27

Prctica No. 6. MEDIDA DE CRECIMIENTO BASADA EN EL PESO SECO DE MICROALGAS MARINAS 30

Prctica No. 7. ANLISIS DE PIGMENTOS (CLOROFILA A, B Y C) EN MICROALGAS MARINAS 32

Prctica No. 8. CULTIVO ESTTICO DEL ROTFERO MARINO BRACHIONUS PLICATILIS 35

Prctica No. 9. CULTIVO SEMI-CONTINUO DEL ROTFERO MARINO BRACHIONUS PLICATILIS 38

Prctica No. 10. MTODO DE DECAPSULACIN DE QUISTES DE ARTEMIA PARA SER INCUBADOS 41

Prctica No. 11. CULTIVO Y CUANTIFICACIN DE ARTEMIA 45

Prctica No. 12. HISTORIA DE VIDA E IDENTIFICACIN DE ESTADIOS DE DESARROLLO DE ARTEMIA 49

Anexos 53

Normas Generales de Seguridad e Higiene 53

Medidas generales en Caso de Accidente 54

Plan General de Emergencia 54

Fuego en el Laboratorio 55

Fuego en el Cuerpo 55

Quemaduras 55

Cortes 56

Derrame de Productos Qumicos Sobre la Piel 56

Corrosiones en la Piel por cidos y lcalis 56

Corrosiones en los Ojos 56

Ingestin de Productos Qumicos 57

Manual de Prcticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo Encuadre del Sistema de Prcticas Pgina 5

Enrique Valenzuela Espinoza Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Introduccin Este manual est diseado para alumnos del curso de Cultivos de Apoyo que se imparte en

la carrera de Biotecnologo en Acuacultura en la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad

Autnoma de Baja California. Tambin, es til para el conocimiento prctico en el cultivo de

microalgas para docentes y alumnos de las carreras de Oceanologa y Biologa de la Facultad de

Ciencias Marinas y Facultad de Biologa respectivamente.

En este manual se consideran tres especies de microalgas (Isochrysis aff. galbana,

Chaetoceros muelleri y Nannochloropsis sp), las cuales son comnmente usadas en laboratorios

que se dedican a actividades de cultivo de moluscos, crustceos, y peces marinos. En particular,

se han elegido las especies arriba mencionadas para su cultivo en este manual de laboratorio,

debido a su importancia en acuacultura y biotecnologa. Sin embargo, las tcnicas y

procedimientos presentados aqu, pueden ser usadas en el cultivo de cualquier especie de

microalga, lo cual facilita el conocimiento prctico para que el estudiante desarrolle experiencias

de cultivos con otras especies de microalgas de inters biotecnolgico.

A travs del presente documento, se dan a conocer referencias de metodologas descritas en

distintos textos y publicaciones cientficas, as como tambin se incluyen experiencias de

investigacin que han sido realizadas en la Universidad Autnoma de Baja California a travs

del Instituto de Investigaciones Oceanolgicas para el cultivo y produccin de microalgas.

Finalmente, para fortalecer las competencias del alumno, se incluyen visitas a laboratorios

comerciales con el propsito de que el alumno identifique las principales diferencias entre las

tcnicas de cultivo desarrolladas en el laboratorio docente y aquellas que se realizan en los

centros acucolas.



Encuadre del Sistema de Prcticas

Introduccin El estudiante de la carrera Biotecnologo en Acuacultura debe conocer que para la

produccin de organismos acuticos de importancia econmica (larvas de moluscos, crustceos,

equinodermos, juveniles de peces etc.), se requiere de cultivos de apoyo (microalgas, rotferos,

coppodos, Artemia), los cuales constituyen el alimento principal durante el desarrollo

ontognico de las distintas especies en los cultivos comerciales. En este contexto, para que el

estudiante egresado de la carrera Biotecnologo en Acuacultura sea competente, es necesario

facilitarle no solo el desarrollo de tcnicas de cultivo especificas, sino tambin conocimiento

especializado para que lleve a cabo la produccin intensiva y extensiva de cultivos de apoyo. En

consecuencia, se formaran recursos humanos cuya competencia le permitir resolver problemas

que se presentan en los laboratorios y centros acucolas de produccin.

En la actualidad, para incrementar la produccin de organismos marinos, es necesario

realizar cultivos intensivos de fitoplancton y zooplancton que renan los requerimientos

nutricionales del consumidor tanto en calidad como en cantidad. Esto se puede lograr mediante

el uso de tecnologa moderna y la relacin que existe en el ambiente donde se lleva a cabo el

cultivo de los organismos. En el presente manual se incluyen las principales tcnicas de cultivo y

analticas que son comnmente usadas en acuacultura, como tambin su potencial uso en la

biotecnologa. Por otra parte, debido a que en Mxico todava no existe una industria

desarrollada para la produccin de insumos biolgicos para la acuacultura, entonces es

recomendable formar recursos humanos con alta capacidad competitiva y que promueva la

sustentabilidad durante su ejercicio profesional en el rea de cultivos de apoyo.



Competencias a las que contribuye

Niveles de Desempeo

El presente manual se ha elaborado en base al trabajo y la experiencia obtenida a travs de la

investigacin con diferentes especies de microalgas, rotferos marinos y Artemia, con el

propsito de que el estudiante obtenga el mximo nivel de desempeo al realizar actividades de

cultivo de las especies que son comnmente usadas como alimento vivo en acuacultura.

Las razones que justifican que el alumno obtendr el mximo nivel de desempeo son:

Realizar prcticas diseadas para adquirir habilidades y conocimientos sobre el cultivo de

fitoplancton y zooplancton marino.

Hacer reportes de laboratorio en formato cientfico, donde el alumno formule y evalu

hiptesis de trabajo, analice y evalu los resultados y consulte fuentes de informacin para la

redaccin del manuscrito.

Ejercicios y tareas sobre temas relacionados a la produccin de fitoplancton y zooplancton y

su importancia en la alimentacin de distintos estadios de crecimiento de diferentes especies

en cultivo.

Investigar y exponer temas relacionados con la biotecnologa micro-algal, con el propsito

de que el alumno recurra a fuentes de informacin y ejercitar nuevas formas de estudio.



Ubicacin dentro del mapa curricular MAPA CURRICULAR BIOTECNOLOGA EN ACUACULTURA



CRITERIOS DE EVALUACIN

Para que el alumno tenga derecho a calificacin ordinaria, debe tener un 80% de asistencia al curso prctico.

De cada una de las prcticas, el alumno deber entregar un reporte escrito en formato word, el cual se entrega a la semana de haberse realizado y a la siguiente semana se le entrega la prctica calificada. Nota: Aquellos alumnos que no entreguen prctica a tiempo no tendrn calificacin y no se recibirn prcticas atrasadas, salvo circunstancias justificadas.

La prctica se presentar en forma individual, formato cientfico, atendiendo los siguientes puntos: La calificacin se asigna en base al cumplimento de los

puntos 1.- Introduccin: Propsito, cul es el objeto de estudio 10 % 1.1. Investigar: buscar informacin acerca del tema de estudio 15 % 2.- Objetivo (s), hiptesis: producir la respuesta al problema 15 % 3.- Experimento: realizar el procedimiento prctico para confirmar objetivo (s) o rechazar hiptesis

25 %

4.- Resultados y discusin: anlisis y registro de datos durante el Experimento prctico

25 %

5.- Conclusin: con la metodologa propuesta se dio respuesta al objetivo e hiptesis planteada

10 %

Para aprobar la asignatura, el alumno requiere presentar al menos el 80% de las prcticas realizadas. Sin embargo, para el clculo de la calificacin final se tomar en cuenta el total de las prcticas.



Programa del Sistema de Prcticas NMERO DE PRCTICA

TITULO DE LA PRCTICA, MBITO DE DESARROLLO Y DURACIN PGINA

1 PREPARACIN DE SOLUCIONES DE NUTRIENTES-

LABORATORIO- 3 HORAS

12

2 TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR Y PREPARACIN DE

MEDIO PARA EL CULTIVO DE FITOFLAGELADOS Y

DIATOMEAS MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

16

3 OBSERVACIN, RENOVACIN DE CULTIVOS PRIMARIOS Y

TRANSFERENCIA DE MICROALGAS MARINAS- 3 HORAS

20

4 MANTENIMIENTO Y PRODUCCIN DE MICROALGAS

MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

24

5 MANTENIMIENTO Y CUANTIFICACIN CELULAR DE

MICROALGAS MARINAS MEDIANTE MICROSCOPIO PTICO

27

6 MEDIDA DE CRECIMIENTO BASADA EN EL PESO SECO DE

MICROALGAS MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

30

7 ANLISIS DE PIGMENTOS (CLOROFILA A, B Y C) EN

MICROALGAS MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

32

8 CULTIVO ESTTICO DEL ROTFERO MARINO BRACHIONUS

PLICATILIS- LABORATORIO- 3 HORAS

35

9 CULTIVO SEMI-CONTINUO DEL ROTFERO MARINO

BRACHIONUS PLICATILIS- LABORATORIO- 3 HORAS

38

10 MTODO DE DECAPSULACIN DE QUISTES DE ARTEMIA PARA

SER INCUBADOS- LABORATORIO- 3 HORAS

41

11 CULTIVO Y CUANTIFICACIN DE ARTEMIA- LABORATORIO- 3

HORAS

45

12 HISTORIA DE VIDA E IDENTIFICACIN DE ESTADIOS DE

DESARROLLO DE ARTEMIA- LABORATORIO- 3 HORAS

49

Contenido de Prcticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo

Dr. Enrique Valenzuela Espinoza

Responsable de la elaboracin del manual de Cultivos de Apoyo

Manual de Prcticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo Pgina 12


PRCTICA No. 1

PREPARACIN DE SOLUCIONES DE NUTRIENTES

1.1.1. Introduccin

Para el crecimiento y bioqumica normal de micro-algas, se requiere de la disponibilidad de un nmero variable de elementos minerales, probablemente de 15 a 20, con la posibilidad de que otros elementos puedan ser agregados a la lista. El requerimiento elemental de nutrientes es considerado en dos grupos: Los macro-nutrientes, los cuales son usados directamente o indirectamente para la construccin de bloques celulares (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y los micro-nutrientes, que son necesitados en una menor concentracin como catalizadores o para funciones nicas como material estructural o reguladores osmticos (Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, V, B, Cl, Co, Ca, Si, Na). Los compuestos usados para suministrar la mayora de los minerales y los intervalos de concentracin en los cuales ellos son generalmente requeridos por la micro-algas marinas se muestran en la tabla 1 (Guillard, 1975).

Los nutrientes utilizados por el fitoplancton auttrofo son sustancias qumicas que se agregan al agua de mar y la demanda por estos nutrientes frecuentemente exceden el suministro que en la prctica comn se usan para la preparacin de medios de cultivo. Es decir, el nutriente se suministra en menor cantidad a las necesidades del fitoplancton, lo cual llega a limitar la produccin de fitoplancton en sistemas de cultivo. La tabla I describe la cantidad de sales inorgnicas y orgnicas usadas para el cultivo de fitoplancton en laboratorio. Algunos nutrientes son componentes nicos de una solucin primaria, otros son combinados en una solucin primaria y de esta solucin se derivan otras soluciones. Estas soluciones de nutrientes son mezcladas en el agua de mar en la cual el fitoplancton es cultivado.

1.1.2. Objetivo

Preparar soluciones de nutrientes mayores (nitrato de sodio, fosfato de sodio y silicato de

sodio), micronutrientes y vitaminas, mediante los procedimientos de laboratorio que consideren

la cantidad del nutriente que es usado por litro de agua de mar y el requerimiento establecido

para fitoflagelados y diatomeas, para disear medios de cultivos apropiados, con una actitud

crtica y propositiva

1.1.3. Material Planchas de agitacin, agitadores magnticos, esptulas, navecillas para pesar, matraces volumtricos de 250 mL, matraces volumtricos de 100 mL, picetas, frascos de 250 mL, frascos de 100 mL.



1.1.3.1. Instrumental Balanza analtica

1.1.3.2. Reactivos Agua destilada, cloro comercial al 6%, acido clorhdrico, reactivos qumicos especificados en la tabla 1, tiosulfato de sodio.

Tabla I: Concentracin de los nutrientes en 1 litro de agua de mar.

1.1.4. Desarrollo

1.- Asegrese de que todos los recipientes y materiales que se usen para la preparacin de las soluciones de nutrientes estn perfectamente limpios y secos.

2.- Los nutrientes enlistados en la tabla II, son componentes de una solucin primaria. Pese en una balanza analtica la cantidad requerida de cada uno para hacer una solucin primaria de 250 mL. Disuelva el reactivo en agua destilada y afore en un matraz volumtrico de 250 mL. Una vez preparadas las soluciones almacenar en recipientes de vidrio o de plstico y mantenerlos en refrigeracin.



3.- Para la preparacin de soluciones stock primario de metales traza, es conveniente hacer soluciones individuales de metales traza. Los componentes qumicos requeridos para la preparacin se especifican en la tabla III. Pesar en una balanza analtica la cantidad requerida de cada sustancia qumica para hacer una solucin primaria de 100 mL. Disuelva cada sustancia qumica en agua destilada y afore en un matraz volumtrico de 100 mL. Una vez preparadas las soluciones almacenar en recipientes de vidrio o de plstico y en mantenerlos en refrigeracin.

4.- Solucin stock de metales traza, usando cloruro frrico y EDTA-di-sdico (Na2EDTA).

Disolver 3.15 g de FeCl.6H2O y 4.36 g Na2EDTA en aproximadamente 900 mL de agua destilada; Aada 1 mL de cada una de las soluciones stock primaria de metales traza (ver tabla III) y afore a un litro con agua destilada.

5.- Las soluciones stock primarias de vitaminas son hechas pesando en una balanza analtica las cantidades que se describen en la tabla IV-A.



Tabla IV-A. Cantidad de vitamina que se utiliza para preparar un litro de medio de cultivo.

Vitamina Formula Cantidad de vitamina por cada

litro de agua de mar de cultivo

Tiamina hidroclorhidrica C12H17CIN4OS.HCl 0.1 mg

Biotina C10H16N2O3S 0.5 g

Cianocobalamina B12 C63H88CoN14P 0.5 g

6.- Para preparar el tris-buffer, se pesan 200 g y disolver en 1000 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.2-7.5, con ~30-35 ml de HCl concentrado. Use 1 ml de tris por cada litro de agua de mar, solo para cultivos de volumen pequeo.

1.1.5. Mtodo de Evaluacin

Reporte de laboratorio en formato cientfico, donde el alumno formule y evalu hiptesis de trabajo, analice y evalu los resultados y consulte fuentes de informacin para la redaccin del manuscrito.

1.1.6. Bibliografa

Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In:

Smith, W.L. and M.H. Chanley (ed.). Culture of marine invertebrates animals.

Plenum Publishing Corp. New York., pp.29-60.

Lavens, P; Sorgeloos, P. 1996. Manual on the Production and Use of Live Food for

Aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper. No. 361. Rome, FAO. 295 pp.



PRCTICA No. 2

TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR Y PREPARACIN DE MEDIO PARA EL CULTIVO DE FITOFLAGELADOS Y DIATOMEAS MARINAS.

1.1.7. Introduccin

El agua de mar natural es un medio complejo que contiene ms de 50 elementos

conocidos y una gran cantidad de compuestos orgnicos. Para el cultivo de micro-algas, el

uso directo del agua es poco aceptable, debido a que, el agua de mar presenta variaciones en

su calidad y concentracin de nutrientes a travs del ao, dando como resultado una baja

produccin de micro-algas. Entonces, uno de los procedimientos que comnmente se lleva a

cabo, es tener un control de concentracin de nutrientes disponibles para el crecimiento de

micro-algas. Esto se logra mediante la adicin de nutrientes inorgnicos mayores (NO3-,

PO43-, y silicatos), metales traza quelados, y vitaminas. Entre los medios ms utilizados esta

el f/2 de Guillard (1975), el cual tiene una proporcin de nitrgeno:fsforo >16 : 1, indicando

que el fitoplancton podra estar limitado de fosforo en fase de envejecimiento del cultivo

(Berges et al. 2001). La mayora de los medios de cultivo se usan para mantenimiento de

cepas de micro-algas como para produccin de biomasa micro-algal, por este motivo, el

enriquecimiento es comnmente requerido.

Por otra parte, el personal que se dedica al cultivo de micro-algas y aquel que labora

en los centros de produccin acucola usualmente ponen poca atencin a la proporcin

nitrgeno:fsforo o nitrgeno: slice que se usa en la preparacin de medios de cultivo para la

produccin de micro-algas, lo cual finalmente determinar cual nutriente limitar el

crecimiento e influir en la composicin bioqumica y razn fisiolgica cuando las clulas

lleguen a la fase de envejecimiento del cultivo. Por lo tanto, la concentracin y formas de

macro nutrientes en ( f, f/2, and f/50) en los medios comnmente varia. Tpicamente los

macro nutrientes estn en exceso en comparacin con concentraciones naturales,

particularmente en el caso de medios usados en acuicultura.



1.1.8. Objetivo

Tratamiento del agua de mar, mediante su filtracin, tratamiento por radiacin ultravioleta y mtodo qumico de desinfeccin del agua, as como el anlisis de la apertura del filtro que se usa y los protocolos establecidos para preparar las soluciones requeridas, para su uso en la preparacin de medio para el cultivo de fitoflagelados y diatomeas marinas, con una actitud crtica y proactiva.

1.1.9. Material

Frascos Erlenmeyer, frascos Fernbach, algodn, gasa, tijeras, pipetas graduadas, probeta graduada, rea para transferir cultivos (equipada con mesa, suministro de gas, mecheros de alta temperatura).

1.1.9.1. Instrumental Autoclave

1.1.9.2. Reactivos Agua de mar filtrada a 1m, soluciones stock de NO3-, PO43-, SiO32-, secuestrante, vitaminas, tris buffer.

1.1.10. Desarrollo

El Agua de mar se obtiene de la zona costera adyacente mediante bombeo y se almacena

en reservorios de concreto o de plstico. Esta agua de mar no filtrada se hace pasar por filtros

rpidos de arena para separar material partculado el cual es retenido en la cama de arena y el

agua filtrada es almacenada en otro reservorio.

Despus el agua filtrada es bombeada al laboratorio de micro-algas, donde de nuevo es

tratada con filtros tipo cuno hasta obtener agua filtrada a 1 micra. Subsecuentemente es

pasada a travs de una unidad equipada con luz ultravioleta para descodificar genticamente

los micro-organismos y/o atenuar la mayora que no fueron retenidos por el filtro. El agua

puede de aqu en adelante ser almacenada para su uso en cultivo de micro-algas.

La tcnica de cultivo esttico usa recipientes de cultivo de diferente tamao y el volumen

de cultivo puede variar considerablemente en diferentes laboratorios.

Antes de iniciar la preparacin de medios de cultivo, asegrese de que los recipientes y

materiales que se usen para la preparacin estn perfectamente limpios y secos.

Con la ayuda de una probeta graduada, mida un volumen de 1000 mL y vierta este en el

frasco donde se preparar el medio.



De cada solucin stock de nutrientes mayores (NO3-, PO43-, SiO32-) y secuestrante, aada

un mililitro por cada litro de agua de mar. Tambin use Tris a razn de 1 mL L-1 de agua de

mar antes de esterilizar. El Tris es solo para cultivos de pequeo volumen (150 y 2000 mL),

no para cultivos de mayor volumen

Una vez preparado el medio, se recomienda preparar volmenes de acuerdo al nmero de

Erlenmeyers que se necesiten. Por ejemplo, en matraces Erlenmeyers de 125 y 250 mL de

capacidad, se pondr un volumen de cultivo de 100 y 150 mL respectivamente. El matraz se

cubre con una torunada hecha de algodn y gasa, la cual se coloca en la boca del matraz

un poco ajustada para que cubra efectivamente.

Esterilice el medio en autoclave a 121 C, 15 libras de presin por pulgada cuadrada

durante 15 minutos (121 C, 1.05 Kg cm-2 de presin por 15 minutos).

Deje enfriar los medios de cultivo a temperatura ambiente. Luego aada las vitaminas

aspticamente (previamente esterilizadas) a razn de 1 mL L-1. Si el volumen de cultivo

preparado en Erlenmeyer es de 100 o 150 mL entonces adicione 100 o 150 L.

Transferir con pipetas estriles 1 mL de cepa inicial unialgal de cada especie (Isochrysis

aff. galbana, Nannochlropsis sp, Chaetoceros muelleri).

Los cultivos se colocan en un cuarto de temperatura controlada (191C), bajo irradianza

fotosintticamente activa de 150 mol quanta m-2 s-1. Esta irradianza, provee la energa para

el crecimiento de las microalgas.

Despus de algunos das las clulas se han multiplicado, tomaran un color caracterstico

debido a la densidad. Este rpido incremento en el nmero de clulas es conocido como

bloom. Al cabo de una semana los cultivos deben renovarse para mantener las cepas y/o

usarse como inoculo para volmenes mayores de cultivo.





1.1.12. Bibliografa

Berges, J.A., Franklin, D. J., and Harrison, P. J. 2001. Evolution of an artificial seawater

medium: Improvements in enriched seawater, artificial water over the last two

decades. J. Phycol. 37:1138-45.

Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In:

Smith, W.L. and M.H. Chanley (ed.). Culture of marine invertebrates animals.

Plenum Publishing Corp. New York., pp. 29-60.





PRCTICA No. 3

OBSERVACIN, RENOVACIN DE CULTIVOS PRIMARIOS Y TRANSFERENCIA DE MICROALGAS MARINAS

1.1.13. Introduccin

Una de las principales actividades de un laboratorio de cultivo de micro-algas marinas es el mantenimiento, renovacin y transferencia de cultivos de diferentes especies que son utilizadas para la alimentacin de distintos estadios de crecimiento de organismos acuticos.

Comnmente para iniciar la actividad del cultivo de micro-algas, un inoculo primario es obtenido de laboratorios biolgicos como por ejemplo, el Centro para el Cultivo de Fitoplancton Marino, Utex (Universidad de Texas), Milford, Connecticut, son algunos de los disponibles en Estados Unidos de Amrica y en Mxico Instituto de Investigaciones Oceanolgicas de la UABC y el Centro de Investigacin Cientfica y de Educacin Superior de Ensenada. El inoculo requerido es unialgal, esto es que exista solo una especie de micro-alga en el recipiente y que el inoculo est libre de bacterias. Una vez que el inoculo primario es obtenido, la micro-alga es transferida para su crecimiento en tubos de ensayo o frascos Erlenmeyer, los cuales son usualmente llamados inoculos primario (stock). Estos cultivos debern ser siempre mantenidos como unialgal y si es posible libre de bacterias. Por consiguiente, al menos que se cometa algn error en el cultivo, por ejemplo que este muera, se contamine con otras especies de microalgas, un nuevo cultivo tiene que ser adquirido para iniciar cultivos primarios (stocks), los cuales son perpetuados en frascos Erlenmeyer.

Para prevenir contaminacin por bacterias durante el tiempo de transferencia, esta debe ser hecha con pipetas estriles. Este procedimiento asegura el cultivo, pero esto no previene la entrada de bacterias del aire al contenedor durante el tiempo de inoculacin. La contaminacin por bacterias puede ser reducida si los cultivos son abiertos tan solo por un breve momento durante la transferencia. Otra manera de evitar contaminacin es trabajar bajo una campana en la cual el aire ha sido irradiado con lmparas germicidas (UV), y/o flameando el rea con mecheros de alta temperatura.

Los cultivos, despus de ser inoculados, son colocados bajo iluminacin. La luz proporciona la energa para el crecimiento de las micro-algas. Los cultivos en este nivel no son aireados; por lo tanto, es necesario agitarlos manualmente una vez al da para prevenir la acumulacin de clulas en el fondo. Despus de 4 a 5 das de crecimiento, las clulas se han multiplicado, entonces ellas tomaran un color caracterstico debido al incremento en nmero de clulas, lo cual es conocido como bloom. Bajo condiciones ptimas las especies flageladas pueden dividirse una vez en 24 horas, y las diatomeas pueden dividirse de 2 a 3 veces por da. Dentro de una semana, los cultivos tendrn un nmero suficiente de clulas para ser usados como inoculos para otros cultivos primarios (stock) o escalar el cultivo a un volumen mayor.



1.1.14. Objetivo

Preparar medios de cultivo y transferir clulas de microalgas a partir de cultivos primarios a medios frescos recin preparados, mediante los procedimientos de laboratorio establecidos en manuales, para promover el crecimiento y mantenimiento de cepas en laboratorio, con una actitud crtica, proactiva y responsable.

1.1.15. Material

Mechero(s), cmara de neubauer de 0.1 mm de profundidad y cubre objeto, pipetas

Pasteur, muestras de cultivos de microalgas, bulbos para pipetas, pipetas graduadas, probetas

graduadas, guantes para sujetar material caliente.

1.1.15.1. Instrumental Microscopio compuesto, autoclave

1.1.15.2. Reactivos Alcohol o etanol al 90%, solucin de lugol

1.1.16. Desarrollo

Tomar 1 L de agua de mar filtrada y aadir 1 mL de cada una de las soluciones de macro

nutrientes y micro nutrientes quelados. Para evitar formacin de precipitados durante la

esterilizacin, aada tris-buffer a razn de 1 mL por litro de agua de mar. Las vitaminas, se

incorporan aspticamente despus de la esterilizacin.

Adicionar el volumen de cultivo correspondiente en recipientes (pueden ser 15 mL en

tubos, 100 mL o 150 en frascos Erlenmeyer) y esterilizar en autoclave a 121 C, 15 libras de

presin por 15 minutos.

Deje enfriar los medios de cultivo.

Asegrese de que la superficie de trabajo este limpia y seca. Puede usar alcohol o etanol

al 70% para tal propsito.

Coloque las pipetas estriles o puntillas para micro pipeta del lado izquierdo del rea de

trabajo y tambin un recipiente para colocar las pipetas o puntillas despus de su uso.



Despus de organizar el material encienda el mechero, ajuste la flama y colquelo en el

centro del rea de trabajo, mantenga un radio de trabajo de 40 cm alejado del mechero. Si se

trabaja con dos mecheros, seprelos, coloque el material en el centro y mantenga los

mecheros a una distancia de 40 cm en ambos lados del material.

Evite circulacin de aire, manteniendo puertas y ventanas cerradas.

Coloque los tubos o frascos Erlenmeyer en orden cronolgico para su uso y asegrese

que todo el material este debidamente etiquetado. Ahora la manipulacin de la muestra puede

iniciar.

Aadir las vitaminas estriles en proporcin al volumen de cultivo, es decir si el volumen

de cultivo es de 100 o 150 mL se aadir 100 o 150 microlitros por muestra.

Despus con la mano izquierda levante el recipiente que contiene las pipetas, abrir este

dentro del rea de trabajo (40 cm), remover la tapa con la mano derecha y con el dedo ndice

y pulgar extraer la pipeta. Si el recipiente es demasiado largo, coloque la tapa en la base del

mechero para extraer la pipeta. Si la manipulacin no es muy frecuente, se recomienda que el

recipiente permanezca cerrado durante el proceso de trabajo.

Una vez extrada la pipeta, sostenga esta con la mano izquierda y coloque el bulbo. En

caso de usar puntillas sostenga la micro pipeta con la mano derecha y coloque la puntilla

estril con la mano izquierda.

Durante repetidos procesos de transferencia es conveniente mantener los contenedores de

pipetas y/o puntillas abiertos, pero que permanezcan en un radio de 40 cm respecto a los

mecheros.

La muestra de alga puede ser ahora transferida a un medio fresco para mantenimiento de

cultivos primarios (stock).

Realizadas todas las transferencias, apagar los mecheros, cerrar las lneas de gas,

remover todos los materiales de la mesa de trabajo, limpiarla y salir del cuarto de trabajo.

Por ltimo, no agitar los cultivos en las primeras 24 horas y colocar los recipientes que

contienen las microalgas en condiciones de luz y temperatura apropiada para su crecimiento.

Cuando se trate de inspeccin de muestras realice lo siguiente:

Colocar una o dos gotas del medio en un portaobjetos limpio.



Inspeccione las clulas bajo el microscopio, revise tamao, forma, color y actividad de

las clulas. Observe posible contaminacin, esto se ver en forma de basura o clulas

extraas que presentan un movimiento diferente a la especie en cuestin.



1.1.18. Bibliografa



Andersen, R.A. 2005. Algal Culturing Techniques. Phycological Society of America.

Elsevier Academic Press. 565 pp.


PRCTICA No. 4

MANTENIMIENTO Y PRODUCCIN DE MICROALGAS MARINAS

1.1.19. Introduccin

La manera ms comn para conservar cultivos de microalgas es mantener estos

continuamente bajo condiciones ambientales controladas. Rutinas de subcultivos en serie es

llevado a cabo usando tcnicas aspticas, que consiste en transferir un inoculo de la fase

exponencial final dentro de medio fresco esterilizado. Esto origina cultivos metablicamente

activos que pueden ser usados en tiempos cortos. El propsito de esta actividad es retener una

poblacin, fisiolgicamente, morfolgicamente, y genticamente saludable. Un factor clave a

considerar es que diferentes edades de subcultivos pueden proveer diferentes estadios del

ciclo de vida (por ejemplo, clulas mviles y dividindose en las primeras fases del cultivo).

Las principales limitaciones de perpetuar las clulas es la selectividad, naturaleza

artificial del medio y rgimen de incubacin con respecto a condiciones naturales.

Condiciones de laboratorio pueden, en casos extremos, conducir a la perdida de

caractersticas morfolgicas y fisiolgicas importantes. Ejemplos de inestabilidad incluyen la

reduccin en tamao de las frustulas de diatomeas (Jaworski et al. 1988), perdida de

composicin pigmentaria normal en diversas algas (Warren et al. 2002). Otras limitaciones

incluyen la posibilidad de contaminacin de cultivos axenicos por manejo inapropiado de

estos durante la transferencia a volmenes mayores de produccin. Rutinas de subcultivos en

transferencias sucesivas para la produccin de microalgas es una labor intensiva y

ciertamente limita la capacidad del cultivador para mantener gran nmero de especies en

lneas de produccin para la alimentacin de invertebrados acuticos. Para evadir esta

desventaja de rutina de mantenimiento, mtodos alternativos de preservacin han sido

desarrollados, especialmente la crio-preservacin. Esta prctica se enfoca en tcnicas de

transferencia, condiciones de mantenimiento y condiciones que aseguren el mejor

crecimiento de cultivos de microalgas.


1.1.20. Objetivo

Mantener diferentes especies de microalgas, mediante los procedimientos de laboratorio

de transferencia de cultivos lquidos de nivel Erlenmeyer a nivel Fernbach, para aumentar la

cantidad y densidad de alimento vivo para las especies de importancia en la acuacultura, con

una actitud crtica y responsable.

1.1.21. Material

Matraces Fernbach, algodn, gasa, tijeras, probeta graduada, pipetas, rea para transferir

cultivos (equipada con mesa, suministro de gas, mecheros de alta temperatura). rea con

temperatura controlada provista de iluminacin con lmparas de luz de da de 40 y 75 W.

1.1.21.1. Instrumental Autoclave

1.1.21.2. Reactivos Agua de mar filtrada, soluciones de nitrato de sodio, fosfato de sodio, silicatos,

secuestrante, tris, vitamina B12, tiamina y biotina.

1.1.22. Desarrollo

1.- Obtener agua de buena calidad con salinidad entre 32 y 34 parte por mil.

2.- Filtrar tan pronto como sea posible a travs de filtros tipo cuno de 1 micrometro. Pasar el

agua filtrada por radiacin ultravioleta.

3.- Si el agua no se va usar inmediatamente, se recomienda almacenarla en la oscuridad y en

refrigeracin a 4C.

4.- Para la preparacin de medio de cultivo en Fernbach, tomar 1.8 L de agua de mar filtrada.

5.- Aadir nitrato, fosfato, secuestrante frrico y silicato en caso de cultivos de diatomeas.

Tambin use Tris a razn de 1 mL L-1 de agua de mar antes de esterilizar.

6.- Mezclar exhaustivamente despus de la adicin de cada solucin de nutriente.

7.- Tapar con torunda de algodn el matraz Fernbach que contiene el medio de cultivo.

8.- Esterilizar el medio de cultivo en autoclave, o cuando sea necesario por filtracin (0.2

micras), tratamiento con luz ultravioleta, o pasterizacin.


9.- Si la esterilizacin es en autoclave, llevar a cabo este procedimiento a 121 C, 1.05 Kg

cm-2 de presin por 15 minutos.

10.- Completada la esterilizacin, retirar el medio de cultivo usando guantes para manejo de

objetos calientes fuera de la autoclave.

11.- Despus dejar enfriar el medio de cultivo en un cuarto a temperatura controlada.

12.- Una vez frio, destape el matraz Fernbach por un breve tiempo y aada las vitaminas

aspticamente (previamente esterilizadas) a razn de 1 mL L-1. Si el volumen de cultivo

preparado en Fernbach es de 1.8 L entonces adicione 1.8 mL de cada una de las vitaminas.

13.- Realizado lo anterior, transfiera 150 mL de inoculo unialgal obtenido en matraz

Erlenmeyer a un matraz Fernbach.

14.- Colocar los cultivos en un cuarto de temperatura controlada (191C), bajo irradianza

fotosintticamente activa de 150-300 mol quanta m-2 s-1. Esta irradianza, provee la energa

para el crecimiento de las microalgas.

15.- Despus de 4-7 das, las clulas sirven como inoculo para cultivos en garrafn


Reporte de laboratorio en formato cientfico, donde el alumno formule y evalu hiptesis

de trabajo, analice y evalu los resultados y consulte fuentes de informacin para la


1.1.24. Bibliografa

Jaworski, G. H. M., Wiseman, S. W., and Reynolds, C. S. 1988. Variability in sinking

rate of the freshwater diatom Asterionella Formosa: the influence of colony

morphology. Br. Phycology. F. 23: 167-76.



Warren, A., Day, J. G., and Brown, S. 2002. Cultivation of protozoa and algae. In Hurst,

C. J., Crawford, R. L., Knudsen, G. R., McInerney, M. J., and Stezenbach, L. D., Eds,

Manual of Environmental Microbiology, ed. 2. ASM Press, Washington, D.C., pp 7-

83.



PRCTICA No. 5

MANTENIMIENTO Y CUANTIFICACIN CELULAR DE MICROALGAS MARINAS MEDIANTE MICROSCOPIO PTICO

1.1.25. Introduccin

El conteo de clulas bajo un microscopio en un hematocimetro es uno de los mtodos

ms comnmente usados para la enumeracin celular y con base a esta determinacin se

calcula el volumen de alimento requerido en la alimentacin de larvas de organismos

acuticos. Esta tcnica es de suficiente precisin para cumplir los requerimientos de alimento

de un laboratorio que se dedique al cultivo de larvas y postlarvas de invertebrados marinos.

Adems, el uso de esta tcnica de enumeracin celular proporciona informacin adicional a

cerca de la condicin del cultivo de microalgas y que no es determinada por centrifugacin o

por peso celular. Por ejemplo, observaciones bajo el microscopio proporcionan informacin

sobre la contaminacin de los cultivos, y da una garanta de la condicin de los cultivos con

respecto al movimiento de la clula, su tamao y pigmentacin. Una de las aplicaciones de

esta tcnica, es conocer el nmero de clulas presentes en una poblacin cultivada, la cual

comnmente se expresa como el nmero total de clulas por unidad de volumen de cultivo.

Tambin, existen otros mtodos para conocer la poblacin de microalgas, la cual puede ser

por biomasa, peso hmedo, peso seco, contenido de clorofila, contenido de nitrgeno

orgnico. Un aspecto fundamental de estos mtodos de evaluacin de la biomasa microalgal,

es que tanto las poblaciones de microalgas en el ambiente natural como en sistemas de

cultivo, se encuentran de forma individual y el concepto de la cuota celular, significa que el

contenido celular promedio de algn constituyente celular (nitrgeno, fsforo, hierro,

vitamina B12), requieren tanto de conteos celulares y determinaciones qumicas del

constituyente.

Otra aplicacin del conteo celular es para conocer la razn de aumento en el cultivo,

equivalente a la tasa de incremento de la poblacin; frecuentemente esta es expresada como

la tasa de divisin celular, porque el proceso de incremento es por la divisin de una clula

individual en dos (ocasionalmente ms) de manera regular. En laboratorios de produccin

comercial, el conteo de microalgas, permite realizar los clculos necesarios para decidir en

que volumen de cultivo se llevar el proceso de produccin de microalgas; as como tambin,



facilita el clculo del volumen de algas que se necesita suministrar como alimento para

diferentes estadios de crecimiento de larvas de moluscos y crustceos en contenedores de

cultivos larvarios.

1.1.26. Objetivo

Cuantificar clulas de diferentes especies de microalgas, mediante los procedimientos

que consideran la cantidad de muestra (volumen) y el factor de dilucin empleado, para

establecer las tasas de crecimiento de cada especie, con una actitud crtica y responsable,

aplicando un rigor matemtico y ordenado.

1.1.27. Material

Mechero(s), hematocimetro y cubre objeto, pipetas pasteur, bulbos para pipetas, pipetas

graduadas, probetas graduadas, , muestras de cultivos de microalgas: Isochrysis galbana,

Chaetoceros muelleri y Nannochloropsis sp.

1.1.27.1. Instrumental Microscopio compuesto binocular

1.1.27.2. Reactivos Alcohol o etanol al 90%, solucin de lugol

1.1.28. Desarrollo

La primera consideracin prctica es elegir la cmara de conteo apropiada de acuerdo a la

forma, tamao y densidad de cultivo.

A continuacin se enlistan diferentes cmaras de conteo junto con sugerencias de

aplicacin bajo su uso en diferentes circunstancias de trabajo.

Cmara de conteo Tamao de la clula

(m)

Densidad del cultivo

(cl mL-1)

Sedgwick-Rafter 50-500 30-104



Cmara de conteo Tamao de la clula

(m)

Densidad del cultivo

(cl mL-1)

Palmer-Maloney 5-150 102-105

Speirs-Levy (0.2 mm de profundidad) 5-75 104-106

Hemacitometro de (0.2 mm de profundidad) 5-75 104-106

Hemacitometro (0.1 mm de profundidad) 2-30 104-107

Petrff-Hausser < 1-5 106-108

Referencia: Robert A. Anderson. Algal culturing techniques, 2005.





1.1.30. Bibliografa



Andersen, R.A. 2005. Algal Culturing Techniques. Phycological Society of America.

Elsevier Academic Press. 565 pp.



PRCTICA No. 6

MEDIDA DE CRECIMIENTO BASADA EN EL PESO SECO DE MICROALGAS

MARINAS

1.1.31. Introduccin

En los trabajos de laboratorio con cultivos de microalgas, el nmero de clulas se utiliza

como base para reportar datos, ya que es relativamente fcil de medir, especialmente con

cmaras de conteo o contadores electrnicos de partculas. La biomasa cuantificada de los

cultivos se expresa como peso seco, peso hmedo, o peso seco libre de cenizas. Cualquiera

de estos valores se obtiene de forma fcil de un cultivo de microalgas, ya que el organismo

que se estudia es el nico presente en el cultivo.

Una de las condiciones para la medicin confiable del peso seco de clulas es el tomado

de las muestras, la cual debe ser representativa del cultivo algal. Un adecuado agitamiento de

la suspensin algal y rpido pipeteo, previenen el asentamiento de clulas durante el proceso

de muestreo. Cada medicin de peso seco es usualmente hecha al menos por duplicado. El

tamao de la muestra generalmente depende de la densidad del cultivo. Despus de tomar la

muestra, las clulas son separadas comnmente del medio de cultivo por centrifugacin o

filtracin. La masa celular separada puede ser entonces expresada como peso seco de clulas

en una unidad de volumen de cultivo.

1.1.32. Objetivo

Determinar el peso seco de muestras de microalgas, mediante los procedimientos de

lavado, secado, calcinado, pesado descritos en los manuales, para establecer el peso de

cenizas, as como los factores que afectan la precisin del mtodo y el protocolo de muestreo,

con una actitud crtica, analtica y responsable, y con disposicin al trabajo en equipo.

1.1.33. Material

Equipo de filtracin completo, filtros de fibra de vidrio GF/F y GF/C, desecador, bomba

manual para hacer vacio, probetas graduadas, jeringas desechables.



1.1.33.1. Instrumental Balanza analtica, estufa, mufla.

1.1.33.2. Reactivos Formato de amonio al 2.25%, agua destilada

1.1.34. Desarrollo





1.1.36. Bibliografa

Stein, J.R. (ed). 1973. Handbook of phycological methods. Culture methods and growth

measurement. Cambridge University Press, Cambridge, 448 pp.



PRCTICA No. 7

ANLISIS DE PIGMENTOS (clorofila a, b y c) EN MICROALGAS MARINAS

1.1.37. Introduccin

Uno de los mtodos para determinar la cantidad total de microalgas en un cultivo es

medir el contenido de clorofila (comnmente clorofila a). Para medir este pigmento en

microalgas existen diferentes mtodos: El ms usado es el espectrofotomtrico, sin embargo,

existen otros como los fluoromtricos y los cromatogrficos como cromatografa en capa fina

de alta resolucin y cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC). Otros ndices de

crecimiento, tales como acumulacin de carbn, nitrgeno, o algunos productos del

metabolismo celular tambin son usados en medidas de crecimiento.

1.1.38. Objetivo

Determinar clorofilas a, b, y c de muestras de microalgas, mediante el uso del mtodo

espectrofotomtrico, considerando las condiciones ambientales durante el muestreo, y el

protocolo de preservacin de las muestras, para cuantificar la muestra de microalgas del

cultivo, con una actitud crtica, analtica y responsable.

1.1.39. Material

Equipo de filtracin completo, filtros de fibra de vidrio GF/F y GF/C, desecador, bomba manual para hacer vacio, probetas graduadas, jeringas desechables, tubos tipo falcn de 15 mL para, celdas para, refrigerador, matraz volumtrico de 1 L o 500 mL, agua destilada, acetona grado reactivo o analtico.

1.1.39.1. Instrumental

Centrifuga, espectrofotmetro, balanza analtica, vortex

1.1.39.2. Reactivos

Acetona al 90% grado analtico, agua destilada.



1.1.40. Desarrollo

CUANTIFICACIN DE CLOROFILAS POR MTODO ESPECTROFOTOMTRICO

Cuando se trate de cultivos de microalgas, se recomienda que la cuantificacin de clorofilas se lleve a cabo utilizando biomasa fresca.

1.- Cuantificar la muestra de microalgas que se desea analizar

2.- Instale el equipo de filtracin y coloque un filtro de fibra de vidrio GF/F de 0.7 m y 25 mm de dimetro.

3.- Medir un volumen conocido de muestra (5-10 mL) y vaci esta sobre el filtro instalado en el equipo de filtracin.

4.- Inicie la filtracin con la ayuda de una bomba manual para hacer vacio.

5.- Colocar el filtro que contienen la muestra en tubos de centrifuga de 15 mL y agregue 8 mL de acetona al 90% y sonicar por 5 cinco minutos.

4.- Extraer el contenido pigmentario de las microalgas por 12 horas en oscuridad a 4 C, agitando despus de las primeras 8 horas para asegurar una mejor extraccin.

5.- Aforar a 10 mL los tubos que contienen el extracto y centrifugar a 1190 x g por 10 minutos.

6.- Decantar el sobrenadante de cada muestra en celdas de 10 cm y medir la absorbancia a las siguientes longitudes de onda: 664, 647 y 630 en celdas de vidrio en un espectrofotmetro.

7.- Corregir cada lectura restando el blanco de turbidez (750) de las absorbancias a 664, 647 y 630.

8.- Para calcular la cantidad de pigmentos en la muestra se utilizan las siguientes ecuaciones descritas por Jeffrey y Humphrey (1975).

Clorofila a = 11.85 E664 1.54 E647 0.08 E630

Clorofila b = 5.43 E664 +21.03 E647 2.66 E630

Clorofila c = 1.67 E664 7.60 E647 +24.52 E630

Donde E es la absorbancia corregida a esa longitud de onda.

La concentracin de pigmentos se expresa en unidades de g mL-1 si se usan celdas de 1 cm, por tanto:



Mg clorofila m-3 = C / 10

Donde es el volumen de acetona en mL (10 mL), es el volumen de agua de mar en litros y C es la cantidad de clorofila por mL. (nota: L L-1 = mg m-3).

1.1.41. Mtodo de evaluacin




1.1.42. Bibliografia

Jeffrey, S.W. and Humphrey, G.F. 1975. New spectrophotometric equations for

determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural

phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanzen, 167: 191-194.

Parson, T.R., Y. Maita and C.M. Lalli. 1985. A manual of chemical and biological

methods for seawater analysis. First edition. Ed. Pergamon press. Inc. New York. 173

pp.



PRCTICA No. 8

CULTIVO ESTTICO DEL ROTIFERO MARINO Brachionus plicatilis

1.1.43. Introduccin

Los rotferos son animales filtro-alimentadores microscpicos que se reproducen

sexualmente o asexualmente dependiendo de su ambiente. Bajo buenas condiciones

ambientales, las hembras producen huevos diploides los cuales se desarrollan en las hembras.

Cuando las condiciones son menos favorables, las hembras producen huevos haploides. Los

huevos los cuales no son fertilizados se convierten en machos. La reproduccin sexual

entonces ocurre produciendo huevos de resistencia diploides que son anlogos a los quistes

de Artemia. Dado que estos huevos no eclosionan inmediatamente, el cultivo usualmente

muere dentro de un cort tiempo.

Existen diferentes especies de rotferos tambin como diferentes lneas de las mismas

especies. Brachionus plicatilis es ampliamente usado debido a que este es plantnico y nada

lentamente, por lo tanto, es fcilmente capturado por larvas. Este tambin es tolerante a ser

cultivado en altas densidades (Tamaru et al. 1991b).

Diversos sistemas de cultivo han sido empleados para el cultivo de rotferos marinos

incluyendo el cultivo esttico. Este es un mtodo en el cual un cultivo es inoculado con

rotferos y se permite un periodo de crecimiento, despus del cual el volumen total es

cosechado. Este mtodo ha sido el ms confiable debido a su simplicidad tcnica. Sin

embargo, sin tener en cuenta el mtodo, se requieren de cuidados diarios en el mantenimiento

del cultivo para asegurar condiciones ptimas de cultivo.

1.1.44. Objetivo

Realizar cultivos separados de Brachionus plicatilis y Nannochloropsis sp., mediante la

aplicacin de los procedimientos de cuantificacin a los cultivos y la consideracin de las

variables ambientales del cultivo en un sistema esttico, para conocer el nmero de

organismos por unidad de volumen, con una actitud crtica, analtica y responsable.



1.1.45. Material

Frascos Erlenmeyer de 150 mL, frascos de 1 Litro, pipetas graduadas de 10 mL, papel

secante, tamiz de 70 micras, contador manual, cmara de conteo neubauer de 0.1 mm de

profundidad, cmara de conteo Sedgwick-Rafter, agua de mar filtrada a 1 micra, solucin de

lugol.

1.1.45.1. Instrumental

Microscopio compuesto, potencimetro, refractmetro, termmetro

1.1.45.2. Reactivos

Solucin de lugol, formaldehido al 4%

1.1.46. Desarrollo



Mantenimiento diario:

Factores abiticos, incluyendo temperatura, oxigeno disuelto, pH, concentracin de NH4+ y demanda qumica de oxigeno son factores que se monitorear diario para mantener condiciones optimas de cultivo.

Condiciones sugeridas para el cultivo:

Temperatura entre 25- 30 C pH 7 - 8

Salinidad 20 - 26 partes por mil Cloro 6 - 10 partes por mil








Tamaru, C. S., C.S. Lee, y H. Ako. 1991. Improving the larval rearing of stied mullet

(Mugil cephalus) by manipulating quantity and quality of the rotifer, Brachionus

plicatilis. In W. Fulks and L. Main (Eds.). Rotifer and microalgae system.

Proceedings of a U.S.-Asia Workshop, Juanary 28-31. Honolulu, Hawaii. pp. 89-104.

Anexo 1

Forma utilizada para el control de la produccin prctica del cultivo esttico de Brachionus plicatilis Nombre Fecha Hora Recipiente No Densidad

inicial de rotferos

(#/mL)

Produccin diaria de rotferos

#/da/mL

Cantidad de huevos presentes por hembra

Cantidad de machos presentes

Temperatura Salinidad pH



PRCTICA No. 9

CULTIVO SEMI-CONTINUO DEL ROTFERO MARINO Brachionus plicatilis

1.1.49. Introduccin

Para el cultivo de rotferos marinos, existen diferentes tcnicas reconocidas. Uno de los

primeros mtodos de cultivo fue el nombrado mtodo de transferencia diaria en tanques por

su creador Hachiro Hirata (1979), donde el crecimiento de rotferos en tanques con Chlorella

es continuamente transferido a tanques del mismo tamao con agua nueva despus de que la

mayora de las algas del tanque original era consumida. De acuerdo a Lubzens (1987), el

cultivo semi-continuo de rotferos emplea recipientes que varan de pocos cientos de litros a

200 m3. Por su parte Coves et al. (1990) describe el cultivo semi-continuo de Brachionus

plicatilis en tanques cilndricos de 0.5 a 2 m3. Comnmente la produccin de rotferos, en

sistemas semi-continuos es cosechada en un 30 % del volumen total del tanque. Sin embargo,

este sistema de cultivo es mucho ms susceptible a caerse que el mtodo de cultivo esttico

debido a que el periodo de cultivo es ms largo, y la calidad del agua disminuye con el

tiempo. Este requerimiento necesita ser monitoreado con mayor frecuencia para prevenir la

perdida de los cultivos. Asimismo, anlisis de la calidad del agua, densidad y tasa de

fertilidad son examinadas diario ya que el uso de levaduras para complementar la

alimentacin de los rotferos, provoca acumulacin de productos de desecho y contaminacin

bacteriana, los cuales son los principales problemas en este tipo de sistemas semi-continuos,

y por tanto los hacen menos confiables que los cultivos estticos. A pesar de estos problemas,

la produccin diaria de rotferos de manera semi-continua rene los requerimientos de

laboratorios comerciales que se dedican al cultivo de organismos acuticos.

1.1.50. Objetivo

Cultivar Brachionus plicatilis de manera semi-continuo, mediante los procedimientos

especificados en manuales para el cultivo semi-continuo de rotferos, y considerando los

factores abiticos crticos (pH, Temperatura), para asegurar la produccin del alimento



vivo para especies de importancia en la acuacultura, con una actitud crtica, propositiva y

responsable.

1.1.51. Material

Frascos Erlenmeyer de 1 L, pipetas graduadas de 10 mL, papel secante, tamiz de 70

micras, contador manual, cmara de conteo neubauer de 0.1 mm de profundidad, cmara

de conteo Sedgwick-Rafter, , agua de mar filtrada a 1 micra, solucin de lugol.

1.1.51.1 Instrumental

Microscopio compuesto, potencimetro, refractmetro, termmetro

1.1.51.2. Reactivos

Solucin de lugol, solucin de formaldehido al 4%.

1.1.52. Desarrollo

El sistema de cultivo semi-continuo se basa en el principio de que los rotferos se duplican en nmero cada 24 horas y la cantidad de alimento ptimo (dependiendo de la temperatura) usando Nannochloropsis sp es de 100 a 150 x 103 clulas/rotfero/da (Fushimi, 1989).

1.- Cuantificar la muestra de rotferos en una cmara de conteo Sedgwick-Rafter.

2.- Llenar el matraz Erlenmeyer a un cuarto de su volumen con agua de mar filtrada a 1 micra y pasada por radiacin ultravioleta.

3.- Aadir los rotferos en una densidad de 100 mL-1, aadir Nannochloropsis sp a razn de 100 a 150 x 103 clulas/rotfero/da e introducir aireacin.

4.- A las 24 horas (da 1) la poblacin de rotferos se habr duplicado. Como resultado, el volumen del agua es duplicado para diluir la densidad de rotferos y regresar a su densidad original. Usar agua de mar filtrada a 1 micra y pasada por UV y ajustar el alimento a la concentracin antes especificada

5.- En el da 2, llenar hasta un litro con agua de mar filtrada a 1 micra y pasada por UV y microalgas (Nannochloropsis sp) como se indico previamente.

6.- En el da 3 y 4, la mitad del volumen es cosechado a travs de tamiz de 70 micras. El matraz es entonces rellenado hasta 1 L con agua de mar y alimento.



7.- En el da 5, los matraces son completamente cosechados y la poblacin total de

rotferos es cuantificada. De nuevo, los matraces son limpiados y llenados a un cuarto de

volumen e inoculados con 100 rotferos mL-1 para repetir el ciclo.






Coves, D., P. Audineau and J. L. Nicolas. 1990. Rotifers rearing technology. In: G.

Barnabe (Ed.). Aquaculture. Volume 1. Ellis Horwood, New York. Pp. 232-245.

Fushimi, T. 1989. Systematizing large-scale culture methods. In: K. Fukusho and K.

Hirayama (Eds.). A live feed-the rotifer, Brachionus plicatilis. Koseisha-Koseikaku,

Tokio. pp. 118-134.

Hirata, H. 1979. Rotifer culture in Japan, Spec. Publ. Eur. Maricult. Soc. 4: 361-365.



Lubzens, E. 1987. Raising rotifers for use in aquaculture. Hidrobiology. 147: 245-255.



PRCTICA No. 10

MTODO DE DECAPSULACIN DE QUISTES DE Artemia PARA SER INCUBADOS

1.1.55. Introduccin

El valor de Artemia en aquacultura es debido a su reproduccin, desarrollo y fisiologa. La Artemia tiene dos modos de reproduccin: 1) ovovivparo, cuando los nauplios son incubados en el ovisaco y estos nacen vivos, y 2) ovparos, cuando los embriones en el estado gstrula de desarrollo son cubiertos por una capsula dura o quiste.

Los quistes deshidratados pueden ser almacenados por meses o aos sin prdida de su capacidad de incubacin. El quiste es de 200 a 300 micrones en dimetro, dependiendo de la lnea. Su capa externa est compuesta de corteza dura, color caf oscuro, y lipoproteinica. La prdida osmtica de agua, deshidratacin por aire, o por causa de anoxia, el embrin se enquista para entrar a un estado de diapausa o criptobiosis, durante el cual el organismo muestra poco o ningn signo de vida. El estado criptobiotico del quiste es extraordinario en su capacidad para resistir las condiciones ambientales extremas como completa desecacin, temperaturas sobre 100 C y cerca del cero absoluto, alta radiacin de energa y una variedad de solventes orgnicos (Cleeg, 1974). Este durable, incubacin en estado de diapausa hacen a los quistes de Artemia una conveniente, fuente accesible constante de animales vivos para los laboratorios que se dediquen al cultivo de peces y camarones penaeidos.

Hoy, existen distintas lneas geogrficas de Artemia. Ms de 50 han sido registradas de diferentes pases en todo el mundo. Existen diversos comercializadores y distribuidores, vendiendo marcas de diferente calidad. El costo de quistes de buena calidad puede variar de 26 a 66 dlares americanos o inclusive ms de este precio. Cada gramo de quiste podra producir de 200 a 300 x 103 nauplios. Es importante que los nauplios de Artemia sean cosechados y destinados como alimento para larvas de camarones penaeidos tan pronto como sea posible, despus de que hayan salido del quiste.

1.1.56. Objetivo

Obtener nauplios de Artemia, mediante el proceso de desenquistamiento, el cual

inicia con la hidratacin, desinfeccin e incubacin. Despus de 16 horas el alumno

identificar bajo el microscopio el primer estadio larval (instar I) con una actitud crtica,

proactiva y propositiva, con responsabilidad y orden.



1.1.57. Material

Quistes de Artemia (6 g), tamiz de 100-120 micras, frascos de 250 mL, frascos de 1.5

litros, pipetas de 10 mL, papel secante, agitadores magnticos, pizetas, agua destilada,

agua de mar filtrada a 1 micra, cloro al 5-6 %, cmara de conteo Sedgwick-Rafter.


Microscopio compuesto, planchas de agitacin, balanza.

1.1.58.2. Reactivos

Hidrxido de sodio, cido clorhdrico 0.1 N, solucin de formaldehido al 4%.

1.1.59. Desarrollo

El mtodo de decapsulacin con lleva los siguientes pasos: hidratacin de los quistes;

tratamiento con la solucin decapsulante; lavado y desactivacin de los restos de cloro

activo.

Hidratacin de los quistes

Una eliminacin completa del corion se puede lograr nicamente cuando los quistes

son esfricos; en la mayora de las cepas, la hidratacin completa en 1-2 horas en agua

dulce o salada a 25C (el tiempo de hidratacin se incrementa cuando disminuye la

temperatura y aumenta la salinidad). Se recomienda el uso de recipientes con fondo en

forma de embudo para la eclosin con el fin de conseguir un hinchamiento homogneo de

los quistes por medio de un burbujeo de aire desde el fondo del recipiente.

Tan pronto como los quistes estn hidratados, transferirlos a la solucin de

hipoclorito, ej. recoger los quistes sobre un tamiz de 125 micras, lavar eventualmente

para eliminar las impurezas y escurrir el exceso de agua. Una hidratacin excesivamente

prolongada antes de someter los quistes al tratamiento de hipoclorito parece afectar

drsticamente la tasa y la eficiencia de eclosin de los quistes. Los quistes hidratados que



no puedan ser tratados inmediatamente podran ser conservados durante algunas horas en

el refrigerador (04C).

El mtodo de decapsulacin es como sigue: Para 15 gramos de quistes

(preferentemente de la lnea San Francisco) la solucin decapsuladora que se necesita es:

71 ml de cloro comercial 2.25 g de Hidrxido de sodio

137 ml de agua de mar cido clorhdrico 0.1 N

1.- Pesar los quiste cuidadosamente.

2.- Poner hidrxido de sodio en 137 mL de agua de mar- permitir que se disuelva

3.- Hidratar los quistes en agua dulce en frascos de 1 litro por 1-2 horas.

4.- Poner los quistes hidratados en un tamiz de 120 micrones, lavar los quistes con agua

dulce por un tiempo de 1 minuto y dejar que se escurra el agua.

5.- Colocar los quistes en un frasco limpio y adicionar el cloro. Cuando se adiciona el

cloro la reaccin de decapsulacin inicia.

6.- Agitar lentamente al principio en una plancha magntica y aumente la velocidad de

agitacin tanto como sea posible evitando que salpique la solucin.

7.- Observe la solucin. Una capa blanca de espuma se desarrollar. La solucin

cambiar de caf a naranja. Esto tomar aproximadamente 6 minutos. Cuando no se

observe ms cambio de color, el proceso de decapsulacin ha sido completado.

8.- Colocar los quiste en el tamiz de 120 micrones

9.- Lavar de manera excesiva con agua dulce por 10 minutos. Esto es tedioso pero muy

importante, hasta que el olor a cloro no se detecte.

10.- Colocar los quistes dentro de un recipiente y ponerlos en suficiente acido clorhdrico

0.1 N para lavar los quiste, por no ms de 30 segundos. Esto neutraliza cualquier resto de

cloro.

11.- Poner los quistes en el tamiz de nuevo y lavar con agua dulce por 3 minutos.

12.- Los quiste estn ahora listos para incubacin en agua de mar agua.

13.- Incube los quistes durante toda la noche y coseche al siguiente da.










Stttrup, J.G. and Lesley A. McEvoy. 2003. Live feeds in marine aquaculture. Blackwell

publishing. 313 pp.

Treece, G.D. and M.E. Yates. 1988. Laboratory manual for the culture of Penaeid

Shrimp. Larvae. TAMU-SG-88-202. 95 pp.



PRCTICA No. 11

CULTIVO Y CUANTIFICACIN DE Artemia

1.1.62. Introduccin

A diferencia de otros crustceos, Artemia puede ser cultivada en altas o muy altas

densidades sin que su supervivencia se vea afectada. Dependiendo de la tcnica de cultivo

empleada, densidades de inoculo de hasta 5 x 103 larvas por litro son usadas en cultivos

estticos, 10 x 103 para cultivos con flujo cerrado y 18 x 103 para cultivos con flujo abierto

pueden ser mantenidos sin afectar el crecimiento y supervivencia. Densidades superiores a

las antes indicadas, las condiciones llegan a ser sub-ptimas (deterioro de la calidad del agua,

menor disponibilidad de alimento por individuo), y disminuye el crecimiento y

supervivencia. Adems, el costo del cultivo se incrementa con el aumento de la densidad de

Artemia. En un sistema de flujo abierto las densidades mximas estarn limitadas por la tasa

de alimentacin, mientras que, en sistemas de recirculacin y esttico, la preservacin de la

calidad de agua determinar un nivel de alimentacin seguro, lo cual a su vez determina la

densidad de organismos en el cual la cantidad de alimento por individuo todava permite una

tasa de crecimiento satisfactoria. Despus de realizar algunos ensayos con altas densidades

de animales, la densidad mxima puede ser identificada como la ms alta densidad posible

donde no ocurra inhibicin del crecimiento de Artemia.

1.1.63. Objetivo

Realizar cultivos estticos de Artemia, Isochrysis aff. galbana y Chaetoceros muelleri

mediante los procedimientos especificados en las practicas 1-4 de este manual, aplicando

los procedimientos de cuantificacin a los cultivos, y evaluar el efecto de variables

ambientales del cultivo de Artemia, para conocer la sobrevivencia de organismos por

unidad de volumen, con una actitud crtica, analtica y responsable.



1.1.64. Material

Nauplios de Artemia (de preferencia en Estadio II), tamiz de 100, 200, 300, 400 y 500

micras, frascos de 3 L, pipetas de 10 mL, papel secante, pizetas, cmara de conteo

Sedgwick-Rafter, contadores manuales, cmara de conteo Neubauer de 0.1 mm de

profundidad,


Microscopio compuesto, balanza.

1.1.65.2. Reactivos

Solucin de formaldehido al 4%, solucin de lugol, alcohol etilico 96, agua destilada,

agua de mar filtrada a 1 micra.

1.1.66. Desarrollo

Procedimiento para el cultivo:

Los nauplios obtenidos del proceso de dacapsulacin (apartado 1.1.59; prctica 10)

concentrarlos en un tamiz con apertura de malla de 100 micras y pasarlos a un recipiente

con un volumen de agua de mar de 3 L.

Cuantificar 1 mL de muestra tanto de cultivos de microalgas como de nauplios de

Artemia en cmaras de conteo Neubauer de 0.1 mm de profundidad y Sedgwick-Rafter

respectivamente bajo el microscopio compuesto

Recoger los nauplios y transferirlos a un recipiente de cultivo a razn de 15-20 X 103

nauplios por litro de cultivo.

Asegurarse de que la temperatura del agua para el cultivo est entre 25-30 C

Aadir el alimento a una densidad celular de 4.5 X 104 clulas mL-1 e introducir aireacin

suave



A las 24 horas (da 1), la poblacin de Artemia habr agotado el alimento, por lo cual se

requiere ajustar la concentracin de alimento.

De acuerdo al crecimiento que registran los organismos, se tienen que hacer ajustes

diarias incrementando la cantidad y frecuencia de alimento. El incremento se har en

funcin del estadio de crecimiento de los nauplios.

Se recomienda remover diario los desechos de alimento del recipiente de cultivo y lavar

lneas de aireacin antes de incorporar el nuevo suministro de alimento.

A partir del 4 da renovar totalmente el agua de cultivo y usar un tamiz con malla de 200

micras.

Conforme los organismos van creciendo, es necesario el uso de mallas de mayor micraje

(250, 300, 400 Y 500 m respectivamente). Una manera de verificar el uso de diferentes

tamices con distinta apertura de malla es verificando el tamao de la Artemia, o

introducir el tamiz, en el medio de cultivo hasta la altura de la malla y verificar si pasan

las larvas.

Controlar diario los niveles de oxgeno disuelto para verificar la necesidad de incrementar

las tasas de aireacin en el recipiente de cultivo.

Verificar la salud de los animales por su actividad natatoria. Tomar unos cuantos

animales y colocarlos en un recipiente de vidrio y ponerlo cerca de la luz, los animales se

concentrarn en un punto (el efecto conocido como crowding). Tambin es

recomendable hacer observaciones microscpicas del tracto digestivo (que deber estar

siempre lleno de alimento), los toracpodos y la zona de la boca debern estar limpios, si

aparecen cubiertos por aglomerados de alimento, los animales estarn pasando hambre:

ello puede ser debido a la naturaleza del alimento o al estado fisiolgico de los animales.

cuantificar la biomasa, y cosechar el cultivo.










Stttrup, J.G. and Lesley A. McEvoy. 2003. Live feeds in marine aquaculture. Blackwell

publishing. 313 pp.





PRCTICA No. 12

HISTORIA DE VIDA E IDENTIFICACIN DE ESTADIOS DE DESARROLLO DE Artemia

1.1.69. Introduccin

La historia de vida y caractersticas reproductivas de lneas de Artemia son factores

importantes que deben ser tomados en cuenta cuando se introduce un nuevo organismo a una

nueva localidad geogrfica., especialmente cuando se espera que exista una competencia con

las lneas locales. Estas capacidades competitivas estn relacionadas a factores tales como la

duracin de periodo reproductivo, pre-reproductivo y post-reproductivo, tiempo de vida,

nmero de cras por camada , animales por hembra, etc. En general nuevas poblaciones

citogenticas tienen un gran nmero de cras por camada, un gran nmero de cras por

hembra por da y un rpido desarrollo para madurez sexual. Estas son todas las caractersticas

favorables comparadas con aquellas poblaciones citogenticas y Artemia partenogenticas.

Por otra parte, la edad en la primera reproduccin tambin es un factor clave que determina

la tasa de crecimiento poblacional, y la tasa de colonizacin de un nuevo ambiente con fuente

de nutrientes limitados. En consecuencia, si factores ambientales y nutricionales no

interfieren, un nuevo mundo de especies citogenticas generalmente desplazaran lneas

partenogenticas. Entonces, experimentos de introduccin de nuevas lneas en hbitats

naturales requiere por lo tanto de un control previo de lneas y de poblaciones locales nativas,

como tambin el estudio de condiciones ambientales prevalecientes.

1.1.70. Objetivo

Realizar un cultivo esttico de Artemia para observar los diferentes estadios de la historia

de vida de estos organismos, con el propsito de que alumno identifique la diferenciacin

estructural, tiempo entre estadios y el tiempo de primera madurez sexual Artemia, fertilidad,

y su uso como alimento vivo para distintas especies en la industria de la acuacultura, con una

actitud crtica, analtica y responsable.



1.1.71. Material

Nauplios de Artemia (de preferencia en Estadio II), tamiz de 100, 200, 300, 400 y 500

micras, frascos de 3 L, pipetas de 10 mL, papel secante, pizetas, cmara de conteo

Sedgwick-Rafter, contadores manuales, cmara de conteo Neubauer de 0.1 mm de

profundidad,


Microscopio compuesto.

1.1.72.2. Reactivos

Solucin de formaldehido al 4%, solucin de lugol, alcohol etlico 96, agua destilada,

agua de mar filtrada a 1 micra.

1.1.73. Desarrollo

Desarrollo larval:

Observar y documentar el inicio del desarrollo larval desde el momento en que organismo rompe el corin para iniciar su vida libre.

Observar y documentar el desarrollo larval para identificar las etapas de emergencia E-1, E-2 y H:

E-1, es el primer estadio de emergencia, en el que la regin de la cabeza emerge del corin, el organismo permanece dentro de una doble membrana.

E-2, es el segundo estadio de emergencia, en el que el nauplio ha emergido totalmente del corin, pero todava permanece dentro de una sola membrana.

H, es cuando la larva se libera de la membrana y el nauplio inicia su nado libre. Este proceso se conoce como desenquistamiento.



A partir de este momento el alumno realizar observaciones y registros que describan el desarrollo de Artemia.

Fase I (Instar I).- Nauplio recin eclosionado mide entre 450-550 m de acuerdo a la lnea u origen. Esta fase tiene una duracin de 20 horas a temperatura de 20 C y termina con la primera muda.

Fase II.- La longitud de la Artemia continua en aumento y su coloracin anaranjada cambia. Esta fase tiene una duracin de 10 horas y termina con la segunda muda.

Fase III (Instar II).- El organismo registra una longitud aproximada de 0.6 mm. Inicia su alimentacin exgena y este estadio de crecimiento dura 40 horas y termina con la tercera muda.

Instar III.- El organismo registra una longitud aproximada de 0.9 mm, con una marcada elongacin del apndice en forma de abanico.

Instar IV.- La longitud promedio en este estadio es de 1.2 mm y aparace el falbelum en los site pares de toracpodos y en los cinco primeros.

Instar V.- La longitud promedio en este estadio es de 1.4 mm. Los ojos compuestos aparacen completamente pigmentados.

Instar VI.- La longitud promedio en este estadio es de 1.6 mm. En esta fase aparecen definidos todos los apendices natatorios.

Instar VII.- Inicia el desarrollo de las papilas genitales en las hembra y machos. La talla promedio en esta fase es de 2.0 mm.

Instar VIII.- El tamao promedio de esta fase es de 2.4 mm y en ambos sexos las antenas dejan de formar un ngulo recto con el eje longitudinal del cuerpo.

Instar IX.- Se observa un aumento de tamao en las antenas del macho. Las hembras permanecen sin cambio notables. La longitud promedio es de 3.4 mm.

Instar X.- La longitud promedio es esta fase es de 4.7 mm, con un aumento en el tamao de las antenas.

Instar XI.- La longitud promedio es esta fase es de 5.2 mm. La protuberancias frontales se han desarrollado al mximo.

Instar XII.- Inicia la formacin de parejas y el tamao promedio es de 6.4 mm.

En las fases subsecuentes, el nico cambio notable de los organismos es el aumento en el tamao hasta registrar tallas de 9.5 a 10 mm y la diferenciacin sexual de caracteres externos es bastante notable









Aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper. No. 361. Rome, FAO. 295 pp

. Stttrup, J.G. and Lesley A. McEvoy. 2003. Live feeds in marine aquaculture.

Blackwell publishing. 313 pp.



Universidad Autnoma de Baja California. Facultad de Ciencias Marinas. 1987.

Memorias del curso de titulacin "Cultivo de Artemia". Ensenada, Baja California.

290 pp.

Manual de Prcticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo Anexos Pgina 53


Anexos

Normas Generales de Seguridad e Higiene 1. El uso de bata es obligatorio.

2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de seguridad disponibles.

3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una evacuacin por fuego o por cualquier otro incidente, as como conocer la localizacin exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.

4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se est en el laboratorio.

5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las salpicaduras de productos qumicos o sus vapores pueden pasar detrs de las lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad cerradas.

6. S un producto qumico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupcin. Acta siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presin de agua de un grifo directamente al ojo porque podras lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide asistencia mdica.

7. 7. El uso de bata (preferentemente de algodn) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos qumicos son inevitables.

8. 8. As mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.

9. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos qumicos.

10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservacin de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios.

11. Lavarse siempre las manos despus de hacer cualquier anlisis y antes de salir del laboratorio.

12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.

13. Est prohibido fumar en el laboratorio por razones higinicas y de seguridad.

Manual de Prcticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo Anexos Pgina 54


14. No inhales, pruebes o huelas productos qumicos si no ests debidamente informado.

15. Cerrar hermticamente los frascos de productos qumicos despus de utilizarlos.

16. Para pipetear los lquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no absorber directamente con la boca.

17. Cuando caliente tubos de ensaye hgalo siempre en la parte superior del lquido y con agitacin suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia ninguna persona.

18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del laboratorio. S tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben ser siempre transportadas cogindolas por el fondo, nunca por la boca de la botella.

19. El rea de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, productos qumicos vertidos.

20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc.

21. No se puede hacer ningn experimento no autorizado.

22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.

23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes.

24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado de uso.

25. Todos los productos qumicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo con las H

manual de laboratorio cultivos de apoyo 2013

Documents