UNAM  FE S  CUAUT ITLÁN

M I C RO B I O LO G Í A   FA RMAC É U T I C A

MANUAL  DE  PRÁCT I CAS  

ALUMNO : _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _

G RU PO _ _ _ _ _ _ _ _

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

REGLAMENTO GENERAL

PARA LOS LABORATORIOS

CODIGO: DOC-CB-DEX-

01-00

No de REVISIÓN: 0

1) Este reglamento aplicará para personal académico, alumnos y laboratoristas.

2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deberá utilizarse bata blanca con manga

larga.

3) La tolerancia para el inicio de la sesión de laboratorio será hasta de 10 minutos a

partir de la hora señalada.

4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las

prácticas.

5) En todo momento deberá mostrarse una conducta adecuada en el área de trabajo.

6) Queda prohibido en los laboratorios:

a) Tirar basura fuera del cesto.

b) Ingerir alimentos y/o bebidas.

c) Fumar.

d) Recibir visitas.

e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos.

f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios.

g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesión experimental.

h) Sentarse sobre las mesas de trabajo.

i) Mover el mobiliario de su lugar.

j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura.

7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal

fin, entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos

o mezclas de ellos que en cualquier estado físico representan un riesgo para el

ambiente, la salud o los recursos naturales, por sus características corrosivas,

reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o biológico-infecciosas (Art. 3º de la Ley

General del Equilibrio y Protección del Ambiente).

8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de teléfonos celulares, reproductores de

sonido o cualquier medio electrónico de entretenimiento. El uso de las

computadoras portátiles queda restringido a temáticas relacionadas con la

asignatura.

9) El acceso al laboratorio se permitirá únicamente cuando esté presente un profesor.

10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deberá programarse con el

profesor responsable en un horario que no interfiera con aquel destinado para el

desarrollo de las prácticas.

11) Para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene

debidamente el vale de material (FPE-CB-DEX-01-09) y lo entregue a la persona

responsable, dejando como depósito la credencial vigente de la UNAM.

12) El alumno deberá revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando

cualquier anomalía (faltante o material dañado) y será devuelto en las condiciones

en que se recibió, de no hacerlo, se hará acreedor a las sanciones establecidas en

cada laboratorio.

13) Es obligación de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el

laboratorio.

Práctica No. 1

CONTROL DE CALIDAD  Y NORMAS DE BIOSEGURIDAD 

1 INTRODUCCIÓN

El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la confiabilidad de la información que proporciona el laboratorio sobre los productos que examina o produce.

El objetivo de cumplir con este parámetro es obtener la calidad óptima en todos los procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo posible.

Es necesario iniciar el desarrollo de un diseño general del Laboratorio, en donde la planificación, la remodelación o la ampliación deben estar a cargo de un Comité en el que participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros profesionales del mismo.

El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios específicos, programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal previsto. Como áreas secundarias se consideran corredores, salas de máquinas, escaleras, etc.

La industria farmacéutica establece un conjunto de actividades necesarias para asegurar que los productos terminados cumplan con la calidad requerida debido a que los medicamentos tienen la finalidad de dar un beneficio al individuo que lo consuma que es la salud. Para que un medicamento pueda llegar al consumidor tiene que pasar por varias actividades de calidad lo que garantiza que durante el proceso de fabricación, acondicionamiento y distribución mantiene la identidad, pureza, concentración, potencia e inocuidad requeridos para su empleo, que no se encuentren contaminados o alterados y no representen un riesgo para la salud

El aseguramiento de la calidad es la recopilación de la experiencia en el manejo de la calidad, que se ha normalizado internacionalmente. Es necesario conocer dos documentos normativos que son básicos para el correcto desempeño de este sistema: Good Manufacturing Practices (GMP) o Buenas Prácticas de Manufactura y la Norma ISO 9000

1.1 GMP’S O BUENAS PRÁCTICAS DE MANUFACTURA

En la producción de fármacos es necesario tener extremo cuidado, siguiendo los principios normativos de las GMP’s, independientemente si los productos van a ser estériles o no.

Este sistema de GMP’s fue elaborado en los Estados Unidos por la agencia de Salud: Federal Drugs Administration (FDA por sus siglas en inglés) por medio del Código Federal de Regulaciones (CFR) y se encuentra en el Registro Federal por los departamentos ejecutivos y agencias del gobierno federal estadounidense. La cual está dividida en 50 títulos y cada uno está dividido en partes y subpartes. La parte aplicada a la industria farmacéutica es la 211, subpartes B a la K.

Los laboratorios de la Industria Farmacéutica controlan la calidad microbiológica de las materias primas, la eficacia de los procesos de tratamiento, los puntos críticos de la producción y la calidad del producto final, por ende las BMP’s tienen como objetivo la implantación de programas de calidad en las actividades que realizan ya que los resultados incorrectos pueden tener una gran repercusión económica y sobre la salud pública.

1.2 NORMAS ISO (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION)

Son una serie de estándares (conocidas en EE.UU. como series ANSI/ASQC Q90-Q94). Primariamente percibido para ayudar a armonizar un gran número de estándares nacionales e internacionales, integrado por una delegación mundial conocida como ISO/Technical Comité 176, conformada por las siguientes agencias AFNOR (Association Francaise de Normalisation), ANSI (American National Standard Institute), BSI (British Standard Institute), NNI (Nederlans Normalisate Institut) y SSC (Standard Council of Canada), entre otras.

La serie ISO 9000 consiste de 5 documentos: tres son básicos de los modelos de aseguramiento de la calidad: 9001, 9002 y 9003; y dos soportan documentos guías: 9000 y 9004. El título claramente indica su propósito:

1.2.1 ISO 9000. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y NORMAS DE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD. Guía para selección y uso.

1.2.2 ISO 9001. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad en diseño, producción, instalación y servicio.

1.2.3 ISO 9002. SISTEMA DE CALIDAD. Modelo para el aseguramiento de calidad aplicable a la fabricación e instalación.

1.2.4 ISO 9003. SISTEMAS DE CALIDAD. Modelo para aseguramiento de calidad en inspección final y prueba.

1.2.5 ISO 9004. ADMINISTRACION DE LA CALIDAD Y ELEMENTOS DE LOS SITEMAS DE CALIDAD-GUIAS.

1.2.6 CONTROL DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA El Control de Calidad es uno de los instrumentos que se utilizan para evaluar la confiabilidad de la información que proporciona el laboratorio sobre los productos que examina o produce.

El objetivo de cumplir con este parámetro es obtener la calidad óptima en todos los procesos, para que se obtengan resultados confiables y oportunos al menor costo posible.

Es necesario iniciar el desarrollo de un diseño general del Laboratorio, en donde la planificación, la remodelación o la ampliación deben estar a cargo de un Comité en el que participen obligatoriamente el arquitecto del proyecto, el director del Laboratorio y otros profesionales del mismo.

El espacio del Laboratorio se determina de acuerdo a los servicios específicos, programas, tipo y volumen de trabajo, equipos necesarios y el cuadro de personal previsto. Como áreas secundarias se consideran corredores, salas de máquinas, escaleras, etc.

El Laboratorio debe disponer de:

• Instalaciones con capacidad de producción de servicios conforme a las necesidades (volumen, calidad y oportunidad).

• Elementos para la protección del personal, de las instalaciones y del equipo • Medios para el control de la emisión de contaminantes al medio ambiente. • Costos de operación razonables para su funcionamiento

1.2.7 Requerimientos básicos de un laboratorio

1.2.8 Ubicación y construcción. La ubicación del Laboratorio de Microbiología debe ubicarse lejos de áreas o instalaciones que puedan interferir en el resultado de los análisis o permitir por su proximidad contaminaciones químicas o biológicas. Las áreas de apoyo (lavado de material y esterilización) deben estar cerca del área analítica para facilitar el flujo de operación.

El área de preparación de muestras debe estar aislada para evitar contaminaciones cruzadas que pueden tener efecto sobre la integridad de la muestra y por consiguiente sobre el resultado del análisis

En cuanto a las características de construcción del Laboratorio, se deben emplear materiales de construcción no inflamables, resistentes a la corrosión y de fácil limpieza, de superficies lisas para disminuir la posibilidad de acumulación de desechos o microorganismos.

Los techos, paredes y suelos deben ser lisos y fáciles de lavar, impermeables a los líquidos y resistentes a la acción de las sustancias químicas, solventes y productos desinfectantes utilizados de ordinario en el laboratorio.

El color de los techos y paredes debe ser de tonos claros mate que permitan una difusión homogénea de la luz, evitando reflejos perjudiciales. No debe emplearse pintura iónica para evitar la disolución de moléculas gaseosas en el ambiente

Las puertas y ventanas pueden ser de madera o metálicas y deben abrir hacia afuera, las metálicas son las más empleadas por su calidad y resistencia. Las más utilizadas son las de aluminio por no requerir pintura y por mantener su apariencia permeable.

Si el laboratorio tiene aire acondicionado; las ventanas deberán ser fijas de cierre absoluto y tener como única misión el permitir la entrada de la luz natural

1.2.9 Instalaciones Eléctricas En cuanto a las instalaciones eléctricas se debe contar con un suministro de energía eléctrica suficiente, estable, libre de fluctuaciones y aislada convenientemente. La carga eléctrica se debe determinar tomando en cuenta los aparatos eléctricos y electrónicos de que dispone el laboratorio; las líneas de distribución de corriente deben de estar diseñadas para alimentar los equipos en cada área sin sufrir sobrecarga. El voltaje se estabiliza, por medio de un regulador central con líneas de distribución de corriente estabilizada para las áreas que lo requieren, o por unidad, con un regulador de voltaje para cada aparato.

1.2.10 Tuberías Es conveniente señalar o pintar con colores reglamentarios las tuberías.

• La instalación de gas, se pueden utilizar gas natural o licuado. Se debe construir en tubería de cobre asegurando la total ausencia de fugas en las juntas y debe de llevar el color reglamentado que es amarillo.

• Las instalaciones de aire comprimido, ésta es una disposición como servicio común en los laboratorios, se prefiere situarlo a través de una red que puede ser construida en tubería de hierro o cobre, operada a presión del orden de 5 Kg/cm2

alimentado por un compresor localizado en la sala de máquinas, y la tubería debe de ser de color azul.

• Las condiciones ambientales en el laboratorio se deben prestar atención a los niveles de iluminación, de ventilación, de temperatura y de humedad para el bienestar de los trabajadores, así como el control de vibraciones y ruidos que puedan afectar considerablemente las operaciones analíticas.

1.2.11 Aire. El aire de los recintos recargados por gases de combustión, placas calientes, así como emanaciones de productos químicos o ácidos exigen una renovación periódica del ambiente. La ventilación puede llevarse a cabo en forma natural o por medio de sistemas mecánicos; se recomienda una renovación del aire de 6 a 10 veces por hora para mantener el ambiente inocuo y cómodo. Es aconsejable prever una instalación mecánica de ventilación que introduzca aire del exterior y expulse el aire viciado sin recirculación; el aire del recinto debe estar libre de polvo y microorganismos, la velocidad de entrada y salida se debe mantener baja y no debe provocar corrientes. La calidad del aire se debe controlar periódicamente a nivel microbiológico (Ver Práctica 2)

1.2.12 Temperatura La temperatura ambiente deberá mantenerse entre 20 y 23 °C y la humedad relativa del aire debe ser aproximadamente de 50% con una tolerancia del 5% ya que valores fuera de estos límites pueden deteriorar los medios de cultivo y producir errores en algunas pruebas de laboratorio. Deben contar con aire acondicionado y no se debe apagar al finalizar las horas de trabajo ni durante los fines de semana, ya que las operaciones se ven seriamente afectadas por las variaciones bruscas de temperatura ambiente.

1.2.13 Limpieza La limpieza se debe hacer diariamente en todas las áreas, después de la jornada de trabajo. Se ha demostrado que 90% de la posible contaminación del aire y otras fuentes se depositan en las superficies horizontales. La contaminación microbiana proviene directa o indirectamente de las personas, del aire de ventilación o del ambiente exterior, de las superficies, de los equipos y materiales. El objetivo principal de la limpieza es eliminar la contaminación microbiana y la suciedad de las superficies; para lo cual, se debe restregar o friccionar lo suficiente.

Al igual que los productos, los métodos de limpieza pasan por una fase de desarrollo para asegurar que son eficaces para usarse en la producción. Deben desarrollarse PNO (Procedimiento Normal de Operación) de limpieza, y el personal debe seguirlos con diligencia. El uso de un protocolo de limpieza puede ayudar a rastrear cambios en el proceso de limpieza. Las operaciones de limpieza, las observaciones, los cambios en el procedimiento, los resultados de pruebas y las recomendaciones pueden documentarse en esos protocolos

1.2.14 Campanas de flujo laminar En las campanas de flujo laminar se debe verificar a intervalos mensuales la velocidad del flujo de aire requerido midiendo la presión a ambos lados de los filtros; estos se deben reemplazar cada 6 meses.

1.2.15 Autoclaves Es una cámara de presión que se usa para esterilizar utensilios, material de laboratorio, medios de cultivo, cepas microbianas, etc. Debe ser considerado potencialmente peligroso, cuando el aire ha sido expulsado y la cámara se ha llenado con vapor saturado, existe una relación entre la temperatura y la presión. Se debe verificar el correcto estado de la válvula de seguridad, cuando comienza a salir el vapor de la espita por lo cual el equipo debe:

• Ser confiable • Ser seguro (temperaturas de +/- 1.0 °C) • Dar un tiempo se respuesta • Las pruebas de distribución del calor deben ser conducidas con el número

adecuado de termopares. • Las pruebas se deben hacer con esporas biológicas.

1.3 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA

Los fundamentos de seguridad son constantes y una vez que han sido aprendidos gobiernan, en cierta forma, automáticamente los actos del trabajador cuidadoso. Todos los establecimientos de enseñanza deben incluir en sus programas de formación un programa específico de entrenamiento en métodos de seguridad. Un defecto y que conduce con más frecuencia a los accidentes de laboratorio es el intento de obtener resultados con demasiadas prisas. Ningún Laboratorio debería de carecer de un código de reglas y medidas de seguridad.

1.3.1 Bioseguridad La seguridad en el manejo de los objetos del laboratorio así como de la protección del personal es un componente esencial en la práctica moderna del Laboratorio. La Bioseguridad del Laboratorio incumbe a todo el personal; por tanto, cada empleado debe comunicar a sus superiores cualquier acto o condición que atente contra ella. Se deben realizar algunas actividades como:

• Redactar un manual de Bioseguridad y de operaciones en el que se identifiquen los riesgos reales o potenciales y se indiquen las prácticas o procedimientos adecuados para reducir al mínimo o eliminar tales riesgos especiales.

• Cerciorarse de que todos los miembros del personal han recibido la instrucción necesaria acerca de los riesgos de infección.

• Estar seguro de que se apliquen métodos de descontaminación en caso de derrame, o ruptura de recipientes de material contaminado.

1.3.2 Criterios del Nivel de Bioseguridad de los laboratorios Conjunto de normas que han de cumplir los laboratorios en los que se manipulan microorganismos infecciosos, muestras de tejidos humanos o animales de laboratorio. Definen las combinaciones de: equipos de protección (barreras primarias), instalaciones del laboratorio (barreras secundarias) y de contención del edificio (barreras terciarias), más adecuadas para la manipulación de los agentes biológicos de riesgo.

Se definen 4 niveles de bioseguridad:

Nivel 1- Manipulación de agentes que no producen enfermedad en adultos sanos.

Agentes biológicos bien caracterizados no causantes de enfermedades en adultos y con un riesgo mínimo para el personal del laboratorio y el medio ambiente

Nivel 2- Agentes patógenos en el hombre (riesgo = daño percutáneo, ingestión, mucosas).

Agentes biológicos del grupo 2 : aquel que puede causar una enfermedad en el ser humano y puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz.

Nivel 3- Agentes patógenos con potencial de transmisión por aerosol.

Agentes biológicos del grupo 3. aquel que puede causar una enfermedad grave en el ser humano y presenta un serio peligro para los trabajadores con riesgo de que se propague a la colectividad y existiendo generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz

Nivel 4- Agentes peligrosos o patógenos con un alto riesgo de enfermedad, con transmisión por aerosol o por medios desconocidos.

Agentes biológicos del grupo 4. Aquel que causando una enfermedad grave en el ser humano supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista una profilaxis o tratamiento eficaz.

Existe toda una gama de equipos de protección indicados según sea el nivel de bioseguridad del laboratorio.

1.3.3 Saneamiento del medio Existen reglas importantes que debe seguirse:

• Mantener ordenado y en buen estado de higiene el conjunto de los locales. • Tener suficientes cubos para basura de un modelo aprobado (con tapa). • Mantener todos los lugares cerrados, de manera que puedan entrar en ellos

roedores, insectos y otras plagas. • Disponer de agua potable. • Disponer de lavados apropiados, mantenidos en buenas condiciones de

higiene. • Destinar el espacio suficiente para que el personal pueda comer. • Deben existir vestidores separados para hombres y mujeres, con armarios

separados para ropa de calle y para ropa de protección.

1.3.4 REGLAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA FARMACEUTICA

• Los miembros del personal se deben lavar las manos después de haber manipulado

• No permitir pipetear con la boca. • Prohibir al personal comer, beber o fumar en la zona de trabajo del

Laboratorio. • No aplicarse cosméticos. • No guardar comida, ni bebidas en los refrigeradores del Laboratorio. • Se debe mantener el Laboratorio limpio y aseado. Las superficies de trabajo de

descontaminarán al menos una vez al día, e inmediatamente en caso de derrame de sustancias potencialmente peligrosas.

• Es necesario que todos los procedimientos técnicos se practiquen de manera que se evite la posible formación de aerosoles.

• En el Laboratorio es necesario utilizar batas, uniformes u otras prendas apropiadas; no se debe llevar ropa de laboratorio fuera de éste y se requiere desinfectar las prendas contaminadas, mediante procedimientos apropiados.

• Autorizar el paso a la persona de trabajo del Laboratorio, sólo a las personas que hayan sido informadas sobre los posibles riesgos y que satisfagan

cualquier requisito que se exija para entrar; durante el trabajo se deben mantener cerradas las puertas del Laboratorio. Sólo tendrán acceso las personas autorizadas.

• No permitir la entrada a niños en las zonas de trabajo del Laboratorio, • No permitir la entrada de animales que no tengan relación con los trabajos que

se estén realizando. • Utilizar guantes en todos los trabajos que entrañen un posible contacto

accidental con material infeccioso. Los guantes se deben quitar asépticamente y esterilizar en autoclave con otros desechos de laboratorio antes de proceder a su eliminación.

1.3.5 Colores de Seguridad En un laboratorio las indicaciones de seguridad deben ser tomadas de forma seria, y el personal debe estar capacitado para saber qué es lo que se está indicando en cada momento. Para hacer más fácil el entendimiento y lograr que todas las medidas de seguridad sean llevadas a cabo se han establecido colores de tono llamativo para usarse en diferentes tipos de señalización. La tabla siguiente hacer referencia a cada uno de los casos.

Rojo

Amarillo

Verde

Azul

1.3.6 Colores de seguridad para tuberías

Rojo

Amarillo

Verde

1.3.7 Modelo de Rombo para sustancias usadas en un laboratorio El esquema del sistema debe ser un rombo, cuya diagonal mayor debe ser perpendicular al plano horizontal.

El rombo se debe dividir en cuatro secciones, como lo muestra la figura 1; con el siguiente orden y color de fondo:

I. Riesgo a la salud, en color azul

II. Riesgo de inflamabilidad, en color rojo

III. Riesgo de reactividad, en color amarillo

IV. Riesgos especiales, en color blanco

Figura 1 Modelo de rombo de seguridad

Para identificar los riesgos especiales se debe:

• Usar las letras OXI para indicar la presencia de una sustancia oxidante; • Usar el símbolo W para indicar que una sustancia puede tener una reacción

peligrosa al entrar en contacto con el agua; • Opcionalmente usar las letras o símbolos del equipo de protección personal.

1.3.8 CRITERIOS DE CLASIFICACION DE GRADOS DE RIESGO A LA SALUD (MODELO ROMBO)

1.4 OBJETIVO GENERAL

• Conocer las Normas Oficiales Mexicanas (NOM’s) que se aplican en el Laboratorio de Microbiología Farmacéutica mediante el control de calidad para evitar riesgos y garantizar la integridad del personal y de las instalaciones.

1.5 OBJETIVOS PARTICULARES

• Identificar los puntos críticos que puedan ser fuente de contaminación en el Laboratorio de Microbiología Farmacéutica de la FESC, que puedan interferir en los resultados mediante la elaboración de productos farmacéuticos.

• Designar la clasificación de los reactivos y materias primas de acuerdo a lo establecido en la Norma Oficial Mexicana 018 del Código SIMAR

• Proponer la construcción de un Laboratorio de Microbiología Farmacéutica, de acuerdo al diseño estipulado en las NOM’s.

1.6 ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE

1.6.1 Realizar la clasificación de los siguientes reactivos con el modelo del rombo.

a) Hidróxido de Potasio

b) Peróxido de Hidrógeno

c) Cloruro de sodio

d) Cristal Violeta

e) Lugol

f) Safranina

g) Alcohol 90%

h) Acetona

1.6.2 Ubicar la tubería del Laboratorio de Microbiología y de acuerdo a los fluidos que conducen dichas tuberías realizar un reporte de acuerdo a lo establecido en la NOM-026-STPS1-19941.

1.6.3 Realizar una inspección en el Laboratorio de Microbiología y establecer si cumple con las normas de seguridad en cuanto a los señalamientos de prohibición, obligación, precaución, de equipo contra incendio, salidas de emergencia y primeros auxilios de acuerdo a la NOM-026-STPS1-19941.

1.6.4 Determinar el equipo de protección personal que se necesita en el Laboratorio de Microbiología de la FES Cuautitlán.

1.6.5 Realizar una inspección y evaluar si el Laboratorio de Microbiología cumple con los requerimientos de construcción establecido por las NOM’s.

1 El alumno debe investigar NOM-026-STPS1-1994

1.7 RESULTADOS

1.7.1 Modelo de Rombo

1.7.2 Tuberias

1.7.3 Señalamientos

1.7.4 Equipo de protección personal

1.7.5 Actividad Extra:

Indica en la tabla el nivel de Bioseguridad del Microorganismo descrito.

Microorganismo Nivel de 

Bioseguridad 

B. subtilis    Clostridium botulinum    Candida albicans    E. Coli    S. Typhi    Virus del Ébola    Virus de la Fiebre de Lassa    B. antracis    Virus Hepatitis C    Virus de HIV    

1.8 OBSERVACIONES ADICIONALES _______________________________________________________________________________

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1.9 CONCLUSIONES _______________________________________________________________________________

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1.10 BIBLIOGRAFÍA

• ÁLVAREZ, Ma. del Rocío. Tesis “Manual de Introducción al Control de Calidad en el Laboratorio de Microbiología”. Universidad Femenina de México. Escuela de Q.F.B. 2001

• CFR, Parte 211. “Current Good Manufacturing Practice For Finished Pharmaceuticals”. FDA, EE.UU, 1992

• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-017-STPS-2000. Equipo de Protección Personal.

• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-018-STPS-2000. Sistema para la identificación y Comunicación de Peligros y Riesgos por Sustancias Químicas Peligrosas en los Centros de Trabajo.

• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-026-STPS1-1998. Colores de Seguridad e Higiene.

• NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-059-SSA1-1993. Buenas Prácticas de Fabricación para establecimientos de la Industria Químico-Farmacéutica dedicados a la Fabricación de Medicamentos

1.11 Referencias Electrónicas

• www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/biosfty.htm

Práctica No. 2

                        MONITOREO AMBIENTAL 

2.1 INTRODUCCION Las condiciones del medio ambiente, en las diferentes áreas de producción y del Laboratorio de Microbiología, tienen un impacto en la calidad de los productos y de las pruebas que se realizan. Debido a que el aire, la infraestructura, los equipos y el mismo personal pueden volverse fuentes de contaminación, es necesario crear un Programa de Monitoreo Ambiental que permita mantener los diferentes contaminantes ambientales dentro de los límites máximos permitidos, que marca la NOM-059, con el fin de que dichos laboratorios operen adecuadamente. Podemos definir el monitoreo ambiental como la medición u observación programada que debe realizarse en los diversos puntos de un área ya que son elementos esenciales de un programa de control que proporciona datos para identificar los factores que contribuyen en los procesos de contaminación y una vez identificado el problema instituir medidas apropiadas y evaluar su eficacia. En el laboratorio de Microbiología, la vigilancia ambiental microbiológica del área tendrá en cuenta la efectividad de la limpieza y sanitización de las superficies, así como la eficacia de la filtración en los sistemas de aire, y la asepsia del personal. Se efectúa la medición de contaminantes biológicos en tres fases:

• Captación • Cultivo • Análisis

  2.1.1 MUESTREO AMBIENTAL La física de captación de partículas suspendidas en el aire y los principios generales para una buena recogida de muestras son aplicables a todo tipo de materia con independencia de si es de origen bilógico o no. Los diferentes métodos de recogida de muestras de contaminantes biológicos, se basan en pasar un determinado volumen de aire sobre un soporte de retención del contaminante por medio de un sistema de aspiración.

El soporte debe impedir la destrucción de los microorganismos manteniéndolos vivos dado que en el cultivo de la misma se propiciará su crecimiento para poder después proceder al conteo. Los diferentes métodos de captación de contaminantes biológicos son:

• Sedimentación: Consiste en ubicar cajas petri, que contengan medios de cultivo adecuado, en aquellas zonas escogidas para el muestreo. Tras el periodo de muestreo se recogerán las placas y se procesarán según las técnicas analíticas microbiológicas más apropiadas

• Recogida en medio acuso: Consiste en hacer borbotear un volumen de aire a través de una solución isotónica contenida en un frasco lavador y la posterior determinación cuantitativa por los métodos microbiológicos habituales.

• Filtración: Consiste en filtrar un volumen de aire a través de filtros de gelatina, incubándolos posteriormente sobre medios de cultivo apropiados.

• Impactación: Se basa en la retención de microorganismos libres o de microorganismos aerotransportados, adheridos a partículas de polvo, en placas que contengan medios de cultivo, ejemplos: recolector Andersen, Recolector RCS (Reuter Centrifugal System), SAS (Surface Air System).

2.1.2 MUESTREO DE SUPERFICIE Esta fase tienen un interés especial puesto que permite determinar la posible contaminación por agentes bilógicos de las materias primas, de los instrumentos de trabajo, las ropas, el mobiliario o los elementos de construcción que por sus características pueden convertirse en reservorios de agentes biológicos. El análisis de superficies, de líquidos o del polvo es necesario, puesto que la simple medición ambiental puede, en ocasiones, dar como resultado la inexistencia de contaminación microbiológica, es decir, proporcionar falsos negativos. Este tipo de mediciones son importantes ya que permiten identificar los focos de contaminación que es uno de los objetivos fundamentales en la evaluación de la exposición a agentes biológicos.

• Placa de contacto: Esta placa que contiene un medio de cultivo adecuado, e ligero exceso, se coloca sobre la superficie a muestrear, presionando sobre la misma y manteniéndola inmóvil durante el contacto.

• Frotis(Swab-rinse): Este método se basa en la utilización de hisopos estériles, que nos permiten muestrear zonas de difícil acceso para las placas de contacto. Dichos hisopos se colocan posteriormente sobre un medio de cultivo adecuado.

2.1.3. MUESTREO DEL PERSONAL Se busca disminuir otra de las formas de contaminación como es el contagio a través de manos y cabello. También debe realizarse cada 2-4 meses estudios médicos como son: coproparasitoscópico, reacciones febriles y exudado faríngeo (ya que una forma importante de transmisión de patógenos son las gotitas de saliva al hablar, toser o estornudar); por lo cual es importante el uso de cofia y guantes. En la mayoría de los métodos de muestreo comentados el soporte en que se recogen los contaminantes es una placa que contiene un medio de cultivo que permitirá el crecimiento de los contaminantes biológicos captados. El medio de cultivo es el material donde se multiplicarán los microorganismos formando colonias, por lo tanto, deberá reunir las condiciones que permitan y favorezcan su desarrollo. En una muestra, ya sea ambiental, de agua o de un material, van a coexistir muchos microorganismos diferentes con requisitos vitales distintos. El cultivo de esa muestra en una placa con un medio de características determinadas harán que otros muchos pasen inadvertidos. Existen diferentes variedades de medios de cultivo en función del objetivo del análisis. Por último es indispensable el analizar el tipo de microorganismos para su aislamiento, e identificación para poder proponer la descontaminación del área y posteriormente volver a sondear para verificar que la zona este libre. Lo importante del monitoreo ambiental en cuanto a la industria, es que la vigilancia proporcione información a tiempo para que se adopten medidas correctivas con el objeto de recuperar el control del proceso antes de que sea rechazado el producto.

2.2. OBJETIVOS Identificar posibles fuentes de contaminación en diversas zonas del laboratorio, por medio de un monitoreo ambiental para poder constatar la limpieza de éste ó para proponer medidas de corrección en las áreas que lo ameriten. Monitorear al personal, tomando muestra de manos, cabello y boca, para determinar si están libres de microorganismos (bacterias u hongos).

2.3 MATERIAL

EQUIPO

• Estufa de incubación • Microscopio óptico

VIDRERIA Y OTROS

• Portaobjetos • Ansa bacteriológica

MEDIOS DE CULTIVO

• Agar SDA • Agar AST • Agar sangre • Caldo nutritivo

REACTIVOS

• Cristal violeta • Lugol • Alcohol-acetona • Safranina • Agua estéril • Aceite mineral • Aceite de inmersión

2.4 DIAGRAMA DE TRABAJO

Analizar posibles focos de infección en el laboratorio

Proponer una solución

para desinfectar

la zona

Mesas Estufa incubadora

Refrigerador

Delimitar 20 cm2 de la mesa

Colocar una caja de agar

SDA y una caja de agar AST

destapadas, en el nivel medio

de cada uno de los equipos.

Colocar una caja de

agar SDA y una caja de agar AST,

destapados en los pasillos durante 30 minutos.

Incubar a 37º C Durante 24hr. 

Realizar conteo de colonias y

tinción de gram

Frotar el área delimitada con

un hisopo estéril

humedecido en caldo nutritivo.

Una vez tomada la muestra sembrar en una caja de agar SDA y en en una caja de agar AST, utilizando la técnica de masivo.

Desinfectar el área y repetir la operación, utilizando hisopo y cajas nuevas. 

Aire

Frotar el área de las

paredes, rejillas ó zonas sospechosas utilizando un hisopo estéril humedecido

en caldo nutritivo.

Determinar si cumple con los

límites establecidos

Personal

Una vez tomada la muestra sembrar en una caja de agar SDA y en en una caja de agar AST, utilizando la técnica de masivo.

2.4.1 DIAGRAMA DE TRABAJO

PERSONAL

 Manos

 Boca

 Cabello

Colocar directamente

las manos sobre una

caja de agar AST y sobre una caja de agar SDA.

Obtener un cabello

desde la raíza y

colocarlo sobre un medio de

agar AST y en un medio de agar SDA

Hablar de frente a una caja de Agar

sangre

. Hablar de frente a una caja de Agar

sangre utilizando un cubrebocas

Incubar a 37ºC durante 24 hr.

Realizar gram Determinar si el

personal está libre de

microorganismos

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA. 

 

NOMBRE DE LA PRÁCTICA MONITOREO AMBIENTAL

Fecha de la Práctica

No. de Práctica

NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS

MONITOREO

UFC/cm2

MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA

Mesa sin desinfectar

Mesa desinfectada

Refrigerador (cajas abiertas)

Refrigerador (hisopado)

Estufa incubadora (cajas abiertas)

Estufa incubadora (hisopado)

Aire

Cabello

Boca sin cubrebocas

Boca con cubrebocas

FIRMA DE REVISIÓN

2.5. DISCUCIÓN ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 2.7 CONCLUSIONES ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ REFERENCIAS

ITACA (Iteractive Training Advanced Computer Application, S.L.), “Riesgos químicos y biológicos ambientales”, Marcombo ediciones técnicas, (2006), Barcelona España, 165pp.

Ramírez Trejo Violeta, “Elaboración de procedimientos normalizados de operación requeridos para el control microbiológico de medicamentos estériles”, (2009), tesis de licenciatura Q.F.B., UNAM, México.

http:www2.ine.gob.mx/publicaciones/libros/105/8.html

Práctica No. 3

Evaluación de Medios de Cultivo

3.1 INTRODUCCION Un medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar a los microorganismos in vitro, así como efectuar pruebas de susceptibilidad. El desarrollo de las técnicas de crecimiento de microorganismos en medios sólidos y de obtención eficaz de cultivos puros se debió a Koch y Loeffler en 1882, el cual sigue siendo esencial en todas las áreas de la microbiología. Gran parte de la Microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio a través de medios especiales de cultivo para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibióticos, analizar agua y alimentos, en microbiología industrial y otras actividades. Los microorganismos necesitan fuentes de energía y la composición precisa de un medio adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar, debido a que las necesidades nutricionales varían considerablemente y pueden ser elementales (para su composición celular) energéticas (satisfacen las reacciones oxido-reducción) o específicas (compuestos que deben ser proporcionados porque no se encuentran en sus vías sintéticas). Además de los nutrientes los medios de cultivo deben reunir condiciones físico-químicas específicas de actividad de agua, pH, potencial de oxido-reducción (E0), condiciones de isotonía. Todos los microorganismos en general, bacterias y hongos en particular se cultivan sobre sustratos nutritivos para poder estudiar sus propiedades o la utilización de ellas en condiciones controladas. 3.1.1 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Principalmente se clasifican en base a los requerimientos nutricionales de los diferentes microorganismos en:

• Básicos o Generales: Contienen los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Tales medios pueden ser: caldo o agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar Tripticaseína soya.

• Enriquecidos: Suplementados con otros nutrientes para promover el desarrollo de microorganismos exigentes: Ejemplo son agar sangre, agar chocolate, agar suero, entre otros.

• De enriquecimiento: Para aumentar la propagación de ciertos microorganismos sin favorecer el desarrollo de otros, utilizados para el aislamiento de enterobacterias: Ejemplo son caldo selenito de sodio y cisteína, caldo tetrationato, agar yema de huevo mas leche, etc.

• Selectivos: Se incorporan sustancias inhibidoras de la propagación de un grupo de bacterias, pero permiten el crecimiento de otros grupos. Ejemplo son agar endo, eosina-azul de metileno y MacConkey.  

• Diferenciales: Permiten identificar con cierta facilidad algunos géneros o especies bacterianas por el aspecto característico que toman sus colonias. Ejemplo de estos medios son el agar sangre, MacConkey.

• De transporte: se utilizan en el envío de muestras al laboratorio, más comunes son: Stuart, caldo tioglicolato, caldo nutritivo y medio Carry-Blair.

• Para el mantenimiento: son medios simples y no deben estimular un crecimiento

abundante. Se pueden emplear: agar nutritivo, medio de Dorset.

• Para el estudio de carbohidratos: medio basal OF, de Hugh Leiffson, medio para MR-VP y los que prueben algún azúcar.

3.1.2 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El control de calidad de los medios de cultivo consiste en una evaluación sistémica del trabajo para asegurar que el producto final se ajuste a un grado aceptable a límites de tolerancia previamente establecidos, donde finalmente se proporcionen resultados verídicos y permite que se acepten los registros documentados de los fabricantes y abastecedores de productos comerciales. La viabilidad de los medios debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas. Para realizar el control de calidad de los medios de cultivo es necesario considerar los siguientes puntos básicos:

a) Personal: debe ser capacitado en el área específica y con un entrenamiento práctico.

b) Material de vidrio: debe estar limpio, seco y libre de cualquier tipo de contaminantes, ya que la presencia de éstos puede afectar los resultados.

c) Materia prima: debe presentar características homogéneas en el tamaño de partícula, color y no presentar apelmazamiento. El envase debe ser de tapa de aluminio, frasco de vidrio ámbar, composición completa en la etiqueta, debe precisar fecha de caducidad, indicación clara de la preparación, así como el número y lote.

El control de calidad para los medios de cultivo debe, en el análisis final, asegurar que un medio respalde el desarrollo de los microorganismos, inhibir el desarrollo de microorganismos comensales, exhibir una respuesta bioquímica típica, ser estable y tener un tiempo de conservación razonable. 3.1.3 PRUEBAS QUE SE REALIZAN A LOS MEDIOS DE CULTIVO Esterilidad. La frecuencia con que se realizan las pruebas de control de calidad de medios es determinada por cada laboratorio y a las instrucciones de los fabricantes para todos los productos comerciales usados y debe efectuarse con varios tubos o frascos de cada lote. Se realiza particularmente para aquellos medios a los que se les adicionan componentes luego de la esterilización, visualmente y por subcultivo. Ciertos medios selectivos que pueden suprimir suficientemente el crecimiento visible de bacterias; sin embargo, pueden aparecer microorganismos viables al subcultivar. Los parámetros a evaluar son aspecto físico como signos de deterioro, decoloración, turbidez, cambios de color o estado de hidratación.

Pruebas de promoción e inhibición de crecimiento Para determinar la capacidad del medio para respaldar el desarrollo del microorganismo inoculado con una concentración baja que nos permita ver la funcionalidad del medio, considerando que un error frecuente del control de calidad es el uso de un inóculo concentrado que puede producir un desarrollo desorientador, para lo cual es necesario estandarizar esta prueba, mediante el empleo de una técnica que nos ayude a dicho propósito como la técnica de Miles & Misra. Esta técnica es una de las más empleados para medios sólidos, la cual consiste en sembrar una suspensión de un cultivo joven de las cepas sobre la superficie de una placa, divida en cuadrantes; la suspensión debe ser de 0.02 ml, y adicionada en cada cuadrante, de cada una de las diluciones del cultivo. Después de la incubación de la caja, se cuenta con el número de UFC que crecen en cada dilución. 3.1.4 USOS Y LAS APLICACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Medicina Humana y veterinaria, se efectúan investigaciones microbiológicas en el diagnóstico de infecciones y para el control de las medidas terapéuticas que le siguen. Industria Farmacéutica, la mayor parte de los productos de esta industria deben cumplir con una especificación microbiológica establecida de acuerdo a la Farmacopea respectiva. En consecuencia, el control de calidad microbiológico es una fase importante en el proceso de producción. Industria Cosmética, debido que casi todos estos productos contienen sustancias biológicas activas y por ello pueden contener microorganismos patógenos. Industria Láctea, la leche cruda es un medio de cultivo ideal para numerosos microorganismos. Industria Cárnica, en los mataderos es donde se procede a investigaciones microbiológicas y para la detección de residuos de antibióticos, si un animal ha estado tratado con antibióticos antes del sacrificio. Industria Alimentaria y de Bebidas, productos naturales pueden deteriorarse debido a la presencia de microorganismos. Su tratamiento está sometido a reglamentaciones particularmente estrictas.

 

3.2 OBJETIVO GENERAL Al finalizar la práctica el alumno deberá:

Evaluar medios de cultivo, por medio de la promoción e inhibición de crecimiento microbiano para determinar si los medios de cultivo son viables.

3.2.1 OBJETIVOS PARTICULARES

Aplicar la técnica de Miles & Misra, por medio de la inoculación de cepas ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo) en los medios de cultivo a utilizar y determinar si los medios de cultivo son viables.

Comprobar si la morfología colonial obtenida en cada uno de los medios de cultivo es específica de los microorganismos tipo empleados.

 

3.3 METODO EXPERIMENTAL

3.3.1 MATERIAL 4.3.1.1 EQUIPO � Microscopio óptico � Estufa de Incubación � Vortex � Asa bacteriológicas calibradas de 0.01 y 0.001 ml � Mecheros Bunsen 3.3.1.2 MATERIAL DE VIDRIO � Tubos de ensaye de fondo plano � Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml � Porta objetos planos � Cubre objetos � Tubo 0.5 del Nefelómetro de Mac Farland 3.3.1.3 MEDIOS DE CULTIVO (por equipo) � Agar Sangre (AS) � Agar Chocolate (ACh) � Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB) � Agar Cetrimida (AC) � Agar sales Manitol (ASM) � Agar McConkey (AMc) � Agar Dextrosa Saboraund (ADS) � Agar Salmonella-Shigella (SS) 3.3.1.4 CEPAS ATCC # COLECCION � Salmonella enteritidis � Enterobacter aerogenes � Staphylococcus aureus � Pseudomonas aureginosa � Cándida albicans � Streptococcus β-hemolítico grupo A � Escherichia coli � Shigella 3.3.1.5 PRUEBAS BIOQUIMICAS � OF � Nitratos � MR � VP � KIA � SIM � Urea � Citratos � MIO � Arginina � Malonatos � LIA 3.3.1.6 REACTIVOS � Glicerol � Cristal Violeta � Alcohol etílico al 70 y 90% � Acetona � Lugol

� Safranina � Aceite de inmersión � Solución Salina Fisiológica (estéril) 3.3.2 METODO EXPERIMENTAL 3.3.2.1 DETERMINACION DE LA DILUCION PARA LA TECNICA a) Sembrar las cepas de los diferentes microorganismos con un asa bacteriológica 24 horas antes de la experimentación. b) Dividir en cuatro partes las cajas petri, y posteriormente colocarlas durante menos de una hora en la estufa de incubación a 37 °C. c) Rotular la serie de tubos de ensaye para cada microorganismo del 1 al 5 respectivamente, y agregar 4.5 ml de SSF (estéril). d) Preparar una suspensión de la cepa del microorganismo igualando la turbidez con el tubo número 0.5 del Nefelómetro de McFarland el cual equivale a 1.5 x 108 UFC / ml e) Tomar de la solución anterior un volumen de 500 μl con una micro pipeta y adicionarlo a un tubo que contenga SSF (Tubo 1 de dilución 10-1) f) Homogenizar la solución en el vortex g) Tomar del tubo 1 un volumen de 500 μl con una micro pipeta y adicionarlos a otro tubo con SSF (Tubo 2 de dilución 10-2) h) Homogenizar la solución obtenida en el Vortex. i) Realizar los pasos hasta el tubo 5. 3.3.2.2 PROMOCION E INHIBICION DE CRECIMIENTO a) Agregar 10 μl de la dilución para la técnica de Control de Calidad en los diferentes medios de cultivo a evaluar y distribuir uniformemente. Para realizar esta técnica se debe emplear según sea el medio de cultivo: un microorganismo que debe crecer (Cuadrante I), uno que debe diferenciarse del anterior (Cuadrante II) y por último otro que no debe crecer (Cuadrante III) y el último cuadrante se emplea como área de esterilidad. b) Esperar a que la solución anterior se difunda en el medio de cultivo, posteriormente realizar un barrido y/o estriado con una asa bacteriológica y se incuba las cajas petri con los medios de cultivo en la estufa de incubación a 37 °C / 24 hrs. c) Realizar la lectura de las cajas petri (conteo manual), en donde el número de colonias debe oscilar entre 20-30 por cuadrante. d) Realizar el ensayo al mismo tiempo en un medio de referencia para asegurar el crecimiento del microorganismo, empleando la misma dilución para cada una de las cepas de microorganismos empleados para comparación de la recuperación bacteriana en los medios de cultivo evaluados y de referencia. NOTA: A continuación se presenta un diagrama de flujo con base al diseño experimental.

3.4 DIAGRAMA DE FLUJO

 

 

 

3.5 RESULTADOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO. 

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. 

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA. 

NOMBRE DE LA PRÁCTICA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO.  

Fecha de la Práctica

No. de Práctica

NOMBRE DE LOS ANALISTAS

 

Nombre de la bacteria/Levadura

Gram

Catalasa

Oxidasa

O/F

Otra prueba especificar  

CUENTA VIABLE.

Dilución Morfología Colonial Tipo de Agar: _________________________________ UFC/mL

10-1

10-2

10-3

10-4

 

 

 

NOMBRE DEL AGAR

MODO DE ACCIÓN

 

CONTROL DE CALIDAD.

Parámetros a evaluar Bacteria/Levadura Morfología Colonial UFC/mL

Promoción (--)

Promoción (+)

Inhibición

Esterilidad

PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

PRUEBA Microorganismo usado Cumple

 

3.6 CONCLUSIONES 

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_________________________________________.___________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________._

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

________________________________________.____________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________. 

FIRMA DE REVISIÓN

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.7 BIBLIOGRAFIA

� BOLAÑOS, Carlos Alberto y ANACORETA, Inocencia Vargas. Tesis. “Evaluación de la Estabilidad de diferentes Medios de Cultivo preparados en condiciones estándar”. FESC, 1999. � COLLARD, Patrick. “El desarrollo de la Microbiología”. Editorial Reverte. Barcelona, España. 1990. � COLLINS, C.H. “Métodos Microbiológicos”. 5ª ed. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 1990. � HERNÁNDEZ, Guadalupe. Tesis. “Manual de Prácticas del Laboratorio de Bacteriología”. FESC, 2000. � KONEMAN, MD. “Diagnóstico Microbiológico”. 5ª ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 1999 � MANUAL DE RECOMENDACIONES GENERALES PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Secretaría de Salud. Dirección General de Epidemiología. Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos “Dr. Manuel Martínez Báez”. México DF, 1989. � NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-065-SSA1-1993. “Especificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo”. � PRESCOTT, Lasing. “Microbiología”. 4ª ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana. España, 1999.

PRÁCTICA No. 4

CONSERVACIÓN DE CEPAS

INTRODUCCIÓN

Los sistemas de Validación son los procesos que se requieren para asegurar que los parámetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domésticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como métodos de diagnóstico en el laboratorio. La mayoría de los procedimientos en Microbiología, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus características morfológicas, fisiológicas y que sean típicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas Estándar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validación.

Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son:

ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA

NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra

JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japón

CCTM : Colección Nacional – Lille, Francia

RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Moscú, Rusia.

NCIB : Colección Nacional industrial – Aberdeen, Escocia

DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen – Gottinger, Alemania.

Así, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210.

Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificación, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domésticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, área de aislamiento, reacciones bioquímicas y patrón de sensibilidad a los antibióticos, forma de almacenaje, fecha de último pase.

En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos específicos:

• Características típicas. • Características estables. • Reproducibilidad.

MÉTODOS DE CONSERVACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS.

Los métodos de conservación de las cepas estándar de control de calidad, deben asegurar que las mismas mantengan sus características típicas y que puedan ser reproducidas después. El medio utilizado para su conservación debe mantener un mínimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo también el mínimo crecimiento del microorganismo y aportando óptimas condiciones ambientales para su sobrevivencia, con el menor número de subcultivos.

Para una mejor clasificación de los métodos de conservación de cepas, los dividiremos en tres categorías: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario.

CULTIVOS STOCK:

Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos". Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservación, minimizando su actividad genética y fisiológica, para evitar su potencial mutación.

Los dos métodos más importantes para conservación en Stock, son la Liofilización y el ultracongelamiento.

LIOFILIZACIÓN: Se hace una suspensión fuerte de un cultivo puro y joven en leche estéril o similar, y se coloca en tubos con tapón de rosca y se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vacío, hasta un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la formación de aerosoles.

Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas.

ULTRACONGELAMIENTO: Hacer una suspensión fuerte de la colonia pura en caldo Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en porciones de 0.5 ml en pequeños tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45°C.

También se puede utilizar la modificación de Ultracongelamiento en Nitrógeno líquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato específicamente designado para el mantenimiento de cepas en nitrógeno líquido.

Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo.

CULTIVOS SEMISTOCK:

Este término se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5 técnicas listadas a continuación, solo la de congelamiento es utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios.

Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a -25°C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelación y

son colocados en el congelador. El método permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por años y en la mayoría de las veces por al menos de 6 a 12 meses.

CONGELAMIENTO EN CONGELADOR CONVENCIONAL:

Se preparan tubos con tapón de rosca conteniendo agar soya tripticasa-cisteína.

Inocular el cultivo puro y jóven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeración, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un año y los fastidiosos por 6 meses.

CULTIVO EN CTA:

Este método es conocido también como método Stamp en honor de su creador. Corte pequeños círculos de papel encerado y colóquelo en una caja Petri de vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presión.

Prepare una suspensión de caldo nutritivo con 10% de gelatina en polvo ( Peso por Volumen ) y 0.25% de ácido ascórbico ( P x V ) y dispense en tubos con rosca y esterilice en autoclave.

Haga una suspensión fuerte de un cultivo puro y jóven y coloque una gota del mismo con una pipeta estéril sobre uno de los discos de papel acerado estéril en una caja Petri. Con una pinza estéril, transfiera el disco a un desecador de vacío conteniendo Pentaóxido de fósforo. Evacue el desecador con la bomba de vacío. Cuando el disco está seco, asépticamente introducir en un tubo estéril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador.

Para hacer un subcultivo del disco, asépticamente retire un círculo de papel con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas a 35ºC y luego inocular en agar sangre e incubar nuevamente.

SECADO EN DISCOS CON GELATINA:

Es un método especialmente utilizado para hongos, pero es útil también para algunas bacterias.

En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo jóven y bien desarrollado en un medio de cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite mineral estéril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presión por 45 minutos, para asegurar su esterilidad absoluta.

Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o incinerador y remueva una porción visible de crecimiento con una asa estéril larga o una aguja.

Este método permite la sobrevivencia por muchos años.

Si el método se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazón o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos con tapón de rosca. Se esterilizan y luego se les hace solidificar en forma inclinada.

Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35°C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxígeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estéril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 años a temperatura ambiente.

CONSERVACIÓN EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE MINERAL:

MANTENIMIENTO EN TIERRA ESTÉRIL:

Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas.

Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presión por 1 hora. Haga una suspensión fuerte del microorganismo jóven y esporulado y colóquelo en el tubo con tierra estéril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador.

CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO:

Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para éste propósito se utilizan cultivos de 24 horas y son pasados diariamente.

BACTERIAS RESISTENTES:

Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacterias. Se transfiere una colonia jóven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar por un mínimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Después de éste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo stock.

BACTERIAS DELICADAS :

Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeración. Después de una serie de 6 pases consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock.

BACTERIAS ANAERÓBICAS:

Los cultivos para trabajo diario de la mayoría de las bacterias anaeróbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio adicionado después de esterilizar por autoclave.

Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente.

HONGOS:

Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulación, para luego ser colocados en refrigeración. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos cada 2 meses. Pasado éste tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock.

CULTIVOS DE TRABAJO COMERCIALES:

Son preparados por casas comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC. Estas son estables en refrigeración por un año. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras.

Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo soya tripticasa e incubados por 24 horas a 35°C. Luego se hace un pase a un medio de enriquecimiento o agar sangre.

Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda importante en la validación de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa metódico de pase de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus características bioquímicas, sensibilidad a los antibióticos, origen de la cepa, método de identificación, fecha de siembra y próximo pase.

OBJETIVO

Conocer y aplicar las técnicas de mantenimiento de un cepario bacteriano y de hongos, por medio de metodología establecida en la literatura, para ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificación.

MATERIAL

Medios de cultivo y reactivos • Cajas de agar soya tripticasa • Cajas de agar sal y manitol • Cajas de agar MacConkey • Cajas de agar cetrimida • Cajas de agar dextrosa Sabourou • Tubos de OF • Tubos de citratos • Tubos de MR-VP • Tubos de KIA • Tubos de LIA • Tubos de MIO • Tubos de arginina • Tubos de malonato • Tubos de nitratos • Tubos de urea • Tubos con caldo nutritivo • Tubos de carbohidratos • Tubos con agua estéril • Tubos de dilución con 5 ml de SSF estéril • Tubos de dilución con agar base sangre inclinados • Tubos de dilución con 5 ml de caldo BHI+1% de sacarosa+1% de leche

descremada • Plasma de conejo • Suero humano • Peróxido de hidrógeno • Reactivo para oxidasa • Reactivo de Erlich • α-naftol • α-naftilamina • KOH 40% • Ácido sulfanílico • Aceite de inmersión

• Aceite mineral estéril • Cristal violeta • Lugol • Alcohol/acetona • Safranina

Vidriería y diversos

• Pipetas graduadas estériles de 1 ml • Pipetas graduadas estériles de 10 ml • Tubo 0.5 del Nefelometro de MacFarland • Microscopio compuesto • Mechero/tablita • Palillos estériles • Asas bacteriológicas • Portaobjetos • Cubreobjetos • Plastilina • Estufa bacteriológica • Refrigerador • Congelador

Material Biológico

• Escherichia coli • Staphylococcus aureus • Staphylococcus epidermidis • Staphylococcus saprophyticus • Streptococcus faecalis • Salmonella Typhi • Pseudomonas aeuroginosa • Enterobacter cloacae • Enterobacter aerogenes • Citrobacter freundii • Klebsiella pneumoneae • Candida albicans

DIAGRAMA DE TRABAJO No.1. Identificación y conservación de cepas.

Cepa desconocida 

Realizar pruebas bioquímicas 

primarias Sembrar por dilución 

Agar Soya Tripticaseína 

Medios selectivos y diferenciales 

OFGram 

MotilidadCatalasa 

Incubar 24 hrs/37ºC Incubar Oxidasa 24hrs/37

Realizar pruebas bioquímicas secundarias 

ºC

Preparar suspensión bacteriana igualada al tubo 0.5 del NMF. 

Registrar e interpretar resultados Registrar e interpretar 

resultados.  

Registrar e interpretar resultados 

Colocar 1 ml. en caldo BHI con 1% de sacarosa y 1% de leche descremada.  

Inocular con una asada 2 tubos con agar base sangre inclinados

Incubar 8‐12 hrs/37ºC y conservar

A un tubo inclinado agregar hasta cubrir aceite mineral estéril y mantener a 20‐25ºC 

A un tubo inclinado agregar hasta cubrir aceite mineral estéril y refrigerar a 8ºC

El caldo BHI se congela a ‐10ºC 

DIAGRAMA DE TRABAJO No.2. Recuperación e identificación de cepas.

Cepa   conservada 

Realizar pruebas bioquímicas primarias 

Gram 

Catalasa 

Oxidasa 

Motilidad 

OF 

Dividir en tres los medios selectivos y diferenciales e inocular en cada tercio 

las cepas recuperadas 

Dividir en tres una caja de agar soya tripticaseína e inocular en 

cada tercio las cepas recuperadas 

Realizar pruebas bioquímicas secundarias

Incubar 24 hrs/37ºC

Crecimiento en medios diferenciales y selectivos

Registrar e interpretar resultados. 

Registrar e interpretar resultados 

Registrar e interpretar resultados 

Eliminar el aceite mineral estéril al tubo inclinado incubado a temperatura ambiente 

Ambientar y eliminar el aceite mineral estéril al tubo inclinado refrigerado 

 Descongelar el caldo BHI colocándolo a 

temperatura ambiente

Crecimiento en agar soya tripticasa

7 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA 

7.1 INTRODUCCION El agua empleada en la Industria Farmacéutica, ya sea como aditivo en las diferentes formas farmacéuticas o en las operaciones de limpieza de los equipos y áreas, que participan en los procesos de producción farmacéuticos, debe cumplir ciertas especificaciones dependiendo el tipo de agua que se emplea y en los procesos de producción que se utiliza. Se debe contar con un sistema de control que asegure y mantenga la calidad del agua desde que se recibe para su proceso de purificación hasta su uso. La FEUM (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos) describe las especificaciones y los usos del agua. La siguiente tabla muestra el agua usada en la industria farmacéutica: 1 tipo de agua

uso especificaciones Agua Purificada

El agua purificada es usada como un excipiente en la producción de preparaciones oficiales, para limpieza de equipo y preparaciones de algunas soluciones farmacéuticas. El agua purificada tiene requerimiento físico, químico y microbiológico. Para obtener agua purificada se utiliza agua comúnmente de la red municipal que es sometida a varias operaciones unitarias, como desionización, destilación, intercambio iónico, osmosis inversa, filtración u otro proceso de purificación.

pH: entre 5 y 7 Determinar los siguientes compuestos: Cloruros: 0.5 mg/l Sulfatos* Amonio: <0.03 ppm Calcio* Dióxido de Carbono* Metales pesados* Sustancias oxidables* Nitratos: <0.2 ppm Sólidos totales: <0.001% Carbono orgánico total: 500 ppb Conductividad* Límites Microbianos No más de 100 UFC/ml de mesófilos aerobios y ausencia de patógenos.

Agua Purificada Estéril

Se usa en las preparaciones farmacéuticas no parenterales. Esta agua no debe contener agentes antimicrobianos y debe estar envasada apropiadamente.

Cumplir con todos los requisitos de agua purificada y pruebas de esterilidad.

Agua para la Fabricación de Inyectables

Se usa como aditivo para la fabricación de inyectables y para la limpieza de los equipos. Es producida a partir de agua potable y se purifica por destilación u osmosis

. Cumple con los requisitos de todas las pruebas indicadas en Agua Purificada y: Endotoxinas. Libre de endotoxinas. Límites microbianos. Ausencia de patógenos

inversa.

El agua es un excelente vehículo para la transportación de los organismos patógenos, especialmente los que existen en las aguas negras cuando estás no han sido bien tratadas. Los estragos causados por la proliferación de estos gérmenes hicieron que se tomaran medidas como la cloración de los suministros de agua. Es preciso analizar el agua para determinar si es potable; el análisis microbiológico del agua es un procedimiento diseñado para comprobar si una muestra de agua ha sufrido contaminación de aguas negras, materia fecal; y por lo tanto, si contiene microorganismos patógenos al humano y/o animales. Los organismos en el agua están generalmente diluidos a tal grado que la pequeña muestra de agua a analizar estará muchas veces libre de todo patógeno. En este tipo de análisis se trata de detectar aquellos microorganismos que son provenientes de aguas negras, materia fecal; los llamados coliformes.3 Las bacterias patógenas que causan ciertas enfermedades pueden sobrevivir al caer en el agua y ser transportadas, usando el agua como vehículo, de una persona a otra. La presencia de estos microorganismos en el agua origina una contaminación de la misma y la hace impropia e insegura para su consumo. El grupo de los microorganismos Coliformes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos y en la industria farmacéutica como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. El uso de los Coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

• La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos.

• La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.

• Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo. La demostración y la cuenta de microorganismos Coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales.5

7.1 METODOS DE ANALISIS

7.1.1 METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) Método del Número Más Probable (NMP) se emplea para la determinación de número de microorganismos viables, un procedimiento estadístico en el cual se elaboran diluciones específicas para alcanzar un punto de extinción. Generalmente se emplean réplicas, usualmente 3 a 10 de cada dilución y se registra el patrón positivo o negativo. Para determinar en NMP de microorganismos presentes en la muestra original se emplea una tabla estadística basada en la distribución de Poisson.

En los diferentes procedimientos del NMP se emplean criterios variados para establecer las marcas positivas o negativas. En muchos procedimientos, un tubo se marca positivo cuando hay crecimiento visible (como aumento en la turbidez). Otros procedimientos emplean criterios más cuantitativos, tales como un incremento en la concentración de proteínas o criterios diferenciales, como la producción de ácidos a partir carbohidratos o producción de dióxido de carbono, y de clorofila son también utilizadas para establecer una marca positiva en procedimientos para bacterias y algas respectivamente utilizando este método. 7

7.1.2 CUENTA EN PLACA Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del producto ha sido el adecuado. Por otra parte, el recuento de termofílicos, psicrofílicos y psicotróficos es importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Esta técnica puede aplicarse para la estimación de microorganismos viables en una amplia variedad de alimentos y productos farmacéuticos.8

7.2 MUESTREO DEL AGUA

En el análisis microbiológico, la adecuada selección de la muestra, la toma correcta, los medios de conservación y su transporte al laboratorio, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables. Esto implica precisar el objetivo del estudio, la naturaleza de las muestras y la cantidad, el tamaño o el volumen, en lo posible, sean representativos del producto y del lote o partida de donde provienen. La recolección de la muestra se debe efectuar evitando toda contaminación externa, tanto ambiental como humana, para asegurar la integridad de la misma. Se requiere consignar en el informe con que se entrega la muestra todos los datos pertinentes que pudieran afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en consideración. Las condiciones de conservación y transporte, tiempo comprendido entre la recolección de la muestra, su entrega al laboratorio, así como la realización del análisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la población microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos.

7.3 TECNICA ENZIMATICA

7.3.1 Ready cult: La identificación bacteriana se realiza determinando la actividad enzimática específica, se evidencia por un cambio de color o emisión de fluorescencia en un medio de cultivo especifico.

SUSTRATOS CROMOGENICOS ENZIMAS X - GAL β - D - Galactosidasa MUG β - D - Glucoronidasa Para la determinación de los Coliformes totales la enzima β - D – Galactosidasa degrada al sustrato X-GAL produciendo una coloración azul-verde, para determinación de Coliformes fecales la enzima β - D – Glucoronidasa degrada al sustrato MUG produciendo fluorescencia.

7.4 OBJETIVOS • EL ALUMNO IDENTIFICARA LOS PRINCIPALES MICROORGANISMOS

OBJETABLES PRESENTES EN UNA MUESTRA DE AGUA PARA EL CONTROL MICROBIOLOGICO, POR LA TECNICA DEL NMP Y LA TECNICA ENZIMATICA DE READY CULT.

• EFECTUAR LA TOMA DE MUESTRA, SU PREPARACION Y ANALISIS

MICROBIOLOGICO PARA LA IDENTIFICACION Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS EN UNA MUESTRA DE AGUA.

7.5 MATERIAL

7.5.1 EQUIPO Baño María Autoclave Estufa de Incubación Refrigerador Microscopio óptico

7.5.2 MATERIAL DE VIDRIO Pipetas graduadas de 1 ml (estériles) Pipetas graduadas de 10 ml (estériles) Cajas de petri (estériles)

7.5.3 MEDIOS DE CULTIVO 1 Agar Mc Conkey (AMc) Agar Cuenta Estándar 1 Agar Cetrimida (AC) 6 tubos con Caldo rojo de fenol Lactosado concentración simple (CRFL) 3 tubos con Caldo rojo de fenol Lactosado concentración doble

4 tubos con Caldo Lactosado bilis verde brillante (CBVB) 1 tubo con Caldo Soya Tripticaseína 1 Citratos 1 SIM 1 Rojo de metilo 1 Vogues Proskauer 2 Medio O/F

7.5.4 REACTIVOS Kit paraTinción de Gram Rojo de metilo Reactivo de Kovac α-Naftol 5% Peróxido de Hidrógeno Agua destilada KOH

7.6 METODOLOGÍA

MESOFILOS AEROBICOS

DETERMINACION DE Pseudomonas

Se colocan 4 cajas petri estériles

Agregar 1 mL de la muestra en cada caja.

Agregar 25 mL de Agar Cuenta Estándar

Homogeneizar. 6 vueltas a la derecha y 6

a la izquierda

2 cajas se incuban

37ºC /24-48 hrs

Determinar el NMP

En un tubo con 5 mL de Caldo Nutritivo se agregan 5 mL de la

muestra de agua

Incubar de 24-48 hrs a 37ºC

Si el tubo esta turbio se siembra en Agar

Cetrimida

Se realizan pruebas bioquímicas para

Identificar Pseudomonas

MUESTRA DE AGUA

2 cajas se incuban

25ºC /24-48 hrs

7.7 RESULTADOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA.

NOMBRE DE LA PRÁCTICA ANALISIS BACTERIOLÓGICO DEL AGUA

Fecha de la Práctica

No. de Práctica

NOMBRE Y FIRMA DE LOS ANALISTAS

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

MUESTRA TOMADA EN: Fecha/Lugar de la toma.

APARIENCIA

MESÓFILOS AEROBIOS UFC/mL UFC/mL Promedio.

Caja 01

Caja 02

NUMERO MÁS PROBABLE NMP

Cambios después de la Incubación

No. de Serie 24 hrs 48 hrs 72 hrs

01

02

03

Pseudomonas spp.

Medio de Cultivo Morfología colonial

Ready Cult

Turbidez y cambio de color Fluourescencia Prueba del Indol

CONCLUSIONES. _________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________________________

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FIRMA DE REVISIÓN

ESPECIFICACIONES

Prueba

LIMITES PERMISIBLES

Mesófilos aeróbicos Menor a 100 UFC/Ml Coliformes Totales Menor a 2 UFC/mL de agua Coliformes Fecales Ausentes Determinación de Pseudomonas Ausentes

BIBILOGRAFIA: 1 FARMACOPEA DE LOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS. 7ª ed. Secretaría de Salud. México, 2000 3 BRADSHAW, Jack. “Microbiología de Laboratorio”. Editorial El Manual Moderno. México, DF. 1990 4 MANUAL DE TRATAMIENTO DE AGUAS. Departamento de Sanidad del Estado de Nueva York, Albany. 8ª ed. Editorial Limusa. México, DF. 1990 5 NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-113-SSA1-1994. “Método para la cuenta de microorganismos Coliformes totales en placa”. 6 NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-112-SSA1-1994. “Determinación de bacterias Coliformes. Técnica del número más probable”. 7 RHEINHEIMER, Gerhard. “Microbiología de las Aguas”. Editorial Acribia. Zaragoza, España. 1990. 8 NORMA 7OFICIAL MEXICANA. NOM-092-SSA1-1994. “Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa”.

Productos Farmacéuticos No Estériles.

Objetivo.

Conocer y manejar los procedimientos establecidos en la Farmacopea de los Estados

Unidos Mexicanos a través de su ensayo en productos farmacéuticos no estériles para

asegurar la calidad de estos.

Introducción.

Los productos farmacéuticos considerados como no estériles que se fabrican son:

tabletas, grageas, cápsulas, comprimidos, supositorios, óvulos, jarabes, elixires,

emulsiones, suspensiones, cremas, geles, pomadas, ungüentos, soluciones, y deben de

cumplir con las buenas prácticas de fabricación.

La presencia de una gran variedad de levaduras, hongos y bacterias en productos

farmacéuticos pueden ocasionar una serie de problemas como: la descomposición del

principio activo, ruptura de la emulsión, cambios en el color, olor y consistencia,

y daños al paciente.

Cada materia prima presenta características independientes y dependiendo de su

origen (animal, vegetal y/o sintético) son aprovechadas por los microorganismos

como sustratos. En estas materias primas las bacterias, hongos y levaduras pueden:

Mantenerse viables.

Desarrollarse.

Ha de saberse que cada una de las materias primas presenta diferentes límites

microbianos, tal y como se demuestra en la farmacopea indicada.

Por otra parte los análisis microbiológicos deberán de ser minuciosos y brindar una

cuantificación del estatus microbiano de la muestra obtenida.

La importancia de la presencia de microorganismos en los productos no estériles

debe ser evaluada en términos de uso y de la naturaleza del medicamento. La USP

sugiere que cierta categoría de productos sean analizados de rutina para determinar

cuenta total microbiana y contaminantes microbiológicos específicos.

Las formas farmacéuticas no estériles deben de cumplir con normas oficiales NOM-059

-SSA1-1994, NOM-073-SSA1-1993; respecto a la cantidad y tipo de microorganismos que

puedan contener. Los requisitos generales de calidad microbiológica son los

siguientes:

Cuenta Total de Bacterias mesófilas aerobias

Cuenta Total de Bacterias anaerobias

Cuenta Total de Hongos y Levaduras

Identificación de Microorganismos Patógenos Objetables

Materiales.

Equipo:

Baño Maria

Estufa bacteriológica

Refrigerador

Autoclave

Microscopio óptico

Instrumentos de vidrio

Pipeta graduadas de 1 y 10 ml estériles.

Probeta graduada de 100 ml estéril

Porta objetos y cubre objetos

Medios de cultivo

Botella de dilución con 90 ml de caldo soya tripticaseína

Botella de dilución con 90 ml de caldo tioglicolato

Agar soya tripticaseína

Agar dextrosa Saboraud

Agar Sales Manitol

Agar MacConkey

Agar Cetrimida

Agar Letheen

Reactivos

Safranina

Lugol

Cristal violeta

Aceite de inmersión

Azul de algodón

Agua destilada

Buffer de fosfatos pH= 7.2

Solución salina fisiológica

Diagrama de trabajo

Dilución de la -muestra.

Muestra

Revisar estado Físico

Muestras viscosas calentar

en baño maría a 45 C

Pesar o medir el

equivalente a 10 g o 10 m.

Colocar una muestra en

cada uno de los caldos:

soya tripticaseína y

Tioglicolato.

Identificar cada uno de

los caldos

Reservar el caldo soya

tripticaseína

Incubar 37 C por un

periodo de 24-72 h

Revisar cada 24 h y

registrar cambios

Mesófilos aerobios, Hongos y Levaduras; Microorganismos Objetables.

Botella de Dilución

Caldo Soya Tripticaseína

Hongos y Levaduras Mesófilos aerobios Microorganismos

objetables

Tomar 0.1 de la muestra y

estriar en cada uno de los

medios

Tomar 4 ml del caldo

soya tripticaseínaTomar 4 ml del caldo

soya tripticaseína

Adicionar de 20 a 25 ml

de medio dextrosa-

Saboraud fluido (45 C)

Colocar cada 1 en

cada una de las 4

cajas petri estériles

Agar Sales-Manitol

Agar MacConkey

Agar Cetrimida

Agar Salmonella-Shigella

Colocar cada 1 en

cada una de las 4

cajas petri estériles

Rotular cajas petri e

incubar:

37 C/24-48 h

Adicionar de 20 a 25 ml de

medio Cuenta Estándar

fluido (45 C)

Homogeneizar la

muestra, Dejar

gelificar

Homogeneizar la

muestra, Dejar

gelificar

Si existe

crecimiento:

Identificar colonias

y realizar pruebas

bioquímicas primarias

y secundarias.

Rotular cajas petri e

incubar:

2 cajas a 37 C/24 h

2 cajas a 25C/1 semana

Rotular cajas petri e

incubar:

2 cajas a 37 C/24 h

2 cajas a 25C/24 h

Realizar conteo,

obtener promedios

Realizar conteo,

obtener promedios

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN.

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA.

NOMBRE DE LA PRÁCTICA PRODUCTOS FARMACEÚTICOS NO ESTÉRILES

Fecha de la Práctica

No. de Práctica

NOMBRE DE LOS ANALISTAS

IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA

NOMBRE

LOTE

CODIGO

FECHA DE RECEPCIÓN

AISLAMIENTO

TIPO DE MEDIO 24 48 72 96

CALDO SOYA-

TRIPTICASEÍNA

CALDO

TIOGLICOLATO

MESÓFILOS AEROBIOS UFC/mL UFC/mL Promedio.

Caja 01

Caja 02

HONGOS Y LEVADURAS UFC/mL UFC/mL Promedio.

Caja 01

Caja 02

PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRIMARIAS

GRAM INDOL ( NITRITOS ( ) LISINA (

) )

O/F

( )

RM (

)

NITRATOS ( ) ORNITINA (

)

CATALASA (

)

VP (

)

H2S (

)

ARGININA ( )

OXIDASA

( )

CITRATOS ( ) GAS (

)

FENILALANINA (

)

MOTILIDAD (

)

MALONATOS (

)

UREA (

)

NOMBRE DE LA PRÁCTICA PRODUCTOS FARMACEÚTICOS NO ESTÉRILES.

COAGULASA (

)

NOV 5μg

( )

BACITRACINA 0.04 UI (

)

BILIS ESCULINA (

)

HIPURATO (

)

NaCl 6.5%

( )

CAMP

( )

OTRAS PRUEBAS

Carbohidratos

GLU ( ) SAC ( ) FRUC ( ) LAC (

)

MAN ( ) RAM ( ) TRE (

)

XIL (

)

ARA ( ) ADO ( ) MEL ( ) SOR (

)

DUL (

)

MNL ( ) RAF (

)

SAL ( )

Otros carbohidratos:

MICROORGANISMO IDENTIFICADO.

CONCLUSIONES.

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__________________________________________________________________________________________________.

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__________________________________________________________________________________________________.

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FIRMA DE REVISIÓN

9 PRODUCTOS FARMACÉUTICOS ESTÉRILES

9.1 INTRODUCCIÓN Un producto farmacéutico estéril es el que se encuentra libre de microorganismos y pirógenos, y cuando es administrado no ocasiona una respuesta adversa por contaminación microbiológica. En este tipo de productos se eliminan todas las formas viables de microorganismos, por la realización de un proceso de esterilización en el cual las células microbianas o sus componentes se remueven o destruyen, de tal modo que ya no son detectables en medios de cultivo adecuados para su proliferación. Un requisito fundamental para todo producto estéril es que tenga la máxima calidad y ofrezca la mejor seguridad al paciente. Los productos farmacéuticos estériles son diversos como: inyectables (sueros, soluciones, nutritivas, ampolletas, intramusculares, subcutánea, intravenosa), sólidos estériles (polvos liofilizados para inyectables), ungüentos (óticos y oftálmicos), líquidos (oftálmicos), etc. 1

La Norma Oficial Mexicana 056-SSA1-1993, establece una serie de características sanitarias que un área de proceso para productos farmacéuticos debe cumplir, tales características son: superficie adecuada (espacio suficiente para trabajar y limpiar cómodamente), acabados sanitarios (superficies lisas, eliminando ángulos de 45° y que resistan la acción de los sanitizantes), ventilación apropiada (aire filtrado por filtros absolutos de ser requerido), extracción eficiente (donde se genere calor, gases y/o vapores) e iluminación suficiente (natural o artificial).2,3

Las guías de la FDA (Federal Drug Administration) describen el procesamiento aséptico como un proceso en que el producto, contenedor y tapones son sujetos a procesos de esterilización, sin embargo, al ser estas operaciones separadas, tienen sus correspondientes consecuencias (como riesgo de contaminación) debido a que no hay cercanía entre un proceso y otro para mantener la esterilidad del producto y en contenedor final.

El término de área aséptica se define de manera sencilla como: “Zona comprendida dentro de un área limpia, diseñada y construida para minimizar la contaminación por partículas viables y no viables, manteniéndola dentro de límites preestablecidos”4. Esta área cuenta con un ambiente microbiológico controlado, y está diseñada de tal forma que permita una limpieza fácil y eficiente.

1 TESIS. “Auditorias Técnicas en la Industria Farmacéutica”. Alejandra Manzano Montiel. FESC, 2004 2 NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. “Buenas Prácticas de Fabricación para Establecimientos de la Industria Químico Farmacéutica dedicados a la Fabricación de Medicamentos”. 3 GUIA DE PRÁCTICAS ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS LIMPIOS. CIPAM. Monografía Técnica No. 1. México DF, 1989. 4 NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-059-SSA1-1993. “Buenas Prácticas de Fabricación para Establecimientos de la Industria Químico Farmacéutica dedicados a la Fabricación de Medicamentos”.

9.1.1 CLASIFICACIÓN DE LAS ÁREAS ASÉPTICAS Las áreas asépticas se clasifican en grado A, B, C y D de acuerdo con las características requeridas del aire. Ésta clasificación se representa en la Tabla 9-1

Tabla 9-1 Clasificación de los tipos de área aséptica usadas en la fabricación de productos farmacéuticos estériles.

Para controlar el nivel de contaminación microbiana de las distintas zonas de funcionamiento, deben monitorizarse las áreas (Ver práctica “Monitoreo Ambiental”). Cuando se realicen operaciones asépticas, la monitorización debe ser frecuente utilizando métodos como placas de sedimentación, muestreo volumétrico del aire y de superficies (por ejemplo, hisopos y placas de contactos). Los resultados del monitoreo deben estudiarse al revisar la documentación del lote para la liberación del producto terminado. Las superficies y el personal deben supervisarse tras las operaciones críticas. También es necesario realizar un monitoreo microbiológico después de la validación de sistemas, limpieza y desinfección, etc. Este monitoreo es adicional y distinto al que se lleva de rutina en la producción

9.1.2 AREAS DE FABRICACIÓN DE MEDICAMENTOS La fabricación de medicamentos está sujeta a requisitos especiales para minimizar los riesgos de contaminación microbiana, de partículas y de pirógenos. La garantía de calidad reviste una importancia especial y esta fabricación debe seguir estrictamente métodos de preparación y procedimientos establecidos y validados cuidadosamente. La confianza en la esterilidad u otros aspectos de la calidad no debe basarse exclusivamente en un proceso final o en los ensayos sobre un producto terminado.

Las diversas operaciones de preparación de los componentes, preparación del producto y llenado deberán realizarse en zonas separadas dentro de la zona limpia.

Las operaciones de fabricación se clasifican en dos categorías: aquellas en que el producto se esteriliza al final y aquellas que se realizan asépticamente en todas o alguna de sus partes.

9.2 PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS

9.2.1 PRUEBAS DE IRRITABILIDAD

9.2.1.1 Pruebas de Irritabilidad para Medicamentos de Uso Oftálmico. Los productos oftálmicos son preparados estériles de acuerdo a las buenas prácticas de manufactura para garantizar su seguridad y efectividad por lo que deben cumplir con la prueba de irritabilidad. Esta prueba se debe realizar no solo a colirios y pomadas oftálmicas sino también, a aquellos medicamentos de uso tópico que accidentalmente puedan introducirse al ojo (ungüentos, cremas o soluciones que se apliquen en la cara). Se basa en la evaluación de las reacciones oculares observadas después de la administración del producto oftálmico. Para la realización de la prueba se utilizan conejos albinos, adultos, sanos, de cepa adecuada y cuyo peso debe estar entre 1 a 3 Kg. Se deben mantener en jaulas individuales y aisladas, en condiciones de ventilación, temperatura, iluminación controlada. Los animales se deben emplear con una frecuencia no mayor de dos veces por semana, separando los ensayos consecutivos por un mínimo de tres días. Se aplican en el ojo derecho de cada uno de los conejos, 3 o 4 gotas del producto oftálmico en estudio y en el ojo izquierdo, el cual se toma como control, se aplica solución isotónica de cloruro de sodio estéril. Se observa la reacción del ojo a los 5 minutos y a las 24 horas, después de la aplicación de unas gotas de fluoresceína en los dos ojos, detectando la respuesta con la ayuda de una lámpara de luz ultravioleta5.

Además de estas pruebas realizadas in-vivo se pueden realizar técnicas in vitro en huevos fertilizados (se mide la irritación de la membrana coriónica después de administrar el medicamento), y existe la medición de la irritación de la cornea en ojos de ternera recién sacrificada. Todas estas técnicas se encuentran en la NOM-039-SSA1-1993

Aunado a la técnica realizada en conejos, se puede realizar pruebas de irritabilidad en piel de cobayos, e incluso se encuentran pruebas realizadas en piel de humano (prueba del parche)6.

9.2.1.2 Prueba de esterilidad. Las pruebas de esterilidad tal como están descritas en la farmacopea, son adecuadas para revelar la presencia de formas viables de bacterias, hongos y levaduras. No contempla la realización de pruebas específicas para detectar virus, ya que estas técnicas, para su cultivo son muy complicadas y están limitadas a la detección de algunas especies. Todos los lotes de productos inyectables en sus envases finales deben probarse en cuanto a su esterilidad. La USP XXV describe los requerimientos oficiales que se deben cumplir. La FDA usa esos requerimientos como guía para probar productos estériles no oficiales. La prueba oficial principal se realiza por el método de la filtración, pero se utiliza transferencia directa si la filtración por membrana es inadecuada. Esta prueba no pretende ser una evaluación definitiva para un producto sometido a un proceso de esterilidad de eficacia desconocida, sino que está concebida en mayor medida como

5 NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. “Determinación de los Índices de Irritación Ocular, Primaria Dérmica y Sensibilización”

una prueba para verificar la probabilidad de que un procedimiento de esterilización convalidado con anterioridad se haya repetido, o para asegurar la continuidad de su eficiencia. Al realizar la prueba de esterilidad a un determinado número de unidades de un lote, si los resultados obtenidos son negativos, indican que la probabilidad de encontrar unidades contaminadas en la parte no analizada, es menor al nivel detectable señalado en los planes de muestreo utilizados. Ningún plan de muestreo puede asegurar que todas las unidades del lote se encuentren libres de microorganismos, por lo que la garantía de que el producto sea estéril, se logra mediante la validación del proceso de esterilización.

La sensibilidad de esta prueba se ve afectada por la naturaleza del medio de crecimiento, por lo tanto debe realizarse utilizando medios de cultivo altamente nutritivos para que favorezcan el desarrollo de todos los microorganismos y esporas presentes en la muestra. Estos medio deben ser según la USP de caldo tioglicolato, apropiado para bacterias y el digerido de soya Tripticaseína para hongos y levaduras. Durante el desarrollo de la prueba esterilidad se deben tener las precauciones necesarias que eviten la contaminación de la muestra para que esta mantenga sus características microbiológicas originales.

Una vez preparados y esterilizados los medios de cultivo y antes de ser utilizados, tienen que ser sometidos a un proceso de control de calidad para confirmar que realmente hayan quedado estériles y que no pierdan su capacidad de promover el crecimiento bacteriano. Si después de incubar los tubos de tioglicolato a 30-35 °C y los de digerido de soya Tripticaseína a 20-25 °C durante un período de 7 días, no presenta turbidez, se comprueba la esterilidad de los medios.

La prueba de esterilidad es aplicable a medicamentos, materias primas, materiales de curación y productos de uso clínico. Los medicamentos que deben ser estériles cuando el paciente adquiere son los parenterales, los oftálmicos y los óticos. La calidad microbiológica de esos productos farmacéuticos por dos técnicas:

9.2.1.3 Método de siembra directa Se aplica a productos que no contengan inhibidores del desarrollo bacteriano y todos aquellos que permitan apreciar fácilmente el crecimiento microbiano en los tubos, después del período de incubación. Los ungüentos o líquidos oleosos, deberán esparcirse y los sólidos deberán disolverse en diluyentes estériles que no inhiban el desarrollo bacteriano y con esta solución se realizan los inóculos correspondientes. La prueba de esterilidad para gasa, algodón, y otros implementos quirúrgicos, debe realizarse lavando el material con solución isotónica estéril la cual después de arrastrar los microorganismos, se siembra en los medios especificados. La cantidad del inóculo y de medio dependerá del contenido del envase, pero nunca será inferior a 1 ml y 15 ml respectivamente. Los tubos de tioglicolato inoculados se incuban durante 14 días a 30-35 °C y los de digerido de soya Tripticaseína a 20-25 °C6.

6 PRADEU. “Análisis Químicos Farmacéuticos de Medicamentos”. Editorial Limusa. México DF.1998

9.2.1.4 MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA La prueba de esterilidad realizada por la técnica de filtración por membrana, es aplicable a aquellos productos estériles que pueden inhibir el desarrollo bacteriano, a los polvos insolubles, a las presentaciones parenterales de grandes volúmenes y prácticamente a cualquier tipo de muestra. El equipo de filtración soporta una membrana, la cual debe tener una porosidad de 0.45 micras, en la cual quedarán retenidas todas las formas viables y esporuladas de microorganismos, una vez que la muestra pase a través de ella. La unidad completa deberá esterilizarse en autoclave antes de ser utilizada; se conecta a un sistema de vacío para facilitar el paso de la muestra. Para el desarrollo de la técnica se requiere agua destilada estéril para disolver la muestra y solución de enjuague del artículo o muestra problema; generalmente se utiliza solución peptonada al 1% o solución salina isotónica de NaCl. Para muestras de líquidos miscibles en agua, la prueba se llevará a cabo vaciando dentro del recipiente de filtración de una manera aséptica, el contenido de los envases, aplicando vacío para favorecer el paso del líquido a través de la membrana. Si la solución contiene inhibidores del desarrollo bacteriano, se enjuaga el filtro con varias porciones de peptona al 1 % para eliminar cualquier residuo que pudiera permanecer en la membrana y afectar el resultado de la prueba. Ya drenado el líquido, se separa la membrana y sosteniéndola con pinzas estériles especiales se corta en dos, introduciendo cada una de las mitades en los tubos del medio Caldo de tioglicolato y en digerido de soya Tripticaseína, respectivamente. Los tubos se incuban a 30-35 °C y a 20-25 °C durante un período de tiempo no inferior a 7 días.

9.2.1.5 Prueba de Pirógenos Los pirógenos son productos del metabolismo celular presentes en artículos farmacéuticos que han estado en contacto con algún tipo de contaminación microbiana, los cuales al entrar al torrente sanguíneo pueden provocar reacciones febriles. De acuerdo a la capacidad inherente de producir pirógenos, las bacterias se han clasificado en cuatro grupos:

I Aquellas cuyos productos metabólicos no tienen efecto en la temperatura

II. Las que causan fiebre ligera durante un tiempo corto

III. Las que causan un incremento marcado en la temperatura durante varias horas

IV. Las que matan a los conejos o les producen colapso

Los pirógenos más potentes son los producidos por las bacterias coliformes de los géneros Salmonella y Pseudomonas. El proceso de esterilización por calor usado (cuando sea el caso) en la fabricación de medicamentos estériles no elimina la presencia de pirógenos en las soluciones parenterales, deben seguirse las buenas prácticas de manufactura durante la fabricación de los productos, para asegurar que cumplan con los requisitos de calidad establecidos para este ensayo. La prueba de pirógenos oficial está diseñada para mantener un nivel aceptable de riesgo de reacción febril en los productos farmacéuticos; se efectúa en conejos, en la cual se evalúa la elevación de la temperatura

corporal, después que se les ha administrado por vía intravenosa, la dosis especificada de acuerdo en la norma de cada producto. La temperatura corporal del conejo será determinada por vía rectal introduciendo un termómetro o termopar; no se deberán usar conejos que tengan una temperatura basal superior a 39.8 °C y que presenten una variación entre ellos de más de 1 °C. La temperatura basal control de cada uno de los tres conejos utilizados, debe registrarse 30 minutos antes de la administración de la dosis problema en la vena marginal de la oreja del conejo, y debe ser verificada a la primera, segunda y tercera hora después de la inyección. El producto cumple con la prueba de ausencia de pirógenos si ninguno de los conejos muestra un incremento individual igual o superior a 0.6 °C respecto a su temperatura control y si la suma de los tres incrementos individuales más altos, no excede de 1.4 °C.

9.2.1.6 PRUEBA DE Amebocitus de Limulus Para asegurar que las soluciones parenterales sean apirogénicas, las compañías farmacéuticas han utilizado por más de 40 años, la prueba oficial de pirógenos que marca la FEUM. En los últimos años se han desarrollado una prueba de pirógenos in Vitro por medio del reactivo de Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL), la cual permite estimar con gran sensibilidad y rapidez, la concentración de endotoxinas procedentes de la pared celular de bacterias G (-) en un producto farmacéutico. Esta determinación ha demostrado ser 10 veces más sensible que la obtenida por reacción febril del conejo. La prueba de LAL está basada en la aglutinación producida cuando las endotoxinas bacterianas se combinan con un preparado que contiene el lisado.

Para la realización de la prueba de LAL se deben de combinar cantidades específicas de la solución del ensayo y del Lisado diluido de Amebocitos (1:1 con buffer de fosfatos pH=7.2), incubando la mezcla a 37 °C durante una hora. Si la solución contiene endotoxinas, se produce un gel o aumento de viscosidad en la mezcla. La velocidad de reacción entre el Lisado y la endotoxina depende de la concentración, de la temperatura y del pH6.

9.3 OBJETIVOS

9.3.1 GENERAL

• Evaluar a los productos farmacéuticos considerados como estériles, mediante métodos oficiales, para determinar si cumplen con la normatividad vigente.

9.3.2 PARTICULARES

• Realizar las pruebas oficiales para productos farmacéuticos estériles para consumo humano y/o animal.

• Determinar si los productos evaluados están libres de agentes patógenos.

• Identificar los puntos críticos de riesgo que puedan ser fuente de contaminación en la fabricación de los productos considerados como estériles.

9.4 DESARROLLO EXPERIMENTAL

9.4.1 MATERIAL DE VIDRIO

Portaobjetos planos

Cubreobjetos

Tubos de ensaye grandes

Pipetas graduadas de 1, 5, 10 ml

Botellas de dilución (leche)

9.4.2 MATERIAL DIVERSO

Gradilla para tubos de ensaye Pinzas de disección (estéril)

9.4.3 EQUIPO

Autoclave

Estufa de incubación

Refrigerador

Filtración con membrana

9.4.4 MEDIOS DE CULTIVO EN TUBO O BOTELLA (por equipo)

Caldo Tioglicolato (CT) ( 10 tubos o 4 botellas por equipo)

Caldo Soya Tripticaseína (CST) (10 tubos o 4 botellas por equipo)

9.4.5 REACTIVOS

Solución Salina Fisiológica (estéril) Todos los necesarios para pruebas bioquímicas secundarias.

9.4.6 MUESTRAS Formas Farmacéuticas estériles (indicadas por los profesores)

DIAGRAMA DE TRABAJO EXPERIMENTAL

9.4.6.1 PRUEBA DE ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

9.4.6.2 PRUEBA DE ESTERILIDAD POR MEMBRANA

Sembrar en medios diferenciales y selectivos

9.5 RESULTADOS

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FARMACEÚTICA.

NOMBRE DE LA PRÁCTICA PRODUCTOS FARMACEÚTICOS ESTÉRILES.

Fecha de la Práctica

No. de Práctica

NOMBRE DE LOS ANALISTAS

CRECIMIENTO CST (hrs)

PRUEBA 24 48 72 96 120 144 168 192 384

ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA

ESTERILIAD POR MEMBRANA

CRECIMIENTO CT (hrs)

PRUEBA 24 48 72 96 120 144 168 192 384

ESTERILIDAD POR SIEMBRA DIRECTA

ESTERILIAD POR MEMBRANA

MEDIO DE CULTIVO COLONIAS OBSERVACIONES (CAMBIO

DE COLOR, COAGULACIÓN, ETC)

INTERPRETACIÓN

BIOQUIMICAS (SI ES EL CASO)

MICROORGANISMO(S) IDENTIFICADO(S).

CONCLUSIONES. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

FIRMA DE REVISIÓN

9.6 BIBLIOGRAFÍA CEJUDO, Blanca y GARZON, Ma. de Lourdes. “Control Biológico para Productos

Farmacéuticos”. Departamento de Sistemas Biológicos. División de C.B.S. UAM Xochimilco, 1993.

GUIA DE PRÁCTICAS ADECUADAS DE MANUFACTURA PARA CUARTOS

LIMPIOS. CIPAM. Monografía Técnica No. 1. México DF, 1989. MANZANO, Alejandra. Tesis. “Auditorias Técnicas en la Industria Farmacéutica”.

FESC, 2004. NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-039-SSA1-1993. “Determinación de los

Índices de Irritación Ocular, Primaria Dérmica y Sensibilización” NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-056-SSA1-1993. “Requisitos Sanitarios del

Equipo de Protección Personal”.