luciferasa final

5/14/2018 Luciferasa Final.. - slidepdf.com

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Proyecto de Taller de Investigación

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Tabla de contenido

Planta de tabaco alterada con lucíferasa. .......................................................................................................................... 3 Introducción. ............................................................................................................................................................... 3 Propósitos .................................................................................................................................................................... 4

Propósito ................................................................................................................................................................. 4 Objetivos ...................................................................................................................................................................... 4

General .................................................................................................................................................................... 4 Especifico ................................................................................................................................................................ 4 Justificación. ............................................................................................................................................................ 6 Preguntas de investigación. ................................................................................................................................. 7

Hipótesis. ..................................................................................................................................................................... 7 Fundamento teórico ................................................................................................................................................... 8

Antecedentes........................................................................................................................................................... 8 Tratamiento de la información. .............................................................................................................................. 11 Alcances y limitaciones ............................................................................................................................................ 44

Alcances ................................................................................................................................................................. 44 Limitaciones .......................................................................................................................................................... 44 Metodología .......................................................................................................................................................... 44

Referencia bibliográfica ........................................................................................................................................... 44

Libros ..................................................................................................................................................................... 45 Anexo.......................................................................................................................................................................... 47

Anexo 1.................................................................................................................................................................. 47 Anexo 2.................................................................................................................................................................. 49




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Planta de tabaco alterada con lucíferasa.

Introducción.Los vegetales constituyen el componente nutricional más

importante para la humanidad y son la fuente de multitud de

materias primas. Por este motivo la investigación en el

campo de la ingeniería genética de plantas recibe una gran

atención en los organismos públicos, pero también, debido a

su enorme interés comercial, ha recibido un fuerte impulso

por parte de las grandes multinacionales del sectoragroalimentario. Esto, unido a la menor dificultad que

presenta la modificación genética de las plantas con

respecto a los animales, ha hecho que en tan solo dos

décadas se haya avanzado de una forma espectacular en

este campo. Hoy día, se cultivan una gran variedad de

especies vegetales de interés agrícola y comercial

modificadas genéticamente (plantas GM llamadas también

plantas transgénicas) y la extensión de estos cultivos en el

mundo crece de forma exponencial. Actualmente se

encuentran en el mercado una gran variedad de productos

alimentarios procedentes de estos cultivos.

En este tema se analizan las estrategias y las técnicas que

se utilizan, así como la aportación que provocan estas

técnicas a las ciencias que las practican, principalmente que

nos sea permitido poder apreciar los fines que se buscanalcanzar por parte de los científicos practicantes de estas

técnicas.




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Propósitos

PropósitoLas plantas de tabaco de tono verde cambiaron a un tono

bioluminescente, el propósito de esta investigación esconocer el porqué de ese tono y el beneficio, o causas que

pudieran ocasionar al ser humano.

Parte de esta investigación describen los métodos de

transformación de las plantas. Además de algunos aspectos

botánicos de la planta de tabaco

Objetivos

General Se asimilara la importancia de la incorporación del

gen de la lucíferasa a la planta de tabaco.

El análisis de una planta mejorada o transgénica, en

este caso la planta de tabaco.

Dar a conocer el proceso que se aplica en la

incorporación del gen de la lucíferasa a la planta de

tabaco.

Cuál es el beneficio que aporta este gen a la planta.

Conocer si la aplicación es este gen a la planta

puede hacerla resistente a enfermedades o a

herbicidas, a condiciones climáticas, etc.

Establecer cómo afecta la estructura de la planta de

tabaco el gen de la lucíferasa.

Especifico Conocer las propiedades que tiene la luciérnaga

(Photinuspilarys), que tiene el gen de la lucíferasa.




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A través de qué proceso ocurre esta transformación

en la planta de tabaco.

Cual fue la razón por la cual se realizó estatransformación a la planta de tabaco.

Cuáles son los beneficios y consecuencias de la

incorporación del gen de la lucíferasa a la planta de

tabaco.

Conocer cuál es la modificación a nivel genético en su

estructura y que se obtiene al modificar la planta de

tabaco. Establecer el por qué se realiza este experimento de

modificación, es decir

Cuál es la finalidad de este proceso.




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Justificación. La realización de la presente investigación es con el fin de

lograr identificar el origen del tono bioluminescente de la

planta del tabaco, y a su vez lograr saber si el uso de

enzimas como marcadores provocan algún efecto

secundario a la salud de los seres humanas, de esta forma

lograr descartar la hipótesis en cuanto a los daños que este

uso pudieran provocar a la humanidad y poder determinar

los objetivos que impulsaban a la práctica del uso de la

lucíferasa hacia la planta del tabaco.

Todo esto será posible a través de la teoría.




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Preguntas deinvestigación. ¿Cómo realizan los científicos el agregado de enzima

lucíferasa a la planta del tabaco? ¿Qué beneficio nos proporciona el agregado de estaenzima a la planta de tabaco?

¿En verdad es grato el resultado obtenido por loscientíficos después de esta alteración genética?

¿Qué fue lo que motivo a los científicos a realizarestas pruebas con la planta del tabaco?

Hipótesis.

Determinar si es posible introducir un gen alterno a

una planta, en este caso saber si el experimento

transgénico, de introducir el gen de la lucíferasa

permanece en la planta de tabaco.

La nueva planta adquirirá las características que

puede darle el gen que se introduce en la planta de

tabaco. La luminiscencia.




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Fundamento teórico

Antecedentes.

La genética durante muchos años ha intentado mejorar lasplantas a través de alteraciones en sus genes, esto lo han

realizado mediante diferentes métodos intentando así

proporcionarle a diferentes plantas, cualidades que les

permitan resistir a diferentes plagas, climas, etc.

Muchas plantas tienen un gran potencial extractivo en el

campo de los reactivos útiles para la investigación científica.

Algunos de los principales productos que se pueden obtener

de las plantas:

Insecticidas

Enzimas

Inhibidores de enzimas

Proteínas

Planticuerpos (inmunoglobulinas gamma y kappa

producidas en plantas)

El campo más amplio de estos productos es el de las

enzimas, que comprende todo tipo de catalizadores

biológicos que van desde proteasas hasta DNA –

polimerasas. Una mayor producción de estas sustancias

puede obtenerse por selección artificial, selección masal e

intervención genética.

La tecnología de producción de anticuerpos recombinantes

en plantas (o Planticuerpos) es uno de los mayores avances

de la biotecnología moderna. Mediante el aislamiento de

genes específicos en mamíferos, se pueden obtener




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grandes cantidades de anticuerpos monoclonales en las

plantas, los cuales sirven para la investigación en virología y

para la detección de muchas enfermedades virales pormedio de métodos inmunológicos.

Las plantas de tabaco (Nicotianatabacum), petunia (Petunia

spp.), zanahoria (Daucus carota), Arabidopsisthaliana y

Corydalissempervirens son fuente primaria de metabolitos

como la achicoria 5, que es un aditivo principal para los

alimentos procesados ya que favorece la asimilación de

nutrientes en el organismo. Otro metabolito importanteextraído de las plantas es el manitol, un azúcar alcohólica

que se usa en la industria de alimentos, en la industria

farmacéutica y ampliamente en la química analítica y la

microbiología, puesto que es un buen regulador osmótico

neutro.

El asentamiento de los pueblos nómadas permitió que los

primeros labradores de la tierra comenzaran a elegir y

cultivar ciertas plantas para alimentarse y supuso el inicio de

la civilización humana. Desde entonces los agricultores han

sido profundos conocedores de la genética empírica y

acumulando conocimientos prácticos que han transmitido

durante generaciones han sido capaces de “crear” multitud

de especies nuevas para uso y consumo de la humanidad.

A lo largo del siglo XX se produjo un cambio drástico en laagricultura pasando de la artesanía genética, practicado

durante milenios, a la ingeniería genética.

Algunas fechas importantes que marcan hitos importantes




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en este siglo revolucionario también para la agricultura son

las siguientes:

1910Los botánicos europeos comienzan a aplicar las leyes de

Mendel para la mejora de plantas agrícolas; es el comienzo

de la selección y mejora clásicas con base científica.

1950

Se obtiene la primera generación de plantas procedentes de

un cultivo in vitro

1968Se inicia la Revolución Verde, se introducen las semillas

híbridas en los países del Tercer Mundo. Comienza la

comercialización de las semillas, y la introducción de

productos industriales en la agricultura: herbicidas,

pesticidas, abonos químicos .En pocos años se logra un

incremento drástico en la producción agrícola y en el

rendimiento de las cosechas, imprescindible para alimentar

a la creciente población humana.

1973

Primer OGM. Los investigadores logran aislar genes e

introducirlos en un genoma ajeno, se obtiene la primera

bacteria Escherichiacoli transgénica que representa el inicio

de la Ingeniería Genética.

1983

Primera planta GM. Se obtiene la primera plantatransgénica, una planta de tabaco con el gen de la

resistencia al antibiótico kanamicina, lograda por un equipo

de científicos de la multinacional agroalimentaria Monsanto.




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1986

Primer OGM en el campo. Se emplea “Frostban” un spray

que contenía bacterias modificadas genéticamente, a las

que se les había introducido un gen que produce resistencia

a las heladas. Se pulverizan sobre cultivos de fresas para

protegerlos del daño provocado por las heladas en los

campos de Brentwood (California).

1994Primer OGM en el mercado. Se pone a la venta en USA el

tomate FLAVR SAVR, modificado genéticamente de forma

que tiene una maduración retardada, producido por la

empresa Calgene.

Tratamiento de la información.

Como tal, la biotecnología ha sido utilizada por el hombre desde loscomienzos de la historia en actividades tales como la preparación del pan y

de bebidas alcohólicas o el mejoramiento de cultivos y de animales

domésticos. Históricamente, biotecnología implicaba el uso de organismos

para realizar una tarea o función. Si se acepta esta definición, la

biotecnología ha estado presente por mucho tiempo. Procesos como la

producción de cerveza, vino, queso y yogurt implican el uso de bacterias o

levaduras con el fin de convertir un producto natural como leche o jugo deuvas, en un producto de fermentación más apetecible como el yogurt o el

vino.

De acuerdo a Izquierdo (1999), la biotecnología no es, en sí misma, una

ciencia; si no que es un enfoque multidisciplinario que involucra varias




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disciplinas y ciencias tales como la biología, bioquímica, genética,

virología, agronomía, ingeniería, química, medicina y veterinaria entre

otras. García (2000), define a la biotecnología como un conjunto deinnovaciones tecnológicas que se basan en la utilización de

microorganismos y procesos microbiológicos para la obtención de bienes y

servicios, y para el desarrollo de actividades científicas de investigación.

El creciente interés que en los últimos años ha despertado la biotecnología,

tanto en los medios académicos como en la actividad económica, se ha

traducido, entre otras cosas, en una proliferación de definiciones. Esta

relativa abundancia es un reflejo, por un lado, del carácter multidisciplinariode la biotecnología y, por el otro, de la dificultad que existe para fijar

estrictamente sus límites. Todas las definiciones tienen en común que

hacen referencia al empleo de agentes biológicos y de microorganismos,

pero en un sentido más amplio se diría que la biotecnología consiste en un

gradiente de tecnologías que van desde las técnicas de la biotecnología

tradicional, largamente establecidas y ampliamente conocidas y utilizadas,

hasta la biotecnología moderna, basada en la utilización de las nuevas

técnicas del ADN recombinante llamadas de ingeniería genética (Bolaños,

2000).

Los conocimientos genéticos se han utilizado desde hace muchos años

para obtener variedades más útiles de plantas y animales, pero con los

procedimientos modernos de ingeniería genética esto se puede hacer con

mayor rapidez, y además ha sido posible introducir genes que son de otras

plantas o de otros seres vivos en cualquier especie vegetal o animal, sin

tener que depender de cruces entre variedades de la misma especie, como

sucedía en la genética tradicional. Representando esta técnica un gran

avance científico, debido a que tiene una capacidad enorme para cambiar

de forma revolucionaria la agricultura y, no solo la agricultura, sino muchos




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otros campos (Aguilar, 2002).

Como definición se tiene que la ingeniería genética es una rama de la

genética que se concentra en el estudio del ADN, con el fin de sumanipulación; en otras palabras, es la manipulación genética de

organismos con diversos propósitos como lo son la creación de individuos

con mejores características, la corrección de defectos genéticos y la

fabricación de numerosos compuestos (Sandel, 2007). Según Lemkow

(1993), la ingeniería genética es la introducción de nueva información

genética en un organismo para dotarlo de capacidades que antes no tenía,

para su posterior reproducción, obteniendo organismos modificados queson empleados para determinados usos y funciones.

Pese a los beneficios que promete la ingeniería genética existe una gran

discusión sobre los posibles efectos negativos de esta técnica, por

consecuencia de que permite a los científicos intercambiar genes entre

especies que normalmente no se cruzarían, dando origen a nuevos

organismos denominados comúnmente como transgénicos, que en los

últimos años han causado gran polémica en diversos sectores de la

sociedad por sus posibles efectos negativos tanto en la salud al ser

consumidos, como en el ambiente en caso de ser liberados (Reymond y

Smith, 2007).

Agrobacterium : un precursor natural de la biotecnología.

El co-cultivo de células o tejidos con Agrobacterium tumefaciens es el

procedimiento más utilizado para transformar plantas dicotiledóneas, las

bacterias del género Agrobacterium son patógenos de las plantas capaces

de inducir una malformación llamada tumor de agalla. Estas bacterias

penetran en los tejidos vegetales causando una proliferación celular




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(Carrasco, 1999).

Durante el contacto con las células vegetales la bacteria transfiere a las

células vegetales un plásmido llamado Ti (inductor de tumores). Esteplásmido se integra en el ADN del cromosoma de la célula vegetal. El

plásmido transferido o T-ADN contiene los genes oncogénicos (onc) cuya

expresión provoca una mayor producción de hormonas de crecimiento,

estas son las que inducen las divisiones celulares que dan origen a la

formación del tumor o agalla (Figura 1).

Figura 1. Inducción de tumores en plantas por efecto de Agrobacterium tumefaciens. (Fuente:

Zamora, 2003. Ingeniería genética en agricultura).

De esta forma, la bacteria establece con la planta una especie de"colonización genética", obligándola a fabricar una sustancia de la que sólo

se puede nutrir el Agrobacterium y que es segregada en el tumor.

El estudio del plásmido mencionado, permitió observar la existencia de

genes de virulencia y de genes inductores de tumores. Estos últimos están




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flanqueados por unas secuencias de nucleótidos características en el

borde izquierdo y derecho. Mediante manipulación genética se consiguió

obtener cepas de Agrobacterium sin genes tumorales pero manteniendolos bordes izquierdo y derecho (Figura 2). De esta forma, cualquier gen

integrado dentro de estos bordes será transferido a las células de la planta.

Figura 2.

Cepa de Agrobacterium tumefaciens con ausencia de genes tumorales. (Fuente: Zamora, 2003.

Ingeniería genética en agricultura).

Una vez introducido el transgen en el Agrobacterium , es necesario

proceder a co-cultivar las células de la planta con la bacteria. Para ello se

emplean tejidos vegetales que deben ser heridos con el fin de activar los

genes de virulencia bacterianos y así inducir la introducción del transgen.




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Los tejidos vegetales empleados pueden ser de hoja, de cotiledones,

fragmentos de tallo o incluso semillas en germinación. Este sistema es más

fiable que otros ya que la transformación es más estable y sólo seintroduce una copia del transgen (Carrasco, 1999).

La introducción de genes extraños en plantas para incorporar caracteres

deseables, es un objetivo importante de la investigación Actual. La

incorporación de propiedades como resistencia a enfermedades a

herbicidas, al frio, a la salinidad, esc. A especies de interés agrícola, tiene

una gran trascendencia económica. Todo esto tiene grandes dificultades y

el conocimiento está lejos de alcanzar todas sus aplicaciones prácticas, poruna parte porque los vectores conocidos para la clonación de genes en

bacterias no sirven para las células vegetales, y por otra parte porque la

expresión genética en las eucariotas está sujeta a regulaciones muy

complejas. A pesar de todo se han obtenido muchas plantas transgénicas

de interés agrícolas e industrial con propiedades mejoradas que van

alcanzando las autorizaciones para su explotación comercial. El camino

para introducir genes en cromosomas vegetales se ha descubierto por el

estudio del agroobacterium humefaciens bacteria que en las plantas

produce tumores amorfos, cuyas células vegetales cultivadas invitro se

multiplican también de forma incontrolada. Esta bacteria , inoculada en

una planta de una hoja ancha produce un tumor en la unión del tronco

con la raíz e introduce, en estas células, un plásmido (plásmido Ti)

(tumuorinducins) que porta genes que se incorporan al cromosoma

vegetal y da lugar a la producción de nuevos péptidos (opinas) que sirven

de alimento para alas bacterias estos genes están situados , junto con susreguladores, en un segmento llamado DNA –T (transferido) que es el que

se transfiere al cromosoma vegetal, el DNA-T tiene en cada extremo una

secuencia de 25 nucleótidos que son adherentes con determinadas zonas

de un cromosoma vegetal. El plásmido lleva dos genes fundamentales




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para su acción: un gen oncogénico causante del crecimiento descontrolado

de las células vegetales y un gen productor de un péptido llamado opina

que sirve de alimento de la bacteria que prolifera. El oncogén induce unaalta producción de auxina. El plásmido Ti del A. tumefasiens es un vector

adecuado para introducir genes y caracteres extraños en vegetales apara

ello es necesario:

a) Introducir el gen extraño en el plásmido Ti, insertarlo en el segmento

de DNA-T e incorporarlo en A tumefaciens.

b) Infectar células vegetales cultivadas, A. tumefaciens transformado

c) Que el segmento de DNA-T transformado se inserte en el

cromosoma vegetal.

d) Que se puede regenerar la planta entera a partir de las células

transformadas.

e) Que en la planta regenerada se expresa en los genes extraños

insertados y se manifiesten los nuevos caracteres. La trasformación

de las célula vegetal y la regeneración de una planta transformadase ha realizada según las siguientes etapas

1) La agrobacterium tumefaciens manipulada tiene insertado el gen

deseado en su plásmido Ti y , dentro de este, en el segmento

transferible (DNA-T) la obtención de una cepa de esta bacteria

con su plásmido Ti recombinante exige una manipulación

complicada de varios pasos.

2) Actualmente se dispone de un plásmido artificial pequeño

(plásmido Binario) formado por el segmento de T. con sus

extremos derechos e izquierdos para insertarse en un

cromosoma vegetal, este plásmido vegetal artificial e3s fácil de




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manipular en el laboratorio y permite la inserción de un gen

extraño; además lleva incorporado otro gen de resistencia, con

Kenamisina, que permite la selección de las células que loincorporan. También se dispone de células manipuladas de A.

tumefaciens cuyo plásmido Ti carece de la región T pero

conserva todos los genes de virulencias. Necesarias para la

infección de células vegetales.

3) Cuando en esta bacteria se introduce el pequeño plásmido

binario y aquellas infectan células vegetales de un tejido, el gen

extraño se introduce en el genoma vegetal. De ese cultivohibrido puede reconstruirse una planta completa, haciéndolo

diferenciarse en tallos y enraizare la carencia del oncogén A.

tumefaciens utilizado facilita la diferenciación.

Una gran pare de la investigación actual no busca aplicaciones

inmediatas si no el conocimiento del mecanismo de los procesos

bioquímicos implicados en el problema y el desarrollo de técnicas validas

se han logrado plantas de tabaco que llevan el gen de la alcohol

deshidrogenasa de la levadura, Pero el gen no se expresa en ellas. Una

experiencia espectacular ha sido la obtención de plantas enteras de

remolacha y tabaco que llevan incorporado el gen de la lucíferasa,

procedente de un insecto luminoso (Photinuspilarys). Esta enzima oxida la

luciferina con producción de luz las nuevas plantas obtenidas pueden

verse y fotografiarse en la oscuridad

Del mismo modo se han obtenido plantas enteras cuyas células

tienen incorporadas un gen bacteriano de resistencia a la

Kenamisisna otros resultados pueden ser de aplicación más




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inmediata, por ejemplo en plantas de tabaco se ha introducido un

gen del maíz que es responsable de su resistencia a los herbicidas

triasinicos, También se ha introducido, en plantas de tabaco, un genbasillusthurigensis k es responsable de la producción de su toxina

insecticida. Algunos preparados de B. turigensis vivos están

autorizados para combatir algunas plagas: por ejemplo, se usa

masivamente en pulverizaciones aéreas para infectar la

procesionaria de los bosques de pinos, las plantas que han

incorporado este gen son tóxicos para algunas especies de

insectos, que mueren al comer de ellas. Actualmente es posiblesintetizar genes “inversas” a los naturales, es decir, que tienen la

secuencia de bases inversas a la del gen natural (anti genes).

Otra especie importante en este campo es Nicotiana tabacum (la planta del

tabaco) que fue usada inicialmente para el estudio de los circuitos de

regulación y expresión genética (Madigan et al. 1999) mediante la

construcción de una planta transgénica que expresaba el gen de la

lucíferasa (enzima que produce la luminiscencia en las luciérnagas), y la

respuesta luminosa de la planta permitió dilucidar muchos mecanismos de

interacción entre genes que no se conocían antes (Fig. 3). También fue un

modelo principal para el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética, y

es considerada como un buen modelo evolutivo en plantas (Klug&

Cummings 1999).




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Fig. 3: Nicotianatabacum transgénica expresando el gen de la lucíferasa (tomado de Madigan et al. 1999).

N. tabacum también se empleó para la expresión de proteínas víricas como

la P24 del virus X de la papa y la generación de plantas resistentes a virus

mosaico (Ares et al. 1998). Otra especie cercana a N. tabacum es N.longiflora que se usó ampliamente como modelo de genética mendeliana.

Las plantas han estado muy vinculadas con el desarrollo de la civilización

humana. Desde tiempos prehistóricos, los seres humanos consumieron

frutos y semillas como alimento, y pronto comenzaron a cultivar y

recolectar aquellas que tenían mayor interés. Las semillas desde el punto

de vista nutritivo son un almacén muy concentrado de proteínas, aceites,

carbohidratos y vitaminas, ya que estos compuestos son necesarios para

la germinación y el desarrollo de la planta. Asimismo, tienen una gran

ventaja sobre otro tipo de alimentos que, generalmente, resultan muy

perecederos, sin embargo, las semillas son fáciles de almacenar y,




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además, pueden conservarse durante largos periodos de tiempo si se las

mantiene secas, de tal modo que son de los pocos alimentos que pueden

ser guardados en tiempos de abundancia para aprovecharlos en épocas deescasez. Pocos alimentos tienen esta doble ventaja.

Pero tampoco en esto los seres humanos hemos sido muy originales.

Todos los seres vivos del planeta dependen para su alimentación de las

plantas. Las únicas formas de vida en la Tierra que no dependen de las

plantas para su existencia son algunas pocas especies de procariotas y

protistas autótrofos. Para el resto de los seres vivos las plantas son

indispensables ya que la energía de la luz solar entra a la biosfera a travésde los cloroplastos de las plantas, y el carbono y otros elementos

fundamentales para la vida como el nitrógeno y el azufre se incorporan a

los ecosistemas como moléculas orgánicas gracias a que son asimilados

por las plantas. Los seres vivos que no comen plantas se alimentan de

otros que si las comieron. Las plantas están en la base de las cadenas

alimentarias.

La domesticación de algunas plantas para su uso como alimento, que

puede considerarse la biotecnología más antigua, constituye un largo y

paciente proceso, que se inició hace miles de años y continúa en la

actualidad. Durante este largo periodo siempre se ha buscado lo mismo:

“mejorar”, desde el punto de vista humano, las propiedades de estas

plantas; lograr que tengan buenas y agradables condiciones nutritivas, que

tengan un mayor rendimiento, y que tengan características que favorezcan

su cultivo y faciliten su recolección. El resultado de este proceso de

domesticación, con profundas consecuencias evolutivas, es la “creación”

de diversas variedades cuyo único objetivo es servir a las necesidades

humanas, y cuya supervivencia está prácticamente limitada a su cultivo y

su mantenimiento seria imposible sin los cuidados del hombre. No

obstante, las cosechas a su vez han dependido de multitud de factores




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externos a las propias plantas domesticadas cuyas condiciones la

humanidad no ha podido controlar, como la climatología y las plagas que

han arruinado, y siguen haciéndolo todavía en porcentajes muyimportantes, los rendimientos de los cultivos.

Se estima que alrededor de una 80000 especies de plantas son

comestibles, de las cuales los humanos únicamente cultivamos 300,

aunque sólo 12 de ellas podemos considerar que son esenciales para la

alimentación de la humanidad, y tan sólo 3, arroz, maíz y trigo, pueden ser

consideradas como la base de la alimentación mundial.

Además de su importancia alimenticia, las plantas han representado parala humanidad una fuente fundamental para la obtención de muchos otros

compuestos: fibras vegetales para el vestido y la construcción, compuestos

para la salud, tintes, cosméticos, etc.

La mayor parte de las plantas que el ser humano cultiva y explota, así

como las semillas y frutos que consume proceden de las plantas que los

botánicos denominan Angiospermas, que son las plantas con flores,

aunque también son comestibles las semillas de algunas Gimnospermas o

plantas sin flores, como es el caso de los piñones del pino.

Las plantas con flores son fundamentales para nuestra supervivencia como

especie. Todos los cultivos importantes que nos proporcionan alimento

como los cereales: trigo, arroz, maíz y cebada; las plantas leñosas, de las

cuales obtenemos madera, como el roble, castaño, cerezo; las que nos

proporcionan fibras como el algodón y el lino; y otros muchos productos

como el caucho, el tabaco, el café, el chocolate, los aceites aromáticospara los perfumes, y los miles de medicamentos como el digital y la

codeína, por poner solamente algunos ejemplos, son obtenidos de plantas

que pertenecen al grupo de las Angiospermas.

Las Angiospermas son actualmente las plantas con más éxito y sus más




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de 235.000 especies dominan el planeta, aunque no siempre en la historia

de la Tierra fue así ya que su aparición es muy reciente, unos 180 millones

de años según el registro paleontológico. Comenzaron a ser muyabundantes hace unos 120 millones de años, coincidiendo con el declive

de los dinosaurios. Se han adaptado a todos los ambientes y presentan

una amplia variedad de formas y tamaños, desde las pequeñas plantas

herbáceas de los pastos y praderas con diminutas flores, a las plantas con

grandes y llamativas flores hasta los gigantescos árboles de los bosques.

Las Angiospermas son plantas vasculares que se reproducen de manera

sexual, mediante un proceso de doble fecundación único entre los seresvivos, formando flores y frutos que las distinguen de todas las otras

plantas. El fruto protege la semilla en desarrollo y a menudo ayuda a su

dispersión. La flor y el fruto representan mecanismos por los cuales los

animales son atraídos para participar en la estrategia reproductora de este

tipo de plantas, y probablemente evolucionaron como un pago a los

animales por los servicios prestados en el transporte de las semillas.

Dentro de las Angiospermas se distinguen dos clases: las

monocotiledóneas, que son generalmente plantas herbáceas con hojas

largas y estrechas, con nerviaciones paralelas, entre las que se incluyen

los pastos, los lirios, la cebolla, las palmeras, y los cereales cuyas semillas

son fundamentales para el alimento de la humanidad como son el trigo,

arroz y maíz; y las dicotiledóneas que son más diversas e incluyen muchas

más especies (al menos 180.000), entre las que podemos citar, por

ejemplo, el roble, los girasoles, los cactus, los arándanos, el tomate.

El tabaco es un producto de la agricultura originario de América y

procesado a partir de las hojas de varias plantas del género

Nicotianatabacum . Se consume de varias formas, siendo la principal por

combustión produciendo humo. Su particular contenido en nicotina la hace

http://es.wikipedia.org/wiki/Nicotiana_tabacum






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muy adictiva. Se comercializa legalmente en todo el mundo, aunque en

muchos países tiene numerosas restricciones de consumo, por sus efectos

adversos para la salud pública.

El tabaco de Virginia, Petén o hierba santa (Nicotianatabacum ) es una

planta herbácea perenne, de la familia de las solanáceas, de cuyas hojas

se produce la mayor parte del tabaco consumido hoy en el mundo. Es

oriunda de América tropical, y está estrechamente emparentada con otras

plantas cultivadas comercialmente, como el tomate (Solanumlycopersicum )

y la papa (Solanumtuberosum ).

N. tabacum es una hierba perenne, robusta, de 50 a 120 cm de altura. La

raíz es larga y fibrosa. El tallo es erecto, de sección circular, pilosa y

viscosa al tacto. Se ramifica cerca de su extremo superior, produciendo

hojas densas, grandes (30 a 60 cm de largo por 10 a 20 de ancho),

alternas, sésiles, ovado a lanceoladas, apuntadas, de color verde pálido; al

tacto comparten la viscosidad del tallo. Son frágiles, y despiden un olor

ligeramente acre y narcótico, debido a la nicotina, un alcaloide volátil desabor agresivo y olor intenso.

Las flores son verde-amarillentas o rosadas según la variedad, con un

pequeño cáliz de 1 a 2 cm y una corola pubescente, de cinco lóbulos

aovados, de hasta 5 cm. El ovario es glabro; la planta es hermafrodita,

produciendo flores de ambos sexos. La polinización es entomófila, siendo

himenópteros y lepidópteros los principales polinizadores. Aparecen a

comienzos del verano, y hacia octubre dan un fruto en forma de cápsula de1,5 cm de largo.

http://es.wikipedia.org/wiki/Solanum_lycopersicum



http://es.wikipedia.org/wiki/Solanum_tuberosum



http://es.wikipedia.org/wiki/Flor

http://es.wikipedia.org/wiki/Polinizaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Entomofilia

http://es.wikipedia.org/wiki/Himen%C3%B3ptero

http://es.wikipedia.org/wiki/Lepid%C3%B3ptero

http://es.wikipedia.org/wiki/Polinizador

http://es.wikipedia.org/wiki/Fruto

http://es.wikipedia.org/wiki/Fruto

http://es.wikipedia.org/wiki/Polinizador

http://es.wikipedia.org/wiki/Lepid%C3%B3ptero

http://es.wikipedia.org/wiki/Himen%C3%B3ptero

http://es.wikipedia.org/wiki/Entomofilia

http://es.wikipedia.org/wiki/Polinizaci%C3%B3n

http://es.wikipedia.org/wiki/Flor






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Composición química.

Glúcidos (40%), sales minerales (15-20%) y ácidos fenoles (cafeico,

clorogénico).

Principios activos: Alcaloides piridínicos (2-15%). El principal es la

nicotina, líquido oleoso, volátil, soluble en agua y solventes

orgánicos.

Características botánicas.

El tabaco es una planta dicotiledónea y vivaz, que rebrota al cortarse.

Suele cultivarse como planta anual, aunque en los climas de origen puededurar varios años, pudiendo alcanzar el tallo hasta dos metros de altura.

Hojas: son lanceoladas, alternas, sentadas o pecioladas.

Flores: hermafroditas, frecuentemente regulares.

Corola: en forma de tubo más o menos hinchado, terminado por un limbo

con5 lóbulos.

-Raíces: el sistema radicular es penetrante, aunque la mayoría de las

raíces finas se encuentran en el horizonte más fértil.

Fruto: cápsula recubierta por un cáliz persistente, que se abre en su vértice

por dos valvas bífidas.

Semillas: son numerosas, pequeñas y con tegumentos de relieves

sinuosos más o menos acentuadas.

http://es.wikipedia.org/wiki/Nicotina

http://es.wikipedia.org/wiki/Nicotina




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La manipulación genética de las plantas no es, estrictamente hablando,

una novedad. El hombre ha modificado durante miles y miles de años el

contenido genético de multitud de plantas de interés agrícola, en unproceso de domesticación largo y acumulativo, basado en cruces, incluso

entre especies diferentes, y en la selección posterior de semillas, con unas

prácticas que con el tiempo se fueron haciendo cada vez más sofisticadas.

A pesar de que estos métodos eran lentos e inciertos,

Jugando el azar un papel bastante importante, se han logrado obtener

especies vegetales que en poco se parecen a las originarias silvestres de

las cuales derivaron tras siglos de paciente labor agrícola.Las nuevas tecnologías de ingeniería genética no han hecho sino acelerar

la velocidad de este proceso y, sobre todo, afinar en la selección de

caracteres, ya que permiten elegir genes en vez de mezclar genomas

completos, pero tienen esencialmente el mismo fundamento y objetivo.

Sin embargo, una diferencia sustancial es que los métodos de mejora

clásica de plantas estaban limitados por la variabilidad genética, que podía

ser suministrada únicamente por especies que se cruzaran entre sí, es

decir, por especies próximas. El gran potencial, y a la vez el riesgo, de la

ingeniería genética reside en que se han roto estos límites,

desapareciendo las barreras para elegir y transferir genes entre especies e

incluso entre taxones, lo que proporciona un amplio rango de posibilidades

para suministrar el fenotipo deseado a un organismo.

La ingeniería genética de plantas tienen un enorme potencial de

aplicaciones y, al menos, tres factores importantes confluyen para explicar

los impresionantes avances alcanzados en este campo:

Enormes intereses económicos y, por tanto, una elevada

financiación destinada a la investigación para la mejora en la

producción de frutos y semillas de interés para la alimentación




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humana y ganadera, con mejores cualidades y mayor rendimiento.

Además del interés que tiene la obtención de nuevas variedades

destinadas a condiciones ambientales adversas (salinidad,temperaturas elevadas) o para su cultivo en terrenos hasta ahora

considerados no fértiles.

Por otra parte, la creación de nuevas variedades de flores y plantas

de interés ornamental es también un campo de enorme futuro comercial.

A nivel industrial, las plantas son también una importante fuente de

materias primas. Productos como el almidón y el azúcar tienen gran

importancia para las industrias relacionadas con la alimentación, pero

también con la energía. El etanol, obtenido por fermentación de la caña de

azúcar se utiliza en mezcla con petróleo como combustible en los coches

en Brasil. Productos como el algodón, el lino, etc., son la base de la

industria textil.

Así mismo, las plantas son la fuente de multitud de compuestos

químicos para la industria farmacéutica, cosmética, de aditivos

alimentarios, etc.

Menor dificultad para obtener plantas transgénicas. La producción

de plantas transgénicas es, al menos en teoría, mucho más sencilla

que la de animales transgénicos. Las plantas tienen una gran

capacidad regenerativa. En muchos casos, una sola célula

manipulada genéticamente puede dar origen a la producción de una

nueva variedad. Muchas células vegetales son “totipotentes”, esto

es, capaces de multiplicarse, diferenciarse y acabar formando

plantas completas y fértiles. Esto representa una gran ventaja con

respecto a la obtención de animales transgénicos, ya que se pueden

obtener plantas genotípicamente alteradas a partir de una única




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célula transformada. Además, la larga historia de la agricultura ha

proporcionado un profundo conocimiento de la genética de las

plantas cultivadas y se dispone de una enorme variedad de líneasportadoras de mutaciones que hoy pueden ser explotadas a nivel

molecular. La capacidad de autofecundación de muchas plantas y la

producción de una numerosa progenie hace que sea más fácil

encontrar mutaciones y recombinaciones poco frecuentes y obtener

homocigotos.

Muchas plantas presentan un genoma muy grande, con frecuenciadebido a su poliploidía, lo que dificulta mucho la experimentación

genética.

A pesar de que muchas plantas se pueden regenerar a partir de una

única célula manipulada genéticamente y se espera que sean un

clon de esta célula, sin embargo, a menudo se producen células

heterogéneas debido a una variación somatoclonal, frecuente en

plantas, lo que crea graves problemas para esta experimentación.

Finalmente, hay que decir que las plantas monocotiledones,

precisamente las que tienen un mayor interés desde el punto de

vista de la alimentación, resultan muy difíciles de transformar,

aunque el desarrollo de los métodos de biobalística para introducir

los genes exógenos está consiguiendo bastantes éxitos.

En términos generales, la modificación del genoma de una planta se puede

plantear desde dos estrategias alternativas:

► Adicción génica. Cuando se pretende que la planta adquiera una

nueva característica o propiedad para lo cual hay que añadir nuevos

genes. Puede tratarse de añadir un gen, o más de uno, y puede proceder




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de otra variedad de la misma planta cultivada, de otra especie de planta

silvestre o cultivada que tenga la característica que se quiere incorporar, o

incluso el gen puede proceder de especies muy alejadas filogenéticamentecomo bacterias , levaduras o animales.

► Supresión génica. Se trata de eliminar alguna característica o

propiedad no deseada, para lo cual hay que eliminar la acción del gen o los

genes de la propia planta responsables de la misma. En este caso no se

trata de quitar físicamente el gen del genoma de la planta, ya que esto no

es factible actualmente, sino que la modificación genética persigue

inactivar el producto del gen para impedir, retardar o ralentizar su acción.Aunque hay distintas estrategias la que ha dado mejores resultados es la

de introducir en el genoma de la planta un gen que sea el inverso

complementario, lo que se ha denominado un gen antisentido, de tal forma

que cuando se transcriben sus RNAs al tener la misma secuencia pero ser

complementarias hibridarían y se inactivan. De hecho esta tecnología se

empleó en el tomate de maduración retardada, el primer alimento GM que

fue aprobado para su comercialización.

Aunque las dos estrategias están siendo utilizadas, está claro que la

segunda tiene unas aplicaciones más limitadas, las características no

deseables que se tratan de eliminar son siempre limitadas, mientras que

las nuevas características que se pueden incorporar a una planta solo

tienen el límite teórico de los genes disponibles para ellas.

Las células vegetales son totipotentes esto significa que, si se

proporcionan las condiciones físicas y nutricionales adecuadas, cualquier

célula vegetal puederegenerar el fenotipo del organismo completo ydiferenciado del cuál derivó originariamente. Por este motivo, y a diferencia

de lo que ocurre con los animales, resulta relativamente sencillomodificar

las células vegetales aisladas introduciendo el gen o los genes de interés

que van a conferir la nueva característica o eliminar la no deseable, y luego




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a partir de estas células se puede regenerar la planta GM completa.

En cualquiera de las dos estrategias comentadas, los pasos

fundamentales que hay que tener en cuenta a la hora de plantear lamodificación genética de una determinada especie vegetal son:

► Disponer de células en cultivo de la especie para transformar

► Diseñar y obtener la construcción génica que se va a utilizar

► Disponer de un método adecuado para transferir la construcción génica

al interior del núcleo de la célula, una vez allí es necesario que se integre y

que se exprese, de forma que sea estable►Cultivar posteriormente las células transformadas y lograr regenerar la

planta completa.

Para obtener buenos cultivos de células vegetales se debe partir de

pequeñas piezas de tejido denominados explantes capaces de una rápida

proliferación, como por ejemplo del ápice de raíz, de yemas o bien de

semillas en germinación, todas estas regiones contienen células que se

encuentran continuamente en ciclo de división. El explante se lava con undesinfectante, agua oxigenada o hipoclorito, para eliminar

microorganismos, y se deja crecer en un medio nutritivo, donde

dependiendo de la especie puede llegar a formar una masa indiferenciada

de células denominada callo, que puede propagarse indefinidamente por

divisiones en un medio nutricional adecuado suplementado con

fitohormonas. El medio de cultivo suele contener sacarosa como fuente de

carbono; una fuente de nitrógeno orgánico, por ejemplo aminoácidos, o

inorgánico, como nitratos; sales inorgánicas, metales (Cu, Zn, Co y otros),

vitaminas y hormonas vegetales (auxinas, giberlinas, citoqinas)

reguladoras del crecimiento.

Si una pieza de callo joven se transfiere a un medio de cultivo líquido y se




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agita, la masa celular se disgrega y se produce una suspensión de células

que puede cultivarse indefinidamente, o bien puede sembrarse en un

medio sólido en el que las células crecen se dividen y forman callos deforma análoga a las colonias de bacterias. Esta forma de cultivo in vitro de

tejidos es muy frecuente para conservar ciertas variedades de vegetales en

los llamados bancos de germoplasma.

Un callo es a menudo, el objetivo de un marcador genético para la

inserción específica de DNA en experimentos.

El tejido de callo es de uso particular en la micropropagación, donde puedeser utilizado para cultivar copias genéticamente idénticas de plantas con

características deseables

En un momento dado, el estado de indiferenciación de estas células en

cultivo puede alterarse, modificando el tipo y la concentración de

fitohormonas en el medio, e inducir la diferenciación de raíces, tallos, etc.,

que permitirán regenerar una planta completa. Este proceso se denominaorganogénesis requiere unas condiciones específicas para cada especie.

La capacidad con que una especie superara este proceso es clave para el

desarrollo de plantas GM.

Las células vegetales tienen por fuera de la membrana plasmática una

fuerte pared de celulosa, que supone un verdadero obstáculo físico para la

entrada de genes. Para salvar este problema se pueden seguir dos

estrategias, o bien liberar a la célula de esta barrera física, o biodiseñar

sistemas que dirijan el DNA al interior de la célula incluso en presencia de

la pared. Estos últimos son los métodos denominados de biobalística.

Para la transformación se suelen utilizar “protoplastos”, que son células

vegetales a las que se les ha eliminado la pared celular por medio de

http://es.wikipedia.org/wiki/Biol%C3%ADstica

http://es.wikipedia.org/wiki/DNA

http://es.wikipedia.org/wiki/DNA

http://es.wikipedia.org/wiki/Biol%C3%ADstica




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tratamiento enzimático con celulasa y pectinasa. Se suelen emplear células

de hoja, que son fáciles de dispersar y regeneran muy bien la planta

completa. También son muy utilizados los protoplastos haploides de polen,ya que pueden regenerar plantas haploides que resultan de gran utilidad

para analizar mutantes. La facilidad y las condiciones con que los

protoplastos regeneran la planta completa son muy variables y depende de

las especies. Los protoplastos al estar desprovistos de la pared externa

facilitan la penetración de moléculas de DNA y por tanto son células más

fáciles de transformar. Posteriormente, el protoplasto puede regenerara la

pared celular en un medio sólido con los nutrientes y señales adecuadas,en un proceso que dura entre cinco y diez días, tras lo cual la célula

comienza a dividirse y puede formar callos e incluso regenerar la planta

completa.

Se denominan protoplastos a las células vegetales desprovistas de pared

celular. Su obtención se lleva a cabo mediante procesos mecánicos y

enzimáticos de eliminación de la pared celular. Por ejemplo, se pueden

obtener protoplastos de tabaco o petunia a partir de hojas, mediante el

retiro de la epidermis y el tratamiento con celulasas y pectinasas (enzimas

que digieren los componentes de la pared celular vegetal) en medio

isotónico, para evitar su rotura (al carecer de pared no son capaces de

soportar cambios osmóticos) (Carrasco, 1999).

Mediante este proceso se obtiene una suspensión con millones de células

individuales susceptibles de ser transformadas. Los protoplastos se

mantienen en un medio de cultivo y se adiciona el gen que se ha de

transferir. Para conseguir la penetración del transgen es necesaria la

permeabilización de la membrana, que de acuerdo a Díaz et al. (2004) se

lleva a cabo mediante distintos procesos:

Electroporación que consiste en aplicar al protoplasto descargas




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eléctricas de manera que la membrana se despolariza y se crean

diminutos poros por los que puede penetrar el ADN (Figura 4).

Figura 4. Poros en el protoplasto creados a partir de la aplicación de descargas eléctricas. (Fuente:Lal, 1993. Geneticengineer of plantsforcropimprovement).

Tratamiento con polietilenglicol, este método es muy similar al

anterior, debido a que también se producen poros en la membrana

plasmática por alteración de la polaridad de la misma y por ellos

penetra el ADN foráneo (Figura 5).

Figura 5. Poros creados por medio del tratamiento con polietilenglicol por alteración de lapolaridad. (Fuente: Díaz et al., 2004. Biotecnología y Mejoramiento Vegetal).

La microinyección, que es un método difícil y laborioso que consiste

en la introducción de ADN dentro de protoplastos individuales

mediante el uso de capilares de inyección y micro-manipulación




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(Figura 6) y aunque con esta metodología es necesario manipular

las células individualmente, es posible lograr un alto grado de

integración del ADN foráneo.

Figura 6. Imagen del método de microinyección en donde se muestra la introducción del ADN en el

interior de la célula mediante una micropipeta (Fuente: Carabuxa, 2007. Técnicas para fabricar

organismos transgénicos).

Fusión con la membrana de liposomas que contengan. Entre los

distintos métodos para introducir ADN aislado en protoplastos, la

transferencia directa de genes mediada por liposomas es uno de los más

difíciles. Esta a pesar de ser una técnica establecida para la producción de

plantas transgénicas, no se utiliza mucho debido a que no presenta

mayores ventajas sobre las demás técnicas.

Una vez incorporado el ADN, se requiere cultivar los protoplastos para

permitir su división, además de que es necesario conservar las condiciones

que permitan conseguir la regeneración de las plantas en las que se ha

incorporado el transgen.

En cualquier caso, bien se trabaje con células en cultivo o conprotoplastos, para modificar genéticamente una planta se requiere

introducir genes exógenos en el interior del núcleo de una célula vegetal y

para ello hay que recurrir a vectores que transporten el gen o los genes, o

bien utilizar técnicas que permitan la introducción directa del transgen. Y,




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previamente, es necesario diseñar la construcción de DNA adecuada que

contenga el gen o genes de interés, pero también algunos elementos

necesarios para asegurar su correcta expresión. Estos son las regionesreguladoras y el promotor del gen que permitirán que el gen sea activo y

que lo sea en el momento y en el lugar correcto, es decir, que la proteína o

proteínas se sinteticen en las células del tejido donde debe hacerlo.

Además, suele ser muy útil introducir en la construcción otros genes que

llamaremos marcadores de selección, que también se suelen denominar

reporteros, que permitirán confirmar que se ha producido la integración.

El plásmido TiUno de los métodos más utilizados para transformar células de

plantas consiste en utilizar como vector para los genes foráneos el

plásmido Ti (tumor-inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens .

Ésta es una bacteria gram negativa del suelo, muy abundante y que es

capaz de infectar de forma natural a una gran variedad de especies

diferentes del grupo de las dicotiledóneas, provocando la aparición de

tumores llamados de agalla en corona. La bacteria penetra, a través de

cualquier herida reciente en la epidermis de la planta, y se adhiere a la

pared externa de una célula. Desde aquí, es capaz de transferir fragmentos

del plásmido Ti, que se encuentra normalmente en el interior de estas

bacterias, hasta el núcleo de la célula vegetal. La célula vegetal que ha

adquirido el plásmido se convierte en una célula tumoral, creciendo de

manera independiente y no regulada, y se dedica a sintetizar unos

aminoácidos especiales, las opinas, y otros compuestos única y

exclusivamente para alimentar a la bacteria.El plásmido Ti tiene un tamaño muy grande, es un DNA circular de

unas 200Kb. Sin embargo, al interior de la célula vegetal solo penetra un

fragmento de este plásmido, llamado T-DNA (DNA transferido), que tiene

un tamaño de entre 12 y 24 Kb, dependiendo de la cepa bacteriana. Esta




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región tiene una serie de características muy interesantes:

- Una vez en el interior de la célula, el T-DNA no permanece comoun plásmido independiente sino que se integra en uno de los cromosomas

de la planta. Ésta es una característica muy interesante ya que gracias a

ello todas las células descendientes, formadas por división de ésa célula,

portarán el plásmido debido a que se transmite con los propios

cromosomas, produciéndose una transformación estable e irreversible de

las células de la planta afectada.

- Este T-DNA resulta por tanto un vector natural idóneo ya que en élse pueden introducir genes foráneos de interés y utilizar este sistema para

la manipulación genética de las plantas dicotiledóneas, que son las que de

forma natural son infectadas por la bacteria.

- El T-DNA lleva una serie de genes, algunos de los cuales codifican

para enzimas que intervienen en la síntesis de opinas. Éstas son unas

moléculas derivadas de aminoácidos, que son sintetizadas por acción de

las enzimas que la bacteria introduce en la planta utilizando los propios

aminoácidos y otras moléculas de la planta, y que, sin embargo, son

utilizados como nutrientes por la bacteria. Es decir, la infección de las

células con el plásmido de la bacteria hace que estas células se pongan a

trabajar para la bacteria de forma que suministran nutrientes para las

propias bacterias.

Conviene reconocer que la humilde bacteria del suelo

Agrobacterium ha logrado desarrollar todo un sistema de ingenieríagenética de plantas para ponerlas a producir sustancias en su propio

beneficio, algunos millones de años antes que el Homo sapiens fuera

capaz de hacerlo.

Además, como hemos dicho la infección provoca una proliferación




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desordenada de las células de la planta, debido a que el T-DNA lleva

también un grupo de genes que codifican enzimas para la síntesis de

hormonas vegetales, cuya superproducción induce una proliferacióndesordenada produciéndose un tumor, conocido como agalla de la corona.

Hoy día se explota este sistema para introducir genes nuevos en

plantas, pero para ello previamente es necesario realizar una serie de

manipulaciones para modificar el propio plásmido Ti y hacerlo más

adecuado. En la versión comercial que se utiliza se han eliminado los

genes oncogénicos responsables del crecimiento tumoral de las células de

la planta, y también se han eliminado los genes responsables de laproducción de opinas. Sin embargo, se suele dejar la región del promotor

de estos genes de opinas junto a la cual se añade el gen de interés, de

este modo se asegura la expresión del gen foráneo introducido a la planta.

También es necesario incorporar genes marcadores para identificar y

seleccionar las células vegetales transformadas.

El promotor de las opinas es útil para expresar genes de forma

constitutiva, es decir, genes que van a estar permanentemente activos

produciendo su producto. Sin embargo, en la práctica a veces se requiere

que los genes que se introducen se expresen únicamente en determinadas

células de la planta, por ejemplo en semillas, o en determinados momentos

del desarrollo. Esto complica bastante las cosas y hace necesario el uso de

promotores específicos de la planta o al menos promotores que se puedan

controlar por factores específicos y así lograr regular la expresión del gen.

El plásmido Ri. Otro vector específico es el plásmido Ri (rootinducing) de la bacteria

Agrobacteriumryzobium, cuya utilización sigue básicamente el mismo

proceso que acabamos de comentar para el Ti Este plásmido cuando

infecta una planta produce raíz de cabello, o aparición de múltiples raíces




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por una proliferación desordenada de las células de la raíz.

También algunos virus de plantas pueden ser utilizados como vectores de

genes foráneos. Si son adecuadamente manipulados son capaces de

transportar un DNA como pasajero al interior de la célula vegetal. Los

mayores avances se han logrado con geminovirus y caulimoviruse, dentro

de estos últimos, especialmente utilizado ha sido el virus del mosaico de la

coliflor. También los virus con genoma de RNA que son muy abundantes

en el mundo vegetal están siendo utilizados como vectores de genes, los

más frecuentes son los del mosaico de la cebada y el virus del mosaico del

tabaco.

Debido a que el sistema de Agrobacterium no es eficaz en la plantas

monocotiledones, precisamente las de mayor interés agrícola como los

cereales, se han tratado de desarrollar alternativas para introducir DNA en

las células vegetales basadas en métodos físicos.

Algunas células vegetales pueden ser transformadas directamente, por

transfección de fragmentos de DNA añadidos al medio de cultivo, aunque,

en general, la eficiencia de la transformación directa es bastante baja. Hoydía se trata de mejorarla utilizando diversas técnicas que favorecen la

penetración del DNA foráneo. Algunas de estas técnicas son:

► Permeabilización de membranas

- La Electroporación, que consiste en la apertura de poros en la

membrana por tratamiento con impulsos eléctricos controlados.

Utilizando campos de entre 200 y 600 V/cm se consigue transferir

DNA extraño a células de arroz y de maíz con rendimientos bastante

buenos.

- La permeabilización química, por ejemplo con etilenglicol.




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- La permeabilización con ultrasonidos.

- También se utilizan liposomas para transportar DNA al interior de

las células.

► Biobalística

Otras técnicas más sofisticadas son las conocidas como biobalística

que incluyen el uso de “pistolas génicas”. Estas técnicas se basan en la

utilización de microesferas de metales, como oro o tungsteno, de 0,4 a 4

μm de diámetro, recubiertas del DNA que se desea introducir que es

precipitado sobre ellas con cloruro cálcico, y que se disparan sobre lascélulas, o bien el uso de microproyectiles que llevan dentro gotitas del DNA

a transfectar en solución. El mecanismo de disparo se basa en una pistola

especial que lanza las partículas a más de 400m/s sobre las células de

forma que penetran sin destruir la membrana, todo el sistema funciona en

un vacío moderado para evitar el rozamiento con el aire, condiciones que

las células vegetales soportan durante uno o dos minutos. Tras el

bombardeo, las células son colocadas en condiciones adecuadas para

crecer y regenerar la planta.

Transformación biobalística

Según Petruccelli (2002), se denomina biolística o bio-balística a la

introducción de ADN en células mediante la aceleración (disparo) de

proyectiles de muy pequeño tamaño (microproyectiles). Generalmente los

microproyectiles tienen alrededor de una micra de diámetro, y son de un

material inerte como el oro o el tungsteno (Figura 7). Los microproyectiles

se pueden recubrir de ADN, y se pueden acelerar mediante pólvora, una

descarga eléctrica, o utilizando gases a presión (por ejemplo el helio

comprimido) para alcanzar velocidades supersónicas y de esta forma

introducir ADN en prácticamente cualquier tejido de cualquier especie

vegetal.




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Figura 7. Imágenes de los microproyectiles de oro y tungsteno respectivamente (Fuente: Petruccelli,

2002, Aplicaciones de la biotecnología en el sector agropecuario y agroalimentario).

No obstante, el proceso tiene una desventaja; debido a la falta de control

sobre la integración del gen en el genoma de la planta puede suceder que

el transgen se rompa durante el proceso o que se integren demasiadostransgenes, provocando que la planta reaccione silenciándolo, es decir,

impidiendo que el gen se exprese.

Expresión de genes exógenos en células vegetales.

Regiones reguladoras

Las cosas no son generalmente tan sencillas y, con frecuencia, los

genes introducidos en las plantas, sea cual sea el procedimiento queempleemos para ello, plantean problemas de expresión y de

mantenimiento en las células, resultando que su presencia y actividad es

sólo transitoria.

Otras dificultades adicionales surgen cuando el producto del gen

foráneo introducido, es decir la proteína, es rápidamente degradada por los

sistemas enzimáticos de la planta, o bien, por el contrario, cuando el

compuesto que interesa no puede ser correctamente producido al faltar

enzimas o proteínas adecuadas para su procesamiento, empaquetamiento

final, etc.

Está claro que los problemas de la ingeniería genética para obtener

plantas modificadas genéticamente no finalizan al encontrar un vector o un




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sistema adecuado para introducir un gen foráneo más bien, por el

contrario, se puede decir que es cuando verdaderamente comienzan. En

este punto los avances en el conocimiento de la genética molecular básicade las plantas, la regulación de la expresión de los genes y el desarrollo,

son los cimientos sobre los que crece y puede progresar la ingeniería

genética aplicada de plantas.

La expresión constitutiva o continuada de los genes incorporados a

plantas se consigue cuando se colocan en los vectores junto a regiones

reguladoras como por ejemplo los promotores de opinas, de los quehablamos anteriormente. Pero muchas veces puede resultar más

interesante que el gen o los genes exógenos insertados no se expresen

hasta que sean activados específicamente, para lo cual se colocan frente a

promotores regulables no constitutivos, que por ejemplo se activen

únicamente en determinado momento del desarrollo o únicamente en cierto

tejido. Para ello se utilizan promotores como por ejemplo el de la

subunidad pequeña de la enzima rubisco (del ciclo de Calvin) que se activa

solamente en los tejidos fotosintéticos, como las hojas; o bien promotores

que se activan únicamente en las flores o en la raíz. También son muy

interesantes los promotores que se activan en determinadas situaciones de

estrés, como los de las proteínas HS o los de las proteínas PR. El uso de

estas señales permite controlar con mayor o menor precisión la expresión

de los genes foráneos incorporados. La búsqueda de promotores

específicos de tejidos tiene una enorme importancia para el desarrollo de

plantas transgénicas más específicas y seguras. Por ejemplo, plantas queexpresen solo un insecticida que lleven incorporado en aquellos tejidos de

la planta que son atacados por el insecto o el patógeno, permaneciendo sin

expresarse en aquellos que son comercializados como alimento, por

ejemplo frutos y semillas.




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Muchas veces el gen o los genes incorporados no son activos a

pesar de haber diseñado una construcción con los reguladores adecuados.

Y es que las plantas disponen de mecanismos protectores contra lainvasión de DNA ajeno. Uno de estos es la metilación del DNA extraño

integrado en el cromosoma, lo cual impide su transcripción y por tanto su

expresión. Otras veces, se produce una inactivación de toda la cromatina

alrededor de la región donde se encuentra el gen intruso lo que provoca el

mismo resultado. Algunas plantas disponen de un mecanismo más

sofisticado conocido como cosupresión, que consiste en que se bloquean

secuencias que sean de algún modo semejantes o otras endógenas.Todo esto hace que lograr el éxito en este tipo de experimentación sea

bastante más difícil y complejo de lo que a primera vista podría parecer. El

estudio y el conocimiento básico de la genética de plantas son

fundamentales para avanzar con nuevas estrategias.

Genes marcadores

La identificación de las células vegetales que han incorporado un

determinado gen exógeno, es decir que han sido efectivamente

transformadas, es factible mediante el uso simultáneo de algún otro gen

que codifique para alguna actividad fácilmente detectable y que se inserta

junto con el de interés actuando de testigo por lo que se suele llamar gen

marcador o reportero. Un gen marcador muy utilizado es el de la lucíferasa

una enzima que en presencia de ATP degrada la luciferina emitiendo luz y

que por tanto puede valorarse con ayuda de un luminómetro o de unaplaca o película fotográfica sensible a la luz.

A pesar de que, hasta el momento, ninguna de las proteínas de los

genes utilizados como marcadores ha demostrado ser nociva para la salud

humana o animal, los genes marcadores han sido el blanco de muchas de




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las críticas a las plantas transgénicas Se argumenta que podrían tener

efectos tóxicos, alergógenos, o provocar un aumento de la resistencia a

antibióticos o transferir esta resistencia a otras especies.Actualmente se emplean distintos métodos para obtener plantas

transgénicas libres de genes marcadores. La idea es utilizar el marcador

solamente en las primeras etapas para identificar y seleccionar las células

transformadas, y posteriormente eliminarlo antes de obtener la planta

transgénica. Para ello la estrategia es que el gen que se desea clonar en la

planta y el gen marcador se localice en sitios diferentes del genoma de la

planta receptora, en cromosomas distintos, para que tras unos cuantoscruces iníciales dirigidos se pueda perder el marcador por segregación

cromosómica.




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Alcances y limitaciones

Alcances Se logro obtener el conocimiento, acerca de como adquiere

la planta del tabaco el color bioluminescente que posee la

lucíferasa, así como las diversas técnicas que son posibles

emplear para la inserción de nuevos genes procedentes de

un organismo diferente.

Limitaciones No fueron posibles realizar los estudios a la planta ya que no

contamos con los recursos económicos para poder adquiriruna planta de tabaco alterada.

Metodología Se empleo información teórica en base de libros de; biología

celular y molecular, bioquímica y fuentes de internet, así

como el apoyo de otras tesis de las cuales obtuvimos parte

de la información.

Referencia bibliográfica




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Ville, C. A. (2003). Biología, Octava Edición. Naucalpan,

México: Editorial: Mac Graw Hill.




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Anexo

Anexo 1

Imagen 1. pagina 14

Imagen 2 pagina 15.




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Imagen 3. pagina. 20

Imagen 4. página 33




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Imagen 5. página 33

Imagen 6. Página 34

Imagen 7. Página 40




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Anexo2

luciferasa final

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