Levaduras no-Saccharomyces como

alternativa para controlar el grado

alcohólico de los vinos.

El papel del oxígeno y la

respiración.

www.icvv.es/microwine

Selección clonal y varietal Técnicas de cultivo

Desalcoholización parcial

Objetivo: compensar 2-3 grados

Tres limitaciones:

Productos secundarios debido a

reajustes metabólicos (acético,

acetoína, productos de

“oxidación”)

¿(multi) GMOs en vino?

Estrategias basadas en

levaduras recombinantes(S. cerevisiae)

Tres limitaciones:

Productos secundarios debido a

reajustes metabólicos (acético,

acetoína, productos de

“oxidación”)

¿(multi) GMOs en vino?

¿Qué hacemos con el azúcar?

Estrategias basadas en

levaduras recombinantes(S. cerevisiae)

Ethanol

Glucosa + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O

Glucosa 2 Etanol + 2 CO2

Opción co-inoculación

Azúcar

GL

GL

GL

GL

GL

GL

Azúcar

GL

GL

GL

GL

GL

GL

Azúcar

Tres limitaciones previstas

Fermentación con especies alternativas de levaduras

Necesitamos oxígeno

Ninguna de ellas es la auténtica limitación

Exceso de oxígeno disuelto

Efecto Crabtree en S. cerevisiae

Candida sake x4Candida stellataCandida vanderwaltiiCandida vinariaCandida zemplinina x4Debaryomyces hansenii x4Debaryomyces fabryiHanseniaspora guilliermondii x3Hanseniaspora uvarum x2Hanseniaspora vineaeHansenula polymorphaKazachstania exigua x2Kloeckera apiculata x3Kluyveromyces sp. x4Kluyveromyces nonfermentans

Kregervanrija fluxuumLanchancea cidriiLanchancea thermotoleransMetschnikowia pulcherrima x4Pichia anomala x4Pichia membranifaciens x4Saccharomyces cerevisiae x4Scheffersomyces stipitis x4Starmerella bombicola x4Torulaspora delbrueckii x3Zygosaccharomyces bailiiZygosaccharomyces rouxii

65 cepas de levadura (28 especies)

AQ (IATA), CIDA (ICVV), CIAL (IFI), CRA-ENO (Asti), CBS

RQ=1: respiración pura

RQ= ∞: fermentación pura

RQ=%respiración=

100/(3RQ-2)CO2 producido

O2 consumido

¿Cuánto azúcar respira o fermenta cada cepa?

•pH 3.5

•200g/L de azúcar

•Aire 0.2 vvm

•Preaclimatación 24h

Cuantificación de RQs

O cómo soslayar el stripping del etanol

RQ=2: 25 % respiración

Acético

Mosto sintético, aireación moderada, 15+2 cepas

Factores que afectan a la reducción de grado

•Temperatura15ºC, 20ºC, 25ºC

•Intensidad de oxigenación10% O2, 21% O2, 50% O2

•Nitrógeno asimilable•150 mg/L, 200 mg/L, 250 mg/L

Ensayos con cuatro cepas de levadura

y tres niveles por parámetro

(diseño ortogonal: 9 de 27 combinaciones)

•Metschnikowia pulcherrima•Kluyveromyces lactis•Candida sake•Saccharomyces cerevisiae

Consumo de azúcar 72 h

Rendimiento en glicerol 72 h

Rendimiento en ácido acético 72 h

Rendimiento en etanol 72 h

Grados de reducción

Eficacia

Relevancias relativas de cada parámetro

S. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake

Consumo de[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +

azúcarYAN 45 + 45 + 50 + 18 +

TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +

Etanol[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -

(rendimiento)YAN 44 + 67 + 33 + 71 +

TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +

Ácido acético[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +

(rendimiento)YAN 15 - 46 - 28 + 46 +

TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +

Glicerol[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -

(rendimiento)YAN 2 + 78 - 4 - 12 -

TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -

Reducción[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +

de gradoYAN 27 + 35 + 29 + 28 -

TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +

Eficacia[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -

YAN 46 - 37 + 30 - 67 -

TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

El efecto del oxígeno sobre la respiración es el esperado

(pero siempre tiende a aumentar el acético)

S. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake

Consumo de[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +

azúcarYAN 45 + 45 + 50 + 18 +

TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +

Etanol[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -

(rendimiento)YAN 44 + 67 + 33 + 71 +

TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +

Ácido acético[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +

(rendimiento)YAN 15 - 46 - 28 + 46 +

TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +

Glicerol[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -

(rendimiento)YAN 2 + 78 - 4 - 12 -

TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -

Reducción[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +

de gradoYAN 27 + 35 + 29 + 28 -

TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +

Eficacia[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -

YAN 46 - 37 + 30 - 67 -

TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

La producción de glicerol por M. pulcherrima

responde de manera opuesta al restoS. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake

Consumo de[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +

azúcarYAN 45 + 45 + 50 + 18 +

TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +

Etanol[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -

(rendimiento)YAN 44 + 67 + 33 + 71 +

TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +

Ácido acético[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +

(rendimiento)YAN 15 - 46 - 28 + 46 +

TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +

Glicerol[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -

(rendimiento)YAN 2 + 78 - 4 - 12 -

TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -

Reducción[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +

de gradoYAN 27 + 35 + 29 + 28 -

TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +

Eficacia[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -

YAN 46 - 37 + 30 - 67 -

TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

El oxígeno raramente es el factor más relevante

(dentro de los márgenes estudiados)

S. cerevisiae M. pulcherrima K. lactis C. sake

Consumo de[O2] 2 + 5 - 3 - 42 +

azúcarYAN 45 + 45 + 50 + 18 +

TEMP 53 + 50 + 47 + 39 +

Etanol[O2] 26 - 11 - 62 - 18 -

(rendimiento)YAN 44 + 67 + 33 + 71 +

TEMP 30 - 21 + 5 + 11 +

Ácido acético[O2] 38 + 21 + 63 + 54 +

(rendimiento)YAN 15 - 46 - 28 + 46 +

TEMP 47 + 34 - 9 - 0 +

Glicerol[O2] 79 - 15 + 75 - 76 -

(rendimiento)YAN 2 + 78 - 4 - 12 -

TEMP 19 + 7 + 21 + 12 -

Reducción[O2] 12 + 8 - 33 + 51 +

de gradoYAN 27 + 35 + 29 + 28 -

TEMP 61 + 57 + 38 + 21 +

Eficacia[O2] 19 + 5 + 38 - 22 -

YAN 46 - 37 + 30 - 67 -

TEMP 35 - 58 + 32 + 11 +

Puesta a punto de condiciones para reducir el grado alcohólico

Cultivo mixto con M. pulcherrima, diferente

proporciones de inoculación, mosto natural, 25ºC,

aireación controlada 48 h (resto anaeróbico)

Consumo de azúcar en mosto natural

Etanol producido

-3 grados

Consumo de azúcar en mosto natural

Etanol producido

-3 grados

0.17 g/L

1.90 g/L

0.64 g/L

Acidez volátil final

Consumo de azúcar en mosto natural

Etanol producido

0.17 g/L

0.51 g/L

0.35 g/L

Acidez volátil final

-2.1 grados

0

20

40

60

80

100DO

0 34 67 101 134 168

hours

Time

100% airM. pulcherrima

0

20

40

60

80

100DO

0 34 67 101 134 168

hours

Time

100% airM. pulcherrima/S. cerevisiae (1%)

0

20

40

60

80

100DO

0 34 67 101 134 168

hours

Time

100% airM. pulcherrima/S. cerevisiae (10%)

0

24

48

72

96

120DO

0 34 67 101 134 168

hours

Time

100% airS. cerevisiae

0

20

40

60

80

100DO

0 34 67 101 134 168

hours

Time

25% airM. pulcherrima/S. cerevisiae (10%)

0

20

40

60

80

100DO

0 34 67 101 134 168

hours

Time

25% airS. cerevisiae

¿Puede haber exceso de oxígeno?

Con la industria

Investigación de base

•Metabolismo energético de especies alternativas de levaduras(y su regulación)•Mecanismo de producción de acético en condiciones oxigenación(S. cerevisiae y otras especies)•Interacciones metabólicas en condiciones aeróbicas•Factores determinantes para la competición entre cepas

•Selección de cepas con criterios enológicos•Optimización de parámetros de proceso•Desarrollo de dispositivos específicos de control

GRACIAS