HIDRLISIS DEL ALMIDN FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS1. Objetivos:1.1. Hidrlisis del almidn:

Demostrar y comparar el consumo de almidn de los microorganismos a sembrar.

1.2. Fermentacin de carbohidratos:

Observar la fermentacin realizada por los microorganismos inoculados para poder identificar si se trata de microorganismos aerobios o anaerobios.

2. Fundamento terico:

METABOLISMOSe conoce con el nombre de metabolismo al conjunto de reacciones qumicas que tienen lugar dentro de las clulas de los organismos vivos, las cuales transforman energa, conserva su identidad y se reproducen. Todas las formas de vida dependen de la realizacin simultnea de centenares de reacciones metablicas reguladas con absoluta precisin, desde el nacimiento, la maduracin y hasta la muerte. Las clulas tienen una serie de enzimas (catalizadores biolgicos) que se encargan de activar, controlar y terminar todas estas reacciones, cada una de las cuales estn a su vez coordinada con muchas otras que se producen en todo el organismo. Adems para que se realicen estas reacciones qumicas se necesita de energa, la cual se obtiene por oxidacin de sustancias introducidas en forma de alimentos.

En todo metabolismo se distinguen tres etapas: la primera etapa se denomina de degradacin o catabolismo, aqu es donde se hidrolizan las sustancias nutritivas en compuestos ms sencillos producindose gran cantidad de energa que se almacena en forma de ATP (Adenosn trifosfato).

Las sustancias obtenidas en el catabolismo se transforman en una serie de compuestos de bajo peso molecular mediante las reacciones del metabolismo intermedio o anfibolismo. El metabolismo intermedio junto con la tercera etapa que es la biosntesis de macromolculas se denomina metabolismo biosinttico o anabolismo.

El anabolismo utiliza la energa liberada por las reacciones catablicas para recomponer enlaces qumicos y construir componentes de las clulas como lo son las protenas y los cidos nucleicos.

Mtodos de produccin de energa:

Para no incumplir las dos primeras leyes de la termodinmica, el organismo no puede ni crear ni destruir energa: slo transformarla de unas formas en otras. Por tanto la energa pasa del sol a los organismos fotosintticos y despus a los otros en forma de energa potencial (Hidratos de carbono, protenas y grasa) contenida en los enlaces de los compuestos qumicos.

Los organismos cuando producen energa a partir de molculas orgnicas emplean varias reacciones controladas en lugar de hacerlo en una sola reaccin, a esta serie de reacciones qumicas catalizadas enzimticamente que tienen lugar en la clula se denomina ruta bioqumica o metablicas. Casi todas las reacciones que tienen lugar en una ruta bioqumica estn catalizadas por un enzima especfico.

Ruta metablica:

Una ruta metablica o va metablica es una sucesin de reacciones qumicas que conducen de un sustrato inicial a uno o varios productos finales, a travs de una serie de metabolitos intermediarios.

Por ejemplo, en la ruta metablica que incluye la secuencia de reacciones:

A B C D E

A es el sustrato inicial, E es el producto final, y B, C, D son los metabolitos intermediarios de la ruta metablica.

Las diferentes reacciones de todas las rutas metablicas estn catalizadas por enzimas y ocurren en el interior de las clulas. Muchas de estas rutas son muy complejas e involucran una modificacin paso a paso de la sustancia inicial para darle la forma del producto con la estructura qumica deseada.

Todas las rutas metablicas estn interconectadas y muchas no tienen sentido aisladamente; no obstante, dada la enorme complejidad del metabolismo, su subdivisin en series relativamente cortas de reacciones facilita mucho su comprensin. Muchas rutas metablicas se entrecruzan y existen algunos metabolitos que son importantes encrucijadas metablicas, como el acetil coenzima-A.

Normalmente se distinguen tres tipos de rutas metablicas:

Rutas catablicas: Son rutas oxidativas en las que se libera energa y poder reductor y a la vez se sintetiza ATP. Por ejemplo, la gluclisis y la beta-oxidacin. En conjunto forman el catabolismo.

Rutas anablicas: Son rutas reductoras en las que se consume energa (ATP) y poder reductor. Por ejemplo, gluconeognesis y el ciclo de Calvin. En conjunto forman el anabolismo.

Rutas anfiblicas: Son rutas mixtas, catablicas y anablicas, como el ciclo de Krebs, que genera energa y poder reductor, y precursores para la biosntesis.

Enzimas:

Las enzimas son protenas altamente especializadas que tienen como funcin la catlisis o regulacin de la velocidad de las reacciones qumicas que se llevan a cabo en los seres vivos, sin sufrir alteracin ni ella misma ni la clula sobre la que acta.

Las enzimas actan siempre de forma especfica, es decir, cada enzima afecta solamente a un sustrato especfico, esto es debido a la estructura especfica de cada enzima.

En algunos casos las enzimas estn compuestos por una parte protica, llamada apoenzima, y una parte no protica, llamada cofactor. El apoenzima junto con el cofactor constituyen el holoenzima.

Las caractersticas generales de las enzimas son las siguientes:

La mayora de las enzimas estn constituidas por ms de 100 aminocidos, lo cuales confieren a la molcula una masa mayor de 10 KDa y un dimetro de 25 . Disminuyen la energa de activacin, facilitando el inicio de una reaccin; es decir, son catalizadores que pueden ser definidos como: agentes que afectan la velocidad de una reaccin qumica, sin participar coo reactantes y sin aparecer en los productos finales de la reaccin. Se requiere en cantidades mnimas. Alta especificidad: Una enzima generalmente cataliza una sola reaccin, aunque en algunos casos es capaz de actuar sobre varias reacciones ntimamente relacionadas. Pueden ser regulables: la actividad cataltica de muchas enzimas vara en respuesta a la concentracin de sustancias diferentes al sustrato. Los mecanismos de este proceso regulador incluyen: control alostrico, modificacin covalente y variacin en la cantidad de enzima sintetizada. Son sensibles de ser inhibidas al disminuir o abolir su actividad por medio de diversas sustancias. Modifican la estructura qumica del sustrato, segn el tipo de reaccin que catalicen. Las enzimas no alteran el equilibrio de las reacciones. Pueden ser capaces de intercambiar diferentes formas de energa. Por ejemplo, durante la fotosntesis la energa luminosa es transformada en energa qumica de enlace.

Las enzimas pueden clasificarse en:

1. xido-reductasa: catalizan reaccin de transferencia de electrones o tomos de hidrgeno. Precisan la colaboracin de las coenzimas de oxidorreduccin (NAD+, NADP+, FAD) que aceptan o ceden los electrones correspondientes. Tras la accin cataltica, estas coenzimas quedan modificadas en su grado de oxidacin, por lo que deben ser recicladas antes de volver a efectuar una nueva reaccin cataltica. Ejemplos: citrocromo-oxidasa, D-lactato deshidrogenasa.

2. Transferasa: transfieren grupos funcionales como metilo, amino, fosfato, etc., a otras sustancias receptoras, obtenidos de la ruptura de ciertas molculas. Suelen actuar en procesos de interconversin de monosacridos, aminocidos, etc. Ejemplos: transaminasas, quinasas, alanina desaminasa.

3. Hidrolasa: catalizan reacciones de hidrlisis mediante la adicin de una molcula de agua para romper un enlace. Ejemplos: glucosidasas, lipasas, esterasas, sacarasa.

4. Liasa: catalizan reacciones en las que se eliminan grupos H2O, CO2 y NH3 para formar un doble enlace o aadirse a un doble enlace, as como eliminacin no hidroltica de grupos qumicos. Ejemplos: oxalato descarboxilasa.

5. Isomerasa: actan sobre determinadas molculas obteniendo de ellas sus ismeros funcionales o de posicin, es decir, catalizan la racemizacin y cambios de posicin de un grupo en determinada molcula obteniendo formas isomricas. Suelen actuar en procesos de interconversin. Ejemplo: epimerasas (mutasa).

6. Ligasa: catalizan la degradacin o sntesis de los enlaces denominados "fuertes" mediante al acoplamiento a molculas de alto valor energtico como el ATP. Ejemplos: sintetasas, carboxilasas. Apoenzima:

Es la parte proteica de una holoenzima, es decir, una enzima que no puede llevar a cabo su accin cataltica desprovista de los cofactores necesarios, ya sean iones metlicos (Fe, Cu, Mg, etc) u orgnicos, que a su vez puede ser una coenzima o un grupo prosttico dependiendo de la fuerza de sus enlaces con la apoenzima. La apoenzima es por tanto catalticamente inactiva hasta que se le une el cofactor adecuado.

Cofactor:

Es un componente no proteico, termoestable y de bajo peso molecular, necesario para la accin de una enzima. El cofactor se une a una estructura proteica denominada apoenzima, y a este complejo se le denomina holoenzima. Entre los cofactores mencionables se encuentran: Iones metlicos (Fe2+, Cu2+, K+, Mn2+, Mg2+, entre otros) y molculas orgnicas. Aquellos cofactores que estn fuertemente unidos a la apoenzima son denominados grupos prostticos; en otros casos los que estn unidos dbilmente a la apoenzima y actan fundamentalmente como uno de los sustratos especficos de la reaccin, se llaman coenzimas.

Coenzima: son cofactores orgnicos no proteicos, termoestables, que unidos a una apoenzima constituyen la holoenzima o forma catalticamente activa de la enzima. Tienen en general baja masa molecular (al menos comparada con la apoenzima) y son claves en el mecanismo de catlisis, por ejemplo, aceptando o donando electrones o grupos funcionales, que transportan de un enzima a otro. A diferencia de las enzimas, las coenzimas se modifican y consumen durante la reaccin qumica.

ATP (Adenosn trifosfato):

Es un nucletido fundamental en la obtencin de energa celular. Est formado por una base nitrogenada (adenina) unida al carbono 1 de un azcar de tipo pentosa, la ribosa, que en su carbono 5 tiene enlazados tres grupos fosfato. Se encuentra incorporada en los cidos nucleicos.

Se produce durante la fotosntesis y la respiracin celular, y es consumido por muchas enzimas en la catlisis de numerosos procesos qumicos. Su frmula es C10H16N5O13P3.

El ATP es la principal fuente de energa para la mayora de las funciones celulares. Esto incluye la sntesis de macromolculas como el ADN, el ARN y las protenas. Tambin desempea un papel fundamental en el transporte de macromolculas a travs de las membranas celulares, es decir, en la exocitosis y endocitosis.

Catabolismo de hidratos de carbono:

HIDRLISIS DEL ALMIDN

Almidn + H2O Dextrina + azcaresAmilasa

Los polisacaridos, como el almidn son demasiados largos para ser transportados al interior de la clula. Los microorganismos excretan amilasas que hidrolizan esos polmeros hasta oligosacridos o monosacridos que pueden usarse como sustratos para crecer.

La hidrlisis de almidn es analizada en medios conteniendo almidn en placa. Despus de incubar se inundan las placas con lugol que al unirse con el almidn intacto forma un complejo prpura.

La prueba ser positiva, hay hidrlisis, cuando la zona donde se ech lugol se torna clara, debido a la reaccin de la amilasa con el lugol.

Ser negativo, no hay hidrlisis, si no se produce amilasa, por tanto la zona donde se hech lugol se tornar de color prpura o azul, debido a la reaccin del almidn con el lugol. FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOSLas bacterias anaerobias o anaerobicas facultativas a menudo fermentan carbohidratos a cidos orgnicos y gas (H2 o CO2). Estos pueden detectarse incluyendo en el medio un indicador de pH y una campana Durham. Se pueden ensayar diferentes azcares como sustrato para diferenciar especies sobre todo bacterias entricas.

Se inocula la bacteria en un medio conteniendo una pequea cantidad de peptona, un indicador de pH y una fuente de carbono fermentable (en este laboratorio se emplea lauril triptosa) al 1-2 % y se coloca dentro de los tubos una campana Durham.Esta prueba nos puede mostrar: Negativo: si la bacteria no puede crecer en este sustrato y existe poca turbidez o ninguna.

La produccin de cidos orgnicos, ocasionando la disminucin del pH, por tanto tornando cido el medio.

La produccin de cidos orgnicos disminuyendo el pH y la produccin de hidrgeno o CO2 que se acumula en la campana Durham.

El metabolismo microbiano no produce ni cido ni gas.

3. Procedimiento:

3.1. Hidrlisis del almidn:

1. Para la realizacin de este laboratorio nos ayudamos de los cultivos del laboratorio N 03: DETERMINACIN DE LA CALIDAD DEL AGUA POR SU CONTENIDO BACTERIAL. Escogemos la placa a trabajar.

2. Los materiales e insumos a emplear son: 5 placas petri estriles (1 para cada grupo, hay 5 grupos). 5 inoculadores estriles (1 para cada grupo, hay 5 grupos). 5 tubos de prueba estriles. 5 tubos de fermentacin esterilizados. Agar almidn 75 ml (15 ml para cada grupo, hay 5 grupos). Mechero bunsen.

3. Preparar el agar almidn (75 ml), repartir 15 ml en cada tubo de prueba y llevar al autoclave.

4. Dividir las placas petri con marcador en dos secciones A y B. la seccin A pertenecer al cultivo A y la seccin B al cultivo B.

5. Verter 15 ml de agar almidn a cada placa petri esterilizada.

6. Del cultivo escogido para el anlisis, escoger una colonia. Sacar con el inoculador parte de esta y sembrarla siguiendo el mtodo de la estra en la placa petri que contiene el agar-almidn.

7. Dejar incubar la placa a 35C por un lapso de 48 72 horas.

8. Luego del tiempo de incubacin verter lugol a cada seccin de la placa. Para el anlisis respectivo.

3.2. Fermentacin de carbohidratos:

1. Prepara 150 ml de caldo lauril triptosa, repartirlos en los tubos de fermentacin tal que contengan 15 ml cada uno. Llevarlo al autoclave.

2. De la placa escogida (laboratorio N 03: DETERMINACIN DE LA CALIDAD DEL AGUA POR SU CONTENIDO BACTERIAL), con el inoculador estril obtenemos parte de la colonia que utilizamos en el primer anlisis y lo inoculamos en los tubos de fermentacin que contienen caldo lauril triptosa.

3. Dejamos incubar los tubos de fermentacin a 37C por 24 horas.

4. Luego del tiempo esperado analizamos las muestras anotando la cantidad de crecimiento y la formacin de gas, adems del pH de algunos de estos tubos.

4. Resultados y observaciones:

HIDRLISIS DEL ALMIDN

GRUPOLUGARCULTIVO ACULTIVO B

1Estanque arquitecturaNo hay hidrlisisSi hay hidrlisis

2Estanque arquitecturaSi hay hidrlisisSi hay hidrlisis

3Grifo de bao FIASi hay hidrlisisSi hay hidrlisis

4Estanque arquitectura--

5Estanque arquitecturaSi hay hidrlisisSi hay hidrlisis

GRUPOANTES DE ECHAR LUGOLDESPUES DE ECHAR LUGOL

1

2

3

4

5

Observacin:

La placa del grupo 4 no se pudo analizar, ya que se produjo un error en la elaboracin del cultivo, se verti el agar nutritivo cuando la placa estaba invertida, lo que ocasion que al abrir la placa el cultivo se malograra. El tiempo de incubacin de las placas con agar almidn fue de 72 horas (3 dias).

Al echar lugol sobre el crecimiento de la placa nos puede dar dos resultados:

Si la bacteria produce amilasa, hay hidrlisis, existe una zona ms clara entorno a la estra.

Si la bacteria no produce amilasa, no hay hidrlisis, no existe una zona clara alrededor de la estra.

FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS

GRUPOTUBO ATUBO B

Cantidad de crecimientoFormacin de gasCantidad de crecimientoFormacin de gas

1EscasoNoEscasoNo

pH 7

2EscasoNoEscasoNo

pH 8

3No hayNoNo hayNo

4EscasoNoEscasoNo

pH 7-8

5AbundanteSiAbundanteNo

pH 7

GRUPO N 01GRUPO N 02

OBSERVACIONESEl crecimiento se evidencia por la presencia de turbidez, lo cual nos indica que es una bacteria anaerobia facultativa.Similar a los tubos de fermentacin del grupo N 01 se evidencia turbidez, por tanto la bacteria es anaerobia facultativa.

GRUPO N 03GRUPO N 04

OBSERVACIONESNo se evidencia crecimiento ni presencia de gas, a pesar que en la hidrlisis del almidn de las mismas bacterias hubo crecimiento en el agar almidn; lo que indica que no se inocul bacteria alguna.La evidencia de crecimiento es escaso, y esto se presenta por la formacin de turbidez, por tanto la bacteria es anaerobia facultativa. El pH tiende de 7 a 8 lo que nos indica la basicidad de la muestra.

GRUPO N 05

OBSERVACIONESSe evidencia gran crecimiento (Tipo precipitado), es mayor en el tubo A (Cultivo A) que en el tubo B (cultivo B); adems en el tubo A se evidencia gas pero en pequea cantidad, casi despreciable, lo cual no influye en su pH.

Observacin: La incubacin de los tubos de fermentacin con caldo lauril triptosa fue de 72 horas, lo cual pudo ocasionar alteraciones en la muestra.

5. Conclusiones:

5.1. Hidrlisis del almidn:

Observamos que la mayor cantidad de bacterias sembradas realizan la hidrlisis del almidn generando amilasa, debido a que al momento de echar el lugol los alrededores de la estra estaba claro.

5.2. Fermentacin de carbohidratos:

En los tubos de fermentacin de los grupos 1, 2, 4 las bacterias inoculadas son anaerobias facultativas, ya que hay crecimiento de stas en forma de turbidez.

En los tubos de fermentacin del grupo 5 se evidencia la presencia de bacterias anaerobias, ya que hay crecimiento en el fondo del tubo. Pero hay mayor crecimiento en el tubo A que en el tubo B.

El pH del tubo A perteneciente al grupo 5 no es cido a pesar de la evidencia de gas, esto se debe a que la presencia de gas es casi despreciable.

6. Recomendaciones:

Escoger placas que contengan colonias de considerable tamao, pues estas las utilizaremos para los dos anlisis: hidrlisis del almidn y fermentacin de carbohidratos.

Diferenciar cuando se dice que una placa est invertida y cuando no, para evitar echar el medio de cultivo en la tapa de la placa, pues se debe echar el medio de cultivo en la base de la placa.

Fijarnos si estamos inoculando o no la bacteria problema, pues podramos sacar el inoculador sin sembrar el inculo.

7. Bibliografa:

BIOLOGA 2. Patricia Campos. (Respiracin aerobia y anaerobia). MICROBIOLOGA BSICA PARA EL REA DE LA SALUD Y AFINES. 2 edicin. Hugo Humberto Montoya Villafae. http://edicion-micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html ... (fermentacin de azucares e hidrlisis de almidn) http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima#Clasificaci.C3.B3n_y_nomenclatura_de_enzimas (clasificacin de enzimas)

8. Cuestionario:8.1. Definir: Enzima, hidrlisis, fermentacin.

Enzimas: son molculas de naturaleza proteica que pueden acelerar una reaccin qumica aumentando la frecuencia de las colisiones, o disminuyendo la energa necesaria de activacin sin sufrir alteracin ni ella misma ni la clula sobre la que actan, pues no modifican la temperatura ni la presin. Son catalizadores biolgicos.

Las enzimas actan de forma especfica, por tanto cada enzima afecta solamente a un sustrato especfico, esto se debe a la estructura especfica de cada enzima.

Una enzima puede encontrarse en forma activa o en forma inactiva dentro de la clula, el paso de una a otra forma lo determina el ambiente celular.

Hidrlisis: la hidrlisis es una reaccin qumica entre el agua y otra sustancia. La sustancia al ser disuelta en agua, sus iones constituyentes se combinan con los iones hidronio u oxonio (H3O+) o bien con los iones hidroxilo (OH-) que proceden de la disociacin del agua. Esto produce un desplazamiento del equilibrio de disociacin del agua y como consecuencia se modifica el valor del pH.

Fermentacin: es un proceso catablico de oxidacin incompleta, totalmente anaerobia. Es llevada a cabo comnmente por levaduras, pero tambin puede realizarse por algunos metazoos y protistas.

Este proceso se inicia a partir del cido pirvico formado en la oxidacin de la glucosa. Entre las caractersticas principales de la fermentacin podemos nombrar:

No necesita oxgeno, por ello es anaerobia. No necesita el ciclo de Kreps ni una cadena transportadora de electrones. Utiliza una molcula orgnica como aceptor final de electrones. Libera energa a partir de azcares u otras molculas orgnicas como aminocidos, cidos orgnicos, purinas, pirimidinas, etc. Libera solamente dos molculas de ATP por cada molcula de sustrato de partida. Los productos finales de la fermentacin pueden ser: cido lctico, etanol y CO2, cido propinico, cido actico, CO2 y agua, cido butrico. Es til el anlisis de productos finales para identificar a los microorganismos.

8.2. A qu se les llama: Enzimas extracelulares, enzimas intracelulares?

Enzimas extracelulares: tambin llamadas exocelulares, exoenzimas; tienen su funcin catalizadora fuera de la clula. Su funcin principal consiste en efectuar cambios precisos en los nutrientes del ambiente externo, para que dichos nutrientes puedan ser transportados al interior de la clula. Por ejemplo las amilasas rompen el almidn en molculas ms pequeas de azcar para que logren pasar al interior de la clula.

Enzimas intracelulares: tambin llamadas endocelulares, endoenzimas; su accin cataltica se limita al interior de la clula. Sintetizan el material celular y tambin degradan los nutrientes que penetraron a la clula por la accin de las enzimas extracelulares.

8.3. Qu es: Almidn, protena, grasa.

Almidn: el almidn es un polisacrido de reserva alimenticia predominante es las plantas; lo que llamamos almidn no es realmente un polisacrido, sino la mezcla de dos, la amilosa y la amilopectina, ambos formados por unidades de glucosa.

Proporcionan el 70-80% de las caloras consumidas por los humanos de todo el mundo. Tanto el almidn como los productos de la hidrlisis del almidn constituyen la mayor parte de los carbohidratos digestables de la dieta habitual.

A diferencia de los dems carbohidratos, en la naturaleza se presenta como complejas partculas discretas (grnulos), los cuales son densos, insolubles y se hidratan muy mal en agua fra.

Protena: las protenas son las molculas operadoras de la clula y llevan adelante el programa de actividades codificado por los genes, por ende este papel es fundamental para la vida. Este programa requiere el esfuerzo coordinado de diferentes tipos de protenas, las cuales primero evolucionan como molculas rudimentarias que facilitan un nmero limitado de reacciones qumicas. Gradualmente muchas de estas protenas primitivas evolucionan hasta transformarse en una amplia gama de enzimas capaces de catalizar un rango increble de recciones qumicas inracelulares y extracelulares. Con el paso del tiempo otras protenas adquieren capacidades especficas: protenas estructurales ( que proveen rigidez estructural a la clula), protenas transportadoras (controlan el flujo de materiales a travs de las membranas celulares), protenas reguladoras (actan como sensores e interruptores para controlar la actividad de las protena y la funcin de los genes), protenas sealizadoras (transmiten seales externas al interior de la clula), protenas motoras (producen el movimiento).

Grasa: llamadas tambin lpidos, son compuestos orgnicos que constituyen la mayor fuente de energa de los organismos. Las grasas estn presentes en muchos organismos y tienen funciones estructurales como metablicas.

Las grasas pueden ser slidas o lquidas a temperatura ambiente, adems son insolubles en agua teniendo menor densidad que la mencionada.

8.4. Diferencias entre proceso de respiracin aerobia y anaerobia.

La respiracin es un proceso mediante el cual las sustancias orgnicas se degradan y la energa puede ser usada por las clulas en forma de ATP. La glucosa es la molcula orgnica combustible usada con mayor frecuencia por la clula, y su metabolismo depende de la presencia o ausencia de oxgeno.

Respiracin aerobiaRespiracin anaerobia

El aceptor final de hidrgeno (electrones) es el oxgeno molecular O2.

Emplea O2 molecular.

Degrada la glucosa en CO2 y H2O.

Se producen 38 molculas de ATP por cada molcula de glucosa.

Es propia de los organismos eucariontes y de algunos tipos de bacterias. El aceptor final de hidrgeno (electrones) es una molcula inorgnica distinta del oxgeno molecular, como son los iones nitratos (NO-3), sulfatos (SO2-4), carbonatos (CO2-3); y ms raramente una molcula orgnica. No emplea O2. Degrada la glucosa en cido lctico.

Se producen 2 molculas de ATP por cada molcula de glucosa. Debido a que la degradacin de la glucosa es incompleta y se producen compuestos intermedios que an contienen energa