¿PODEMOS SEPARAR UNA MEZCLA DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA DE REPARTO?

Objetivo: Se llevará a cabo la separación de mezclas de aminoácidos mediantecromatografía en papel. Se revelará la presencia de los mismos en el papel mediante

con ninhidrina y se identificarán en la cromatografía por comparación con la posición

correspondientes patrones preparados al efecto.La cromatografía es un método físico para separar e identificar compuestos. Se basa en que cualquier sustancia, al serdisuelta en dos disolventes distintos no miscibles, se reparte entre ambos con arreglo a su solubilidad. La relación entrelas solubilidades de dicha sustancia en cada uno de los disolventes se denomina Coeficiente de Reparto.Si uno de los disolventes se mantiene fijo (Fase Estacionaria) se puede hacer desplazar el otro disolvente (Fase Móvil)sobre el primero. Las sustancias a cromatografiarse verán sometidas a una distribución entre las fases estacionaria ymóvil de modo que las más solubles en la fase móvil avanzarán más que las que sean retenidas por la fase estacionaria.

De acuerdo con el mecanismo que produce la separación, se puede hablar de distintos tipos de cromatografía:

Uno de ellos es la cromatografía en papel que se utiliza para la separación de cantidades mínimas de soluto y tambiéncomo un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de unafase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte sólido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente enmovimiento. Una vez realizada la cromatografía, la posición de los componentes se determina mediante una técnicaque permita “visualizarlos”. Es común revelar la cromatografía mediante reacciones que originen productos coloreados,como la ninhidrina.

La ninhidrina que reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoníacoy anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (la ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez conamoníaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta, debido a que su grupo amino está sustituido.

Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de lascromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, elaminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína paracompararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuvieraesta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubieratenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizado

Los aminoácidos suben sobre el papel cromatográfico de manera distinta, esto se debe a su composición químicaestructural.Si se emplea un solvente polar, aquellos aminoácidos polares-con o sin carga- tendrán una interacción mayor que losotros aminoácidos, en cambio, si se usa un solvente apolar, los apolares recorrerán una distancia mayor, en amboscasos, los neutros recorrerá una distancia intermedia, debido a su naturaleza neutra.

Después de realizar una cromatografía, en ocasiones, se necesita un revelador que nos indique la posición final a lacual llegaron los analitos, un ejemplo de revelador para aminoácidos, es la Ninhidrina, ya que reacciona con el grupoamino de los A.A. dando una coloración azul-púrpura, a excepción de la prolina, ya que esta tiene su radical NH3sustituido, por lo que toma una coloración amarilla

AMINOÁCIDOSSon compuestos orgánicos formados por Carbono, Nitrógeno, Oxígeno e Hidrógeno; (algunos poseen Azufre).Los aminoácidos reciben este nombre porque presentan los grupos funcionales Amino (NH3+) y carboxilo(COO-); algunos autores los definen como derivados aminados de ácidos carboxílicos.

CROMATOGRAFIA:La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tieneaplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retenciónselectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar ydeterminar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de loscompuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separaciónefectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

•Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente(etapa final de muchas síntesis).•Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades dematerial empleadas son pequeñas.

LEUCINALa leucina interactúa con los aminoácidos isoleucina y valina para promover la cicatrización del tejido muscular, la piel y los huesos y serecomienda para quienes se recuperan de la cirugía. Este aminoácido reduce los niveles de azúcar en la sangre y ayuda a aumentar laproducción de la hormona del crecimiento.

LISINAFunciones de este aminoácido son garantizar la absorción adecuada de calcio y mantiene un equilibrio adecuado de nitrógeno en losadultos. Además, la lisina ayuda a formar colágeno que constituye el cartílago y tejido conectivo. La Lisina también ayuda a la producciónde anticuerpos que tienen la capacidad para luchar contra el herpes labial y los brotes de herpes y reduce los niveles elevados detriglicéridos en suero.

PROLINAFunciones de este aminoácido son mejorar la textura de la piel, ayudando a la producción de colágeno y reducir la pérdida de colágeno através del proceso de envejecimiento. Además, la Prolina ayuda en la cicatrización del cartílago y el fortalecimiento de las articulaciones,los tendones y los músculos del corazón. La Prolina trabaja con la vitamina C para ayudar a mantener sanos los tejidos conectivos.

LA NINHIDRINALa ninhidrina es un poderoso agente reactivo común para visualizar (Castro, J. 1990) las bandasde separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada confines cuantitativos para la determinación de aminoácidos Reacciona con todos los aminoácidosalfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso.Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, lacoloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original delaminoácido.

Butanol

Fórmula: CH3(CH2)3OH M.=74,12 CAS [71-36-3] Número CE (EINECS): 200-751-6 Número de índice CE: 603-004-00-6 INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo FRASES R: 10-22-37/38-41-67 Inflamable. Nocivo por ingestión. Irrita las vías respiratorias y la piel. Riesgo de lesiones oculares graves. La inhalación de vapores puede provocar somnolencia y vértigo. FRASES S: 7/9-13-26-37/39-46 Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado. Manténgase lejos de alimentos, bebidas y piensos. En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. Úsense guantes adecuados y protección para los ojos-la cara. En caso de ingestión, acuda inmediatamente al médico y muéstrele la etiqueta o el envase. NÚMERO DE ÍNDICE CE: 603-004-00-6

Ninhidrina

Fórmula: C9H6O4 M.=178,15 CAS [485-47-2] Número CE (EINECS): 207-618-1 INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo FRASES R: 22-36/37/38 Nocivo por ingestión. Irrita los ojos, la piel y las vías respiratorias. ALMACENAMIENTO: Recipientes bien cerrados. Ambiente seco. Temperatura ambiente No se descartan otras características peligrosas. Observar las precauciones habituales en el

manejo de productos químicos.

Material:-Cámara cromatografía-Papel para cromatografía (16cm de largo X 18cm de ancho)-Estufa 90ºC-Capilares

Reactivos:-Aminoácidos en solución 0.05 M-Solvente: n-Butanol: Ácido acético glacial: Agua (4:1:5)-Revelador: Solución de Ninhidrina-Hidróxido de Amonio concentrado

Hidróxido de amonio

Fórmula: NH4OH Masa molecular: 35.1 Nº CAS 1336-21-6 Nº RTECS BQ9625000 Nº ICSC 0215 Nº NU 2672 Nº CE 007-001-01-2 ESTADO FISICO; ASPECTO: Disolución incolora, muy volátil, de olor acre. PELIGROS QUIMICOS: Reacciona con muchos metales y sus sales dando lugar a la formación de compuestos explosivos. Ataca a muchos metales formando gas inflamable de hidrógeno. La disolución en agua es una base fuerte y reacciona violentamente con ácidos. LIMITES DE EXPOSICION: TLV no establecido. MAK no establecido. VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalación del vapor o aerosol y por ingestión. RIESGO DE INHALACION: Por evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar muy rápidamente una concentración nociva en el aire. EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: La sustancia es corrosiva para los ojos, la piel y el tracto respiratorio. Corrosiva por ingestión. La inhalación de altas concentraciones del vapor puede originar edema laringeal, inflamación del tracto respiratorio y neumonía. Los efectos pueden aparecer de forma no inmediata. EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: Los pulmones pueden resultar afectados

por la exposición prolongada o repetida al vapor o aerosol.

DISCUSIÓN:

Consultando el libro “Laboratory Experiments for Introduction to General, Organic and Biochemistry” de Frederick Bettelheim, se encontró la siguiente tabla para los valores de Rf para cada aminoácido utilizando como solvente una mezcla de butanol/acido acético/agua en proporción 12/3/5. Aunque el eluyente no sea en la misma proporción que en la práctica, la fase estacionaria y la móvil son la misma, así que se pueden esperar resultados parecidos, al menos en cuanto al orden de menor a mayor factor de retención

Amino acid Rf value Amino

acid

Rf value

alanine 0.38 leucine 0.73

arginine 0.20 lysine 0.14

asparagine 0.5 methionin

e

0.55

aspartic acid 0.24 phenylala

nine

0.68

cysteine 0.4 proline

not a true

amino

acid -

shows up

as yellow

0.43

glutamine 0.13 serine 0.27

glutamic acid 0.30 threonine 0.35

glycine 0.26 tryptopha

n

0.66

histidine 0.11 tyrosine 0.45

isoleucine 0.72 valine 0.61

Aminoácido Valor promedio Rf en la

práctica Valores Rf reportados en proporción 12/3/5

Leucina 0.589 0.738

Prolina 0.389 0.43

Lisina 0.291 0.14

Mediciones:

Aminoácido Distancia recorrida por el compuesto (x)

Distancia recorrida por el eluyente (y)

Factor de retención Rf=x/y

Color

Leucina

3.7cm 7cm 0.529 Morado

Prolina

2cm 6cm 0.333 Amarillo

Lisina

2cm 7.4cm 0.27 Morado

Mezcla. Sustancia 1

2.3cm 7.4cm 0.311 Morado

Mezcla. Sustancia 2

3.3cm 7.4cm 0.446 Amarillo

Mezcla. Sustancia 3

4.8cm 7.4cm 0.649 Morado

Rf (Leucina)= 3.7cm/7cm=0.529Rf (Prolina) =2cm/6cm=0.333Rf (Lisina) =2cm/7.4cm=0.27

Rf (Sustancia 1) =2.3cm/7.4cm=0.311Rf (Sustancia 2) =3.3cm/7.4cm=0.446Rf (Sustancia 3) =4.8cm/7.4cm=0.649

𝑅𝑓 (𝐿𝑒𝑢𝑐𝑖𝑛𝑎 ) + 𝑅𝑓 (𝑆𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 3)

2 =

0.529 + 0.649

2=0.589

𝑅𝑓 (𝑃𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛𝑎 ) + 𝑅𝑓 (𝑆𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 2)

2 =

0.333 + 0.446

2=0.389

𝑅𝑓 (𝐿𝑖𝑠𝑖𝑛𝑎 ) + 𝑅𝑓 (𝑆𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 1)

2 =

0.27 + 0.311

2=0.291

Observaciones:Se concluye que la sustancia 2 en la mezcla corresponde a la prolinaporque ambas presentan la coloración amarilla ante el revelador deaminoácidos. La sustancia 1 en la mezcla es más probable que se tratede la lisina, y la sustancia 3 que se trate de la leucina, porque existemayor relación entre los valores.Hubo algunos errores que provocaron la diferencia en los factores deretención entre los primeros 3 aminoácidos y los que formaban lamezcla, principalmente que hubo movimiento no intencional del frascodonde se estaba llevando a cabo la separación de solutos porcromatografía.Promedio de los valores obtenidos de Rf por cada aminoácido

1º Paso: Sobre una placa de papel cromatográfico de 20 x 20 cm se trazo con un lápiz una recta paralela

a uno de los bordes y a una distancia de éste de 2 cm. Sobre esta línea se pone 4 puntos

equidistantes entre sí y sobre los bordes (3.5, 7.5, 11.5, y 15.5).

NOTA: No hay que tocar la parte del papel cromatografico de la placa con las manos, ya que la contaminaremos con

aminoácidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolígrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marqués.

2º Paso: Agregamos aproximadamente 20ml de el solvente (n-Butanol: Acido acético glacial: Agua) en la

cámara y tapamos para saturar.

3º Paso: En cada punto (identificamos con el nombre de cada uno de los aminoácidos) se aplicaron tres

gotas de la solución de aminoácidos y solución problema (un aminoácido en cada punto y en el

último la solución problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con

mucho cuidado). Procurando secar en cada aplicación.

4º Paso: Pasamos el papel cromatográfico sobre el bocal de la botella de hidróxido de amonio

concentrado para neutralizar (una vez secadas las muestras)

5º Paso: Se añadió al tanque cromatográfico eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que

éste alcance la zona de aplicación de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se

deja desarrollar la cromatografía hasta que el

elulyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (45min aproximadamente).

NOTA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es tóxico y no mover la cámara.

6º Paso: Terminada la cromatografía se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se

seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se rocía con un

pulverizador que contiene la solución reveladora (en la campana de gases). La placa se secará

haciéndole llegar aire caliente con el secador.

NOTA: Esta operación debe de hacerse en la campana extractora de gases.

7º Paso: Se indican los valores de distancia recorrida por cada uno de los aminoácidos en una tabla y se

calculan los correspondientes valores de Rf. Se indica la composición de la solución problema,

justificando la conclusión a la que se ha llegado.

¿En qué orden migran los aminoácidos de diferentes grupos?

En una cromatografía, migran primeramente aquellos aminoácidos apolares, ya que los

solventes comúnmente usados son menos polares que el agua, lo que hace que los

aminoácidos polares (con o sin carga) sean retenidos en la fase estacionaria

¿Es a ninhidrina es un revelador selectivo, porque?

Sí, porque reacciona con el grupo amino o amoniaco de un compuesto, dando una tonalidad

entre azul y purpura, llamado purpura de Ruhemann

¿Cómo se calcula el Rf?

𝑅𝑓 =𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜

𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒

CUESTIONARIO:

Ácido acético

Acido etanoico Fórmula: CH3COOH Masa molecular: 60.1 Nº CAS 64-19-7 Nº RTECS AF1340000 Nº ICSC 0363 Nº NU 2789 Nº CE 607-002-00-6(>90%) ESTADO FISICO; ASPECTO: Líquido incoloro, con olor acre. PELIGROS QUIMICOS: La sustancia es moderadamente ácida. Reacciona violentamente con oxidantes tales como trióxido de cromo y permanganato potásico. Reacciona violentamente con bases fuertes. Ataca muchos metales formando gas combustible (Hidrógeno). LIMITES DE EXPOSICION: TLV: 10 ppm; 25 mg/m3 (como TWA); 15 ppm; 37 mg/m3 (como STEL) (ACGIH 1990-1991) VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalación del vapor y por ingestión. RIESGO DE INHALACION: En la evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar bastante rápidamente una concentración nociva en el aire. EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: Corrosivo. La sustancia es muy corrosiva para los ojos, la piel y el tracto respiratorio. La inhalación del vapor puede originar edema pulmonar (véanse Notas). Corrosivo por ingestión. EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: El contacto prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis.

Observamos que aunque los valores no son los mismos, el orden de menor a mayor son iguales. Hubo errores cometidos en la práctica, como el movimiento no intencional del frasco donde se llevaba a cabo la cromatografía, por lo que los resultados difieren de los reales.

Conclusión

Si es posible, porque gracias a los diferentes factores de reparto que tiene cada aminoácido ante el eluyente es que muestran diferentes velocidades de desplazamiento ante la fase móvil. Por estas diferentes velocidades es que el desplazamiento final es diferente en cada caso y entonces quedan separados cada uno de los aminoácidos.

Esta es nuestra cromatografía de reparto en papel