la resistència bacteriana als antibiòtics
DESCRIPTION
Autora: Clàudia Gangoso Gimferrer | Tutora: Teresa Castells | Tema: Bacteris, AntibiòticsTRANSCRIPT
TREBALL
DE RECERCA: La resistència
bacteriana als
antibiòtics
Clàudia Gangoso Gimferrer 2n de Batxillerat
Curs 2014-2015
Tutora: Teresa Castells
Institut Montserrat
Agraïments
M’agradaria donar les gràcies a la
tutora del meu treball de recerca, per tota
l’ajuda que m’ha ofert durant tot el temps que
ha durat la realització del treball. Ella m’ha
ajudat a encaminar el meu treball, s’ha
preocupat d’aconseguir-me el material
necessari per a les pràctiques i m’ha aconsellat
en tot moment.
També agrair als meus pares que
m’han ajudat des del primer dia i m’han donat
confiança per tirar endavant el meu treball. Tot
i que no entenguessin molt bé el contingut
l’hagin llegit per aconsellar-me.
Finalment donar les gràcies a la
meva germana Alba, ja que m’ha pogut ajudar
en la part teòrica del treball
Sense vosaltres aquest treball no
hagués estat possible i per això vull agrair la
vostra dedicació, moltes gràcies a tots.
3
Índex
0. INTRODUCCIÓ.......................................................................................................5
1. BACTERIS................................................................................................................6
1.1. Història................................................................................................................6
1.2. Què són els bacteris.............................................................................................7
1.2.1. Arqueobacteris..........................................................................................8
1.2.2. Eubacteris ................................................................................................8
1.3. Estructura bacteriana..........................................................................................9
1.3.1. Part externa...............................................................................................9
1.3.2. Part interna..............................................................................................14
1.4. Classificació dels bacteris.................................................................................17
1.4.1. Segons la morfologia i l’agrupació........................................................ 17
1.4.2. Segons la nutrició.................................................................................. 19
1.4.3. Segons la respiració............................................................................... 21
1.4.4. Segons l’òptima de temperatura............................................................ 22
1.4.5. Segons el pH en que es desenvolupen................................................... 23
1.5. La fisiologia bacteriana.................................................................................... 24
1.5.1. Funció de nutrició.................................................................................. 24
1.5.2. Funció de relació................................................................................... 25
1.5.3. Funció de reproducció........................................................................... 27
1.6. Genètica bacteriana.......................................................................................... 28
1.6.1. Mutacions.............................................................................................. 28
1.6.2. Fenòmens de transferència genètica...................................................... 29
1.7. Creixement bacterià......................................................................................... 31
1.7.1. Fases de creixement bacterià................................................................. 33
1.8. Medis de cultiu................................................................................................. 34
1.9. Tinció de Gram................................................................................................ 40
4
2. ANTIBIÒTICS...................................................................................................... 43
2.1. Història............................................................................................................ 43
2.2. Què són els antibiòtics..................................................................................... 44
2.3. Classificació .................................................................................................... 45
2.3.1. Segons el seu origen.............................................................................. 45
2.3.2. Segons el seu espectre d’acció.............................................................. 46
2.3.3. Segons la seva forma d’actuació........................................................... 46
2.3.4. Segons el mecanisme d’acció................................................................ 46
2.4. Resistència als antibiòtics................................................................................ 49
3. EXPERIMENTACIÓ.............................................................................................51
3.1. Pràctica 1: Comprovació de la mutació dels bacteris........................................51
3.2. Pràctica 2: Comprovació de la resistència bacteriana als antibiòtics..............57
4. CONCLUSIÓ......................................................................................................... 63
5. REFERÈNCIES.................................................................................................... 65
5.1. Webgrafia ........................................................................................................ 65
5.2. Bibliografia...................................................................................................... 66
5
0. INTRODUCCIÓ
El meu treball de recerca es titula “La resistència dels bacteris als antibiòtics”. i amb ell
pretenc demostrar la resistència bacteriana als antibiòtics i dur a terme una fase
experimental per fer-ho.
Inicialment no era això el que volia fer, el que pretenia fer era un treball sobre un tema
totalment diferent al que tractaré, un treball sobre la SIDA. Però era un tema difícil de
treballar a causa de la seva extensió i no estava al meu abast com a estudiant de 1r de
Batxillerat, per tant, era pràcticament impossible obtenir uns bons resultats en la meva
recerca. Per això, la meva tutora em va proposar canviar la idea del treball i em va
semblar interessant.
Així, finalment el que faré serà una recerca d’informació teòrica que necessitaré per a la
bona elaboració del meu Treball de Recerca i un bon recull de resultats que extrauré de
la part d’experimentació que duré a terme en un laboratori i posteriorment analitzaré els
resultats per tal de comprovar la resistència bacteriana als antibiòtics.
Els bacteris són sovint malignes i són la causa de malalties en els humans i en els
animals. Tanmateix, certs bacteris produeixen antibiòtics, altres viuen de manera
simbiòtica als intestins dels animals (inclosos els humans) o en alguna altra part del seu
cos, o en les arrels d’algunes plantes, convertint el nitrogen en una forma utilitzable.
Els bacteris juguen un paper fonamental en la natura i en l’home. Ells posen sabor al
iogurt i el gust en el ferment del pa. Són de màxima importància a causa de la seva
extrema flexibilitat, la capacitat pel creixement i la ràpida reproducció.
El meu treball constarà d’una part teòrica important sobre els bacteris i els antibiòtics i
d’una altra part experimental on duré a terme les pràctiques de laboratori.
Objectius:
Els objectius bàsics que pretenc assolir amb aquest treball són:
Conèixer a fons què i com són els bacteris i els antibiòtics..
Estudiar i experimentar la mutació dels bacteris.
Estudiar i experimentar la reacció bacteriana als antibiòtics.
6
1. ELS BACTERIS
1.1. Història
Antony Leeuwenhoek (1632-1723) va ser un comerciant de Delft (Holanda) aficionat a
la ciència. No va tenir educació universitària i això va ser un motiu suficient per
excloure’l de la comunitat científica a la seva època. La seva curiositat i la seva ment
oberta el van portar a aprendre a polir lents i construir senzills microscopis (la lent era
una petita esfera de vidre sobreposada en una fusta). Gràcies a aquest senzill microscopi
va aconseguir descobrir els bacteris. La primera observació de bacteris la va realitzar
amb mostres de les dents.
Posterior a Leeuwenhoek, el científic austríac Marc von Plenciz va afirmar que les
malalties contagioses eren causades pels organismes descoberts per Leeuwenhoek. El
1828, Christian Gottfried Ehrenberg va anomenar aquells éssers amb una paraula grega,
bacteris, que en català significa “petit bastó”. El 1835 Agostino Bassi, va poder
demostrar experimentalment que la malaltia del cuc de seda estava causada per bacteris.
Posteriorment, va deduir que els bacteris podrien ser els causants de moltes altres
malalties.
Finalment, Louis Pasteur i Robert
Koch van relacionar els bacteris amb
diferents malalties considerant-los com
a patògens. Així doncs, els bacteris van
ser classificats com un grup totalment
separat de la resta d’organismes.
El microbiòleg estatunidenc Carl
Richard Woese, en conclusió, els va
classificar en dos tipus de bacteris, els
“Eubacteris” i els “Arqueobacteris”.
1. Retrats de Louis Pasteur i Robert Koch
respectivament
7
1.2. Què són els bacteris
Els bacteris són éssers unicel·lulars, procariotes que no tenen un nucli diferenciat i per
tant el seu ADN està situat dins el citoplasma. Pertanyen al grup dels protists inferiors i
existeixen només quatre tipus morfològics, els cocs (esfèrics), els bacils (bastons), els
espirils (espirals) i els vibrions (coma ortogràfica). Poden presentar-se amb una càpsula
gelatinosa o sense, aïllats o en grups i poden tenir cilis o flagels.
El bacteri és l’organisme més simple i abundant i pot viure a la terra, a l’aigua, matèria
orgànica, vegetals i animals.
Gairebé tots els tipus de bacteris posseeixen una capa protectora anomenada paret
cel·lular, que els hi permet viure en una àmplia gama d’ambients. Aquesta paret, li dóna
forma i algunes espècies estan rodejades a més a més, per una càpsula que la fa més
resistent als productes químics destructius.
Tot i que els bacteris són organismes mols simples, amb escasses estructures internes i
tan sols quatre formes externes, presenten una gran variabilitat de metabolismes, de de
l’heteròtrof fins a l’autòtrof (bacteris fotosintètics) i des de l’aerobi fins a l’anaerobi.
Tenen una mida que pot oscil·lar entre els 1,5 µm de l’Escherichia coli, el bacteri
intestinal humà, els 7 µm del cianobacteri Oscillatoria o els 600 µm d’Epulopiscium
fishelsoni, un bacteri “gegant” que viu a l’intestí del peix cirurgià dels oceans Índic i
Pacífic.
2. Escherichia coli (1,5 µm) 3. Oscillatoria (7 µm) 4. Epulopiscium fishelsoni
(600 µm)
8
1.2.1. Arqueobacteris
Els Arqueobacteris són els bacteris primitius que viuen en hàbitats més semblants als de
la Terra primitiva.
Tot i que aquest grup de bacteris van ser descoberts originàriament en els hàbitats molt
extrems, amb el pas dels anys ja es van poder trobar en tot tipus d’hàbitats i actualment
constitueixen el 20% de la biomassa bacteriana oceànica.
Són un dels grups d’organismes més abundants de tot el planeta.
Algunes espècies són hipertermòfiles i poden sobreviure a temperatures superiors als
100ºC i es poden trobar en guèisers, fonts hidrotermals i pous de petroli.
N’hi ha d’altres que són extremòfiles i es troben en aigua híper-salina, àcida o alcalina.
No obstant això, també n’hi ha que són mesòfiles o psicròfiles i prosperen en ambients
com aiguamolls, aigües residuals, aigua del mar i el terra.
Les metanògenes que es troben al tracte digestiu dels éssers
vius com rumiants, termites i els humans.
Un exemple és el Sulfolobus. Aquestes espècies creixen en
aigües termals i ho fan de manera òptima quan hi ha un pH
entre 2 i 3 i una temperatura de 75 a 80ºC, per tant, són
termòfiles i extremòfiles respectivament.
1.2.2. Eubacteris
Els Eubacteris són organismes microscòpics que tenen cèl·lules procariotes. A causa
d’aquestes, tenen una paret cel·lular rígida.
Són organismes molt simples ja que manquen dels orgànuls grans i només tenen un
cromosoma. La majoria d’aquests es reprodueixen de manera asexual.
Certs tipus d’Eubacteris representen un problema per a la salut dels humans. Per
exemple, el bacteri Estreptococo pot ser el responsable d’una angina.
A vegades, en carns i ous mal cuits, hi ha uns bacteris anomenats E. Coli i Salmonel·la
poden causar malaltia.
Però d’altra banda, també hi ha bacteris que són beneficiosos per a la salut dels humans,
com poden ser els bacteris utilitzats perfer iogurt, per fer el vi, per fermentar la llet i
inclús per l’elaboració de certs tipus de formatges.
5. Imatge d’un Sulfolobus
9
Un exemple és el Streptococcus Sanguinis, és un
habitant normal de la boca humana sana ,
especialment de la placa dental on modifica
l’ambient perquè sigui menys acollidor per a altres
soques de Streptococcus que provoquen càries,
com Streptococcus mutans.
1.3. Estructura bacteriana
L’estructura dels bacteris és molt més simple que la de les cèl·lules eucariotes, però en
canvi, l’estructura superficial és més complexa. Els components estructurals més
importants dels bacteris són:
La part externa que està formada per la
càpsula bacteriana, que pot faltar, la paret
bacteriana i la membrana plasmàtica.
La part interna està formada per un citoplasma
en el qual es troba el hialoplasma i el citosol on
estan immersos els ribosomes i inclusions i el
filament de DNA bacterià.
1.3.1. Part externa
La part externa de l’estructura bacteriana està composta pels següents elements: la
càpsula bacteriana, la paret bacteriana i la membrana plasmàtica
Càpsula bacteriana
La càpsula bacteriana és una coberta gelatinosa de diferents polisacàrids que envolta la
paret bacteriana i que només presenten alguns bacteris. És rígida i està adherida a la
paret bacteriana , però si per la seva composició absorbeix aigua, augmenta el gruix i es
torna mucilaginosa, s’anomena capa mucosa. Això explica que presenti un gruix molt
variable d’entre 100 i 400 A0.
6. Imatge d’un Streptococcus Sanguinis
7. Dibuix de l’estructura
bacteriana
10
Aquesta càpsula és rica en glúcids com l’àcid urònic1, l’àcid glucurònic,
l’acetilglucosamina i glicoproteïnes que es forma en els bacteris patògens.
Molts bacteris patògens tenen càpsula. La càpsula dificulta que els anticossos i les
cèl·lules fagocítiques de l’hoste els reconeguin i els destrueixin. La càpsula, a més,
permet l’adhesió dels bacteris a les cèl·lules de l’hoste, i l’adhesió dels bacteris fills
entres si, de manera que es facilita la formació de colònies . Les càpsules també
intervenen en els processos d’intercanvi d’aigua, ions i substàncies nutritives i actuen
com un mecanisme de defensa davant la dessecació del medi.
Les diferents funcions de la càpsula bacteriana són regular l’intercanvi d’aigua, ions i
substàncies nutritives en el medi extern, protegir la cèl·lula de la fagocitosi2, també
serveix com a dipòsit d’aliments, com a lloc d’eliminació de substàncies de rebuig i a
més evita l’atac dels bacteriòfag3.
Aquesta capa és rica en aigua i protegeix el
bacteri de la deshidratació, creant-li una
resistència en cas de dessecació del medi i a més
permet la formació de colònies. També és un
mitjà de defenses front a bacteriòfags,
anticossos i la fagocitosi que poden reconèixer
el bacteri per a destruir-lo.
Molts bacteris patògens tenen càpsula.
Paret bacteriana
La paret bacteriana és una capa que recobreix el bacteri per donar-li rigidesa i forma
davant les variacions de pressió osmòtica, regula el pas dels ions com a membrana
semipermeable, té un gruix d’uns 50 a 100 A0 i és molt resistent als antibiòtics. Els
components principals d’aquesta paret són peptidoglicans o mureïnes4 formades per
anells de polisacàrids enllaçats amb oligopèptids.5
.
8. Bacteri encapsulat i paret cel·lular
11
9 Qualsevol molècula utilitzada, capaç o produïda durant el metabolisme. 10 Enzim que sintetitza Adenina Trifosfat (ATP) a partir d’Adenina Difosfat (ADP).
Les funcions de la paret bacteriana són mantenir la forma característica dels bacteris. És
permeable a les sals i a moltes molècules orgàniques de baix pes molecular. La
destrucció de la paret bacteriana deixa inerme el bacteri davant dels canvis de salinitat
del medi. El lisozim, un enzim present en les llàgrimes i les secrecions nasals, actua
trencant enllaços glicosídics dels peptidoglicans, i per això té acció bactericida. En
canvi, molts antibiòtics, com ara la penicil·lina, no destrueixen la paret bacteriana, sinó
que actuen impedint els enllaços peptídics entre
les llargues cadenes de NAM-NAG durant la
seva síntesi, i això impedeix la proliferació
bacteriana.
Els bacteris s’han classificat durant molt de
temps com a bacteris Gram+ i Gram-, en funció
al seu comportament davant la tinció de Gram.
El fet que es comporti com Grampositius
(Gram+), es tenyeixen de color morat, o com Gramnegatius (Gram
-) que es tenyeixen
d’un color rosat, és degut a la seva paret cel·lular.
La paret cel·lular dels Gram- és monostratificada6 i està composta per mureïna,
polisacàrids7, proteïnes i àcids teïcoics
8. És baixa en lípids, i el peptidoglicà present
formant una monocapa, és un component important que suposa el 50% del pes sec
d’algunes cèl·lules bacterianes
La paret cel·lular de les Gram+ és més rica en mureïna que les de Gram-. Existeixen a
més, uns altres bacteris que no són sensibles a la tinció
de Gram, degut a que presenten una paret bacteriana
de diferent composició; són els anomenats bacteris
àcid-alcohol-resistents.
També hi ha altres tipus de bacteris que no presenten
paret cel·lular; unes pertanyen al gènere Micoplasma
(bacteris patògens) i uns altres són els bacteris que
habitualment sí tenen paret (formes S) però l’han
perdut (formes S).
10. Micoplasma (patògen)
9. Dibuix de la paret bacteriana
12
9 Qualsevol molècula utilitzada, capaç o produïda durant el metabolisme. 10 Enzim que sintetitza Adenina Trifosfat (ATP) a partir d’Adenina Difosfat (ADP).
Membrana plasmàtica
La membrana plasmàtica és una capa que envolta el citoplasma. Està constituïda per una
membrana de tipus unitari de 75 A0 de gruix i d’estructura és molt semblant a la de les
cèl·lules eucariotes, excepte per l’absència de colesterol. Les funcions de la membrana
plasmàtica, són les mateixes que en les cèl·lules eucariotes, és a dir, delimiten el bacteri
i regulen el pas de substàncies nutritives. És una estructura de 8nm d’espessor que
separa l’interior de l’exterior cel·lular i si es destrueix, es perd la integritat cel·lular.
Actua com ma barrera selectiva ja que reté metabòlits9 importants i excreta substàncies
de rebuig. Els seus components més abundants són els fosfolípids i en segon lloc les
proteïnes. El fet de no tenir esterols, els hi treu rigidesa.
La membrana plasmàtica conté nombrosos sistemes enzimàtics que intervenen en
diverses funcions com: subjectar el cromosoma bacterià, dirigir la replicació del DNA
per mitjà de DNA-polimerasa, fer la respiració
bacteriana gràcies a la presència d’enzims
ATP-sintetases10
a les membranes, fer la
fotosíntesi en els bacteris fotosintètics que no
són cianobacteris gràcies a la presència de
fotosistemes I a la membrana i finalment assimilar
nitrogen en forma de NO3- o NO2
- (bacteris
nitrificants) o el N2 atmosfèric, gràcies al fet que conté l’enzim nitrogenasa.
Flagels
Els flagels són prolongacions fines amb una longitud que
pot ser diverses vegades més gran que la del bacteri. N’hi
pot haver d’un sol fins a 100 per cèl·lula bacteriana.
Segons el nombre i la situació dels flagels en el cos
bacterià, els bacteris poden ser monòtrics, lofòtrics,
amfítrics i perítrics. Els bacteris sense flagel s’anomenen
àtrics.
Els monòtrics tenen només un flagel, els lofòtrics tenen
diversos flagels en un sol pol, els amfítrics tenen grups de
flagels en els dos pols i finalment els perítrics tenen flagels
que l’envolten.
11. Dibuix de la menmbraa
plasmàtica
12. A: Monòtrics B: Lofòtrics
C: Amfítrics D: Perítrics
13
11 Proteïna que s’autoorganitza en un cilindre buit per formar el filament en flagel bacterià. 12 Proteïna fibrosa que es troba en estructures de pèls en els bacteris.
Els flagels bacterians són molt més senzills que
els de les cèl·lules eucariotes. En els flagels es
distingeixen dues zones, la zona basal i el
filament. La zona basal es compon del cos basal
i el colze, formats tots dos per proteïnes. El cos
basal dels bacteris gram- es compon del bastó
central i quatre estructures discoïdals. Els dos
discos més interns que estan associats a la
membrana plasmàtica, giren sobre si mateixos i
transmeten el seu moviment a la resta del flagel;
els altres dos discos són fixos i estan incrustats a
la paret, l’un a la capa de mureïna i el més
extern a la membrana externa.
El colze té una curvatura de gairebé 90º i és una
mica més gruixut que el flagel. Aquest, que té
un gruix que oscil·la entre 100 i 200 A0, està
format per un nombre variable de fibres d’una
proteïna, la flagel·lina11
. Els flagels, en girar, són
les estructures que permeten el moviment dels bacteris.
En la imatge núm. 13 es pot observar l’estructura del flagel d’un bacteri gramnegatiu
com podria ser l’Escherichia coli. Els discos inferiors fan de rotors i proporcionen una
velocitat de gairebé 200 voltes/segon al colze i a la tija del flagel. Als bacteris
grampositius els hi falta el disc superior.
Pèls
Són estructures allargades i buides que els bacteris fan servir per
adherir-se a diferents superfícies i també serveixen com un
sistema d’intercanvi d’informació genètica per conjugació.
Només es troben en bacteris gram-. Els pèls es componen de
molècules d’una proteïna anomenada pilina12
. Hi ha dos tipus de
13. Estructura del flagel d’un bacteri gramnegatiu
14. E. coli (bacteri amb fímbries)
14
pèls, els pèls de conjugació (o pèls sexuals) i els pels d’unió (o fímbries).
Els pèls d’unió són curts, n’hi pot haver fins a 200 per bacteri i els bacteris els utilitzen
per adherir-se a diferents superfícies com la interfase aigua/aire i la superfície de les
cèl·lules. En aquest últim cas poden contribuir a augmentar el caràcter patogen dels
bacteris. Hi poden haver soques que en tenen i d’altres que la mateixa espècie que, per
mutació, no en tenen. Són més freqüents en Gram- que en Gram
+.
1.3.2. Part interna
La part interna dels bacteris està formada per quatre elements principals i aquests són
els ribosomes, les inclusions, els orgànuls especials i el cromosoma bacterià.
Ribosomes
Els ribosomes són partícules globulars d’uns 200A0 de diàmetre que es troben en gran
nombre (5.000-20.000) lliures en el citoplasma bacterià o formant llargues cadenes
anomenats poliribosomes. Els ribosomes bacterians tenen una velocitat de sedimentació
de 70 S (són una mica més petits que els de les cèl·lules eucariotes) i estan formats per
dues subunitats, la més gran, de 50 S i la més petita, de 30 S. La lletra S correspon a
unitats de Svedverg i indica la
velocitat relativa de sedimentació.
La composició dels ribosomes és
RNA i proteïnes. Igual que en les
cèl·lules eucariotes, els ribosomes
bacterians fan la síntesi de
proteïnes.
Normalment es troben en grups de
3 o 4 units per un filament de
RNA missatger, denominats
poliribosomes.
15. Dibuix d’un ribosoma i síntesi de proteïnes
15
Inclusions
Les inclusions són grànuls de substàncies de reserva que el bacteri sintetitza en
moments d’abundància. Aquestes inclusions es troben disperses en el citoplasma i no
tenen membrana plasmàtica que els aïlli. Poden ser de reserva energètica, com ara els
grànuls de midó (o de glicogen, segons l’espècie) i els dipòsits de lípids (generalment
triglicèrids). També poden ser de reserva de fòsfor en forma de polifosfat, els
anomenats glòbuls de volutina, o de reserva de sofre, els anomenats grànuls de sofre.
Orgànuls especials
Poden haver-hi de diferents tipus:
Tilacoides: Vesícules aplanades que
formen part de l’estructura de la
membrana interna del cloroplast, lloc on
es du a terme la fotosíntesi i per tant
consten de pigments fotosintètics (per
exemple, els cianobacteris).
Orgànuls diminuts (citoplasmàtics): Delimitats per membranes de proteïnes. Hi ha
diversos tipus:
Vacúols de gas: Orgànuls refringents formats per l’agrupació regular de
vesícules de gas que tenen forma de cilindre amb els extrems cònics. La seva paret
està constituïda per l’acoblament recular de dos tipus de proteïnes:
- GvpA: Majoritària (97%), estructura en
làmina β, és rígida i molt hidròfoba.
- GvpC: Minoritària, estructura en α-hèlix,
reforça la paret de les vesícules al
encreurar-se amb GvpA.
Clorosomes (o vesícules de clorobi): Vesícules no rodejades per unitat de
membrana , situades sota la membrana dels bacteris fotosintètics verds
16. Dibuix d’un cloroplast i tilacoides
17. Proteïnes GvA i GvC dels vacúols de gas
16
13 Invaginacions de la membrana plasmàtica de cèl·lules procariotes.
(Chlorobium). Estan rodejats per una coberta proteica i contenen els pigments
antena per la fotosíntesi dels bacteris verds del sofre i no del sofre
(anoxifotobacteris).
Carboxisomes: Cossos polièdrics amb una coberta proteica. Tenen cúmuls de
reserva de l’enzim ribulosa-bifosfat-carboxilasa (RuBisCo), enzim clau per dur a
terme el cicle de Calvin (És l’anomenada de manera incorrecta fase fosca de la
fotosíntesi). En tenen els bacteris fotoautòtrofs i quimiolitoautòtrofs.
Magnetosomes: Cristalls de magnetita (Fe3O4), en forma de cub o d’octaedre
que es disposen en files paral·leles a l’eix longitudinal de la cèl·lula. Permeten
l’orientació segons el camp magnètic terrestre. Els tenen bacteris aquàtics
flagel·lats aerobis o microaeròfils.
El DNA i el cromosoma bacterià
El DNA bacterià és la informació genètica del bacteri, està format per una sola molècula
llarga i circular amb una cadena doble hèlix amb superenrotllaments. El DNA se situa
unit als mesosomes13
i la seva funció és dirigir el funcionament del metabolisme
bacterià.
19. Imatge de clorosomes
(Microcystis) 20. Imatge de
carboxisomes
(Chlorogeopsis
fritschii)
21. Imatge de
magnetosomes
(Aquaspirillum
magnetotacticum)
18. Imatge de vacúols de gas
(Microcystis)
17
14 Molècula de DNA circular de doble cadena pròpia dels procariotes amb capacitat per replicar-se
La regió condensada de DNA s’anomena nucleoide.
El cromosoma bacterià està constituït per una doble
cadena circular (encara que hi ha excepcions) situada
al nucleoide. Està associat a RNA i proteïnes. A més
està altament enrotllat i unit a proteïnes de
membrana plasmàtica. Dins els bacteris apareixen
varies molècules de DNA de menor massa que un
cromosoma anomenades plasmidis14
(DNA circular
amb replicació autònoma). Aquests plasmidis poden tenir gens de resistència als
antibiòtics o gens que intervenen en els processos de reproducció.
1.4. Classificació dels bacteris
Els bacteris poden ser classificats en molts grups diferents segons les seves
característiques. Les classificacions principals són: segons la morfologia i la forma,
segons la nutrició i segons el metabolisme.
1.4.1. Segons la morfologia i l’agrupació
Existeixen quatre tipus de bacteri segons la seva morfologia, aquests són:
Els cocs, són organismes amb una forma esfèrica que tenen poca relació amb l’exterior i
viuen en medis rics en nutrients. Aquests tipus de bacteris són molt resistents ja que es
transmeten a través de l’aire i poden ser patògens. Exemples: Staphilococcus aureus (1)
,
Diplococcus pneumoniae (2)
i Streptococcus pyogenes (3)
.
Els bacils, són bacteris amb una forma allargada que viuen en medis amb un nivell baix
de nutrients. Exemples: Bacillus subtillis (4)
, Corynebacterium diphteriae (5)
i Ebertheria
typhi (6)
.
22. Cromosoma bacteria i plasmidis
Els espirils tenen forma d’hèlix i els
vibrions tenen forma de coma, viuen
en medis viscosos. La majoria tenen
un diàmetre petit, travessen fàcilment
les mucoses i són patògens en
contacte directe. Exemples: Vibrio
comme (7)
, Spirillum volutans (8)
i
Treponema pallidum(9)
.
En el cas dels cocs i els bacils es poden classificar segons l’agrupació.
Els cocs poden aparèixer:
- Aïllats.
- En parelles (diplococs).
- En cadenes (estreptococs).
- En un grapat (estafilococs).
- En formes cúbiques de 8
elements (Sarcines).
Els bacils poden parèixer:
- Aïllats.
- En parelles (diplobacils).
- En cadena (estreptobacils).
Alguns bacils s’assemblen tant als cocs que
s’anomenen coccobacils.
23. Cocs (1,2 i 3). Bacils (4, 5 i 6) i Vibrons (7, 8 i 9).
25. Agrupacions de bacils
24. Agrupacions de cocs
19
1.4.2. Segons la nutrició
Segons la seva nutrició podem classificar els bacteris en autòtrofs i heteròtrofs.
Bacteris autòtrofs: Són capaços de sintetitzar les substàncies orgàniques a partir de
les minerals. N’hi ha de dos tipus:
Fotosintetitzadors: Utilitzen l’energia de les radiacions lluminoses gràcies a certs
pigments que posseeixen, bacterioclorofil·la principalment. Un exemple és el
Rhodospirillum.
Quimiosintetitzadors: Obtenen l’energia necessària partir de reaccions químiques
d’oxidació com els bacteris nodridors del sòl i els sulfobacteris de les aigües
sulfuroses. Un exemple és el Nitrobacter que és un bacteri gramnegatiu que forma
una part molt important del cicle del nitrogen.
Bacteris heteròtrofs: es divideixen en dos tipus:
Bacteris patògens o paràsits: uns utilitzen els compostos orgànics elaborats per
altres éssers vius als que parasiten. Aquests són bacteris productors de malalties en
els humans i en els animals. Un exemple és el bacteri Neisseria meningitidis, que és
el bacteri causant de la malaltia anomenada meningitis bacteriana, afectant a les
meninges i el líquid cefaloraqui.
26. Rhodospirillum (fotosintetitzador) 27. Nitrobacter (quimiosintetitzador)
20
Bacteris de putrefacció o sapròfits: viuen en substàncies orgàniques,
descomponent-les aprofitant la matèria orgànica morta per l’alimentació. Un
exemple és el bacteri Paenibacillus polymyxa.
Bacteris zimògens: aquests bacteris provoquen fermentacions, acètica, butírica,
làctica, etc. Per exemple, el bacteri Stapylococcus aureus, que és l’encarregat de dur
a terme la fermentació làctica.
Bacteris simbiòtics: viuen en pla o ajuda mútua amb organismes vegetals o
animals, com els bacteris de les lleguminoses. Per exemple, el bacteri Rhizobium,
que s’associa amb un grup molt gran de plantes lleguminoses (llentia, soja, etc.).
28. Neisseira meningitidis (paràsit) 29. Paenibacillus polymyxa (sapròfit)
30. Staphylococcus aureur (zimògen) 31. Rhizobium (simbiòtic)
21
1.4.3. Segons la respiració
Fent referència a la seva respiració, es divideixen de la següent manera:
Bacteris aerobis estrictes: utilitzen l’oxigen per realitzar la respiració. Depenen de
l’O2 pel seu creixement. Un exemple és el bacteri Mycobacterium tuberculosis, que
és el causant de la major part dels casos de tuberculosi.
Bacteris anaerobis estrictes: es desenvolupen amb l’absència total d’O2, utilitzen
acceptadors finals diferents de l’oxigen: CO2, H2, N2, o posseeixen metabolisme
estrictament fermentatiu. Un exemple és el bacteri Porphyromonas gingivalis, es
troba freqüentment a la boca i es creu que pot estar relacionat amb algunes formes
d’artritis reumatoide.
Bacteris anaerobis facultatius: poden desenvolupar-se amb l’absència o presencia
d’O2, encara que predominen en ambients anaerobis. Un exemple és l’Escherichia
Coli, aquest el trobem a la flora intestinal de molts mamífers sans, als que ajuda amb
l’absorció dels nutrients a l’intestí. En l’ésser humà, E. Coli colonitza l’intestí en els
recent nascuts, després de la primera lactància. Però també pot produir infeccions, les
més freqüents són intoxicacions alimentaries.
Microaeròfils: només es poden desenvolupar en presència de baixes tensions d’O2
(menor del 12% en comptes del 20% que és l’atmosfèrica) i altes tensions de CO2.
Un exemple és el bacteri Borreila burgdorferi, és l’agent de la malaltia de Lyme.
Aquesta és una malaltia transmesa per paparres.
22
1.4.4. Segons l’òptima de temperatura
Els bacteris prefereixen les temperatures moderades, però alguns d’aquests són capaços
d’adaptar-se al fred i sobreviure dins dels refrigeradors, mentre que n’hi ha d’altres que
necessiten certa intensitat de calor per poder multiplicar-se. Però més usual és que la
calor els destrueixi , el fred els inhibeixi i la temperatura mitjana afavoreixi el seu
desenvolupament. Llavors, per evitar la proliferació dels bacteris la opció és cadena de
calor o cadena de fred.
La classificació dels bacteris segons l’òptima de temperatura, és la següent:
Termòfils: els bacteris viuen i es multipliquen entre 40ºC i 90ºC, i la seva
temperatura òptima és de 55 – 75ºC. Aquest tipus de bacteris és un dels problemes a
resoldre per la industria conservera, que utilitza les altes temperatures per el
32. Mycobacterium tuberculosis (aerobi
obligat)
33. Porphyromonas gingivalis (anaerobi
obligat)
34. Escherichia Coli (anaerobi facultatiu) 35. Borreila burgdorferi (microaeròfil)
23
processament dels aliments. Un exemple és el bacteri Pyrococcus furiosus que té una
òptima de temperatura superior als 100ºC.
Mesòfils: els bacteris creixen entre 5ºC i 47ºC, i la seva temperatura òptima és de 30
– 45ºC. Com que aquests bacteris causen malalties, són capaços de desenvolupar-se
en la temperatura corporal. Un exemple és el bacteri Salmonella ja que és un bacteri
que viu com a hoste dins l’home.
Psicròfils: els bacteris es desenvolupen entre 5ºC i 20ºC, i la seva temperatura òptima
és de 12 – 15ºC. Les baixes temperatures son les més favorables per a aquest tipus de
bacteri. Un exemple és el Flavobacter capsulatum.
Psicòtrofs: els bacteris creixen entre 5ºC i 35ºC, i la seva temperatura òptima és de
25 – 30ºC. Aquests bacteris son capaços de multiplicar-se a baixes temperatures,
però no és la seva temperatura ideal de desenvolupament. Un exemple és el bacteri
Polaromonas vacuolata que viu en les aigües de l’Antàrtida i la seva temperatura
òptima és de 4ºC.
1.4.5. Segons el pH en que es desenvolupen
Segons en el pH en que es desenvolupen, podem distingir tres tipus de bacteri:
Acidòfil: es desenvolupa a un pH d’entre 1.0 i 5.0
Neutròfils: es desenvolupen a un pH d’entre 5.5 i 8.5.
Psicròfils: es desenvolupen a un pH d’entre 9.0 i 10.0.
36. Pyrococcus furiosus
(termòfil) 37. Salmonella (mesòfil) 38. Flavobacter
capsulatum (psicròfil) 39. Polaromonas vacuolata
(psicròtof)
24
1.5. La fisiologia bacteriana
Tot i que els bacteris estan àmpliament distribuïts a la naturalesa, per conèixer els detalls
de la seva fisiologia cal estudiar-los al laboratori en cultius controlats i purs. Els medis de
cultiu bacterià són dissolucions aquoses que tenen sals minerals i nutrients orgànics
(monosacàrids, àcids grassos, aminoàcids, àcids orgànics i bases nitrogenades, entre
d’altres) que satisfan els requeriments d’elements químics que necessiten els bacteris per
desenvolupar el metabolisme, créixer i reproduir-se.
Els medis de cultiu dels bacteris es preparen en medi líquid en tubs d’assaig, als quals
s’afegeix la mostra del bacteri que es vol cultivar. També s’utilitzen medis de cultiu en
estat de gel (semisòlid), que s’obtenen quan s’afegeix al medi de cultiu líquid d’una
substància gelificant, com ara l’agar-agar, que s’obté d’algues marines. Els medis de
cultiu semisòlids es preparen en càpsules de Petri. Per transportar les mostres de bacteris
als medis de cultiu s’utilitzen els anomenats mànecs de sembra (nansa de kolle).
Els bacteris, com qualsevol ésser viu, desenvolupen les funcions de nutrició, de relació i
reproducció.
1.5.1. Funció de nutrició
Els bacteris poden dur a terme tots els tipus de metabolisme que hi ha. A més, una
mateixa espècie pot, fins i tot tenir dos tipus de metabolisme diferents, segons les
característiques del medi i l’abundància de nutrients. Els bacteris poden ser, com he
explicat en apartats anteriors, fotoautòtrofs, fotoheteròtrofs, quimioautòtrofs i
quimioheteròtrofs. Per a nodrir-se, els bacteris necessiten una sèrie de nutrients i aquests
són: H2O, ions, carboni, oxigen (depèn de quin tipus), CO2i factors de creixement
orgànics com les vitamines, purines/pirimidines, aminoàcids i hemoglobina.
25
1.5.2. Funció de relació
Moltes espècies de bacteris disposen de mobilitat. El desplaçament pot efectuar-se a
través de reptació sobre un substrat sòlid, per mitjà de moviments de contracció i
dilatació o bé per mitjà de flagels.
S’han comprovat respostes davant d’estímuls lluminosos (fotoactisme) en bacteris
fotosintètics, i també d’estímuls químics (quimioactisme). Una de les respostes més
conegudes respecte a variacions de medi de la formació d’espores, que són formes
de resistència. Els bacteris que viuen al sòl, enfrontant-se a les condicions adverses
del medi, entren en períodes de metabolisme reduït i protegeixen el seu DNA, al
voltant del qual formen una complexa coberta que dóna lloc a l’endòspora. Quan la
resta de la cèl·lula bacteriana es destrueix, les endòspores queden lliures al sòl i
s’anomenen exòspores, que poden sobreviure molt temps en condicions de sequera,
i també suportar l’acció d’agents químics com ara àcids i desinfectants o radiacions.
Quan les condicions ambientals tornen a ser adequades, les exòspores germinen i
donen lloc a bacteris amb totes les seves funcions.
26
40. Fases en la formació d’una endòspora d’un bacteri
27
1.5.3. Funció de reproducció
La reproducció dels bacteris és de tipus asexual i es duu a terme per mitjà de bipartició o
fissió binaria, a la qual precedeix una duplicació del DNA bacterià i una separació de les
dues molècules obtingudes. Els bacteris fills són genèticament idèntics, per la qual cosa
les colònies de bacteris estan formades per individus clònics, és a dir, són clons.
41. Reproducció per bipartició en els bacteris
28
15 Dotació de gens o al·lels que presenta una espècie o un individu concret.
16 Expressió del genotip modulada per la interacció amb el medi.
17 Material genètic contingut en els cromosomes d’un organisme en particular.
1.6. Genètica bacteriana
La informació genètica dels bacteris es troba continguda a la seqüència de nucleòtids del
DNA cromosòmic, com he explicat en apartats anteriors. Les modificacions que poden
aparèixer en els caràcters bacterians poden afectar al seu fenotip15
(adaptacions
condicionades per l’ambient) o al seu genotip16
(mutacions i fenòmens de transferència
genètica). Les variacions fenotípiques són modificacions degudes a canvis ambientals,
sense relació amb el genoma17
, i no són transmeses hereditàriament.
1.6.1. Mutacions
Les mutacions són canvis espontanis, irreversibles i hereditaris d’un caràcter del bacteri i
no dependents de la incorporació de material genètic d’un altre organisme. En una
colònia gairebé sempre es produeix alguna mutació: el bacteri amb les propietats
originals es denomina salvatge i la que varia respecte a ella, mutant.
Bioquímicament són alteracions a la seqüència de nucleòtids del DNA, el que porta a la
producció de proteïnes que tenen alterada la seva seqüència d’aminoàcids i poden influir
en la funció a la que es destinen.
Les mutacions es caracteritzen per:
Baixa freqüència: una colònia bacteriana conté una petita proporció de mutants.
Especificitat: cada mutació afecta normalment a un caràcter determinat. Si es
produeix en un sol nucleòtid s’anomena puntual.
Estabilitat: són hereditàries. Només es reverteixen per una altra mutació.
Espontaneïtat: la mutació es produeix de forma independent a les característiques
que codifica el gen mutat.
Les mutacions poden ser incrementades pels agents mutàgens, com són les radiacions
UVA o ionitzants, factors antineoplàstics, agents alquilants.
29
Quan una mutació coincideix amb un tractament antibiòtic, pot afectar al tractament, de
manera que hi hagi un bacteri resistent a l’antibiòtic i es multipliqui.
Les mutacions puntuals es produeixen per substitució, inserció, adició o pèrdua d’un
nucleòtid.
1.6.2. Fenòmens de transferència genètica
Un fenomen de transferència genètica, és el procediment pel qual un bacteri adquireix
gens que anteriorment no tenia, procedents d’un altre bacteri.
Els bacteris tenen mecanismes relacionats amb la reproducció anomenats parasexuals,
per mitjà dels quals intercanvien informació genètica amb altres bacteris, siguin o no de
la mateixa espècie. Hi ha cinc tipus de mecanismes d’intercanvi genètic: la
transformació, la transducció, la transfecció la conversió i la conjugació.
Transformació
La transformació és un procés pel qual un bacteri introdueix a dins seu fragments de
DNA que estaven lliures en el medi i procedien de la lisi d’altres bacteris. Aquests
mecanismes d’intercanvi genètic expliquen la variabilitat genètica que poden presentar
alguns bacteris en viure juntament amb d’altres d’espècie diferent. Un exemple d’aquest
procés és la resistència als antibiòtics que presenten alguns bacteris patògens quan
conviuen a l’intestí amb bacteris simbionts que resisteixen bé l’acció d’aquests
medicaments.
Transducció
La transducció és un fenòmen d’intercanvi genètic accidental a través d’un agent
transmissor, generalment un virus, el qual transporta fragments de DNA procedents de
l’últim bacteri parasitat. Això és degut al fet que per error dins del virus s’ha introduït un
fragment d’aquest bacteri.
30
Transducció generalitzada: un virus lític infecta un bacteri, es reprodueix i
introdueix la lisi del bacteri. Quan el virus s’acobla, pot adquirir fragments del
cromosoma del bacteri infectat, i transferir aquests quan infecti un altre bacteri. El
fragment de DNA s’incorpora al de la cèl·lula hoste. Pot donar-se la transducció
abortiva si el fragment transferit no s’integra en el cromosoma i no es replica
juntament amb ell, de manera que nomes passi a una de les seves cèl·lules filles.
Transducció restringida: provocada per un bacteriòfag temperat. Quan s’indueix el
bacteri lisogen i el pròfag es transfereix en el bacteriòfag temperat, pot arrossegar un
fragment del DNA bacterià veí i transmetre’l a un nou bacteri.
Transfecció
La transfecció és la inoculació d’un DNA obtingut d’un virus a un bacteri per a que se li
integri en el cromosoma bacterià. És un procediment artificial per a obtenir productes
genètics.
Conversió
La conversió és la integració d’un DNA bacteriòfag en el cromosoma bacterià, que
codifica una sèrie de caràcters nous per al bacteri.
Conjugació
La conjugació és el procés en què un bacteri, considerat donador, transmet DNA per
mitjà d’un pèl sexual a un altre bacteri anomenat receptor . Els bacteris donadors tenen, a
més del seu DNA, un tipus de plasmidis especials que reben el nom de plasmidis F i
factors F (de fertilitat), que contenen els gens que informen de la producció dels pèls
sexuals. Els bacteris amb plasmidis F s’anomenen F+ i els que ni en tenen, F
-. Com que
els plasmidis F s’autodupliquen, els bacteris F+ poden contenir desenes de plasmidis F.
Per aquest motiu, en un cultiu bacterià, al cap de poc temps, tots els bacteris passen a ser
F+ o donadors. En la transmissió del plasmidi només passa d’un bacteri a un altre una de
31
18 Examen del sèrum d’una persona per comprovar l’existència d’anticossos per a una malaltia.
les dues cadenes de plasmidi. De vegades un plasmidi F s’intercala (recombina) dins del
DNA bacterià. En aquest cas el plasmidi rep el nom d’episoma. Aquests bacteris,
anomenats Hfr (de l’anglès High frequency of recombination o alta freqüència de
recombinació), també són capaços de donar DNA als bacteris F-. En la conjugació, un
bacteri Hfr transmet part del seu plasmidi F i alguns dels gens adjacents del seu
cromosoma, que es recombinen amb el DNA del bacteri receptor i hi queden integrats.
La conjugació entre una cèl·lula F+ i una F
- converteix aquesta última en donadora o F
+,
mentre que si la donadora és Hfr, el bacteri receptor queda com a F-.
1.7. Creixement bacterià
El pas essencial per iniciar l'estudi d'una soca bacteriana, és el cultiu. Aquest pas és
important per proveir d'una població de bacteris que puguin ser analitzades mitjançant
proves bioquímiques, serològiques18
, genètiques i de susceptibilitat als antibiòtics.
El cultiu és el procés de propagació dels microorganismes en el laboratori, que s'obté
aportant les condicions ambientals adequades i els nutrients necessaris per al creixement
bacterià. Hem de recordar que alguns dels bacteris que causen infeccions en éssers
humans no són capaços de créixer en medis artificials inerts.
Cal conèixer quins són els requisits bàsics del bacteri en qüestió per el seu cultiu al
laboratori (nutrients, requeriments atmosfèrics i ambientals), així com els requisits del o
dels tipus bacterians que es necessiti recuperar.
La sembra d'un material que conté bacteris en un medi sòlid adequat amb la tècnica
d'aïllament permet, després d'un període adequat d'incubació, la recuperació de milions
de bacteris agrupades en colònies aïllades. Aquestes poden ser aïllades novament en un
nou mitjà per obtenir un cultiu pur. El creixement es defineix com l'augment del nombre
de bacteris en una població determinada (com es pot veure a la imatge 42). És important
diferenciar entre el creixement d'una cèl·lula individual i el d'una població. Aquest
creixement cel·lular, és el resultat de l'augment de la mida de la cèl·lula, seguit de la seva
divisió. El creixement d'una població, en canvi, és el resultat de l'augment del nombre
total de cèl·lules, que pot ser quantificat directament (comptant el nombre de cèl·lules) o
indirectament (per exemple, mesurant la massa cel·lular).
32
19 Substància mucilaginosa extreta de membranes d’algues roges utilitzada en microbiologia.
El recompte de cèl·lules totals pot determinar per recompte microscòpic en una càmera
amb àrees de volum conegut, comptant les cèl·lules per unitats. Aquest recompte,
considera la totalitat de les cèl·lules presents a la mostra (viables i no viables). Per
realitzar un recompte de les cèl·lules viables, cal fer un cultiu en medi sòlid per explicar
el nombre d'unitats formadores de colònies (UFC) presents en un volum conegut de la
mostra.
Aquesta tècnica es pot realitzar per sembra en la superfície d'un mitjà apropiat o per
sembra incorporada en agar19
. El creixement de les poblacions bacterianes en un sistema
de cultiu tancat (sense entrada ni sortida dels components del sistema), està limitat per
l'esgotament dels nutrients o bé per l'acumulació de productes tòxics del metabolisme.
Quan els bacteris es sembren al laboratori en un mitjà líquid (per exemple en un tub
d'assaig), es tracta d'un sistema tancat de cultiu. Si es prenen mostres a intervals regulars
en diferents temps d'incubació i es realitza un recompte del nombre de cèl·lules viables
per mil·lilitre de cultiu, la representació gràfica de les dades (recompte de cèl·lules
viables en funció del temps) donarà la corba de creixement característica que consta de
quatre fases: latència, exponencial, estacionària i mort.
42. Corba de creixement bacterià
33
20 Tot allò propi, característic i peculiar que defineix la naturalesa d’una persona, animal, lloc o cosa.
1.7.1. Fases de creixement bacterià
Fase de latència
Els bacteris transferits d'un cultiu en fase estacionària a un mitjà fresc, pateixen un canvi
en la seva composició química abans de ser capaços d'iniciar la multiplicació. Hi ha
augment dels components macromoleculars i de l'activitat metabòlica, gairebé sense
divisió cel·lular, associat a un increment de la susceptibilitat als agents físics i químics.
Per tant, la mal anomenada fase de latència implica intensa activitat metabòlica.
Fase exponencial
Les cèl·lules es divideixen a velocitat constant, determinada per la naturalesa intrínseca20
del bacteri i per les condicions del medi. Existeix gran augment del nombre total de
cèl·lules viables, que pot ser expressat en forma exponencial. Pròxim al final d'aquesta
fase, es produeix l'alliberament de exotoxines pels bacteris que les produeixen.
Fase estacionada
Eventualment l'esgotament dels nutrients o l'acumulació de productes tòxics determina el
cessament del creixement. Hi ha pèrdua de cèl·lules per mort, la qual és equilibrada per la
formació de noves cèl·lules. Quan això passa, el recompte total de cèl·lules augmenta
lleument encara que el dels bacteris viables segueixen sent constants. Cap al final
d'aquesta etapa, pot ocórrer l'esporulació en aquells bacteris que posseeixen aquest
mecanisme de resistència.
Fase de mort
Després de la fase estacionària, la taxa de mort s'incrementa, el nombre de bacteris
viables disminueix ràpidament i, per tant la corba de creixement declina.
Les característiques de la corba de creixement poden variar en funció de les
característiques pròpies del microorganisme, de l'estat metabòlic del inòcul, del medi de
34
21 Polipèptid format durant la degradació enzimàtica de les proteïnes.
cultiu i de les condicions d'incubació. Les condicions físiques i químiques del medi on el
microorganisme creix afecten les activitats d'aquests. La comprensió de com influeix
l’ambient en el creixement, ens ajuda a explicar la distribució dels microorganismes en la
natura i fa possible dissenyar mètodes que permetin estudiar i controlar el creixement
bacterià. A més, hi ha sistemes de cultiu oberts que són poc usats en el laboratori de
microbiologia clínica. El cultiu continu (amb aportació i sortida de nutrients i
requeriments a una taxa constant), permet mantenir als bacteris en una mateixa fase de
creixement durant un llarg període de temps (per exemple en la fase estacionària o en
l'exponencial). Aquesta tècnica és interessant per exemple per als processos productius.
1.8. Medis de cultiu
Un dels sistemes és importants per a la identificació de microorganismes és observar el
seu creixement en substàncies alimentaries artificials preparades al laboratori. El material
alimentari en que creixen els microorganismes és el medi de cultiu i el creixement dels
microorganismes és el cultiu. S’han preparat més de 10.000 medis de cultiu diferents.
Els medis de cultiu poden classificar-se tenint en compte diferents criteris però els més
importants són aquells que es basen en: la seva consistència, la seva utilització, la seva
composició i el seu origen.
Segons el seu estat físic (consistència)
Segons el seu estat físic els podem classificar en medis líquids, sòlids i semisòlids.
Medis líquids: són els que es presenten en aquest estat, denominant-se per aquesta
raó caldos. El medi líquid més utilitzat és l’anomenat caldo nutritiu, compost
principalment d’extracte de carn, peptona21
i aigua. S’utilitza fonamentalment quan
es pretén l’obtenció d’una suspensió bacteriana d’una determinada concentració.
Medis sòlids: es preparen a partir dels medis líquids, agregant un agent gelificant. Els
més utilitzats són la gelatina i l’agar:
35
22 Metabòlit clau en el metabolisme que pot ser sintetitzar a partir de glucosa durant la glicòlisi.
23 Transport de molècules sota l’acció d’un camp elèctric.
La gelatina és una proteïna animal obtinguda dels ossos. Aquesta, té
l’inconvenient de que és hidrolitzada per molts bacteris, i a més, el seu ús està
molt limitat perquè el seu punt de fusió és baix (liqua a temperatura ambient) raó
per la que no pot utilitzar-se en cultius a 37ºC, que és la temperatura òptima de
creixement per a molts microorganismes.
L’agar-agar és un polímer de sucres obtingut d’algues marines. Es tracta d’una
molècula insoluble en l’aigua però soluble en aigua calenta; una solució al 1,5%
p/v forma un gel ferm entre 32 i 39ºC i no es fon per sota els 85ºC. Es fon a 90ºC
i es solidifica un cop fos al voltant dels 45ºC. Té un inconvenient, introdueix
compostos orgànics indefinits que poden falsejar els resultats de les necessitats
nutritives d’un organisme. Encara que l’agar és una mescla de polisacàrids,
Araki el 1937 els va dividir en dos grups:
- Agarosa: amb poc sulfat, lliure d’àcid pirúvic22
.
- Agaropectina: amb molt sulfat i gran quantitat de cendres.
La proporció d’agarosa i d’agaropectina a l’agar varia segons l’alga d’origen.
L’agar pot utilitzar-se per a diferents fins, encara que els més importants són:
agar comercial per a la indústria alimentaria, agar bacteriològic, agars purificats i
agarosa, utilitzada per electroforesi23
en gel. Aproximadament la meitat de tot
l’agar que es produeix, s’utilitza en el sector microbiològic.
Medis semisòlids: Es preparen a partir dels medis líquids, agregant a aquests un agent
solidificant en una proporció menor que per preparar medis sòlids. Un dels seus usos
és la investigació de la mobilitat dels bacteris.
36
24 Medi de cultiu multi ús produït per la digestió enzimàtica de soja i caseïna.
25 Medi de cultiu nutritiu suplementat amb sang.
26 Aminoàcid format per l’oxidació de dos residus químics de la cisteïna units.
Segons la seva utilització
Segons la seva utilització els podem classificar en medis comuns, d’enriquiment,
selectius, inhibidors, diferencials, d’identificació, de multiplicació, de conservació i de
transport.
Medis comuns: són aquells que contenen els components mínims per a que pugui
produir-se el creixement de bacteris que no necessiten requeriments especials. El
mitjà més conegut d’aquest grup és l’agar nutritiu o agar comú, que resulta de
l’adició d’agar caldo nutritiu. Altres representants d’aquest grup són l’agar
tripticase de soja24
, l’agar Columbia25
, etc.
Medis d’enriquiment: són aquells que, a més de les substàncies nutritives normals,
incorporen una sèrie de factors indispensables per al creixement de
microorganismes existents. Aquest enriquiment es fa per adició de sang o altres
productes biològics (sang, sèrum, llet, ou, bilis, etc.) que aporten aquests factors. En
ocasions és possible afegir suplements artificials als medis per produir un
enriquiment d’aquest mateix (per exemple Polivitex, Isovitalex,etc). El gonococ,
per exemple, necessita cistina26
i cisteïna per al seu creixement. Aquestes
substàncies són aportades per la sang escalfada adicionada al medi de cultiu (agar
xocolata).
Medis selectius: són medis utilitzats per afavorir el creixement de certs bacteris
continguts en una població polimicrobiana. El fonament d’aquests medis consisteix
en facilitar de manera nutricional el creixement d’una població microbiana
específica. Un exemple de medi selectiu és el caldo selenit, que s’utilitza per
afavorir el creixement de Salmonella i frenar la resta d’enterobacteris.
Medis inhibidors: quan les substàncies afegides al medi selectiu impedeixen
totalment el creixement d’una població microbiana, es denomina inhibidor. Els
medis inhibidors podrien considerar-se com una variant més restrictiva dels medis
selectius. Aquests medis s’aconsegueixen habitualment per adició de substàncies
antimicrobianes o de qualsevol altra que inhibeixi completament el
43. Agar tripticase
de soja 44. Agar Columbia
37
27 Medi que permet el diagnòstic ràpid orientatiu del tipus de bacteri aïllat.
28 Medi que determina si el bacteri es desenvolupa o no en un medi amb citrat com a única font de C.
29 Substància que pot transformar-se en un colorant per introducció d’un grup cromofòric.
desenvolupament d’una població determinada. Un medi inhibidor és el MacConkey
que permet el creixement dels gèrmens gramnegatius i impedeix el creixement dels
grampositius.
Medis diferencials: s’utilitzen per posar en evidència característiques bioquímiques
que ajudin a diferenciar gèneres o espècies. La adició d’un sucre fermentable o un
substrat metabolitzable s’utilitza per a aquest fi. El medi MacConkey, és un medi
diferencial perquè permet distingir els gèrmens que fermenten la lactosa d’aquells
que no ho fan. També ho són el el C.L.E.D (lactosa+lactosa-), l’agar sang (tipus
d’hemòlisi), el SS (que és doblement diferencial), etc.
Medis d’identificació: són els destinats a comprovar alguna qualitat especifica que
pot servir-nos per reconèixer la identitat d’un microorganisme. Aquests medis han
de constar dels elements necessaris per a assegurar el creixement dels
microorganismes, el substrat específic que vagi a ser metabolitzat i l’indicador que
ens mostri el resultat. L’agar Kligler27
, el medi de Simmons28
i en general,
qualsevol medi al que se li hagi afegit un element diferencial d’un microorganisme,
són medis utilitzats en identificació. Actualment estan apareixent al mercat una
gran quantitat de medis específics d’identificació per certs microorganismes, amb
els quals s’aconsegueix simultàniament abaratir el cost i reduir el temps
d’identificació. Són exemples d’aquest últim els medis CPS o Urline ID
(Biomerieux), utilizats per a identificar els gèrmens urinaris més importants a partir
de la placa de cultiu gràcies a la utilització de substrats cromogènics29
específics.
45. Agar Kligler
46. Medi Simmons
38
30 Medi líquid adequat per al creixement i cultiu de bacteris aerobis i anaerobis.
31 Fer desaparèixer l’aigua deixant la substància al buit.
32 Medis dissenyats per a albergar una amplia varietat de bacteris.
33 Medi recomanat per a la recol·lecció, transport i conservació de mostres aptes per la microbiologia.
Medis de multiplicació: serveixen per obtenir una gran quantitat de cèl·lules a partir
d’un microorganisme ja aïllat. S’utilitzen en l’obtenció de vacunes, en la
investigació i en la indústria. Els medis més adequats per a la multiplicació
acostumen a ser líquids. El caldo-infusió cervell-cor30
(BHI), és un exemple típic
d’aquests medis.
Medis de conservació: s’utilitzen per conservar una soca que, per diverses raons ens
interessa mantenir. Fonamentalment s’utilitzen com controls de qualitat de les
proves i reactius utilitzats en el laboratori de Microbiologia. En el laboratori es
poden conservar soques de tres maneres:
- Fent passades periòdiques de placa en placa.
- Mitjançant liofilització31
d’una suspensió bacteriana.
- Congelant les soques en llet desnatada estèril al 0,1%.
Medis de transport: s’utilitzen per al transport de mostres clíniques que no poden
sembrar-se immediatament. La seva utilització ha de fer-se introduint el tampó amb
el que es va obtenir la mostra en l’interior del medi (generalment en un tub). Són
exemples típics d’aquest grup els medis de Stuart-Amies32
, Cary-Blair33
, etc.
47. Caldo-infusió cervell-cor (BHI)
39
34 Bacteri gramnegatiu que produeix la malaltia clamídia (ETS).
35 Bacteri gramnegatiu que porta la paparra-rickèttsia.
Segons la seva composició
Segons les substàncies que entren a formar part en la seva composició, els medis de cultiu
poden classificar-se en medis complexos, sintètics i semisintètics.
Medis complexos: van ser els primers utilitzats i els més empleats , es preparen a
partit de teixits d’animals i més rarament de vegetals. La seva composició no és
exactament definida i per consegüent no és rigorosament constant. Això pot tenir
certs inconvenients en condicions experimentals, on la reproductibilitat no podrà
ser exacta. En la pràctica corrent aquests medis donen excel·lents resultats i són
més utilitzats.
Medis sintètics: són aquells que contenen a la seva composició exclusivament
substàncies químiques conegudes i dissoltes en aigua destil·lada en proporcions
determinades, resultant un medi de composició perfectament definit.
Medis semisintètics: el gran nombre de factors de creixement exigits per a certs
gèrmens fa que la fabricació d’un medi sintètic per aquests gèrmens sigui
impossible o massa cara. En aquest cas s’aporten els factors de creixement sota la
forma d’un extracte orgànic complex (extracte de llevat, extracte de teixits, etc.).
Certs gèrmens no creixen en cap medi per molt enriquit que estigui aquest, fent-ho
exclusivament en cèl·lules vives amb unes característiques determinades. Exemples
d’aquest tipus són, a part dels virus, l bacteri Clamídia34
, i el Rickèttsia35
, etc.
48. Clamídia 49. Rickèttsia
40
Segons el seu origen
Segons l’origen del medi de cultiu, els podem classificar en medis naturals, sintètics i
semisintètics.
Medis naturals: són preparats a partir de substàncies naturals d’origen animal o
vegetal com per exemple extractes de teixit o infusions, la composició química de
la qual no es coneix exactament.
Medis sintètics: són els medis que contenen una composició química definida
qualitativa i quantitativament. S’utilitza per a obtenir resultats reproduïbles.
Medis semisintètics: són els sintètics als quals se’ls hi afegeixen factors de
creixement sota una forma d’un extracte orgànic complex, com per exemple
l’extracte de llevat.
1.9. Tinció de Gram
La tinció de Gram, també coneguda com a coloració de Gram, és una tècnica de
laboratori que s'utilitza rutinàriament en els estudis microbiològics dels bacteris. Va ser
dissenyada per Christian Gram, un científic danès, l'any 1884. L'objectiu de Gram era
aconseguir una prova amb la que va ser possible diferenciar diferents grups de bacteris
per així poder estudiar-los i classificar-los. La prova va resultar tot un èxit i aviat es va
convertir en una tècnica molt útil no només per a l'estudi dels bacteris, sinó també per
poder identificar-los ràpidament en una infecció i seleccionar l'antibiòtic més adequat per
a tractar-la.
La tècnica es basa en aplicar una sèrie de colorants a una mostra de qualsevol origen
(esput, orina, pus, etc.) que suposadament contingui bacteris no identificats. Els colorants
tenyeixen la paret dels bacteris de color morat i, després d'uns minuts, es realitza un
rentat del colorant. Després d'això pot ser que el colorant romangui a la paret bacteriana o
que se n'hagi anat. En el primer cas romandria el color morat, i es tractaria de bacteris
Gram positius i, en el segon, la paret tindria un color rosat, i serien Gram negatius.
41
36 Prova microbiològica per determinar la sensibilitat d’un bacteri enfront d’un o més antibiòtics.
Aquests dos grups de bacteris són els pilars en què es basa la classificació de l'amplia
majoria dels bacteris. Cada un dels grups respon de forma diferent a cada tipus
d'antibiòtics, per això és una tècnica útil per seleccionar el fàrmac antimicrobià inicial
davant d'una infecció. Cal tenir en compte que en certes situacions (com la sèpsia) és
molt important iniciar un tractament antibiòtic adequat de forma precoç, per això la tinció
de Gram es demana d'urgència en moltes ocasions. La tinció de Gram també té certes
limitacions. Alguns bacteris no tenen paret, com ara les Clamídies, i no es podran
identificar, igual que els virus. En aquests casos la tinció no acolorirà cap germen. Un
altre aspecte negatiu de la prova és que no pot identificar el tipus exacte de bacteri
responsable de la infecció. Per a això és necessari realitzar un cultiu microbiològic que
s'acompanya sempre d'un antibiograma36
per estudiar de forma exacta l'antibiòtic més
efectiu.
Procediment
1. S'estén la mostra recollida (que sol ser líquida o viscosa) en un porta de vidre, i es
deixa assecar a l'aire.
2. S'aplica metanol al portaobjectes; així, els bacteris queden enganxats a la superfície.
3. S'afegeix violeta de genciana, un colorant que tenyeix tots els bacteris de color porpra.
S'ha de deixar durant un minut perquè faci efecte.
4. Es renta la mostra acolorida amb aigua i s'afegeix alcohol-acetona per destenyir els
bacteris que s'han de tenyir amb el violeta de genciana. És la part més important de la
prova, ja que si es deixa massa temps es destenyirien tots els bacteris. Després es
renta de nou amb aigua per eliminar l'alcohol.
5. S'afegeix fucsina, un altre colorant que tenyeix de rosa els bacteris que no s'han tenyit
de color porpra. Així es poden observar al microscopi, encara que seran
gramnegatius.
6. El microbiòleg estudia la mostra amb un microscopi i identifica bacteris tenyits.
42
Les complicacions de la tinció de Gram són inexistents. És una prova segura que no
comporta riscos per a les persones que se sotmeten a ella. L'únic risc és acceptar resultats
falsos com a positius o negatius, i prendre mesures equivocades sobre això, com succeeix
quan en la tinció no s'observen bacteris perquè s'ha pres un antibiòtic prèviament. La
presa de la mostra no sol comportar riscos, excepte els propis de la punció lumbar en el
cas de les meningitis.
50. Procediment de la tinció de Gram 52. Bacteri Gramnegatiu
51. Bacteri Grampositiu
43
37
Enzim que danya les cèl·lules bacterianes. 38
Enzim produït per alguns bacteris responsable de la seva resistència als antibiòtics.
2. ANTIBIÒTICS
2.1. Història
El primer antibiòtic descobert va ser la Penicilina. Alexander Fleming estava cultivant un
eubacteri (Staphyilococcus aureus) en una placa d’Agar, la qual va ser contaminada
accidentalment per fongs. Després ell va advertir que el medi de cultiu de la floridura
estava lliure de eubacteris. Ell havia treballat prèviament amb les antieubacterianes de
lisozim37
, i per això va poder fer una interpretació correcta del que va veure: que el fong
estava segregant alguna cosa que inhibia el creixement de l’eubacteri. Encara que no va
poder purificar el material obtingut (l’anell principal de la molècula no era estable enfront
els mètodes de purificació que va utilitzar), va informar del descobriment en la literatura
científica. Pel fet que el fong era del gènere Penicillium, va denominar el producte
Penicil·lina.
A causa de la necessitat imperiosa de tractar les infeccions provocades per ferides durant
la II Guerra Mundial, es van invertit molts recursos a investigar i purificar la penicil·lina i
un equip liderat per Howard Florey va tenir èxit a produir grans quantitats del principi
actiu pur. Els antibiòtics aviat es van fer d’ús generalitzat.
El descobriment dels antibiòtics així com de l’anestèsia i l’adopció de pràctiques
higièniques pel personal sanitari (per exemple, el rentat de mans i ús d’instruments
estèrils) va revolucionar la sanitat i s’ha arribat a dir que és el gran avenç en matèria de
salut des de l’adopció de desinfecció. Se’ls denomina sovint als antibiòtics “bales
màgiques”, per der blanc en els microorganismes sense perjudicar l’hoste.
Paral·lelament al descobriment de nous antibiòtics, han anat apareixent resistències per
part dels microbis patògens, com per exemple les beta-lactamases38
, fet que obliga a la
recerca constant de noves formes antibiòtiques. Aviat es va començar a fer síntesi
química d’antibiòtics, fent modificacions a les estructures naturals conegudes.
Actualment, davant la gran quantitat de resistències, es tendeix a buscar noves espècies
eubacterianes que tinguin noves formes d’antibiòtics no coneguts.
44
41
Estructures que tenen funcions semblants. 42 Agent antimicrobià que actua interferint competitivament la síntesi d’àcid fòlic pels bacteris.
2.2. Què són els antibiòtics
Un antibiòtic és una substància química capaç, a baixes concentracions, d'inhibir el
creixement d'altres microorganismes o d'eliminar-los. Generalment, els antibiòtics actuen
sobre eubacteris, o fins i tot sobre cèl·lules d'individus pluricel·lulars, animals o vegetals,
provocant alteracions o de la paret cel·lular, o de la membrana protoplasmàtica, o de la
síntesi proteica, o del metabolisme dels àcids nucleics, etc.
Els antibiòtics resulten més o menys tòxics per a les cèl·lules humanes o d'organismes
superiors. Aquesta toxicitat oscil·la entre valors elevadíssims (actinomicina) i valors
ínfims (penicil·lina). Els antibiòtics de toxicitat baixa, i fins als de toxicitat mitjana,
poden ser emprats en la terapèutica de moltes malalties causades per microorganismes
(eubacteris especialment). En cada cas, però, cal tenir present el marge de toxicitat, i
veure fins a quin punt els avantatges aconseguits amb el tractament a base d'antibiòtics
compensen o superen les alteracions
produïdes per aquests.
Normalment, i dins uns límits raonables, el
balanç és positiu a favor dels antibiòtics.
Es parla d'antibiòtics amb
acció bacteriostàtica si es limiten a inhibir
el creixement dels eubacteris, o bactericida, si arriben a destruir-los. En realitat, però, que
l'acció sigui eubacteriostàtica o eubactericida depèn sovint més de la dosi que no pas de
l'antibiòtic emprat. Segons l'eficàcia d'un antibiòtic enfront de diversos microorganismes,
se li pot atribuir un espectre d'acció més o menys ampli.
Els antibiòtics, evidentment, han revolucionat la terapèutica d'un gran nombre de
malalties. Es pot dir que totes les malalties d'etiologia eubacteriana resten incloses dins
les possibilitats terapèutiques d'un antibiòtic o altre, i només algunes d'origen víric o
fúngic en són del tot indiferents.
La medicina i la veterinària consumeixen la major part dels antibiòtics que actualment
són produïts. Els primers antibiòtics utilitzats eren produïts per microorganismes com a
resultant d'una biosíntesi específica. A hores d'ara la majoria dels antibiòtics són producte
de síntesi i, constantment, se n'obtenen de nous amb la finalitat d'assolir un efecte
53. Imatge d’un antibiòtic
45
41
Estructures que tenen funcions semblants. 42 Agent antimicrobià que actua interferint competitivament la síntesi d’àcid fòlic pels bacteris.
antiinfecciós més eficaç i per tal d'eliminar al màxim els efectes secundaris i tòxics.
Actualment és habitual la síntesi d'anàlegs41
de productes bioquímics com
els aminoàcids que els microorganismes confonguin a l'hora de sintetitzar de manera que
només generin proteïnes inviables que els porti cap a la mort. La importància creixent de
la lluita contra la infecció fa que actualment s'agrupin sota el nom d'agents
antiinfecciosos els antibiòtics, naturals o de síntesi, i els quimioteràpics o altres
substàncies d'utilitat contra qualsevol germen infecciós (eubacteri, virus, fong o paràsit).
Amb això, ha sorgit el concepte d'antibioteràpia o, més pròpiament, terapèutica
antiinfecciosa, que aplega les característiques i els problemes que comporta el tractament
dels estats infecciosos.
2.3. Classificació
Per classificar els bacteris tenim en compte diferents factors, aquests són: el seu origen, el
seu espectre d’acció, la seva forma d’actuació i finalment pel mecanisme d’acció.
2.3.1. Segons el seu origen
Segons l’origen d’un antibiòtic el podem dividir en tres tipus diferents
Antibiòtics biològics: són els que estan produïts per microorganismes, com per
exemple la penicil·lina.
Antibiòtics sintènics: són els que estan produïts per síntesis químiques com per
exemple sulfamides42
.
Antibiòtics semisintètics: sobre una base orgànica es millora sintèticament.
46
43 Antibiòtic bacteriostàtic d’ampli espectre obtingut del bacteri Streptomyces venezuelae. 44 Bacteri d’ampli espectre. Actua inhibint la síntesi de les proteïnes. 45 Antibiòtic pertanyent a la classe dels productes naturals poliquètids. 46 Antibiòtic produït de manera natural pel bacteri Paenibacilluspolymyxa.
2.3.2. Segons el seu espectre d’acció
Segons el seu espectre d’acció, podem classificar els antibiòtics en tres grups.
Antibiòtics d’ampli espectre: actuen sobre nombroses espècies bacterianes, com el
cloramfenicol43
i el tetraciclines44
.
Antibiòtics d’espectre menys ampli: actuen sobre un nombre limitat d’espècies, com
penicil·lines o macròlids45
.
Antibiòtics d’espectre curt: comportament eficaç en poques espècies, com les
polimixines46
.
2.3.3. Segons la seva forma d’actuació
Podem classificar els antibiòtics en dos grups segons la seva forma d’actuació.
Bacteriostàtics: bloquegen el desenvolupament i multiplicació dels bacteris, però no
els lisen, per això el seu efecte és reversible.
Bactericides: provoquen la mort bacteriana i per tant, són irreversibles.
2.3.4. Segons el seu mecanisme d’acció
Segons el mecanisme d’acció d’un antibiòtic el podem classificar en quatre grups: els
antibiòtics que inhibeixen la síntesi de la paret cel·lular, els antibiòtics que alteren la
membrana citoplasmàtica, els antibiòtics que inhibeixen la síntesi proteica i finalment els
antibiòtics que bloquegen la síntesi dels àcids nucleics.
47
47 Solució que té menor concentració de solut. 48 Procés essencial per treure un grup fosfat d’un compost orgànic.
Antibiòtics que inhibeixen la síntesi de la paret cel·lular
La paret cel·lular és l’element protector de la integritat del bacteri, ja que sense aquesta,
el bacteri esclataria per la seva elevada pressió osmòtica. Els antibiòtics que inhibeixen la
síntesi de la paret cel·lular necessiten que el bacteri es trobi en creixement actiu.
Generalment són bactericides i requereixen que el medi sigui hipotònic47
. Acostumen a
ser més actius davant Gram+ i són poc tòxics.
β Lactàmics: inhibeixen la síntesi de la paret cel·lular a la seva ultima fase,
interferint-se la transpeptidació. S’uneixen a les proteïnes fixadores de penicil·lines
de la membrana cel·lular i la unió dóna lloc a la inhibició de la síntesi proteica i a la
pèrdua d’un inhibidor de l’enzim responsable de la lisi cel·lular. Els bacteris que
posseeixen autolisines són lisades per els β-lactàmics, mentre que els que no la tenen
produeixen formes allargades en presencia d’aquests fàrmacs.
Bacitracina: inhibeix les hidròlisis o desfosforilació48
de lípid pirofosfat i no es pot
utilitzar en el transport de N-acetilmuràmic-pentapèptid a través de la membrana
plasmàtica.
Vancomicina: impedeix la transferència del sòlid metil-pentapèptid unit al lípid
portador al acceptor en la paret cel·lular
Fosfomicina: interfereix la condensació de l’Uridil-Difosfat-N-acetil-muràmic.
Cicloserina: inhibeix la L-alanina racemosa, per tant impedeix la formació del
dipèptid d’alanina, component del pentapèptid.
48
Antibiòtics que alteren la membrana citoplasmàtica
La membrana citoplasmàtica actua com a barrera de permeabilitat selectiva, i les
substàncies que actuen sobre ella produeixen canvis en la permeabilitat, permetent la
sortida de K+ i macromolècules i causant un efecte lític.
Polimixines: es comporten com a detergents catiònics, desorganitzant la membrana i
augmentant la seva permeabilitat, el que causa la mort bacteriana. Els bacteris més
susceptibles són les Gram-, per la seva major quantitat de lípids a la seva membrana.
Poliens (nistatina, anfotericina B): s’utilitzen en infeccions per fongs. Alteren la
estructura de la membrana i formen porus hidrofílics, modificant-se la permeabilitat
normal de l’estructura.
Antibiòtics que inhibeixen la síntesi proteica
La seva finalitat consisteix en formar proteïnes anòmales o no funcionals per al correcte
desenvolupament del bacteri o impedir la seva síntesi.
Aminoglicòsids (estreptomicina, amikacina): actuen unint-se de forma irreversible a
un receptor proteic de la fracció 30S del ribosoma, el que causa un bloqueig de la
síntesi proteica i interfereix a la unió del ARNt al codó de locus A, el que provoca
proteïnes anòmales.
Tetraciclines: s’uneixen a la fracció 30S i bloquegen la fixació de l’amonoacil-ARNt
en el lloc A.
Cloramfenicol i lincosamides: s’uneixen a la fracció 50S inhibint la transpeptidació.
Macròlids (eritromicina): actuen sobre els ribosomes 50S impedint la translocació.
De la mateixa manera actuen la espectinomicina i l’àcid fusídic.
49
Antibiòtics que bloquegen la síntesi dels àcids nucleics
Sulfamides, PAS i sulfonas: són anàlegs de l’àcid paraminobenzoic i competeixen
amb ell per formar àcid fòlicm amb el que es formen anàlegs no funcionals d’aquest.
Tenen efecte bacteriostàtic.
Diaminopirimidines, trimetoprim i pirimetamines: inhibeixen la formació d’àcid
folínic. També són bacteriostàtics.
Cotrimoxazol: bactericida, bloqueja dos passos d’aquesta cadena.
Rifampicina: afecta la transcripció inhibint la RNA-polimerasa.
2.4. Resistència als antibiòtics
Una soca bacteriana és resistent als antibiòtics quan necessita per a inhibir-se
concentracions de fàrmacs superiors a la concentració que l’antibiòtic pot arribar en el
lloc de la infecció.
Tipus de resistència
Natural: apareix en els bacteris d’una manera preestablerta, com la resistència dels
endobacteris a la penicil·lina G.
Adquirida: és deguda a modificacions de la càrrega genètica. Pot ser cromosòmica
o extracromosòmica.
50
- Cromosòmica: deguda a una mutació dels gens que controlen la sensibilitat als
antibiòtics. És estranya, espontània, persistent i transmissible per herència.
S’acostuma a presentaren aquells teixits amb poques defenses: vies urinàries,
superfícies seroses, teixit pulmonar.
- Extracromosòmica: plasmídica o infecciosa. Codificada per plasmidis que es
repliquen de forma autònoma i passen s’un bacteri a un altre per transducció o
conjugació.
Mecanismes de resistència
Per modificació enzimàtica: per hidròlisi o detoxicació. Les β-lactamases són
enzims hidrolítics que destrueixen l’anell β-lactàmic inactivant aquests antibiòtics.
També hi ha enzims que no activen que intervenen en la resistència a
aminoglicosídics i cloramfenicol, per la seva toxicitat.
Per alteracions en la permeabilitat: davant tetraclines, fosfomicina,
aminoglicosídics i β-lactàmics.
Per canvis en els llocs on actuen els antibiòtics: per exemple, modificant
l’estructura dels ribosomes.
Per modificacions dels sistemes enzimàtics del bacteri.
51
3. EXPERIMENTACIÓ
3.1. PRÀCTICA 1: COMPROVACIÓ DE LA MUTACIÓ DELS
BACTERIS.
Objectius:
Objectiu principal:
‐ Explicar l’emergència de bacteris resistents als antibiòtics utilitzant el model
d’evolució per selecció natural
Objectius secundaris:
Justificar la idoneïtat de treballar amb microorganismes per estudiar la
mutagènesi.
Prendre contacte amb tècniques de cultiu bacterià.
Proposar hipòtesis i considerar el treball experimental com una manera
d’obtenir evidències per contrastar aquestes.
Descriure i interpretar resultats experimentals.
Breu revisió teòrica
Conceptes generals sobre la mutagènesi
El fenomen de la mutagènesi implica algun canvi que afecta a una o a moltes bases del
DNA. ES coneix sota el nom de mutació puntual quan la mutagènesi només afecta a una
o a poques bases del DNA. Aquest és el principal fenomen mutacional que té lloc en
bacteris, mentre que en d’altres éssers vius, a més de mutacions puntals, les que
impliquen moltes bases, com inversions, delecions o translocacions són importants.
52
La mutagènesi espontània es pot produir com a conseqüència d’errades en la replicació
del DNA en la incorporació de bases nitrogenades que no s’aparellen correctament amb
la base de la cadena motlle. Aquesta mutagènesi també pot ser deguda a danys en el
DNA produïts per molècules generades pel propi metabolisme (agents endògens)
de la cèl∙lula (per exemple, peròxid d’hidrogen o el superanió d’oxigen). La freqüència
de mutació espontània es en general baixa. Per exemple, en un gen bacterià està al
voltant de 10‐8
a 10‐10. De tota manera hi ha gens que contenen regions (per exemple,
una zona amb moltes bases iguals)
amb una major possibilitat de patir mutacions, sent, en aquests casos, la
freqüència major.
La mutagènesi induïda és la que deriva de lesions en el DNA que provoquen agents físics
o químics ambientals (també anomenats exògens). Entre ells destaca la radiació solar
(raigs UVA) i compostos químics que contenen diferents productes, com per exemple el
tabac. La freqüència de la mutagènesi induïda depèn de la dosi de l’agent mutagènic i té
com a conseqüència augmentar la freqüència de la mutagènesi espontània.
Conseqüències de les mutacions en organismes haploides i diploides
Les mutacions no sempre afecten a les funcions cel∙lulars, ja que algunes d’elles no
generen cap canvi d’aminoàcids en les proteïnes o bé no afecten a la funcionalitat
d’aquestes molècules. Són doncs mutacions a nivell genotípic, però sense que signifiqui
una alteració del fenotip. En canvi, algunes mutacions sí que tenen un clar efecte
fenotípic, alterant alguna funció cel·lular.
En organismes que es reprodueixen sexualment cal distingir entre mutació
somàtica que es produeix en qualsevol cèl·lula de l’organisme, menys en les
cèl·lules germinals i mutació en la línia germinal que afecta a les cèl·lules productores
de gàmetes. El primer tipus de mutació no s’hereta, mentre que el segon tipus es
transmet a la descendència.
En organismes haploides, com els bacteris, es manifesten totes aquelles mutacions que
provoquen un canvi fenotípic.
53
En organismes diploides, com els homes, poden haver mutacions recessives que no es
manifestin ni en l’individu que la conté ni tampoc en els seus descendents.
Les mutacions tenen com a conseqüència un augment de la variabilitat genètica de
les poblacions de qualsevol espècie. Sobre aquesta variabilitat actuarà la pressió
selectiva i promourà l’evolució.
Exemples negatius per l’ésser humà de l’augment de la variabilitat genètica dels
patògens és l’emergència de patògens amb major virulència i de patògens que han
fet un salt d’hoste , així com la selecció de mutants patògens resistents als
antimicrobians, entre d’altres raons, pel mal ús d’aquests compostos.
Les mutacions poden tenir clars efectes negatius pels individus. Per exemple,
diferents tipus de malalties genètiques de base mutacional transmissibles o la relació
entre mutació i certs tipus de càncer (càncer de pulmó i fumadors, càncer de pell i
exposició solar, entre d’altres).
Bases de la pràctica
El bacteri a utilitzar és Rhodobacter sphaeroides, un bacteri del sòl, gramnegatiu,
quimioorganotròfic i fotosintètic (1). Aquest microorganisme sintetitza carotens com a
pigments fotosintètics, els quals confereixen a les cèl∙lules i a les colònies d’aquest
microorganisme un color vermell característic. Diferents mutacions en la ruta de
biosíntesi de carotens donen lloc a un canvi de color de la cèl∙lula i, conseqüentment, de
les colònies. Per tant, l’observació de colònies no vermelles demostra l’existència de
mutants espontanis de pigmentació en la població bacteriana.
Les colònies dels mutants espontanis de color verd pàl∙lid que s’observen en les plaques
són conseqüència d’errors en la replicació del DNA, sent la addició d’una guanina en un
determinat lloc del gen crtD, implicat en la síntesi de carotens, un dels errors més
freqüents. Aquesta addició provoca un corriment de la pauta de lectura d’aquest gen i per
tant se sintetitza un enzim no funcional. La incorporació errònia d’aquesta guanina es
54
produeix a la regió inicial del gen, concretament en un zona que conté 7 guanines
seguides. La presència d’aquesta poli‐G en la seqüència del gen, juntament amb la
generació d’estructures secundàries en aquesta zona, justifiquen l’elevada freqüència
de mutació que presenta aquest bacteri fotosintètic en aquest lloc (I).
Material necessari
• R. sphaeroides 2.4.1
• Medi de cultiu líquid
• Plaques de medi
• Nanses de Digralsky
• Nanses de Kolle
• Pipetes estèrils
• Tubs estèrils de vidre o d’un sol ús transparents
• Tubs d’un sol ús estèrils
• Estàndard 0,5 McFarland o espectrofotòmetre
• Estufa a 30oC.
55
TREBALL DE LABORATORI
Treball experimental 1
Dia ‐3: Vaig sembrar una estria per esgotament de nansa de R. sphaeroides en les
plaques que van caldre de medi i les vaig incubar a 30oC durant 2‐3 dies.
Dia 0: Vaig recollir biomassa de les plaques anteriors amb una nansa de Kolle per
tal d’obtenir una suspensió de R. sphaeroides en 5 ml de medi líquid de 1 x 108
cfu/ml1
aproximadament, segons els procediments que s’indiquen al final d’aquest
apartat.
Dia 0: Vai g d iluir 10‐4
i 10‐5
la suspensió bacteriana obtinguda en medi líquid.
Dia 0: Vai g s embrar 3 plaques de medi amb 0,1 ml de cada dilució.
Dia 0: Vai g i ncubar les plaques a 30oC durant 3‐5 dies.
Dia 3 (5): Vaig observar el creixement i identificar les colònies que no presenten color
vermell. Aquestes colònies procedeixen de les cèl·lules mutants que hi havia a la
població bacteriana inicial.
54. Procediment de dilucions de la suspensió bacteriana
56
CONCLUSIÓ DEL TREBALL EXPERIMENTAL
L’objectiu d’aquesta pràctica era comprovar la mutació dels bacteris, és a dir, que si
el fet de fer mutar un bacteri, que implica un error en la duplicació del DNA, és tant
fàcil com ens expliquen o realment no. Doncs després d’haver realitzat aquesta
pràctica, puc afirmar que causar la mutació d’un bacteri, en aquest cas el
Rhodobacter sphaeroides, no té molta complicació Simplement cal invertir una mica
de temps i anar diluint les mostres de bacteris per així facilitar el procés de mutació.
El Rhodobacter sphaeroides és un bacteri de sòl, gramnegatiu, quimioorganotròfic i
fotosintètic i té un pigment que el fa ser d’un color taronja vermellós, que coincideix
amb el pigment de la pastanaga i per tant, el fet de produir la mutació podrem
comprovar sense la necessitat de microscopi si la mutació ha estat realitzada amb èxit
o no, només caldrà mirar el color de la sembra de bacteris. En aquest cas, la mutació
ha tingut èxit ja que a la placa d’agar, on vaig sembrar l’ultima dilució de
Rhodobacter enlloc s’haver-hi bacteris de color taronja, han passat a ser d’un color
verd pàl·lid. Com a resultat, la reacció ha estat efectuada i per tant he demostrat que
realment no és complicat que es produeixin mutacions bacterianes.
55. Cuitiu de R. sphaeroides (no mutat) 56. Cultiu de R. sphaeroides (mutat)
57
3.2. PRÀCTICA 2: COMPROVACIÓ DE LA RESISTÈNCIA
BACTERIANA ALS ANTIBIÒTICS
Objectius:
Comprovar l’existència de soques d’Escherichia coli resistents a determinats
antibiòtics.
Comprovar el risc que comporta el mal us de les substàncies les substàncies
antimicrobianes i el conseqüent increment de soques bacterianes resistents.
Tenir contacte amb la tècnica de cultiu bacterià, tècnica rutinària en els laboratoris
de microbiologia.
Prendre consciència del paper dels antibiòtics i del seu us racional.
Introducció
Com ja he explicat anteriorment en la part teòrica del meu treball, els antibiòtics són
compostos que inhibeixen el creixement dels bacteris, tot actuant en passos concrets del
seu metabolisme. Dins d’aquests podem trobar els d’ampli espectre, que actuen sobre un
gran nombre de bacteris, i d’altres que són més específics, que només actuen inhibint el
creixement d’espècies bacterianes determinades. Gràcies a l’aparició dels antibiòtics,
moltes malalties que en altres temps havien ocasionat moltes morts, actualment estan
pràcticament eradicades. Ara, però se sap que els bacteris presenten resistència als
antibiòtics, la qual cosa comporta un risc important que malalties, ara per ara, fàcils de
tractar puguin presentar complicacions. Paral·lelament a l’ús dels antibiòtics, des de fa
uns quants anys s’ha introduït a diversos àmbits, alimentari, hospitalari, cosmètic, etc.
L’ús d’agents biocides, substàncies tòxiques per als bacteris en general, donat que els
maten o inhibeixen el seu creixement. No se’ls considera antibiòtics ja que tenen un
origen diferent , tenen un ampli espectre de toxicitat i actuen amb mecanismes diferents.
58
Amb aquesta pràctica, compararé l’acció de tres antibiòtics diferents sobre una mateixa
espècie de bacteri i veuré si aquest presenta soques resistents.
Material i Equipament
Equipament:
- Una incubadora que permeti assolir una temperatura de 35-37ºC.
Reactius i altres materials:
- Cultius mare. De soques bacterianes: Escherichia coli.
- 50 ml de medi de cultiu líquid (sense bacteris).
- Oxitetraciclina en pols (400 mg).
- Eritromicina en pols (400 mg).
- Amoxicil·lina en pols (400 mg).
- Aigua.
- Plaques de Petri amb agar.
- Vasos de precipitats .
- Discos de paper de filtre aproximadament 8mm de diàmetre.
- Tisores.
- Pinces .
- Retoladors indelebles per retolar les plaques de petri.
59
PROCEDIMENT
Preparacions prèvies a l’inici
Dissolucions del treball:
Aigua
Oxitetraciclina en pols
Eritromicina en pols
Amoxicil·lina en pols
EXECUCIÓ DE L’EXPERIÈNCIA
1. Transferir els bacteris des de la suspensió a una placa de Petri amb agar.
2. Aplicar en tres extrems de placa un paper de filtre xop amb cada una de les
dissolucions dels antibiòtics. És a dir, un paper de filtre amb una dissolució de 10 ml
d’aigua i 4 mg d’oxitetraciclina, un amb 10ml d’aigua i 4 mg d’eritromicina i
finalment un altre paper de filtre amb una dissolució de 10 ml d’aigua i 4 mg
d’amoxicil·lina. (Dur a terme aquests procediments en dues plaques d’agar
paral·lelament).
3. Incubar les dues plaques d’agar durant 24 hores a 37ºC.
4. Comparar l’amplada de la zona d’inhibició de creixement bacterià respecte a
cadascun dels antibiòtics.
1. Sembra dels bacteris
Transferència dels bacteris des dels cultius líquids mare a les plaques de Petri amb
l’agar. Aquesta operació es fa agafant amb una xeringa 1 ml de cultiu i s’escampa per
la placa amb l’agar. Es tapa la placa immediatament i es mou la placa de tal maneta
que el líquid sembrat quedi uniformement distribuït per tota la placa. (És convenient
tenir les plaques obertes el menor tems que sigui possible).
60
2. Aplicació dels diferents tractaments
Es mullen els discs de paper de filtre amb cada producte a tesar. Cada un dels discs,
agafat amb les pinces corresponents, es col·loca al centre de la superfície d’agar en
cada una de les plaques. Després de deixar-ho, més o menys, 1 minut per permetre
l’adhesió dels discs a l’agar, cal marcar les plaques de Petri amb un retolador indeleble
per diferenciar els tres tipus d’antibiòtic, en aquest cas vaig posar una O
(oxitetraciclina), una E (eritromicina) i una A (amoxicil·lina).
3. Incubar durant 24 h a 37ºC
Els cultius, tant les plaques com les suspensions, s’incuben a 35-37ºC durant 24 hores.
En aquesta pràctica no vaig poder observar els cultius al cap de 24 hores, per tant vaig
haver d’esperar unes 48 hores més, un total de 72 hores.
4. Comparar l’amplada de la zona d’inhibició de creixement bacterià
56. 4 mg d’Oxitetraciclina
mesurats 57. 4 mg d’Eritromicina mesurats 58. 4 mg d’Amoxicil·lina mesurats
61
Cal comparar la distància entre cada antibiòtic i el cultiu bacterià. Donat que la
concentració del tractament aplicat disminueix amb la distància al dics de paper de
filtre, l’amplada de la zona d’inhibició està inversament relacionada amb el grau de
resistència de la majoria dels bacteris resistents.
CONCLUSIÓ DEL TREBALL EXPERIMENTAL
59. Vas 1: Dissolució 10 ml d’aigua i 4 mh
d’oxiteraciclina. Vas 2: Dissolució 10 ml d’aigua i
4 mg d’eritromicina. Vas 3: Dissolució de 10 ml
d’aigua i 4 mg d’amoxicil·lina.
60. Dues plaques d’agar amb cultiu d’E. coli i un
disc de paper de filtre de cada dissolució
d’antibiòtics a cadascuna de les plaques.
61. Cultiu de bacteris E. coli amb els tres tipus
d’antibiòtics (Oxitetraciclina, Eritromicina i
Amoxicilina). Part assenyalada: cultiu d’E. coli.
62. Cultiu de bacteris E. coli amb els tres tipus
d’antibiòtics (Oxitetraciclina, Eritromicina i
Amoxicilina). Contaminat per fongs.
62
S’observa que en les dues sembres s’ha produït un desplaçament dels discs impregnats
amb els productes antibiòtics respecte el centre. Això ha pogut ser causat per l’agitació de
la placa de Petri, tot i així no suposa cap impediment a l’hora de fer l’experiment.
S’observa també que el producte antibacterià que actua amb més èxit és l’Oxitetraciclina,
ja que impedeix el creixement bacterià en la major part del cultiu.
En el cas de l’efecte de l’Eritromicina, podem veure com és l’antibiòtic que afecta menys
al creixement bacterià, ja que com ens indica la part assenyalada de la fotografia, el cultiu
que ha crescut d’E. Coli és molt a prop del disc d’Eritromicina.
Finalment en el cas de l’Amoxicil·lina, podem dir que és l’antibiòtic que afecta en un
punt entremig dels anteriors, no té tant d’efecte com l’Oxitetraciclina però sí en té més
que l’Eritromicina.
De totes maneres en aquesta experimentació ha intervingut un factor inesperat que ha
influït en l’anàlisi de resultats de la segona placa de Petri, i aquest factor ha estat la
contaminació per un fong. Per tant, no es pot observar si s’ha produït el creixement
bacterià en la zona contaminada com es pot observar en la imatge.
Fer aquesta pràctica ha estat realment interessant ja que m’ha conscienciat del risc que
comporta fer un mal ús de les substàncies antimicrobianes ja que molts de nosaltres no en
som conscients a l’hora de medicar-nos i desconeixem les conseqüències que ens pot
portar.
63
4. CONCLUSIÓ
Podria dir que quan vaig començar a fer el treball era una inexperta sobre aquest tema, i
no em refereixo a que ara el domini, simplement que he après una petita part d’aquest
gran món que és la microbiologia que ja és molt més del que em podria haver imaginat
abans de començar-lo.
Realment he gaudit fent el treball i ha valgut molt la pena perquè gràcies a això m’he
formulat preguntes i les he pogut respondre a mesura que feia el treball i anava
investigant i així he pogut conèixer el plaer d’aprendre coses noves per mi mateixa.
Personalment, no ha estat un treball fàcil, m’ha costat trobat tota la informació necessària,
tenint en compte que desconeixia la gran majoria d’aquest sector de la microbiologia.
M’he ajudat de molts llibres diferents a l’hora de fer el treball, també ha resultat ser una
complicació ja que la informació mai ve tota junta sinó que he hagut d’aprendre a
seleccionar el que interessava i el que no per al meu treball.
Tots hem sentit a parlar dels bacteris i dels antibiòtics durant anys i anys, però realment
no ens hi aturem a pensar, en tot el que ens aporten i totes les funcions que fan i que
nosaltres ni ens n’adonem.
El meu objectiu principal era saber perquè hi havia bacteris resistents a uns antibiòtics,
altres que no, alguns que en un principi no eren resistents però que finalment ho arriben a
ser. Tot això per a mi era un enigma, i ara, amb el treball acabat, puc respondre’m tots
aquests dubtes que en el seu dia em vaig formular.
He pogut comprovar experimentalment que en els bacteris es produeixen mutacions
fàcilment i aquestes mutacions es produeixen a l’atzar. Si aquestes mutacions fan que el
bacteri es torni resistent a un determinat antibiòtic, quan prenguem aquest antibiòtic els
bacteris que no són resistents moriran, però els mutants es reproduiran, i la majoria dels
seus descendents heretaran aquesta mutació és a dir, per selecció natural, cada vegada
tindran més bacteris resistents a aquest antibiòtic. Per tant, si prenem antibiòtics sense
necessitat, estem fomentant que hi hagi un augment de bacteris resistents. Degut a això,
64
he pogut entendre perquè sempre ens recomanen que només prenguem antibiòtics per
prescripció facultativa.
Però per altra banda també he conegut moltes curiositats naturals relacionades amb els
bacteris que ni jo em podia arribar a imaginar, des de convertir un llac comú en un llac
d’aigua aparentment de color rosa ( i tot això gràcies a una simple espècie de bacteri )
fins a produir llum en alguns peixos del fons marí.
Moltes són les coses que he après en aquest treball de recerca i he adquirit uns
coneixements, que a partir d’ara em serviran en cada moment.
65
5. REFERÈNCIES
5.1. Webgrafia
http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php
http://ca.wikipedia.org/wiki/Portada
http://www.enciclopedia.cat/
http://www.profesorenlinea.cl/index.html
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/
http://www.monografias.com/
http://kidshealth.org/parent/en_espanol/infecciones/antibiotic_overuse_esp.html
http://www.farmaceuticonline.com/es/el-medicamento/633-antibioticos-uso-adecuado
http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-
%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf
http://books.google.es/books?id=239cauKqSt0C&pg=PA103&lpg=PA103&dq=cultivo+
bacteriano&source=bl&ots=2PczmfcDLg&sig=wEyHEr-L3k36JhnrAM-
hzq_vMHI&hl=es&sa=X&ei=pDpWVO3oAsrVarHkgfgB&ved=0CGAQ6AEwDA#v=o
nepage&q=cultivo%20bacteriano&f=false
66
5.2. Bibliografia
EMILIO O. CASAMAYOR I JOSEP M. GASOL. Microbios en acción. CSIC. Blanes, Girona. 2012.
JOSÉ MIGUEL SÁEZ GOMEZ. Un benefactor universal Pasteur. Nivola – libros y Ediciones.
Tres Cantos, Madrid. 2004.
RAQUEL GRANADOS PÉREZ I Mª CARMEN VILLAVERDE PERIS. Microbiología Tomo I. Thomson
Paraninfo. Magallanes, Madrid. 2003.
JOHN L. INGRAHAM I CATHERINE A INGRAHAM. Introducción a la microbiología: Tomo 1.
Editorial Reverté, S.A. Barcelona. 1998.