la citometría de flujo en el diagnóstico y seguimiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna...

La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

Amparo Sempere

Servicio de Hematología

H.U. La Fe

III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y

HemoterapiaCastellón, 27 de febrero de 2009

HPNHPNDefiniciónDefinición

• Enfermedad clonal adquirida de la célula hematopoyética pluripotencial

• Mutación somática en el gen PIG-A (fosfatidil-inositol-glucano de clase A) implicado en la síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GPI)– Carencia total o parcial de la expresión de

proteínas ancladas a la membrana a través del componente GPI en parte de la células hematopoyéticas

HPNHPNAlteración genética: Gen PIG-AAlteración genética: Gen PIG-A

• Uno de los más de 20 genes implicados en la síntesis de las proteínas ancladas a GPI

• Se encuentran mutaciones del gen PIG-A en todos los casos en que se ha interrumpido la síntesis de GPI

• Como consecuencia de la mutación se reduce o falta la expresión de proteínas ancladas a la superficie de la célula por moléculas de GPI

Bloqueo en la HPN

PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

HPNHPNProteínas ancladas a GPIProteínas ancladas a GPI

Hernández-Campo et al. Med Clin. 2008; 131: 617-630

• Enzimas: acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina granulocítica

• Moléculas de adhesión: CD48, CD58, CD66b-c• Proteínas reguladoras del complemento:

CD55: factor que acelera la degradación de las convertasas del complemento (DAF)

CD59: inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MIRL)

• Receptores: CD14, CD16, CD87, CD90• Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios• Antígenos del neutrófilo• Otros: CD24, CD52

CD59, CD90, CD109

CD55CD58CD59 CD48CD52PrPcCD16

CD24 CD55CD58 CD59 CD48 PrPC CD73 CD108

CD55CD58CD59CD109PrPCGP500Gova/b

CD55CD58CD59PrPCAChEJMH AgDombroch HG Ag

CD55 CD58*CD59 CD14CD16 CD24CD48 CD66bCD66c CD87CD109 CD157LAPNB1 PrPCp50-80 GPI-80ADP-RT NA1/NA2

CD14 CD55CD58*CD59 CD48 CD52CD87 CD109CD157Grupo 8 PrPC GPI-80CD16

CD55 CD58*CD59 CD48CD52 CD87 CD108 PrPcADP-RT CD73CD90 CD109CD16*

Células progenitoras hematopoyéticas

Plaquetas

Hematíes

PMN

Células B

Monocitos

Células T

Células NK

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((Cortesía de Lucio Cortesía de Lucio Luzzatto)Luzzatto)


Distribución de las proteínas Distribución de las proteínas ancladas a GPIancladas a GPI

Déficit de proteínas GPI: Déficit de proteínas GPI: hemólisis intravascularhemólisis intravascular

• La reducción o ausencia de CD55 y CD59 en la superficie de los eritrocitos los hace muy vulnerables a la acción del complemento y provoca su destrucción

• CD55 (DAF): previene la formación de complejos C3-C5-convertasa esenciales para la amplificación de la secuencia de activación de las proteínas del sistema de complemento

• CD59 (MIRL): inhibe la formación del complejo de proteínas del sistema del complemento C5b-C9 de ataque de membrana

• Déficit de CD59: formación de poros en la membrana y muerte celular

HPNCascada del Complemento

Vía alternativa

Vía clásicaCD59

Complejo de ataque a lamembrana

CD59

CD59


HPNHPNTipos de hematíes según Tipos de hematíes según

sensibilidad al complemento sensibilidad al complemento

• HPN tipo I: sensibilidad normal a la acción del complemento

• HPN tipo II: sensibilidad intermedia (3-5 veces superior a la normal). Déficit parcial de CD59

• HPN tipo III: sensibilidad elevada (15-25 veces superior a la normal). Déficit total de CD59

Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 736-748

Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 749-757

HPNHPNIncidencia y prevalenciaIncidencia y prevalencia

• Enfermedad rara, pero grave

• Incidencia: 1,3 casos por 1.000.000 habitantes y año

• Prevalencia: 7-16 casos por 1.000.000 habitantes

• Afecta igual a hombres y mujeres

Hill A et al. Blood 2006; 108: A985

HPNHistoria Natural

Gran Bretaña

Francia USA Japón

Referencia Hillmen, 1995

Peffault de Latour, 2008

Nishimura, 2004

Nishimura,

2004

Pacientes 80 460 176 209

Edad mediana (años)

42 34 30 45

Supervivencia mediana (años)

10 22 23 25

AA previa 29% 23% 29% 38%

Trombosis 39% 31% 32% 4%

Transformación a leucemia/SMD

0% 8% 4% 7%

HPNHistoria Natural

• Amplio espectro de manifestaciones clínicas• Mediana de edad al diagnóstico 40 años• Mortalidad atribuible 50% (trombosis y

citopenias)– La trombosis es la principal causa de mortalidad y de

morbilidad

• Mediana de supervivencia: 10-25 años• Remisión espontánea: 15%

HPN Clínica

Hemoglobinuria

Hemólisis intravascular– síntomas 1

- dolor abdominal- disfagia- disfunción eréctil- letargia

Trombosis

Trombosis2,3

- hepática, cerebral

50% de pacientes

Anemia aplásica

Insuficiencia medular- puede preceder a la HPN4,5

1. Rother et al. JAMA 2005;293:1653-627. 2. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M et al. N Engl J Med 1995;333:1253-8. 3. Socie G, Mary JY, Gramont A et al. Lancet 1996;348:573-7. 4. Wang et al. Blood

2002;100:3897–902. 5. Dunn et al. Ann Int Med 1999;131:401–8.

HPNHPNClasificaciónClasificación

• HPN clásica: hemólisis intravascular, % elevado de granulocitos deficientes en proteínas GPI y una población mayoritaria de hematíes tipo III. Sin otra enfermedad medular asociada

• HPN asociada a otras hemopatías: hemólisis intravascular en el contexto de otra enfermedad medular como AA y SMD

• HPN subclínica: sin evidencia clínica ni analítica de hemólisis. Mediante citometría de flujo se detectan pequeños clones de células de HPN. Asociación frecuente con insuficiencia medular (AA y SMD)

Parker C et al. Blood 2005;106:3699-709

¿HPN sintomática o ¿HPN sintomática o molecular?molecular?

• Mosaicismo: células progenitoras normales y patológicas• Enfermos con pequeños clones raramente tendrán

síntomas relacionados con la HPN • En pacientes con clones de granulocitos HPN < 10% la

clínica de hemólisis será mínima o nula (AA y anemia refractaria)

• Un clon de granulocitos HPN superior a 50%: mayor riesgo de trombosis

• El tamaño del clon puede variar con el tiempo y un 15% de enfermos con HPN hemolítica pueden tener remisión espontánea

• El tratamiento va a depender, en gran medida, de la presentación clínica y del tamaño del clon HPN

HPNHPNTratamientoTratamiento

• Sintomático (transfusiones, anticoagulación oral, corticoides, ácido fólico, hierro,…)

• Trasplante de progenitores hematopoyéticos: único tratamiento curativo

• Eculizumab (anti-C5): nuevo tratamiento específico de la HPN (Registro Internacional de HPN)

Complementarity determining regions(murine origin)

Human IgG4 heavy chainconstant regions 2 and 3

Human framework regions

Human IgG2 heavy chainconstant region 1 and hinge

CH1

CH

3C

H2

Hinge

CL

Rother et al. Nature Biotech 2007;25:1265–73

Eculizumab: Anticuerpo anti-C5

HPNCascada del Complemento

Vía alternativa

Vía clásicaCD59

Complejo de ataque a lamembrana

CD59

CD59

Eculizumab


HPNHPN¿Quién debería ser estudiado?¿Quién debería ser estudiado?

• Hemoglobinuria• Hemólisis intravascular no inmune (Coombs negativo,

LDH elevada) especialmente si ferropenia• Trombosis de localización infrecuente: síndrome de Budd-

Chiari, venas abdominales, cerebrales o dérmicas • Anemia aplásica• SMD: Anemia refractaria • Disfagia o dolor abdominal y hemólisis intravascular• Citopenias mantenidas de origen desconocido

Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

HPNHPNEvaluación inicialEvaluación inicial

• Estimar el grado de hemólisis: hemograma,

reticulocitos, LDH sérica, bilirrubina fraccionada y haptoglobina

• Determinar el grado de insuficiencia medular: aspirado y biopsia de médula ósea y citogenética

• Establecer el déficit de proteínas asociadas a GPI: detección de poblaciones de células de sangre periférica (hematíes, neutrófilos y monocitos) deficientes en antígenos asociados a grupos GPI

Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

HPNHPNMétodos DiagnósticosMétodos Diagnósticos

• Pruebas clásicas: aumento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento

• Citometría de flujo (CMF): ausencia de proteínas asociadas a grupos GPI

• Análisis molecular: secuenciación e identificación de mutaciones del gen PIG-A

HPNHPNPruebas ClásicasPruebas Clásicas

Pruebas de Ham-Dacie y de sacarosa

• Técnicas laboriosas • Difícil estandarización• Restringidas a hematíes• Falsos negativos (especialmente en pacientes

transfundidos) • Requiere un 5% de células tipo III (déficit total) o un

20% de tipo II (déficit parcial) para dar resultados positivos

• Interés histórico

Suero fresco

Suero fresco acidificado inactivado por calor

Salino + hematíes

SacarosaControl de sacarosa

Suero fresco acidificado +

magnesio

Suero fresco acidificado


HPNHPNAnálisis MolecularAnálisis Molecular

• Secuenciación del

gen PIG-A• No aplicable como

técnica de rutina• Laboratorios de

investigación

HPNHPNCitometría de FlujoCitometría de Flujo

• Nicholson-Weller, 1985: aplicación de la CMF al diagnóstico de la HPN

• Van der Schoot, 1990: superioridad de la CMF sobre la prueba de Ham

• Hall & Rose, 1996: CMF como método de elección• Brodsky, 1999, 2000: método diagnóstico alternativo,

proaerolisina conjugada con fluoresceína (FLAER, de fluorescein-labelled AERolysin)

Vidriales M. B. Haematologica (ed. esp.) 2008; 93 (Supl.2); 9-11

Citometría de FlujoCitometría de FlujoVentajasVentajas

• Rapidez (1 hora)• Sensibilidad (clones <1%)• Marcaje múltiparamétrico: con tres anticuerpos la

sensibilidad puede llegar a 0,01%• Análisis de diferentes líneas celulares• Detección de clones de hematíes tipo I/II/III• Cuantificación y monitorización del tamaño del clon

HPN

HPNHPNCitometría de FlujoCitometría de Flujo

• El análisis por citometría de flujo es el método de elección para el diagnóstico y seguimiento de la HPN

Citometría de FlujoCitometría de FlujoCélulas Células

Analizar un mínimo de dos líneas celulares:

• Hematíes

• Neutrófilos y monocitos

• Linfocitos: discrepancias en el tamaño clonal respecto a los neutrófilos

• Plaquetas: expresión débil y variable de proteínas GPI en controles sanos

Citometría de Flujo Tamaño del clon HPN

• Tamaño del clon de hematíes

- Tipos de hematíes: I/II/III

- Proporción de hematíes HPN en relación a la última transfusión

• Tamaño del clon de neutrófilos: refleja mejor el tamaño del clon HPN

• Tamaño del clon de monocitos: valida el tamaño del clon HPN (puede tener discrepancias con los neutrófilos)

Citometría de FlujoCitometría de FlujoEstudio de hEstudio de hematíesematíes

• Análisis multiparamétrico con marcaje directo• Adquisición con SSC/FSC en escala logarítmica • Estudio de dos antígenos GPI diferentes: CD55 y CD59 (permite

descartar deficiencias congénitas aisladas)• Incluir un AcMo frente a un antígeno eritroide no asociado a GPI

para seleccionar los hematíes (CD235a)• CD59: discrimina hematíes tipo I, II y III • Las transfusiones afectan el tamaño del clon de hematíes (realizar

estudio tras un mínimo de un mes desde la última transfusión) • El estudio puede realizarse hasta 2 semanas tras la extracción de la

muestra (mantener los hematíes a 4º C)• Incubación mínima de 15 min y un solo lavado• Incluir un control de sangre normal

Hematíes: análisis multiparamétrico

CombinaciónCD59 FITC/CD55PE/CD235a PE-Cy5

Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

CD59: Identificación y cuantificación de clones HPN

Tipo I: células con expresión normal de CD59Tipo II: células con deficiencia parcial de CD59Tipo III: células con deficiencia completa de CD59

PNH

Co

un

t

CD59 FITC-A


HPN clásica: hematíes

SANTIAGO JOSE ALBA T7 CD55.007CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

CD55 CONTROL T3.003CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

Control Control

HPN clásica

HPN clásica

Tipo III

Tipo II

Tipo I

HPN CD59: hematíes

T4 FRANCISCO M RUIZ SORIA.006CD59 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

Control

HPN AA

HPN clásica

Tipo III

Tipo II

Tipo I

T-4 QIAOLI YE CD59 HEMATIES.007CD59 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HPN subclínica

<1%

12,2%

84%

Citometría de FlujoCitometría de FlujoEstudio de lEstudio de leucocitoseucocitos

• El análisis en granulocitos es superior al de hematíes para

establecer el tamaño del clon HPN • El estudio debe ser multiparamétrico lo que permite detectar

de forma simultánea la deficiencia de antígenos GPI e identificar clones de HPN de pequeño tamaño

• Es muy importante la selección de los AcMo contra antígenos GPI (alta expresión en células normales, específicos de una línea celular, baja afinidad por uniones inespecíficas y combinables en un marcaje múltiple)

• Es recomendable utilizar AcMo no asociados a GPI para seleccionar la población diana

• La técnica de FLAER permite detectar pequeños clones HPN

Citometría de FlujoCitometría de FlujoNeutrófilos y monocitosNeutrófilos y monocitos

• Sangre periférica en EDTA (<24 horas) • Análisis multiparamétrico con marcaje directo • Neutrófilos: CD16, CD24, CD55, CD59 y CD66b• Monocitos: CD14, CD52, CD55, CD59 • Selección de la población: CD15, CD33 • Se debe valorar la presencia de formas inmaduras y

displasia (citología/CMF). • Adquisición de 100.000 eventos• Incluir un control normal de forma paralela• CD55 y CD59: lisar y marcar • Análisis inicial de neutrófilos y monocitos (CD16/CD14), si

compatible con HPN analizar hematíes

P1+P3 = granulocitos P2+P4 = monocitos

Estrategia de análisis: Estrategia de análisis: neutrófilos y monocitosneutrófilos y monocitos


Neutrófilos: CD16

0 256 512 768 1024

PRUEBA HPN .001FSC-Height ->

PRUEBA HPN .001CD16 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

PRUEBA HPN .001CD16 FITC ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ENRIQUE BISBAL FORES 6C_1.fcsCD16 FITC-A ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Control

HPN Subclínica

HPN Clásica

Neutrófilos: CD55

T-6 SANTIAGO J.ALBA CD55.006CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

0 256 512 768 1024

PRUEBA HPN .001FSC-Height ->

Control HPN clásica: 92%

T2 CD55 QIAOLI YE.011CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HPN AA 3,5%

T4 CD55 CONTROL.013CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Neutrófilos: CD55

T6CD55 RUT LUCAS DOMINGUZ.015CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

T-6 SANTIAGO J.ALBA CD55.006CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

T4 CD55 CONTROL.013CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

ControlHPN clásica:

92%

HPN AA: 6,5%

T2 CD55 QIAOLI YE.011CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HPN subclínica:

1,2%

Monocitos: CD14

CONTROL HPN_1.fcsCD14 APC-Cy7-A ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

SANTIAGO J ALBA LOPEZ 6C_1.fcsCD14 APC-Cy7-A ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

RUT LUCAS DOMINGUEZ 6C_1.fcsCD14 APC-Cy7-A ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4Control

HPN AA: 7%

HPN clásica:

93%

Monocitos: CD55

T-2 CD55 ENRIQUE BISBAL F..004CD 55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

0 256 512 768 1024

T-3 CD59 ENRIQUE BISBAL F..005FSC-Height ->

T-4 CONTROL CD55.002CD 55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

T6CD55 RUT LUCAS DOMINGUZ.015CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HPN AA: 6%

HPN clásica:

93%Control

Citometría de FlujoCitometría de Flujo FLAERFLAER

• La aerolisina es una toxina secretada por la La aerolisina es una toxina secretada por la Aeromonas Aeromonas

hydrophilahydrophila, que produce hemólisis mediante la unión a la , que produce hemólisis mediante la unión a la molécula GPI molécula GPI

• La proaerosilina es una variante inactiva de la proteína bacteriana que está conjugada con fluoresceína (FLAER) y que mantiene la capacidad de unión a GPI sin causar lisis

• Restringida a leucocitos, permite la identificación y cuantificación de pequeños clones de HPN (<0,02%)

• Puede utilizarse sola o en combinación con más anticuerpos dirigidos frente antígenos GPI

• Permite el análisis de pacientes con SMDBrodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756. Brodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756.

Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

Citometría de FlujoCitometría de Flujo FLAER FLAER

FL

AE

R A

lexa

488

Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

Células HPN

Células normales

Células normales

FLAER: análisis de los clonesFLAER: análisis de los clones

Clon de granulocitos HPN = 8,9% Clon de monocitos HPN = 8,1%

HPN

HPN

FLAER/ CD24 /CD16 /CD33/CD15/CD14


HPNHPNCMF: SeguimientoCMF: Seguimiento

• El seguimiento y la monitorización del clon de HPN es esencial en el manejo clínico del enfermo

• En los enfermos en tratamiento con eculizumab aumenta el clon de hematíes y se iguala al de neutrófilos en unos 6 meses de media

• Monitorizar el clon de granulocítos es importante por el riesgo de trombosis

• En HPN subclínica se recomienda controlar el tamaño del clon tras iniciar tratamiento con inmunosupresores

• El tamaño del clon puede variar con el tiempo y pacientes con un clon de HPN estable y de tamaño intermedio peden tener una remisión espontánea

Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

Citometría de Flujo Citometría de Flujo Seguimiento del clon HPNSeguimiento del clon HPN

Controles mínimos (Registro Internacional de HPN):• Pacientes con HPN clásica sin eculizumab y en HPN

asociada o subclínica: anual• Enfermos con HPN con eculizumab: al inicio del

tratamiento, a los 6 meses y después anual• Reevaluación si cambios clínicos

Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

T4 CD59 ENRIQUE BISBAL.006CD59 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4


10 10 10 10 100 1 2 3 4

ENRIQUE BISBAL FORES 59 T6.006CD59 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

SeguimientoSeguimientoClon de hematíes con eculizumabClon de hematíes con eculizumab

Células control

HPN clásica: 60% diagnóstico

HPN clásica: 95% 1 año con eculizumab

SeguimientoSeguimientoClon de neutrófilos con eculizumabClon de neutrófilos con eculizumab

T-2 CD55 ENRIQUE BISBAL F..004CD 55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

T-4 ENRIQUE BISBAL CD55.004CD55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Células control

HPN clásica: 94%, diagnóstico

HPN clásica: 98%, 1 año con eculizumab

T-4 CONTROL CD55.002CD 55 ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

HPN HPN CMF: Temas pendientesCMF: Temas pendientes

• El Registro Internacional de HPN requiere que los

datos aportados sean lo más homogéneos posible • El uso de diferentes técnicas complica la

estandarización de los resultados• No se dispone de criterios inmunofenotípicos

validados para el diagnóstico de HPN• Falta de consenso en la estrategia de análisis y en la

selección de los anticuerpos• Necesidad de reuniones de consenso

Citometría de Flujo Reunión de Consenso

Madrid, 27 de enero 2009

• Objetivo principal: intentar llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN por CMF, para tratar de disminuir, en lo posible, las diferencias técnicas e intentar homogeneizar los resultados entre distintos laboratorios

Citometria de Flujo: Reunión de Consenso

Madrid, 27 de enero 2009

• Deben analizarse al menos dos líneas celulares con al menos dos antígenos asociados a GPI

• Marcaje multiparamétrico• Se recomienda el estudio de neutrófilos y hematíes• Cálculo del tamaño del clon

Granulocitos: CD16, CD66, CD24 o CD55

Hematíes: CD59 o CD55/CD59 en marcaje combinado

Monocitos: CD14 y CD55• En el estudio de HPN subclínica, se recomiendan técnicas de

CMF de alta resolución y llegar a una sensibilidad de 0,1% • Realizar el estudio de hematíes y leucocitos de forma

independiente• Necesidad de disponer de un control de calidad externo

La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la

Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

Amparo Sempere

Servicio de Hematología

H.U. La Fe

III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y

HemoterapiaCastellón, 27 de febrero de 2009

la citometría de flujo en el diagnóstico y seguimiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna...

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