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A apoptose é um fenômeno de degeneração celular altamente conservado evolutivamente, sendo observada durante não só o desenvolvimento, mas também associada à uma série de patologias. A apoptose é regulada por um conjunto complexo de proteínas e integrada por mecanismos bioquímicos que atuam para iniciar e concluir a destruição da célula. Por sua vez, o fenótipo apoptótico pode ser identificado por uma série de características gerais, incluindo alterações na membrana mitocondrial, blebbing da membrana plasmática, reorganização do citoesqueleto, fragmentação de DNA e condensação e dissolução nuclear. Recentemente, as alterações bioquímicas e morfológicas típicas do processo de morte celular foram correlacionadas com outros eventos celulares vitais, como proliferação e diferenciação celular. Apesar da tendência para tratar-se apoptose e diferenciação celular como resultados divergentes de vias de sinalização, já foi demonstrado existir um elevado grau de semelhança morfológica entre estes eventos. De fato, a ativação de caspase-3 associada à diferenciação de megacariócitos já foi descrita como necessária para que mudanças morfológicas correlacionadas com a maturação destas células ocorram (De Botton et al, 2002; Guimarães-Sternberg et al, 2004). As moléculas envolvidas na regulação do processo pseudo-apoptótico da diferenciação ainda não foram completamente descritas. Uma vez que o principal inibidor endógeno da caspase-3 é a proteína XIAP e que a mesma é regulada por XAF1, analisamos a regulação dessas proteínas no contexto da diferenciação a partir de diferentes linhagens celulares.

A diferenciação monocítica de células foi induzida nas linhagens de leucemia pró-mielocítica NB4 e HL60 através do tratamento com PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) e avaliada por citometria de fluxo quanto ao aumento da expressão de CD11c. A diferenciação megacariocítica foi induzida na linhagem de mielóide K562 através do uso de PMA e avaliada quanto ao aumento da expressão de CD41, CD61, CD71 e poliploidização (marcação com iodeto de propídeo) por citometria de fluxo. Foi extraído RNA das linhagens utilizando-se Trizol e o RNA extraído foi utilizado para síntese de cDNA. A expressão de XAF1 foi avaliada por PCR em Tempo Real. Foi feita análise de metilação do promotor de XAF1 por PCR específico após o tratamento do DNA com bissulfito de sódio. Foi realizada também a avaliação da expressão de XIAP e XAF1 por Western blot.

A diferenciação monocítica ocorreu mais rapidamente na linhagem NB4 (24h) do que na linhagem HL60 (48hs). A expressão protéica de XAF1 diminui nas duas linhagens durante a diferenciação com PMA, mas somente na NB4 o RNA mensageiro (RNA-m) de XAF1 diminui. A razão XIAP/XAF1 aumenta durante a diferenciação monocítica. As linhagens HL60 que superexpressam Bcl-XL ou Bcl-2 possuem XAF1 silenciado no nível transcricional e isso se deve à metilação do promotor de XAF1. Após o tratamento com agente demetilante 5'Azacitidina a expressão de XAF1 foi restaurada, o que foi acompanhado pela indução de diferenciação monocítica destas células. Durante a diferenciação megacariopoiética induzida por PMA na linhagem K562, ocorreu um aumento na expressão de RNA-m de XAF1 que se refletiu também num aumento de expressão protéica. A expressão protéica de XIAP diminui durante a diferenciação megacariopoiética.

Figura 1: A. Análise da expressão do marcador de diferenciação monocítica CD11c por citometria de fluxo após o tratamento de células NB4 por 24h e HL60 por 48h com 20nM de PMA. B. Análise da expressão de diversos marcadores de diferenciação megacariocítica em células K562 por citometria de fluxo após o tratamento das células com 60nM de PMA durante 72h.

Figura 2: Análise da expressão de XIAP e XAF1 por Western blot das linhagens HL60 e NB4 após o tratamento com PMA em diferentes tempos . Foi utilizado como controle de carregamento HSC70.

Figura 5: Análise da expressão do marcador de diferenciação monocítica CD11c por citometria de fluxo após o tratamento das linhagens HL60, HL60 Bcl-XL e HL60 Bcl-2 por 48h com 20nM de PMA.

Figura 6: Análise da expressão de XIAP e XAF1 por Western blot das linhagens HL60, HL60 Bcl-XL e HL60 Bcl-2 após o tratamento com 20nM de PMA por 48hs. Foi utilizado como controle de carregamento HSC70.

Figura 7: Análise da expressão de RNAm de XAF1 por PCR em Tempo Real das linhagens HL60, HL60 Bcl-XL e HL60 Bcl-2. A expressão de GAPDH foi utilizada como controle endógeno.

Figura 8: Análise da expressão de XIAP e XAF1 por Western blot das linhagens HL60, HL60 Bcl-XL e HL60 Bcl-2. Foi utilizado como controle de carregamento HSC70.

Figura 9: Análise do status de metilação do promotor de XAF1 PCR Metilação específico (MSP) nas linhagens HL60, HL60 Bcl-XL e HL60 Bcl-2. M, PCR para amplificação de promotor de XAF1metilado; UM, PCR para amplificar promotor de XAF1 não metilado; gDNA, controle de DNA totalmente metilado; Plac., DNA de placenta (controle de Dna totalmente não metilado).

Figura 9: Análise da expressão de RNAm de XAF1 por PCR em Tempo Real das linhagens HL60, HL60 Bcl-XL e HL60 Bcl-2 após o tratamento com 5’ azacitidina por 72h. A expressão de GAPDH foi utilizada como controle endógeno.

Figura 10: Análise da expressão do marcador de diferenciação monocítica CD11c por citometria de fluxo após o tratamento das linhagens HL60, HL60 Bcl-XL e HL60 Bcl-2 por 72h com 5Azacitidina. O tratamento com agente demetilante induz a diferenciação das linhagens.

Figura 3: A diferenciação megacariocítica requer degradação de XIAP mediada por proteassoma e leva ao aumento dos níveis de actina. (A) Western blot de XIAP, actina, XAF1a e XAF1c após o tratamento de K562 com 60nM de PMA por 72h tratado ou não com inibidor de proteassoma MG132 nas últimas 24hs. HSC70 foi utilizada como controle de carregamento.

Figura 4: Análise da expressão de RNAm de XAF1 por PCR em Tempo Real das linhagens K562, HL60 e NB4 após o tratamento com PMA em diferentes tempos . A expressão de GAPDH foi utilizada como controle endógeno.

Os resultados demonstram a ativação diferencial de vias de morte celular na diferenciação monocítica e megacariocítica. A modulação das proteínas analisadas parece correlacionar com a duração de cada um dos tipos celulares avaliados após a diferenciação.

O objetivo do presente estudo é avaliar a ativação de vias de morte celular nos processos de diferenciação monocítica e megacariocítica.

1 - Indução de diferenciação monocítica e megacariocítica

2 – Expressão de XIAP e XAF1 durante a diferenciação monocítica

3 – Expressão de XIAP e XAF1 durante a diferenciação megacariopoiética

4 – Expressão mRNA de XAF1 durante a diferenciação.

5 – Diferenciação de linhagem HL60 superexpressando Bcl-XL e Bcl-2.

6 – Expressão de XIAP e XAF1 durante a diferenciação de HL60 superexpressando Bcl-XL e Bcl-2.

7 – Expressão de mRNA de XAF1 em HL60 superexpressando Bcl-XL e Bcl-2.

8 – Expressão basal de XIAP e XAF1 em HL60 superexpressando Bcl-XL e Bcl-2

9- Análise do status de metilação do promotor de XAF1 em HL60 superexpressando Bcl-XL e Bcl-2.

9- Tratamento de linhagens HL60 Bcl-XL e Bcl-2 com agente demetilante 5’Azacitidina

10- Diferenciação induzida por agente demetilante 5’Azacitidina

INTRODUÇÃO

OBJETIVO

METODOLOGIA

RESULTADOS

CONCLUSÃO

ATIVAÇÃO DE VIAS DE MORTE CELULAR NA DIFERENCIAÇÃO MEGACARIOCÍTICA E MONOCÍTICA

DE LINHAGENS HEMATOPOIÉTICAS1 1 1João de Séllos R. Laclette (Mestrando); Erika Carvalho ;Maurício Caetano ; 2 1 1Gustavo Amarante-Mendes , Carlos Gil Ferreira ; Cinthya Guimarães-Sternberg

1Instituto Nacional de Câncer, Coordenação de Pesquisa, Divisão de Pesquisa Clínica e Aplicada.2Universidade de São Paulo, Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Imunologia

HSC70à

XIAPà

HSC70à

XAF1à

CTL PMA CTL PMA

HL60 NB4

CTL PMA

MG132: - + - +

HSC70à

XIAPà

ACTINAà

CTL PMA

MG132: - + - +

HSC70à

XIAPà

ACTINAà

CTL PMA

MG132: - + - +

HSC70à

XAF1aà

XAF1cà

HSC70à

XAF1aà

XAF1cà

CTL PMA CTL PMA CTL PMA

HL60 Bcl-XL Bcl-2

HSC70à

XIAPà

XAF1à

CTL PMA CTL PMA CTL PMA

HL60 Bcl-XL Bcl-2

HSC70à

XIAPà

XAF1à

0

-10,8

-9,9

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

HL60 CTL HL60 Bcl-XL HL60 Bcl-2

Expressão de XAF1 em HL60

XAF1Lo

gD

Dct

HL60 Bcl-XL Bcl-2

HSC70à

XIAPà

XAF1à

HL60 Bcl-XL Bcl-2

HSC70à

XIAPà

XAF1à

HL60 Bcl-XL Bcl-2 gDNA Plac. B

M

UM

HL60 Bcl-XL Bcl-2 gDNA Plac. B

M

UM

Tratamento com 5'AZA

1,001,40

1,00 1,00

49,76104,82

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

HL60 CTL HL60

5AZA

Bcl-XL

CTL

Bcl-XL

5AZA

Bcl-2 CTL Bcl-2

5AZA

DD

Ct

XAF1

26,3% 51,3%

12,65%

16,5%1,87%

38,2%

FS

C

CD11c PE

FS

C

CD11c PE

0,87% 77,5%

4,84% 84,97%

A B

CD41 PE

PI

Evento

s

1,73% 4,72%

Evento

s

6,23% 48,29%

Evento

s

CD61 FITC

3,23% 64,75%

1,48% 88,64%

12,57% 97,85%

1,81% 97,04%

FS

C

CD11c PE

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