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Introducción a La Apoptosis

Introducción a La Terapia GénicaCurso 2008-09


• Concepto • Mecanismos moleculares:

– Inducción– Control– Ejecución

• Implicaciones:– Función fisiológica– Implicaciones patológicas

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ΑποπτωσιξKerr, J.F.R., Wyllie, A.H. & Currie, A.R.“Apoptosis: A Basic Biological

Phenomenon With Wide Ranging Implications In Tissue Kinetics”

British Journal of Cancer (1972), 26: 239.

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¿Qué Es La Apoptosis?

Caída de la hoja (Kerr et al., 1972).Suicidio celular.

“Autodestrucción de las células, activa y genéticamente controlada, caracterizada por una morfología específica.”

Apoptosis Necrosis

• Necrosis:– Tipo de muerte celular, que ocurre como

consecuencia de un daño masivo de tejido, asociada con una rápida incapacitación de las principales funciones celulares como son la expresión génica, síntesis de ATP y potencial de membrana.

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Apoptosis versus Necrosis

-+ Expresión génica, síntesis proteica, activación proteasas

Expresión

InflamientoCambios molecularesMitocondria

Lisa, lisisProtuberancias, cambios en la distribución de fosfatidilserina

Membrana celular

Degradación ADNCondensación, segmentación, fragmentación ADN

Núcleo

Cel. InfladaCel. EncogidaMorfología

AnoxiaDaño físico o químico

Falta factores crecimientoInfluencia hormonalToxicidad suave

Causas

NecrosisApoptosis

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Website designed by Phil Dash: www.sghms.ac.uk/depts/immunology/ ~dash/apoptosis/intro.html

Apoptosis de una célula trofoblástica:





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Mecanismos Moleculares

• Caenorhabditis elegans:– Adulto: 1090 células somáticas 131 mueren por

apoptosis– Básicamente, 4 genes mayores controlan la MCP

(ced = cell death defective):• Mutaciones en egl-1, ced-3 y ced-4: células sobreviven

(promotores de MCP)• Mutación en ced-9: aumenta la apoptosis (inhibidor)

– Genes homólogos en mamíferos

Proteinas Apoptóticas En C. elegans

Hengartner, M. (1998) Science 281: 1298-99

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Genes Homólogos En Mamíferos

Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281: 1322-26

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Inducción De La Apoptosis

• Interacciones ligando-receptor.

• Estrés celular:– Químicos, – Radiaciones,– Infecciones virales.

• Linfocitos T citotóxicos (granzima).

www.sghms.ac.uk/depts/immunology/ ~dash/apoptosis/intro.html

1. Interacción Ligando-Receptor

• “Death receptors” (Superfamilia de TNF):– CD95 (Fas)– TNFR1– TRAIL (TNF related apoptosis inducing

ligand): DR4 y DR5

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Inducción Vía CD95/Fas

• Muerte celular mediada por las células T citotóxicas.

• Respuesta inmune: supresión de células T activadas.

• Sitios inmunoprivilegiados: destrucción de células inmunes e inflamatorias.


DISC

Inducción Vía TNFR1

• TNF se produce por células T y Macrófagos activados en respuesta a la infección.– Activación de NF-κB y

AP-1 Inducción de genes proinflamatorios (1).

– Inducción de apoptosis (2)

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Inducción Vía TRAIL

• Acción similar a CD95.

• Unión a receptores DR4 y DR5.

• Expresión constitutiva en muchos tejidos

• Mecanismos de protección celular mediante la expresión de receptores señuelo DcR1 y DcR2.

www.uchsc.edu/sm/neuro/tylerlab/pennyclarke/pennyclarketrail.html

2. Estrés celular: Daño genotóxico

• Agentes intercalantes (Cisplatin, mytomicin C, formaldehyde).

• Inductores de aductos al ADN (Polycyclic aromatic hydrocarbons: benzo(a)pyrene).

• Agente alquilante (ethyl Methanesulphonate, n-ethyl-n-nitrosurea).

• Productores de radicales libres (Niquel, arsenic, H2O2).

• Inhibidores de microtúbulos (Taxol).

• Inhibidores de la Topoisomerasa (Etoposide, doxorubicin).

• Perturbadores del balance nucleotídico (methotrexate).

• Radiaciones (x-ray).

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• Proteína de unión al ADN con dominios de activación de la trascripción.

• Previene la replicación del ADN dañado.• Supresor tumoral.• Mutaciones de p53 en el 50% de los

tumores humanos (60-70% cancerasociados al ambiente).

p53: El Guardián Del GenomaLane (1992)

Funciones De p53

ADN dañado ATM p53 P MDM

1. Parada del ciclo celular:

p21p53 P Cdk2S phase

(DNA synthesis)

G2 G1

M

2a. ADN reparado:ATM p53 MDM

2b. Apoptosis:Bax, Fas/FasL

Bcl-2

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Regulación De p53

Stanchina et al. (1998) Genes and Development 12: 2434-42

MDM

3. Linfocitos T Citotóxicos

http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Students/spring2000/woodall/perforine.html

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http://www.nature.com/nri/journal/v2/n4/slideshow/nri775_bx2.html





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Función de la Mitocondria

• Localización de miembros de la familia de Bcl-2 en la membrana mitocondrial.

• Promover o prevenir la formación de poros en la membrana controlando la liberación de citocromo C.


Familia de Bcl-2Homólogos a las proteínas ced-9 y egl-1.Miembros pro- y anti-apoptóticos

http://www.geocities.com/CollegePark/Lab/1580/bcl-2.html


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Estructura proteica

• Formación de homo-y hetero-dímeros.• Similar a las proteínas de formación de poros bacterianas.• Dominios de unión a membrana en el extremo C terminal.• Localización en la membrana externa mitocondrial.


Regulación de la apoptosis por la familia de Bcl-2

Liberación de Cyt C


Activación de caspasas

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La sensibilidad de la célula a un estímulo apoptótico depende del balance entre miembros pro y anti-apoptóticos.

Estímulo apoptótico

Bax

Bcl-2Cyt C


Modelos de control de apoptosis:

A

Bcl-2

Bax

B

Bax

Bcl-2

C

Bax Bcl-2Chau, D.T. & Korsmeyer, S.J. (1998) Annual Review in Immunology 16: 395-419

A + B+ C

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Regulación post-traducción: “BH3 only”

Chau, D.T. & Korsmeyer, S.J. (1998) Annual Review in Immunology 16: 395-419

PI3-K

AKT


Regulación post-traducción: “BH3 only”

Casp

asa-

8

Bid

Desagher et al. (1999) JBC 144: 891-901

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Familia De Caspasas

• Homólogos a ced-3.• Cystein proteasas (Cys en su sitio

activo).• Ampliamente expresadas en forma de

proenzimas.• Digestión de proteínas en los residuos

de ácido aspártico.

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Clases De Caspasas

• Iniciadoras (like caspasa-9)

• Ejecutoras (like Caspasa-3)– Digestión de

proteínas– Cambios

morfólogicoscelulares.

Thornberry, N.A.. & Lazebnik, Y. (1998) Science 281: 1312-16

ApoptosisPARP SREBs

Gelsolin Caspase-6 Caspase-7 Caspase-9 DNA-PK MDM2 Gas2 Fodrin

β-Catenin Lamins NuMA

HnRNP proteins Topoisomerase I

FAK Calpastatin

p21Waf1

Presenelin2 ICAD

CPP32, Yama, apopain

Caspasa-3

Apoptosis (activity supressed by serum

deprivation)

Golgin-160Lamins (?)

Ich-1 (human), Nedd2 (rat, mouse)

Caspasa-2

Processing of interleukins

(inflammation). Can also induce apoptosis depending on isoformand if overexpressed.

pre-Interleukin-1b Interleukin-18

Lamins

ICECaspasa-1

FunciónSubstratoNombre alternativo

Caspasa

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ApoptosisPARPLamins NuMA FAK

Caspase-3 Keratin-18

Mch2Caspasa-6

Apoptosis (activity blocked by cIAP1

and cIAP2) Similar in structure and substrate specificity to

caspase-3

PARPGas2

SREB1 EMAP II

FAK Calpastatin

p21Waf1

Mch3, ICE-LAP3, CMH-1

Caspasa-7

Inflammation/Apoptosis (related to human

caspase-4 and caspase-1)

?ICErelIII, TYCaspasa-5

Inflammation/Apoptosis (note: this could be the human form of mouse

caspase-11). Related to human caspase-5 and

caspase-1

Caspase-1Ich-2, ICErelIICaspasa-4


Caspasa

Apoptosis (death receptors)

Caspase-3 Caspase-4 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9

FLICE-2, Mch4Caspasa-10

Murine caspase similar to human caspase-4.

Belongs to the same family as caspase-3 of

enzymes. May be involved in inflammation

and apoptosis

?Ich-3, ICE_BCaspasa-11

ApoptosisCaspase-3pro-Caspase-9

Caspase-7 PARP

Apaf-3, ICE-LAP6, Mch6

Caspasa-9

Apoptosis (death receptors)

Caspase-3Caspase-4 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-13

PARP Bid

FLICE, MACH, Mch5Caspasa-8


Caspasa

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Member of the ICE family of caspases that include caspase-1 and caspases-4, -5 and –11. Involved in

inflammation.

?ERICECaspasa-13

Involved in mediating apoptosis following ER

stress. Related to mouse caspase-1 and caspase-11 and human caspase-4

and caspase-5

?ICE_CCaspasa-12


Caspasa

http://www.sghms.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/caspases.html

Regulación De LasCaspasas

Raff, M. (1998) Nature 396: 119

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Regulación De LasCaspasas


Regulación De Las Caspasas

Slee et L. (1999) Jounal of Cell Biology 144: 281-91 http://www.sghms.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/caspases.html

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Casp

asa-

8

Bid

Desagher et al. (1999) JBC 144: 891-901

Regulación De Las Caspasas

Efectos De Las Caspasas


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Efectos En El Núcleo

• Inhibición de enzimas de reparación [Poly (ADP-ribosa) polimerasa o PARP].

• Inhibición de enzimas de replicación celular (DNA topoisomerasa II).

• Ruptura de proteínas estructurales nucleares (Caspasa-6 lamina).

• Fragmentación del ADN.http://www.sghms.ac.uk/depts/immunology/~dash/apoptosis/caspases.html

Apoptosis Independiente De caspasas (AIF)

• AIF (Apoptosis Inducing Factor) se localiza en la mitocondria.

• Apoptosis: AIF migra al núcleo.• AIF se une al ADN y desencadena la

destrucción del mismo y la muerte celular.

• Mecanismo observado en neuronas.

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Eliminación De Las Células Apoptóticas

Pérdida de la asimetría de membrana exposición de la fosfatidil serina en la capa externa

Mecanismos moleculares de la apoptosis

Terapia

CáncerEnfermedades cardiacasInfartosSIDAEnfermedades autoinmunesEnfermedades neurodegenerativas

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To be continued...





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Implicaciones

Función fisiológica: * Desarrollo embrionario* Homeostasia tisular y diferenciación tisular* Respuesta inmune

Desarrollo• Eliminación de órganos transitorios.• Remodelación Tisular.• Formación de conexiones neuronales

adecuadas.• Inhibición de apoptosis mediante señales

extrínsecas:– Factores Neurotróficos Supervivencia neuronal.– Factor Stell de las crestas genitales

Supervivencia de las células germinales primordiales.

– Andrógenos Supervivencia de las células de la próstata.

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Respuesta InmuneSelección de células B con anticuerpos de alta afinidad

CDF

CDF B

Apoptosis del 90%de centrocitos

Bcl-2

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Mantenimiento De La Integridad De Sitios inmunoprivilegiados

• Organos: ojo, oído interno, testículo o cerebro.

• Expresión de FasL e inducción de apoptosis en linfocitos Fas+.

Célula cornea

Linfocito Utilización para permitir la tolerancia a transplantes.

Eliminación De Células Peligrosas Para La Integridad

Del Organismo

• Células infectadas con virus (CTL).• Células del sistema inmune.• Células con el ADN dañado.• Células cancerosas.

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Implicaciones

Implicación patológica:* Cáncer* SIDA* Daño tóxico* Enfermedades Neurodegenerativas

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Apoptosis Y Cáncer

Oncogenes / Supresores tumorales

Apoptosis

Cancer

rasc-myc

p53Bcl-2

p53*50% tumores

Bcl-290% adenocarcinomas colorectales30-60% cancer de próstata70% leucemias linfocitarias20% cancer de pulmón

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P53 “El guardian Del Genoma”

p53

p53*

Carcinógenos genotóxicos

radiación

- Arresto del ciclo celular en G1- Inducción de la apoptosis

Apoptosis Y Cáncer

céls

.hem

atop

.

epit

elio

s

APOPTOSIS

CANCER Inte

stin

o de

lgad

o(s

tem

cel

ls)

Col

on

34

Iniciación Y Promoción

• 80-90 % de las células pretumorales (GST-P+)

no desarrollan lesiones observables.

• apoptosis por promotores tumorales (Fenobarbital, acetato de ciproterona).

• apoptosis mediante restricción alimentaria

Progresión Y Crecimiento

• Apoptosis:

hepatocitos, foci , adenoma, carcinoma• Daño genético.

• Ausencia de factor de supervivencia (mitógenos, hormonas) regresión y potencial eliminación de tumores.

!

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Apoptosis En Tumores

Apoptosis Proliferación0.05% 0.5%/h 5%/h

Apoptosis

Crecimiento < 5% del esperado

Higado

Bax Bcl-2

Bcl-2Bcl-2

Bax Bax Bcl-2Bax

Bax Bax

Bcl-2Bax

QuimioterapiaRadiación

p53Bcl-2Bax

Apoptosis

Apoptosis

Inducción de Apoptosis De Células Tumorales

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• Cáncer causado por virus:– HPV: Inactivación de p53 por E6.– Epstein-Barr Virus:

• Producción de proteína similar a Bcl-2,• Incremento en la producción de Bcl-2 celular.

• Leucemias de células B: traslocación del gen de Bcl-2.

• Melanoma: Inhibición de la expresión del gen de Apaf-1.

Mecanismos De Escape De La Apoptosis

• Mantenimiento del tumor como un sitio inmunoprivilegiado:– Secreción de moléculas señuelo que se

unen a FasL de los CTL. – Expresión de altos niveles de FasL e

inducción de la apoptosis de linfocitos T activados.

Mecanismos De Escape De La Apoptosis

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APOPTOSIS Y SIDA

Síndrome de Inmuno-Deficiencia Adquirida

1. Infección aguda:• Altos niveles de viremia e infección de células

CD4+, macrófagos, otras,...• Respuesta inmune celular y Ac.

2. Estadío asintomático:• Replicación viral/Respuesta inmune celular,• Disminución Ac.

3. Estadío sintomático:• Disminución de CD4+ y aumento de carga viral.• Sintomatología, infecciones oportunista,

neoplasias, demencia...

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Apoptosis de células inmunitarias

gp120-gp41

CD4+

Apoptosis:CD8+Células BNKGranulocitosMonocitos

¿Mecanismo indirecto de inducción de apoptosis?

Expresión de altos niveles de FasL

Demencia en SIDA

• Pérdida de neuronas en ganglios basales, materia blanca y corteza cerebral.

• Infección por HIV de macrófagos, microglia y astrocitos. No neuronas.

• Actividad neurotóxica:– Proteínas virales: gp120, Tat.– Secreciones de macrófagos y microglía activados:

• TNF-α, excitoxinas, NO

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