apoptosis diapositivas 2011
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H. FREDY ZEGARRA ARAGON
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¿ QUE ES LA APOPTOSIS?
Por qué se dice que es una muerte celular programada ?
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a) Mantención de un número constante de células, mediante la eliminación de las redundantes (tejidos sujetos a un activo recambio celular: hígado, médula ósea y mucosa del tracto digestivo ), permite un balance entre proliferación y muerte celular
b) Eliminación de células potencialmente peligrosas. ( que pueden desarrollar un proceso maligno.)
c) Función inmune: interviniendo en los mecanismos de defensa especialmente en infecciones virales (donde células infectadas sufren apoptosis inducida por linfocitos evitando la replicación viral y por lo tanto la propagación de la infección.)
d) Remodelación de tejidos embrionarios y organogénesis: • Durante la gestación se produce un exceso de neuronas : 50% son eliminadas por apoptosis, quedando el resto para constituir el SNC. • La apoptosis también participa en la involución de órganos como el timo en la pubertad, cambios celulares que inician la menstruación y en las glándulas mamarias cuando termina la lactancia
IMPORTANCIA DE LA APOPTOSIS
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Célula sana
Todos los errores reparados
La célula intenta reparar errores
Injuria
Errores genéticos resultado de la
injuria
Algunos errores permanecen
Injuria adicional
Célula incapaz de reparar errores
La célula programa su muerte vía Apoptosis
APOPTOSIS
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NECROSIS APOPTOSIS
Célula hinchada Célula encogida
Orgánulos dañados Orgánulos no dañados
Cromatina alterada Cromatina marginada
Célula lisada Cuerpos apoptóticos
Orgánulos destruidos Orgánulos intactos
Cromatina destruida Cromatina fragmentada
Contenido celular liberado Contenido celular retenido
Inflamación Fagocitosis
Fagocitosis No inflamación
TABLA Nº 1.- Diferencias entre los cambios morfológicos que ocurren en la necrosis celular y la apoptosis celular
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CARACTERISTICA NECROSIS APOPTOSIS
Participación Celular Pasiva, carente de control genético Activa, controlado por un programa genético
Volumen celular Aumenta Se reduceCromatina Nuclear Condensación laxa y localización difusa Condensación compacta con marginización
nuclearNucleo Fragmentado Fragmentado
ADN Fragmentación irregular , patrón de barrido
Fragmentación internucleosomal, patrón de escalera
ARN Ribosomal Degradación irregular Fragmentación regular, aparición de bandas específicas
Orgánulos Se hinchan y tienden a fusionarse con lisosomas
Permanecen íntegros y no se fusionan con lisosomas
Membrana celular Conserva asimetría de fosfolípidos y se pierde la integridad
Aparición de fosfatidil serina en la lámina extracelular y se conserva la impermeabilidad
Citoesqueleto Se desorganiza Conserva su estructura
Citoplasma Se vierte al espacio intersticial Se conserva en los cuerpos apoptóticos
Activación de proteasas Inespecífica y asociada a disfunción lisosomal
Específica de la familia de las caspasas
Estrés Oxidativo Presente sólo en etapas tardías Presente desde etapas tempranas
Metabolismo lipídico Activación inespecífica de fosfolipasas Producción de Ac. Araquidónico , Ceramida y sus metabolitos derivados
Reacción infamatoria Presente AusenteCicatrización Presente a menudo con fibrosis Ausente
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APOPTOSIS
NECROSIS
Deshidratación Celular
Condensación de la cromatina Preservación de la
integridad de la membrana
Cuerpos Apoptóticos
Fragmentación Nuclear
Ruptura de la membrana plasmáticaHinchamiento de célula
y mitocondrias
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TABLA I. ALGUNOS FACTORES MODULADORES DE LA APOPTOSIS.
FACTORES EXTERNOSA) Estimulantes de las apoptosis Radiaciones ionizantes, radicales reactivos de oxígeno (ROS), Lipoproteínas de baja densidad oxidadas. Drogas citotóxicas (agentes alquilantes, antimetabolitos, antagonistas hormonales,
glucocorticoides, ciclosporina A).
Citocinas (TNF, TGF-b, IL-1b). Receptores transmembrana (receptor Fas/APO, rTNF, rNGF, rIFN-g).
B) Supresores de la apoptosis Factores tróficos de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-6, CSF, EGF).
FACTORES GENÉTICOSA) Genes estimulantes de apoptosis: ced-3, ced-4 (C. elegans), p53, lpr, Bax (mamíferos), Bcl-xS, cmyc.
B) Genes supresores de apoptosis: ced-9 (C. elegans), Bcl-2 (mamíferos), Bcl-xL.
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PROTEINAS EFECTORAS :: Caspasas
PROTEINAS REGULADORAS :: Familia Bcl-2
PROTEINAS ADAPTADORAS : FADD, TRADD, TRAF, RAIDD
COMPONENTES PRINCIPALES DE LA APOPTOSIS( PROTEINAS INVOLUCRADAS EN LA APOPTOSIS)
… aa – aa – aa – aa – aspartato – aa – aa – aa – aa – aa ….
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CASPASAS SEGÚN SU FUNCIÓN
•Inflamatorias: Participan en la maduración de citoquinas, como IL-1 e interferón (caspasas 1,4, y 5).
•Efectoras: Participan en la degradación de sustratos apoptóticos (caspasa 3 ó CPP32, caspasas 7 y 2 y CED-3).
•Reguladoras: (caspasas 6 y 9 y caspasa 8, FLICE), activan a las caspasas efectoras.
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TABLA 2.- Proteínas sustrato (blanco) de las caspasas
Proteína blanco Sitio de
hidrólisis
Caspasa Función de la proteína blanco
PARP1 DEDY-G 3 y 7 Reparación del ADN
UI-70 Kda2 DGPD-G 3 Procesamiento del ARN
DNA-PKCS3 DEVD-N 3 Reparación de brechas en el ADN de doble cadena
SREBP DEPD-S 3 y 7 Proteína que se une a elemento regulado por esterol
D4-GDI DELD-S 3 Regulador de Rho (GTPasa)
PKC-d DMQD-N 3 Degradado a su forma activa en apoptosis
Pro-IL1b YVHD-A 1 Degrada a citocina activa
C1 y C24 ? 3 y 7 Procesamiento del pre-ARNm (HnRNA)
Laminina A y B VEID-N 6 Mantenimiento de la forma de la membrana nuclear
Gas2 SRVD-G ? Componente del sistema microfilamento
Fodrina DETD-S ? Estructura del citoesqueleto asociado a membrana
Actina G LVVD-N ? Estructura del citoesqueleto
NuMa ? ? Mantiene la estructura nuclear
1Poli (ADP-Ribosa) Polimerasa 2Pequeña ribonucleoproteína de de 70 Kda 3Proteína Kinasa ADN dependiente 4Proteína heteroribonuclear
D(asp), E(glu), G(gli), H(his), I(Ile), L(leu), M(met), N(Asn), P(Pro), Q(gli), R(Arg), S(Ser), T(Thr), V(val), Y(Tyr).
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Nombre Dominios Anclaje a
membrana
Función
Subfamilia Bcl-2
Bcl-2 BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica
Bcl-x1BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica
Bcl-w BH4, BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica
Mcl-1 BH3, BH1, BH2 Si Antiapoptótica
A1 BH1, BH2 No Antiapoptótica
Subfamilia Bax
Bax BH3, BH1, BH2 Si Proapoptótica
Bak BH3, BH1, BH2 Si Proapoptótica
Bok BH3, BH1, BH2 Si Proapoptótica
Subfamilia BH3
Bik BH3 Si Proapoptótica
Blk BH3 Si Proapoptótica
Hrk BH3 Si Proapoptótica
BNIP3 BH3 Si Proapoptótica
Bim L BH3 Si Proapoptótica
Bad BH3 No Proapoptótica
Bid BH3 No Proapoptótica
Tomado de Adams y Cori, 1998
TABLA 2.- Clasificación de los miembros de la
familia Bcl-2
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FASE DE ACTIVACION FASE DE EJECUCION
MUERTE CELULAR
M I T O CO N D R I A
Bloqueo por cerpinas
(crm-A)
Bloqueo por Bcl-2
C I T O P L A S M A
MEDIO EXTRACELULAR
Ligando
Receptor
Activación de Receptores TNF-I, APO/FAS o CD40
Activación de Caspasas 8, 10 y 1.
Producción de ácido araquidónico y ceramida
Producción de estrés oxidativo.
Caída transitoria del potencial de membrana mitocondrial.
Liberación del Cit C.
Activación de Caspasas 3, 6 y 7.
Participación de bax y Ced-4
Membrana celular
Representación esquemática de las fases de activación y ejecución durante la muerte por apoptosis . La activación del receptor de muerte como el receptor de TNF tipo I, el antígeno APO/FAS o
el CD40, encienden el programa de muerte. La activación de caspasas tanto en la fase de activación como de ejecución , amplifican el proceso antes y después de la inducción de cambios en el
funcionamiento mitocondrial. Cada fase va acompañada de cambios bioquímicos que participan en la muerte celular.
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Iones
Bcl-2
Bcl-x
l
Apaf 1
Bax
Bax
PI-3 K Procaspasa-3 Caspasa-3
Procaspasa-9
Caspasa-9 CITOSOL
Membrana Mitocondrial
Externa
Espacio Intermambrana
Receptor de Factor Trófico
Cit C
Cit C
Bad
Akt-Kinasa
Cit C
Cit C
Corte se sustratos MUERTE
12-3-3
Membrana citoplasmática
AUSENCIA DE FACTOR TRÓFICO: Activación de Caspasas
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Figure 23-50. Current models of the intracellular pathways leading to cell death by apoptosis or to trophic factor–mediated cell survival in mammalian cells. The details of these pathways in any given cell type are not yet known. (a) In the absence of a trophic factor. Bad, a soluble pro-apoptotic protein, binds to the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-xl, which are inserted into the mitochondrial membrane. Bad binding prevents the anti-apoptotic proteins from interacting with Bax, a membrane-bound pro-apoptotic protein. As a consequence, Bax forms homo-oligomeric channels in the membrane that mediate ion flux. Through an as-yet unknown mechanism, this leads to the release of cytochrome c from the space between the inner and outer mitochondrial membrane. Cytochrome c then binds to the adapter protein Apaf-1, which in turn promotes a caspase cascade leading to cell death.
LA FALTA DE FACTORES TRÓFICOS PROMUEVE LA ACTIVACIÓN DE LAS
CASPASAS
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Bcl-2
Bcl-x
l
Apaf 1
Bax
Bax
PI-3 KProcaspasa-3
Procaspasa-9
CITOSOL
Membrana Mitocondrial
Externa
Espacio Intermambrana
Receptor de Factor Trófico
Cit C
Bad
Akt-Kinasa
Cit C
12-3-3
Membrana citoplasmática
Factor Trófico
P
ATP
ADP
PRESENCIA DE FACTOR TRÓFICO: Inhibición de la activación de
Caspasas
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Figure 23-50. (b) In the presence of a trophic factor such as NGF. In some cells, binding of trophic factors stimulates PI-3 kinase activity, leading to activation of the downstream kinase Akt, which phosphorylates Bad. Phosphorylated Bad then forms a complex with the 14 - 3 - 3 protein. With Bad sequestered in the cytosol, the antiapoptotic Bcl-2/Bcl-xl proteins can inhibit the activity of Bax, thereby preventing the release of cytochrome c and activation of the caspase cascade. [Adapted from B. Pettman and C. E. Henderson, 1998, Neuron 20:633.] (Fuente: Lodish et al., 2000)
LA PRESENCIA DE FACTORES TRÓFICOS
INHIBE LA APOPTOSIS
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Activación de esfingomielinasa
CERAMIDA
JNK/SAPK
TNF
TNFR
TRADDFADD
RAIDDRAID
TRAF
Caspasa-2
Caspasas Efectoras
Caspasa-3
Caspasa-6
Caspasa-7
Supervivencia celularNF-kB
APOPTOSIS
p50
p65IkB
p50
p65
Bcl-2
FIGURA Nº 1. Apoptosis inducida por Factor de Necrosis Tumoral
Endonucleasas
Fragmentación del ADN
Toxinas, hormonas, Factores de crecimiento, citoquinas, oxido
nítrico, etc
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Fas L
Fas
FADD
Pro-Caspasa 8
p18
p18
p11p11
Smac/Diablo IAP
Bid
Cit C
Caspasa-8
Caspasa-3
APOPTOSIS
Pro-Caspasa-3
Cit CPro-
Caspasa -9
Caspasas Efectoras
Caspasa 9
Caspasa-3 Caspasa-6 Caspasa-7
dATP
Apoptosoma
Bcl-XL
FLIP
APAF - 1Pro-
Caspasa -9 Cit C
FIGURA Nº 2. Apoptosis inducida
por Fas
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Pro-Caspasa-3
Caspasa-3
APOPTOSIS
¿
APOPTOSIS
CAD
Granzima B
Célula Efectora Citolítica(lifocitos T citotóxicos, y NK)
Degranulación Granzima B
PerforinaCa2+ Ca2+
Ca2+
II
C A
D
C A
D
FIGURA Nº Inducción de apoptosis por Granzima A
Topo IIHMG1
HMG2
Fragmentación del DNA
Liberación de Citocromo C
Célula tumoral o
infectada por virus
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Luz UV Radiación g
Daños Redox de desintoxicación Drogas / Xenobióticos
¿ … ?
Complejo del Poro de Permeabilidad transicional:
ANT, VDAC
APAF - 1
Cit C
Cit C
Pro-Caspasa-9
Cit CPro-
Caspasa-9
dATP
Caspasa 9APOPTOSIS
Cit C
Figura N° Vía Intrínseca de la Apoptosis
ADNMITOCONDRIA
Luz UV Radiación gStress Quimioterapia
Daños Redox de desintoxicación Drogas / Xenobióticos
¿ … ?
Complejo del Poro de Permeabilidad transicional:
ANT, VDAC
APAF - 1
Cit C
Cit C
Pro-Caspasa-9
Cit CPro-
Caspasa-9
dATP
Caspasa 9APOPTOSIS
Cit C
Figura N° Vía Intrínseca de la Apoptosis
ADNMITOCONDRIA
canal de aniones dependiente de
voltaje
transportador de nucléotidos de
adenina
![Page 25: Apoptosis Diapositivas 2011](https://reader033.vdocuments.co/reader033/viewer/2022061521/55cf966f550346d0338b77fe/html5/thumbnails/25.jpg)
Figura N° . p53 y detención del Ciclo Celular. Mecanismos que reconocen el ADN dañado, detienen la degradación de p53 y modifican a la proteína p53. (1). P53 estimula la transcripción de p21 (2) y GADD45 (3). El producto de p21 inhibe el complejo Ciclina / CDK, lo cual evita la fosforilación de Rb (Retinoblastoma) la cual continua para inhibir el Factor de transcripción E2F, bloqueando por lo tanto la progresión celular a
través del Ciclo Celular (evitando que entre a la Fase S). p53, también estimula la transcripción del gen GADD45 (Grow Arrest and DNA Damage) que cofifica para una enzima reparadora del ADN. Si el daño no es reparado, los genes apoptóticos son activados (4).
(1)
(2)(3)
Luz UV Agentes químicos
CkL
CdK
p53
GADD45
Transcripción del gen GADD45 Transcripción del gen p21
Transcripción del gen Bax. Activa la apoptosis
Transcripción del gen IGF-BP3. Inhibe señales antiapoptóticas
Reparación del ADN dañado
Rb
E2F(-)
(4)
Bloqueo de la progresión del Ciclo Celular
Complejo Ciclina / CdK
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FIGURA Nº
Deprivación de citoquinas
DNA dañado Drogas Citotóxicas
Ligando de muerte
Ej. FasL
Receptor de muerte
Ej. Fas
FADD
Activación de caspasa 8
p53
Proteínas BH3 solamente
Pro-sobrevivencia Miembros de la familia Bcl-2
Bax/Bak
Daño mitocondrial
Liberación de citocromo c
Apaf-1
Activación de
caspasa 9
Activación de caspasas efectoras
Adaptadores
Activación de caspasas iniciadoras
Proteólisis de proteínas vitales
APOPTOSIS
FLIP
Smac/Diablo
IAPs
![Page 27: Apoptosis Diapositivas 2011](https://reader033.vdocuments.co/reader033/viewer/2022061521/55cf966f550346d0338b77fe/html5/thumbnails/27.jpg)
ENFERMEDADPor inhibición de apoptosis
Cáncer Colorrectal Neuroblastoma Glioma Leucemias y linfomas Hígado PróstataEnfermedades Autoinmunes Miastenia grave Lupus eritematoso sistémicoEnfermedades inflamatorias Asma bronquial Enfermedad inflamatoria intestinal Inflamación pulmonarInfecciones víricas Adenovirus Baculovirus
Por Exceso de ApoptosisSida Linfocitos TEnfermedades neurodegenerativas Enfermedad de Alzheimer Retinitis pigmentosa Esclerosis lateral amiotrofica Epilepsia Enfermedad de Parkinson Enfermedades hematológicas Anemia aplasica Linfocitopenia T CD4+ Síndrome mielodisplasico Deficiencia de G6PD Daño Tisular Infarto de miocardio Daño isquémico renal Accidente cerebrovascular Riñón poliquistico
TABLA Nº 6. 4.- Enfermedades asociadas a apoptosis
Tomado de Ramírez Chamond R. y col.
![Page 28: Apoptosis Diapositivas 2011](https://reader033.vdocuments.co/reader033/viewer/2022061521/55cf966f550346d0338b77fe/html5/thumbnails/28.jpg)
METODO DESCRIPCION
Microscopia óptica y electrónica
Electroforesis del DNA en geles de
agarosa.
Citometria de flujo
Cambios en el núcleo
TUNEL
Ioduro de propidio
Hoescht 33342
Cambios en la membrana
Anexina V
Cambios morfológicos: Condensación de la
cromatina, encogimiento citoplasmático, etc.
Se observa el patrón en escalera del DNA degradado.
Adición enzimática de nucleótidos marcados con
fragmentos de ADN de doble hebra.
Entra en las células por un aumento de la
permeabilidad de la membrana.
Entra en todas las células. Tiñe el núcleo y permite
observar la condensación de la cromatina
Tiene una alta afinidad por la fosfatidil serina en la
superficie celular
TABLA Nº 6.5. Técnicas utilizadas para la determinación de apoptosis
![Page 29: Apoptosis Diapositivas 2011](https://reader033.vdocuments.co/reader033/viewer/2022061521/55cf966f550346d0338b77fe/html5/thumbnails/29.jpg)
TECNICA DESCRIPCION
Microscopía óptica y electrónica
Cambios morfológicos (condensación cromatínica, encogimiento citoplasdmático
Electroforesis del ADN Patrón en escalera de ADN degradado en uno o múltiples nucleosomas.
TUNEL Adición enzimática TdT de nucleótidos marcados en fragmentos de ADN de una doble hebra.
ISNT Adición enzimática (ADN Polimerasa I de nucleótidos marcados en fragmentos de ADN de una sola hebra.
Tinción con Yoduro de propidio
Entra en la célula con aumento de la permeabilidad de la membrana (células necróticas y fases tardías de la apoptosis).
Hoescht 33342 Entra en todas las células y tiñe el núcleo permitiendo observar una condensación cromatínica
Anexina V-FITC Detecta fosfatidil serina en la superficie celular para la cual tiene gran afinidad la anexina
PRINCIPALES TECNICAS USADAS PARA LA DETECCIÓN DE APOPTOSIS
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..GRACIAS ...