instructivo tecnico para el muestreo y …faolex.fao.org/docs/pdf/chi138583anx.pdf · 5.3.1...

Instructivo Tecnlco para el muestreo y dlaqnosttco dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco

del control oficial de la plaga en kiwi

C6digo: D-PD-PE-OOSversrcn-uz

INSTRUCTIVO TECNICO PARA El MUESTREO YDIAGNOSTICO DE PSEUDOMONAS SYRINGAE PV.ACTINIDIAE (PSA) EN El MARCO DEL CONTROL

OfICIAl DE lA PlAGA EN KIWI

Peqin« 1 de 50

Instructivo Tecnlco para el muestreo y diaqnosfico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


TABLA DE CONTENIDOS

C6digo: D-PD-PE-OOSverston.oz

CONTENIDO PA.GINA

1 OBJETIVOS y ALCANCE 4

2 REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS 4

3 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS 5

4 REQUISITOS PARA LA AUTORIZACION 6

4.1 Requisitos de personal de laboratorio 6

4.2 Requisitos del personal para muestreo 7

4.2.1 Equipo de Muestreo: 7

4.3 Requisitos de infraestructura, equlpos, materiales y reactivos 8

4.4 Requisitos Especificos 12

4.5 Medios de verlflcaclon de requisites 12

5 ANAuSIS/ENSAYO 13

5.1 Condiciones previas para el muestreo 13

5.1.1 Condiciones previas para muestreo de plantas madres 13

5.1.2 Condiciones previas para el muestreo de huertos 14

5.1.3 Incorporaclon del laboratorio autorizado como usuario del Sistema dede informacion de Sanidad Vegetal (SISVEG) 14

5.2 Captaclon y envio de muestras 14

5.2,1 Muestras de plantas madres de kiwi 14

5.2,2 Muestras de huertos para conocer sltuaclon fitosanitaria 14

5.2.3 Envio de muestras , , , ,.." , 16

5.3 Recepcion de la muestra y manejo de la muestra/contramuestra 16

5.3.1 Recepclon de la muestra 16

5.3.2 Manejo de la contramuestra 16

5.4 Metodologfa, , 17

5.5 Calculo y Expresion de Resultados 17

5.6 Esterilizacion y elirnlnaclon de material de desecho 17

5.7 Varlaclon de la metodologfa 17

Pagina 2 de 50

Instructivo Tecnlco para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-OOSVersi6n:02

6 REGISTRO Y ENVio DE LOS RESULTADOS 17

7 SUPERVISION DE LOS LABORATORIOS AUTORIZADOS 18

8 OBLIGACIONES 18

9 ANEXOS 19

9.1 MUESTREO PLANTAS MADRES KIWI 19

9.1.1 Perfodo de muestreo 19

9.1.2 Proceso de muestreo 19

9.1.3 Condiciones del muestreo de plantas 0 cuarteles madres de kiwi 19

9.1.4 Especificaciones sobre las muestras 20

9.1.5 Plantas con sintomatologla a bacteriosis 20

9.1.6 Plantas sin slntornatoloqia de bacteriosis 21

9.1.7 Muestra compuesta 21

9.1.8 Identificaci6n de las plantas madres 21

9.1.9 Envlo de Muestras al Laboratorio 21

9.1.10 Reqlstro de la informaci6n 22

9.2 METODOLOGiA DE DIAGNOSTICO 23

9.2.1 Esquema Anallsls 23

9.2.2 Toma submuestra a analizar 25

9.2.3 Aislamiento y PCR 25

9.2.4 PCR directo 33

9.2.5 PCR en tiempo real. 38

9.2.6 PCR en tiempo real alternativos 42

9.2.7 Formulaci6n medios de cultivo y tampones 44

9.3 FORMULARIOS 46

9.3.1 Formulario de identificaci6n de personai que conforrna equipos demuestreo y de analista(s) del laboratorio vinculado(s) al diagn6stico 46

9.3.2 Dedaraci6n jurada para la designaci6n del laboratorio autorizado queprestara servicios al vlvero de kiwis 47

9.3.3 Formulario modelo de Dedaraci6n de plantas madres .48

Pagina 3 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnostlco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-OOSVersion :02

1 OBJETIVOS Y ALCANCE

EI objetivo de este documento es establecer 105 requisitos y procedimientos quedeberan cumplir los(as) interesados(as) que, voluntariamente, postulen ante elSAG, para operar como laboratorio autorizado en la ejecuclon de la toma demuestras vegetales y del diaqnostlco de la bacteria Pseudomonas syringae pv.actinidiae (Psa) en muestras provenientes de huertos, para conocer la sltuacionfitosanitaria, y de plantas madres de viveros de kiwi (Actinidia spp.) para obtenerla autortzaclon de propaqacion de tal material vegetal. Se especifican cuatroprocedimientos de dlaqncstlco distintos, pudiendo el laboratorio optar por masde uno, en la solicitud.

Asimismo, este documento entrega las directrices para que estos laboratorios, unavez que obtengan su autorlzaclon ante el SAG, realicen el muestreo y diaqnostico dela bacteria antes sefialada.

Sin perjuicio de 10 anterior, en caso de que el Servicio 10 requiera, podra ampliar elnurnero tecnlcas dlaqnostlcas que forman parte del alcance de esta autorlzaclon SAG,frente a 10 cual, 105 laboratorios que deseen mantener su autorizaclon en estacategoria, deberan postular a la arnpllaclon de su autorlzaclon, de acuerdo alprocedimiento descrito en el numeral 13 del Reglamento especifico de autorizaclonde laboratorios de anallsts/ensayos.

Las actividades relacionadas al proceso de muestreo, para la reallzacion de lastecnicas de dlaqnostico de laboratorio, son la toma, conservacion,almacenamiento, envio y entrega de las muestras al laboratorio, las cualesdeberan ser desarrolladas de acuerdo a 105 metod 05 y procedimientos especificosestablecidos por el SAG en el protocolo de muestreo en el marco del controlobligatorio de Pseudomonas syringae pv. actinidiae. (Anexo 9.1).

Esta autorizaclon se otorqara con caracter nacional, aun cuando las actividadesinvolucradas son ejecutadas en zonas qeoqraftcas definidas por el SAG.

Las disposiciones del presente instructivo seran aplicables a todas las personas quevoluntariamente postulen a la autorlzaclon referida en este documento.

2 REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS

Servicio Agricola y Ganadero. 2013. Resoluclon Exenta del Director Nacional NO2.151 de abril del 2013. Establece medidas fitosanitarias para el control obligatoriode la plaga Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa), en las areas reglamentadasy deroga la Resoluclon N° 5.655 del 201l.

Servicio Agricola y Ganadero. 2013. Resoluclcn Exenta del Director Nacional N°2.152 de abril del 2013. Establece medidas para combatir la dispersion de la plagacuarentenaria bajo control obligatorio Pseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa),fuera de las areas reglamentadas.

Pagina 4 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diagnostico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-OOSversrcn.oz

Servicio Agricola y Ganadero. 2012. Resolucion Exenta del Director Nacional delSAG N° 529, del 30 de enero del 2012, que norma el Sistema Nacional deAutorlzaclon de Terceros.

Servicio Agricola y Ganadero. Reglamento Espedfico para la Autorlzaclon deLaboratorios de Analisis/Ensavos, version vigente.

Donoso, E. 2013. Presentacion "Avances en estudios de epidemiologia de Psa enChile y Tecnlca de Monitoreo en huertos", en el marco del Proyecto FIA"Desarrollo de un modelo de determinacion de riesgo de lnfeccion de labacteriosis del Kiwi causada por Pseudomonas syringae pv. ectinidiee'', TallerTecnico "Sltuaclon actual y estrategias en relaclon a Psa en Chile. 24 de mayo de

2013, Curico ,

• L1oop, P.; Caruso, P.; Cubero, J.; Morente, C.; Lopez, M.M. 1999 A simpleextraction procedure for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plantmaterial by polymerase Cain reaction. J. Microbiol. Meth. 37:23-31.

• Ministry of Agriculture and Forestry (MAF) 2011. Diagnostic Protocol for Detectionof Pseudomonas syringae pv. Actinidiae (Psa) in Leaf Samples. MAF BiosecurityNew Zealand. Protocol Version: 18 March 2011, 16p.

III Rees-George, J.; Vanneste, J.; Cornish, D.; Pushparajah, L; Yu, J.; Templeton, M.;Everett, K. 2010 Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae usingpolymerase chain reaction (PCR) primers based on the 16S-23S rDNAintertranscribed spacer region and comparison with PCR primers based on othergene regions. Plant Pathology 59:453-464.

• Schaad, N.W.; Jones, J.B.; Chun, W. 2001 Laboratory Guide for Identification ofPlant Pathogenic Bacteria Third Edition. APS PRESS. 2001. 373p.

• Takikawa, Y.; Serizawa, S.; Ichikawa, T.; Tsuyumu, S.; Gato, M. 1989Pseudomonas syringae pv. actinidiae pv. Nov.: The Causal Bacterium of Canker ofKiwifruit in Japan. Ann. Phytopath. Soc. Japan. 55:437-444.

3 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Analista

Autortzaclon

Persona designada por el laboratorio autorizado, paradesempefiarse en temas tecnlcos asociados a suactividad y que cumple con el perfil definido por el SAGpara este cargo.

Acto mediante el cual el Servicio autoriza a un terceropara que ejecute una 0 mas actividades en el marco deprogramas oficiales del Servicio, bajo condicionesdefinidas en el Reglamento espedfico de autortzacionde cada actividad.

Pagina 5 de 50

Instructivo Tlknico para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-OOSversion.nz

BPL 0 Buenas Pnlcticas deLaboratorio

Laboratorio Autorizado

PCR 0 Polymerase ChainReaction.

Plantas madres:

Psa

Pss

Servicio/SAG

SISVEG

Buenas Practlcas de Laboratorio. Conjunto de normasreferente a la orqanlzaclon y condiciones sobre las quelos trabajos de laboratorios son planificados,realizados, monitoreados, registrados e informados.

Persona naturai 0 jurfdica reconocida y aprobada por elServicio para ejecutar uno 0 mas anallsls/ensavosdeterminados, en el marco de programas oficiales delSAG, bajo condiciones definidas por el Regiamentoespecifico de autorlzacion de laboratorios deanallsls/ensavos y los correspondientes instructivostecnlcos.

Reaccion en cadena de la polimerasa

Planta a partir de la cual se obtiene material de propaqaclon,previa mente autorizado por el Servicio, para producirplantas de vivero 0 para obtener nuevas plantas.

Pseudomonas syringae pv. actinidiae

Pseudomonas syringae pv. syringae

Servicio Agricola y Ganadero

Sistema de Informacion de Sanidad Vegetal.

4 REQUISITOS PARA LA AUTORIZACION

4.1 Requisitos de personal de laboratorio

EI postulante debe contar con el siguiente personal para las labores de dlaqnostico:

4.1.1 RESPONSABLE TECNICO

EI laboratorio debera designar unja) responsable tecnlco, quien sera la contraparteante el SAG en temas tecnlcos asociados a su actividad como laboratorio autorizado ydebera cumplir con los siguientes requerimientos:

• Poseer titulo profesional otorgado por una entidad reconocida por el Estado,correspondiente a una carrera de las ciencias silvoagrfcolas, bioquimicas,blotecnoloqlcas 0 bloloqicas, de una duraclon equivalente a 10 semestresacadernlcos, como minimo. En caso de titulo obtenido en el extranjero, estedebera estar revalidado sequn procedimiento establecido por el Ministerio deEducacion.

Peqine 6 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diaqnostlco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Codtqo: D-PD-PE-005verston.nz

• Experiencia laboral en el area de laboratorios de ai menos dos (2) afios.

• Tener competencia tecnlca 0 experiencia laboral (de al menos 1 ana)comprobable en dlaqnostlcos de fitopatologia, bacteriologia y/o tecnlcasmoleculares, sequn la metodologia de dlaqnostlco a autorizar.

4,1.2 ANALISTAS

EI laboratorio debera contar con analistas en nurnero adecuado, de acuerdo a lacantidad de anallsls a realizar, quienes deben cumplir el siguiente perfil:

• Contar con titulo profesional 0 tecnlco 0 ser egresado, de una carreracorrespondiente al area bloloqica 0 afin, impartida por una entidad de ansehanzasuperior reconocida por el Estado. En caso de titulo obtenido en el extranjero,este debera estar revalidado sequn procedimiento establecido por el Ministerio deEducaciori.

• Tener competencia tecnlca 0 experiencia laboral (de al menos 6 meses)comprobable en diaqnosttcos de fitopatologia, bacteriologfa y tecnlcasmoleculares, sequn la metodologfa de diaqnostlco a autorizar.

EI laboratorio previendo una eventual ausencia del responsable tecnlco 0 del 0 losanalistas, podra postular a otras personas para que actuen en ausencia del 0 lostitulares, en calidad de subrogante. En tal caso, el laboratorio debera solicitarlo porescrito, presentando al Servicio la docurnentaclon que demuestre que ese personalcum pie con el perfil para desernpefiar el cargo.

4.2 Requisitos del personal para muestreo

EI postulante debera contar con el siguiente personal para las labores de muestreo:

4,2.1 Equipo de Muestreo:

Debera contar con lomas equipos de muestreo, los cuales estaran conformados por a10 menos 2 personas, a saber:

a) Jefe de equipo, qulen debera cumplir con el siguiente perfil:

Poseer titulo profesional otorgado por una entidad reconocida por el Estado 0,

en caso de extranjeros, revalidado sequn procedimiento establecido por elMinisterio de Educaclon, correspondiente a una carrera de alguna de las areasde las Ciencias Agricolas de una duraclon equlvalente a 10 semestresacadernlcos como minimo, en cuva malla curricular se incluya fundamentos defruticultura 0 fruticultura general, entomologfa agricola y fitopatologfaagricola.

Haber aprobado un curso de adiestramiento para postulantes, dictado por elSAG u otra lnstltuclon aceptada por este, en materias referentes a laejecuclon de las actlvidades oficiales comprendidas en este instructivo.

Pagina 7 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-005Versi6n:02

b) Personal de apoyo, que debera cumplir con 10 siguiente:

Poseer titulo profesional/ tecnlco 0 ser egresado de una entidad reconocidapor el Estado 0, en caso de extranjeros, revalidado sequn procedimientoestablecido por ei Ministerio de Educaclon, de una carrera del area agricola.

Haber aprobado un curso de adiestramiento para postulantes, dictado por elSAG u otra instituclon aceptada por este, en materias referentes a laejecuciori de las actividades oficiales comprendidas en este instructivo.

4.3

4.3.1

Requisitos de infraestructura, equipos, materiales y reactivos.

REQUISITOS DE INFRAESTRUCTURA

EI laboratorio debe contar con una infraestructura tal que garantice el correctodesarrollo de la metodologia de anallsls a realizar, disponiendo de areas con suficienteespacio para desarrollar en forma optima las actividades.

En todos los casos debe existir una separaclon efectiva entre las areas vecinas, ya seamediante paneles 0 piezas separadas, en donde se efectuan actividades incompatibles,para evitar contarnlnaclon cruzada.

Las superficies de muros, cielos, pisos y mesones deben ser Iisas, de facll limpieza eimpermeables.

Adernas, dependiendo del tipo de analisls que se solicite autorizaci6n, el laboratoriodebera contar con 10 siguiente: se debera cumplir con los siguientes requisitos:

• Aislamiento y PCR: salas separadas de preparaclon de muestras, lavado yesterlllzaclon, siembra, preparaci6n de muestras (extracclon de ADN), dearnpllficacion ylo electroforesis.

• PCR directo: salas separadas de preparaci6n de muestras (extracclon deADN), de arnpliflcaclon yelectroforesis.

• PCR en tiempo real: salas separadas de preparaclon de muestras (extraccionde ADN) y de ampllflcaclon.

• PCR en tiempo real alternativo: salas separadas de preparaclon de muestras(extracci6n de ADN) y de arnpllficacion,

Respecto del muestreo, debe contar con infraestructura destinada a:

• Disposici6n de equipos 0 instalaciones

• Mantencion de registros documentales

4.3.2 REQUISITOS DE EQUIPAMIENTO

EI laboratorio debe contar con los equipos necesarios, acordes al volumen demuestras, que garanticen el correcto desarrollo de ia metodologia de analisls arealizar. Deben contar con su certificado de mantenci6n Ylo callbracion al dia,

Peqine 8 de 50

Instructivo Tecnlco para el muestreo y diagnostico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-OOSversron.uz

efectuado a 10 menos una vez cada 2 afios por una empresa pertlnente y reconocida enel area.

A contlnuaclon se detalla el equipamiento minimo que se debe considerar:

Sensor de temperatura que permita verificar la temperatura de las muestras almomenta del ingreso, el range de trabajo debe ser de a a 30°C, con una division de1°C Y un error maximo de 0,5°C.

Balanza analitica con una resoluclon de 0,001 gramo.

Estufa de lncubaclon a 28±1°C (solo para aislamiento).

Micropipetas de 10, 100 Y 1000 IJI, 0 equivalente.

Peachimetro.

Agitador rnaqnetlco.

Freezer que alcance temperaturas de -20°C 0 menores.

Refrigerador que alcance una temperatura de 6±2°C.

Conservadora de muestras que alcance una temperatura de 6±2°C.

Autoclave para esterllizaclon de material.

Autoclave para esterillzacion de medios y tampones.

Camara de flujo laminar 0 gabinete de bioseguridad Clase II.

Micro-Centrifuga (hasta 14000 r.p.m.).

Bafio de agua termoregulado.

Agitador de tubos 0 Vortex.

Termociclador para PCR convencional 0 tiempo real.

Fuente de poder (solo PCR convencional).

Camara de electroforesis horizontal (solo PCR convencional).

Transiluminador UV (solo PCR convencional).

Sistema fotogrMico para registro de geles (solo PCR convencional).

Campana extracclon de gases.

Larnpara UV (solo para aislamiento).

Asimismo, para las labores de muestreo se debe contar con 10 siguiente:

Vehfculo adecuado para las labores relacionadas al muestreo.

Computador.

GPS, uno por cada equipo de muestreo.

Equipo e instalaciones de refrlqeraclon de uso exclusivo.

Conservadora de muestras que alcance una temperatura de 6±2°C (de usoexclusivo para terreno).

Pagina 9 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diagnostico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco



4.3.3 REQUISITOS DE MATERIALES y REACTIVOS

EI laboratorio debe contar con los materiales, reactivos necesarios y materiai dereferencia acordes al volumen de muestras (stock suficiente para ios anallsls de latemporada) y que garanticen el correcto desarrollo de la tecnlca de anallsls a realizar.

A contlnuaclon se detallan los materiales, reactivos y medios de cultivo que se debenconsiderar como minimo:

Generales de laboratorio:

o Boisas plastices de polietileno transparentes, selladas de fondo, de 200 micrasde densidad.

o Etanol 95%.

o Hipoclorito de sodio.

o Agua destilada.

o Controles positivos de referencia.

o Puntas para micropipetas con y sin filtro.

Especificas segun tecnlca diagnostica:

a. Aislamiento:

o Placas de 90 mm. de dlarnetro (plastlcas 0 de vidrio Petri).

o Tampon AFT.

o Medio de Cultivo B de King

o Medio de Cultivo CSGA.

o Reactivos y materiaies para pruebas LOPAT.

o Reactivo oxidasa.

o Papel filtro.

o Rastrillo siembra.

o Mechero.

o Tubos de ensayo con tapa.

o Asa de platino.

o Bistu ri.

o Hojas de bisturi.

o Guantes de latex.

b. peR convencional:

o Isopropanol.

o Tampon extracclon ADN (Anexo N° 9.2).

Pagina 10 de 50



Codlqo: D-PD-PE-OOSverstcruoz

o 10 X Buffer PCR.

o Cloruro de Magnesio (MgCIz).

o dNTP·s.

o Taq polimersa platinum 0 similar.

o Partidores especificos.

o Tubos de PCR de 0.2mL libres de nucleasas.

o Tubes eppendorf de 1.5mL libres de nucleasas.

o Agua Libre de nucleasas.

o Marcador de peso molecular 50 y 100pb.

o Buffer TAE (Tris- acetato-EDTA).

o Bromuro de Etidio (10 rnq/rnl) 0 Gel red.

o Agarosa grado moiecular.

c. PCR en tiempo real:

o Eva Green reaction mix 0 similar.

o Agua libre de nucleasas.

o BSA.

o Tampon CTAB.

o Tampon InviMag Plant DNA.

o Partido res especificos.

d. PCR en tiernpo real alternativos:

o Debe ser presentado al SAG para su verificaclon. A la fecha de entrega de esteinstructivo solo ha sido veriflcado el kit completo (extraccion y arnpllflcaclon) DNature.

Muestreo:

Se debe contar con los sigulentes materiales para el muestreo, como mlnimo:

o Boisas plastlcas 25 X 15 cm.

o Boisas plastlcas 50 X 75 ern.

o Plurnon permanente.

o Papel absorbente.

o Corchetera / corchetes.

o Caja conservadora.

o Ice pack activos (congelados).

Peqine 11 de 50

Instructivo Tlf!cnico para el muestreo y dlaqnostico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Codlqo: D-PD-PE-OOSVersion:02

• Cinta de papel engomada de 1 em. de ancho a 10 menos.

• Desinfectante de herramientas (cloro, alcohol, permanganato de potasio, etc.).

• Serrucho.

• Tljera de podar.

4.4 Requisitos Especificos.

A esta autorlzaclon podran postular los terceros que deseen ejecutar dlrectamente laslabores relaclonadas con el proceso de muestreo y dlaqnostico, en el marco del ControlObllgatorlo de Psa, debiendo cumplir con los siguientes requisitos especificos:

- EI laboratorio debe contar con un sistema de qestlon de calidad 0 aseguramiento decalidad implementado basado en buenas practlcas de laboratorio. En este sentido,debe contar con un manual de procedimientos que describa en forma detallada elproceso de anallsls, el manejo de los controles, el manejo de las contramuestras, lapreparacion de las soluciones y la ellrnlnaclon de residuos.

Sin perjuicio de 10 anterior, el laboratorio tarnblen debera contar con losprocedimientos que consideren la metodologia a autorizar, indicada en el numeral5.4 de este instructivo.

- EI laboratorio debera contar con timbres en que consigne el nombre del laboratoriopara ser utilizados en el marco de la autorlzaclon,

- Respecto de las labores relacionadas con el proceso de muestreo (toma,conservacion, almacenamiento, envio y entrega de las muestras al laboratorio),deberan seguir las actividades descritas en el Anexo 9.1 del presente instructivo.

4.5 Medios de verlflcaclon de requisitos.

De acuerdo a 10 dispuesto en el Reglamento especifico para la autorlzacion delaboratorios de anallsls/ensavos, los interesados en autorizarse para realizar eldlaqnostico de Pseudomonas syringae pv. actinidiae, en el marco del control oficial deesta plaga, deben presentar, junto a la solicitud de autortzaclon, los documentosque a contlnuaclon se detallan y que dan cuenta del cumplimiento de los requisitosestablecidos por el SAG:

1. Los antecedentes generales del laboratorio que se establecen en el numeral 6.1del Reglamento especifico para la autorlzaclon de laboratorios deanalisis/ensavos.

2. Croquis del laboratorio, identificando usa de areas y ubicacion de equipos.

3. Lista de equipos, indicando nombre, marca, modelo, fecha de puesta en servicio ycapacidad cuando corresponda.

4. Lista de materiales, reactivos y material de referencia requeridos tanto para eldlaqnostlco como el muestreo.

5. Formulario de identlflcaclcn del responsable tecnlco, sequn formate establecidoen el Anexo 2 del Reglamento especifico para la autorlzacion de laboratorios deanallsls/ensavcs.

Pagina 12 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diaqnosttco dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


Codigo: D-PD-PE-OOSVersion ;02

6. Formularlo de ldentltlceclon de analistas y personal de ios equipos de muestreo,sequn Formato establecido en el formuiario F-PD-PE-023 de este instructivo.

7. Certificado de titulo del responsabie tecnlco Identlficado en el formulariorespectivo, en original 0 fotocopia legalizada.

8. Certlficado de titulo 0 de egreso de los/las analistas identlficados en el formulariorespectlvo, en original 0 fotocopia legallzada.

9. Documentos que garanticen la competencla tecnica y/o experiencia laboral del/Iaresponsable tecnlco en las areas de fitopatologia, bacteriologia y/o tecnlcasmoieculares sequn corresponda.

10. Documentos que acredlten la competencla tecnlca y/o experiencia laboral delos/las analistas en las areas de fitopatologia, bacterlologia y/o tecnlcasmoleculares sequn corresponda.

11. Manual de procedimientos de acuerdo a 10 sefialado en el numeral 4.4 de esteinstructlvo.

Sin perjuicio de 10 anterior, el cumpllmiento de los requisltos descritos tanto en elReglamento especiflco de autortzaclon como en este instructlvo, seran conflrmados porel Serviclo en la visita de verlflcaclon. Aslmlsmo, en la visita de verlflcacion, el SAGsollcltara al postulante, el anallsls de muestras control, mediante la ejecuclon de la 0

las tecnicats) solicltadas a autorizar ya sea por parte del responsable tecnlco 0 de unoo mas analistas del laboratorio, sequn determine el verlficador.

5 ANAlISI5/ENSAYO

5.1 Condiciones previas para el muestreo

Todos los cuarteles de kiwi que se muestreen deben georreferenciarse tomando iacoordenada de una punta (x,y) en el centro del cuartel, mediante GPS,correspondiente a la coordenada este y norte, y deberan expresarse en unidades UTM,Indicando el Huso en el que fue capturado.

En el ingreso a huertos y viveros de kiwi, deberan adoptarse las medidas de profilaxisy seguridad necesarlas para mltigar el riesgo de dispersion de ia piaga.

5.1.1 Condiciones previas para muestreo de plantas madres

EI viverista debe realizar una declaraclon de plantas mad res de kiwi a muestrear, amas tardar el 30 de septiembre de cada afio. Dlcha declaracion debe ser presentadapor un medio escrito (via correo electronlco, fax u otro), en la Oflcina SAG sectorial encuya jurlsdlcclon se ubica ia oflcina comercial de la empresa, Informando adernas, eilaboratorio autorizado que tornara las muestras y reallzara los anal isiscorrespondientes. Este aviso debera enviarlo a la Oficina SAG correspondiente a laublcacion de las plantas mad res, utillzando el formulario de declaracion, anexado aeste instructivo, y debera ser firmado tanto por los propletarios 0 representantes delvlvero como del iaboratorio autorizado. Se debera completer un formulario por cadaiaboratorio autorizado que el viverista eiija para ei muestreo y dlaqnostico de Psa y porcada predio donde se encuentren las plantas mad res.

Pagina 13 de 50



Codtqc: D-PD-PE-DDSVersi6n:02

5.1.2 Condiciones previas para el muestreo de huertos

EI particular que desee conocer la sltuaclon fitosanitaria de un huerto y obtener unresultado oflclal sobre Pseudomonas syringae pv. actinidiae, debera contratar losservicios, para el muestreo y el dlaqnostlco, de un laboratorio autorizado por elServicio, los que tendran un caracter oficial si se realizan bajo los parametresestablecidos en este instructivo.

Cabe destacar que la informacion de los resultados obtenidos por un muestreo oficialdeben ser puestos en conocimiento inmediato al Servicio, sea cual sea su resultado.

Los resultados negativos a Psa, en muestras provenientes de huertos de kiwi, no serancondlcion suficiente para permitir la rnultipllcaclon de taies plantas, si es que estas nofueron declaradas para tal uso y muestreados bajo los estandares establecidos paraeste tipo de plantas.

5.1.3 rncorporacton del laboratorio autorizado como usuario del Sistema dede informacion de Sanidad Vegetal (SISVEG)

EI SAG incorporara en el SISVEG u en otro sistema lnforrnatlco que el SAG determine,al laboratorio autorizado y Ie proporclonara nombres de usuarios y contrasefias para lagest'lon del ingreso y seguimiento de las muestras y para el ingreso y autorlzaclon delos diaqnostlcos.

5.2 captaclon y envio de muestras

5.2.1 Muestras de plantas madres de kiwi

Las plantas postulantes a plantas mad res se presentan con el fin de propagar 0

multiplicar el material vegetal, si los resultados obtenidos son negativos a Psa.

EI muestreo en plantas mad res sera realizado por el laboratorio autorizado, de acuerdoa los procedimientos establecidos e instruidos por el Servicio, por 10 tanto es unaactividad de competencia de los laboratorios autorizados en esta categoria.

En el caso de declarar un cuartel 0 huerto completo, se debe muestrear de acuerdo a10 descrito en el Anexo 9.1 del presente instructivo.

5.2.2 Muestras de huertos para conocer sltuacion fitosanitaria

EI muestreo oficial para conocer la condlcion fitosanitaria respecto de Psa, serarealizado por el 0 los equipos de muestreo del laboratorio autorizado, cumpliendo lascondiciones y procedimientos establecidos por el SAG, por 10 tanto es una actividad decompetencia de los laboratorios autorizados en esta categoria.

a. Huertos con sintomas:

Las muestras deben colectarse de plantas con sintomatologia. Se deben enviar alaboratorio los siguientes orqanos vegetales:

Pagina 14 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco



Follaje, con sfntomas de puntuaciones necrotlcas rodeadas de halo clorotlco, enbrotes de 30 em. Con un numero de entre 10 y 15 hojas, de un mismo arbcl.

Madera, con zona de avance de ataque bacteria no, exudaclon rojiza en maderay/o presencia de cancros, ramas entre 40 y 60 em. considerando 2 a 4 ramaspor muestra, de un mismo arbol,

Cada organa vegetal constituye una muestra independiente y se lnqresare al SISVEG 0

al sistema inforrnatico vigente, bajo un mismo folio, con distintos nurneros correlativosde muestras.

Las muestras de madera deben ser puestas en bolsas de plastlco y las de foliaje debenser envueltas en papel absorbente, previa mente, antes de colocar en las bolsas. Todasias muestras deben ser identificadas con el codiqo de barras que antreqara el SISVEGal momento de ingresar la muestra en ei sistema.

Las plantas muestreadas deberan ser identificadas con pintura indeleble 0 indicar elnumero de hilera y pianta, en los documentos de muestreo.

b. Huertos sin sintomas:

Si el cuartel es hornoqeneo en manejo aqronornlco, de una misma especie y variedad,se deberan colectar muestras al azar, slguiendo un recorrldo en zigzag, esto esavanzando en diagonal entre las hileras del cuartel, y se debera colectar muestrascada 3 plantas. En una unidad hornoqenea de aproximadamente 4 ha. se requieretomar muestras de al menos 10 plantas, para determlnar la presencia de 1 plantapositiva a Psa (Donoso, 2013).

La cantidad de muestras a colectar, sequn la superflcie de los cuarteles se indica en lasiguiente tabla:

Tabla 1: Muestreo en huertos aslntcrnatlcos.

Superflcie del cuartel (hal N° plantas muestras< 1 3

1,1 - 2 5 52,5 - 4 5 10

4,5 - 10 15

Para cuarteles con superficie superior a 10 ha. se debera subdividir en lotes menores 0

igual a 10 ha. y aplicar la tabla anterior.

Cada muestra debe estar compuesta 10-15 hojas por planta, mas 2 trozos de madera,uno de cada braze, esto hasta completar las muestras requeridas por cuartel. Cadaplanta muestreada debera ser identificada con pintura indeleble 0 indlcar el nurnero dehilera y planta, en los documentos de muestreo.

Las plantas muestreadas deberan ser identificadas con pintura indeleble 0 indicar elnurnero de hilera y planta, en los documentos de muestreo.

Peqme 15 de 50

Instructivo Tti!cnico para el muestreo y dlaqnostlco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Ccdiqo: D-PD-PE-OOSverstcn.uz

5.2.3 Envio de muestras

EI despacho de la(s) muestra(s) sera de responsabilidad del laboratorio autorizado acargo del muestreo. Sin perjuicio de 10 anterior, podra utilizar los servicios de unaempresa de transporte de encomiendas 0 courier reconocida a nivel nacional yestablecida legalmente y que garantice el envio en el tiempo y las condiciones detemperatura adecuados (rnantenclon de cadena de frio de ser necesario), sequn losrequerimientos especificos establecidos en el presente instructivo.

EI laboratorio autorizado debera ingresar, recepcionar e informar los resultados de losanallsis de las muestras, las cuales seran identificadas con un codlqo de barras, alingresar muestras en el SISVEG 0 el sistema de qestlon de muestras y resultadosvigente, indicando el afio-follo-correlatlvo.

5.3 Recepcion de la muestra y manejo de la muestra/contramuestra

5.3.1 Recepcion de la muestra

EI laboratorio debera verificar al momenta del ingreso de la muestra, que esta seencuentre en condiciones adecuadas de embalaje y que el tiempo entre el muestreo yla recepclon en el laboratorio sea menor 0 igual a 7Z horas.

Posteriormente, el responsable tecnlco debera evaluar la aptitud de la muestra para elanalisis, conslderandose como muestra apta, aquella que no presenta signos evidentesde deshldrataclon y/o descornposlcion, adernas de ser representativa en cantidad ytarnafio.

Si la muestra presenta condiciones de embalaje inadecuadas 0 no apta para anallsls,esta debe ser rechazada.

Una vez que el laboratorio autorizado ha verificado 10 anterior y considerado que la(s)muestra(s) son apta(s) para su anallsls, debe aceptarlas lnqresandolas al sistemaSISVEG en el modulo laboratorlo/recepclon de muestras.

Las muestras deberan ser conservadas, hasta el momenta del anal isis, a unatemperatura de 6±Z°C.

5.3.2 Manejo de la contramuestra

EI laboratorio autorizado debera mantener al menos Z tubes (1,5 0 Z ml) con tejido dela muestra, macerado en tampon de extracclon, por al rnenos 6 meses, luego delanallsls. Esta conservaclon debera reaiizarse a una temperatura de -ZO±Z°c. Adernas,para las muestras positivas se debera conservar tejido sin macerar y sin buffer, a-zooe durante, al menos 3 meses posteriores a la recepclcn de la muestra.

Adernas, para el caso de autorlzacion mediante la tecnlca aislamiento, se deberamantener un cepario en forma indefinida, tanto para las muestras positivas a Psa comoa Pss.

Pagina 16 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diaqnoatlco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco



5.4 Metodologia.

Para determinar la ausencia 0 presencia de Psa se procedera a desarrollar una 0 masmetodologias de analtsls, de acuerdo a la tecnlca autorizada, las cuales se describen enel Anexo 9.2.

EI material vegetal no utilizado en el anallsls se debe guardar como contramuestra a6±2°C.

5.5 calculo y Expresion de Resultados

EI calculo y expreslon de resultados para las metodologias de dlaqnostlco, y loslineamientos para considerar una muestra positiva 0 negativa a Psa, estan indicadosen el Anexo 9.2. del presente instructivo.

5.6 Esterilizacion y ellminaclon de material de desecho

Todo material utilizado en las diferentes eta pas de la metodologia de diaqnostlco debeser esterilizado mediante autoclavado. EI material que no se pueda reutilizar, debe serautoclavado y desechado en bolsas clara mente identificadas, para su posteriorinclneracion.

EI material vegetal, suelo y/o sustrato de desecho, tarnblen debe ser autoclavado ydesechado en bolsas c1aramente identlficadas, para su posterior lnclneracton.

5.7 Variacion de la metodologia

En el caso de utilizar reactivos diferentes a los indicados en los procedimientos deanallsis definidos en el numeral 5.4 del presente instructivo, estes quedaran sujetos ala evaluaclon por parte del Servicio.

No obstante 10 anterior, los laboratorios podran presentar para la evaluacion, por partedel Servicio, otras metodologias 0 variantes de las indicadas en este instructivo, lasque una vez aprobadas podran ser implementadas por los laboratorios autorizados.

6 REGISTRO Y ENVio DE LOS RESULTADOS

Los resultados obtenidos del anallsls de muestras tanto procedentes de viveros comohuertos de kiwi, deberan ser ingresados al sistema de informacion de sanidad vegetalSISVEG u otro, en un plazo maximo de 15 dias hablles, desde la fecha de recepcion dela(s) muestra(s) por parte del laboratorio autorizado.

Cualquier atraso en el tiempo de respuesta, debera ser informado por el responsabletecnlco del laboratorio autorizado, con 24 horas de anticipaclon a la fecha limite derespuesta, via correo electronlco, FAX u otro, al Encargado de Supervision SAG de eselaboratorio.

La autortzaclon de resultados, en el sistema, sera por parte del responsable tecnlcc,quien los dejara disponibles para el sistema en caso de ser negativos, 0 en calidad deReservados, en caso de ser posltlvos a Psa.

Pagina 17 de 50



Codlqo: D-PD-PE-OOSVersion:02

Los informes fitosanitarios con muestras negativas a Psa pueden ser impresos 0

almacenados como archivo digital y ser enviados al usuario que contrato el servicio.

Los informes fitosanitarios con muestras posltivas a Psa deben ser informados en unplazo maximo de 24 hrs, via correo electronico, FAX u otro, al Encargado deSupervision SAG de ese laboratorio. Estos Informes tienen el caracter de confidencialentre el laboratorio autorizado y el SAG y no pueden ser impresos 0 aimacenadoscomo archivo digital, y tampoco pueden ser enviados 0 informados al usuario de lasmuestras. En caso de no respetarse 10 anterior, sin previa autcrlzaclon del Servicio,sera considerado como una no conformidad critica y causal de suspension inmediata dela autorlzaclon,

7 SUPERVISION DE LOS LABORATORIOS AUTORIZADOS

Todo laboratorio autorizado sera supervisado mediante visitas, al menos una vez alafio. Sin embargo, debera estar dispuesto a recibir supervisiones adicionales, encualquler momento. Asimismo, podra recibir supervisiones del personal del SAG deRegiones 0 del Nivel Central, durante la ejecucion del muestreo, al menos 1 vez porOficina SAG, en cuya jurisdlcclon se encuentre el predio muestreado.

EI Encargado de Supervision SAG del laboratorio autorizado, podra solicitar a esteultimo, en cualquier momento, el envio de contramuestras, ya sea ADN y/o cepas,para ser analizados oficialmente por el SAG. En el caso de no haber concordancia conlos resultados, se proqrarnara una visita de supervision para verificar la conducclon delensayo.

EI Encargado de Supervision SAG del laboratorio autorizado, podra solicitar a esteultimo, en cualquier momento, analizar un set de muestras, tanto positivas comonegativas a Psa, para verificar la conduccion del ensayo.

Si producto de las acciones de supervision, el Departamento de Laboratorios yEstaciones Cuarentenarias 0 el personal del SAG que supervise las actividades demuestreo, detectan faltas en el desempefio del Laboratorio Autorizado, el SAG, deconformidad con 10 dispuesto en la cleusula sexta del correspondiente convenio deautorlzaclon, podra instruir al Laboratorio Autorizado, mediante una carta suscrita porel/la Jefa del Departamento Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias 0 un Director/aRegional 0 un Jete/a de Oficina, el cese inmediato de prestaciones de serviciosejecutados en el alcance de su autorlzaclon.

8 OBLIGACIONES

Sin perjuicio de las obligaciones estipuladas en el capitulo VII del Reglamentoespedfico de autortzaclcn de laboratorlos de anallsls/ensavos, el laboratorio autorizadodebera cumplir con 10 siguiente:

- No podra ejercer como laboratorio autorizado cuando el representante legal, socios,directores, accionistas, gerentes, responsable tecnlco 0 analistas tengan un lnteresdirecto con la activldad para la cual el laboratorio esta postulando u otras quedetermine el Servicio.

Pagina 18 de 50

Instructivo Tecnlco para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


Ccdtqo: D-PD-PE-OOSVersion :02

9 ANEXOS

9.1 MUESTREO PLANTAS MADRES KIWI

9.1.1 Periodo de muestreo

EI muestreo de plantas mad res debe realizarse desde el 1 de septiembre hasta el 30de noviembre. Se podra conslderar una epoca diferente para muestreo, si las tecnlcasde dlaqnostlco vigentes y las estructuras vegetales disponibles, permiten lograr undlaqnostlco confiable y previa autorlzaclon de la declaraclon de muestreo.

9.1.2 Proceso de muestreo

EI viverista debera declarar a la Oficina SAG correspondiente a la jurlsdlcclon delvivero, el nurnero y ublcaclon de las plantas madres a muestrear, mediante unformulario de declaraclon de plantas madres para multiplicar plantas de kiwi,sequn Formato establecido en el anexo 9.3.3.

Esta informacion debe ser enviada por fax/correo electronlco con fecha limite el 30de septiembre del afio a muestrear.

No se podra iniciar el muestreo, si la declaracion no ha sido autorizada por el Servicio.

9.1.3 Condiciones del muestreo de plantas 0 cuarteles madres de kiwi

• En el cuartel 0 huerto

EI cuartel 0 huerto debera estar con todas las condiciones que permitanrealizar las iabores asociadas al proceso de muestreo, permitiendo el Iibredesplazamiento del equipo muestreador, asi como un acceso integral a laplanta que sera sometida a muestreo, de manera de facllitar suldentiflcaclon, marcaje y extracclon de la muestra de acuerdo a lasdisposiciones establecidas por el SAG.

No se debera ingresar a un cuartel en el cuai se esten realizandoaplicaciones de plaguicidas 0 se encuentre sin cumplir el periodo de reingresode estos .

• En la planta(s) madre(s)

Debe estar incluida en la declaracion de muestreo.

Debe corresponder a la especie, variedad (si esta informacion se encuentraincluida en la declaracion) y ubicacion, indicada en la declaraclon demuestreo.

Pagina 19 de 50



Codiqo: D-PD-PE-005Version :02

Debe estar libre de problemas fitosanitarios evidentes que puedan sertransmitidos por material de propagaci6n, adernas de NO mostrarsintomatologfa sospechosa a bacteriosis.

Debe disponer del crecimiento vegetativo suficiente para conformar lamuestra.

• En la muestraDebe estar libre de problemas fitosanitarios (artr6podos, hongos, u otros).

9.1.4 Especificaciones sobre las muestras

Para la realizaci6n del muestreo en cada planta, se debera proceder en primerlugar, a detectar sfntomas asociados a bacteriosis; si estes se encuentran presentes,no se debe efectuar el muestreo y el viverista debera considerar el muestreo de otrocuartel, huerto 0 planta sequn sea el caso; de 10 contrario, sl las plantas nopresentan sintomas, se debera colectar una muestra aslntomatlca, en nurnero deacuerdo a 10 indicado en Tabla 2.

TABLA 2: Muestreo en plantas madres

N° DE PLANTAS DECLARADAS % DE PLANTAS A MUESTREAR

1-10 100

11-100 20

101-1000 5

Mas de 1000 2 (de cada cuartel, en el caso de habermas de dos en un mismo huerto)

9.1.5 Plantas con sintomatologia a bacteriosis

Los sintomas asoclados a bacteriosis deberan ser verificados en todos los 6rganosvegetales susceptibles de ser afectados (si se encuentran presentes al momenta delmuestreo), las cuales constituyen una causal de rechazo de las plantasdeclaradas para muestreo.

• Manchas angulares con halo cior6tico en hojas.• Dafio en brazos junto con exudaclones rojlzas• Atizonado de botones y flares.

Pagina 20 de 50




9.1.6 Plantas sin sintomatologia de bacteriosis

Atendiendo al tipo de especie a muestrear, se captara el siguiente tipo de materialvegetal, en ausencia de sintomas asoclados a Psa:

• 10-15 hojas completamente expandidas, en ramillas que tengan algo demadera del afio anterior (tejido vascular).

• EI tejido colectado debera presentar crecimiento activo y sin signos desenescencia.

• Colectadas alrededor de la canopia del arbol, tornandose de la zona media einterior de cada rama de este.

9.1.7 Muestra compuesta

La muestra que se envle al laboratorio estara constituida de tres submuestras dediferentes plantas, la cual correspondera a tres submuestras de igual tipo de organa(ramilla con hojas).

9.1.8 Identificacion de las plantas madres

La(s) Planta(s) Madre(s), que hayan sido muestreadas, deberan ser marcadas conpintura indeleble ubicada en el eje central de la planta a una altura minima de 20em. La marca debera rodear toda la circunferencia del eje central de la planta ydebera ser de una dimension que permita la facil ldentiflcaclon de la plantamuestreada.

9.1.9 Envio de Muestras al Laboratorio

• Identificacion: Indicar localidad, empresa, nombre predio, cuartel, hilera ynumero de planta de hllera; Indicar adernas las coordenadas en UTM.

• Envases: EI envase ideal es una bolsa plastics cerrable (ziploc 0 similar), contoalla de papel, no debe quedar agua Iibre dentro de la bolsa.

• Ingreso de muestras al SISVEG: EI laboratorio autorizado creara en elSistema computacional SISVEG un folio por cada sitio muestreado, y unnurnero correlativo par cada muestra, la cual esta compuesta por tressubmuestras que provienen de 3 plantas mad res y son tomadas del mismositio. Las muestras deben indicar la especie y variedad espedfica de kiwi quecorresponda, as! como tarnbien deben indicar la plaga espedfica Pseudomonassyringae pv. actinidiae.

• Condiciones de almacenamiento y despacho: Las muestras debenalmacenarse en frio hasta su anallsis, manteniendo temperaturas de entrero-c y 4°C, sin congelar.

Pagina 21 de 50

Instructivo Tlf!cnico para el muestreo y dlaqnosttco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


c6digo: D-PD-PE-OOSVersion :02

9.1.10 Registro de la informacion

EI laboratorio autorizado debera enviar un Programa de Toma de Muestras a cadaregion, con al rnenos 5 dias habiles de antlcipaclon a la toma de muestras, y deberaactualizarlo cada vez que se produzcan cam bios e informarlo con al rnenos 1 dia habllde anticipacion utilizando el formulario establecido en el anexo 9.3.4 del presenteinstructivo. Este registro debera enviarse en forma electronlca al Encargado(a)Regional Agricola y Forestal del Servicio Agricola y Ganadero, en cuya jurisdlccion seencuentren ubicadas las plantas que seran objeto de muestreo. Adernas, debera sereste registro debera ser mantenido en forma documental, en las dependencias deltercero autorizado y debera estar disponible para las supervisiones que realicen losinspectores(as) del Servicio.

Por otra parte, la informacion sobre la ldentlflcacicn de las muestras (folios) paraproceso en laboratorio, debe consignarse en la Declaraclon de Muestreo plantasmad res, sequn formato establecido en el anexo 9.3.3 del presente instructivo.

Los muestreos realizados semanalmente deben ser informados (via fax 0 electronica)a la(s) Oficina(s) SAG en cuya(s) jurtsdlcctonres) se hayan realizado los muestreos,con copia al/la coordinador/a nacional del Programa.

Los registros seran: la Declaraclon de muestreo plantas madres (anexo 9.3.3) yel resumen de muestreo de la temporada, que debera elaborar cada laboratorio,con un formato a convenir con el Servicio.

Pagina 22 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diagnostico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


Codiqo: D-PD-PE-OOSverston.oz

9.2 METODOlOGIA DE DIAGNOSTICO

9.2.1 Esquema Analisis

EI esquema de analisls, tanto para muestras con 0 sin sintomas, de acuerdo a lametodologia a autorizar, es el siguiente:

a) Aislamiento y PCR:

ExtraccionADN

PCRF1/R2

Cultivospuros de colonias

sospechosas

AislamientoKing B

Muestrahoja 0 madera ~

PCR Presencia Genes <2><Ill- Constitutivos cts y gyrB

'----..--------' '--_y_E_fe_c_t_o_r_e_s_h_r_p_K_1_--..J..... (+ ) ....

!Interpretacion resultados

Psa y PssPruebaslOPAT

Pagina 23 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnosfico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Codlqo: D-PD-PE-DDSVersi6n:02

b) PCR directo:

Muestra Extraccionhoja 0 madera ADN

PCRFl/R2

(+)

Interpretacion resultados .-....l IPsa ~ l Secuenciacion +- PCR presencia genes

constitutivos cts y gyrBy efectores hrpKl

c) PCR en tiempo real:

I

Muestra Extraccion Amplificacion (+)hoja 0 madera ADN Fl/R2

nterpretaclon resultadosPCR presencia genes...-1 Secuenciacion I+- constitutivos cts y gyrB

Psa y efectores hrpKl

d) PCR en tiempo real alternativo:

estra ......... Extraccion Amplificacionmadera ADN Kit

Interpretacion ResultadosPsa-V (+)

Muhoja 0

Pagina 24 de 50


del control oficial de la pJaga en kiwi

e6digo: D-PD-PE-005Versi6n:02

9.2.2 Toma submuestra a anaJizar

a) Muestras con sintomas

Se analtzaran ias muestras de acuerdo a su sintomatologia en forma separada y sequnel material vegetal a anallzar (brotes herbaceos, hojas a tejido lefioso).

Para el caso de brotes herbaceos y tejido lefioso, se tornaran seceiones de tejldos apartir de la zona de avance de la lesion. Para el caso de las hojas, se tornaran lasmanchas foliares completas, privilegiando las manchas incipientes.

Las secciones tomadas de los distintos tipos de tejidos se colocan en las balsasplastlcas de polietileno transparente y se identifican can el correlativo de la muestra yel tipo de tejido tomado.

b) Muestras sin sintomas

Si se requiere analizar posible presencia de infeccion latente de Psa, las muestras setornaran en forma separada de acuerdo al material a analizar (brotes herbaceos, tejidolefioso a yemas)

En el caso de brotes herbaceos a tejido lefiosc, se tornaran secciones transversales deaproximadamente 0,5 cm de ancho, siempre y cuando estes tejidos no tengan mas de1 em de dlarnetro, pudiendo agrupar a no trozos de distintas seeciones de la planta. Encaso de tejido can mas de 1 cm de diametro se tornaran secciones longitudinales dehasta 1,5 cm de largo, considerando dentro del corte principalmente el tejidoxilernatlco. Finalmente, en el caso de yemas, la cantidad a tamar del brote a tejidolefioso, debe ser representativa de la muestra.

Los distintos tipos de tejidos se colocan en balsas plastlcas de polietileno transparente,acordes al tamafio de la muestra, y se identiAcan can el correlativo de ia muestra y eltipo de tejido tomado.

9.2.3 AisJamiento y peR

a) Aislamiento

• Desinfectar en forma superficial los trozos de tejido, en hipoclorito de sodio al 1%de soluclon eomercial par 1 minuto. No se incluyen en esta etapa las flores, dada laposibilidad de deqradaclon del tejido.

• Enjuagar los trozos 2-3 veces en agua destilada esterll.

• Dilaeerar a machacar las muestras y agregar dos veces el peso de la muestra detampon AFT.

• Mantener en hielo y aqitaclon par 20 a 45 minutos.

• Las muestras seran sembradas en duplieado en el media de cultivo B de I<ingmediante diluclon, utilizando para la siembra ias diluciones -1, -2 Y -3. Para ella,

Pagina 25 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diaqnosfico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Codlqo: D-PD-PE-OOSVersi6n:02

se agrega mediante micropipeta 100 ~I de diluci6n y se dispersa homoqenearnentedentro de la placa con rastrillo de siembra.

• Las placas se identifican e incuban a 25-27°C por 48 a 72 horas.• Revisar los aislamientos y verificar la presencia 0 ausencia de colonias sospechosas

a Psa 0 Pss.

b) Preparaclon de cultivos purosA partir de las colonias de crecimiento caracterfstlco de Psa 0 Pss, obtenidas en elpunto anterior, se procede a realizar cultivos puros con el fin de multiplicar la bacteria.Estos cultivos puros se utlllzaran en las pruebas complementarias.

Los pasos a seguir para realizar cultivos puros son:

• Seleccionar colonias sospechosas.• Traspasar las colonias sospechosas a medio B de King y CSGA.• Incubar a 28±2°C por 24 horas.

c) Extraccion de ADN a partir de colonias• Colocar 1 ml de agua destilada en un vial y agregar asadas del cultivo puro en

medio King B.• Calentar durante 4 minutos a 100°C y colocar inmediatamente en hielo.• Almacenar a 5±2°C.

d) peR• La amplificaci6n del ADN se realiza utilizando el par de primers PsaF1 (TIT TGC TIT

GCA CAC CCG ATT TT) Y PsaR2 (CAC GCA CCC TTC AAT CAG GAT G).• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):

Agua Mq 12,7

dNTPs 10mM 0,5

Buffer lax 2,5

MgCI250mM 1,5

Primer PsaF1 10pmol 1,25

Primer PsaR2 10pmol 1,25

Taq platinum 0,3

Muestra 5

• La mezcla se prepara considerando el volumen por tuba y la cantidad de muestrasy controles a amplificar.

Peqme 26 de 50


del control aficial de la plaga en kiwi

Codiqo: D-PD-PE-OOSVersi6n:02

• Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de ampliflcacion se debeincorporar un control negativo blanco (control aqua), un control negativo de Pss yun control positivo de Psa.

• Realizar la arnpllflcacion de acuerdo a los siguientes cicios:

95°C 2 min

95°C 30seg }65°C 30seg 30 cicios

72°C 30seg

noc 5 min

• Proceder a realizar la electroforesis, con el fin de visualizar si hubo arnpllftcaclon demuestras y controles.

• Preparar el gel de electroforesis disolvlendo, en tampon TAE, agarosa al 2% yagregando gel red a una concentraclon aproximada de 0,005%.

• Tomar 5 a 10 J.l1 de cada tubo ampllficado y mezciar con tampon de carga.• Cargar en cada bolsillo del gelS a 10 J.l1 de la mezcia obtenida en el punto anterior.• Tomar aproximadamente 2 J.l1 de marcador de peso molecular 50 bp Y mezclar con

tampon de carga. Cargar esta mezcla en el gel.• Proceder a correr el gel a 80 0 mas Volts. Observar bajo luz UV la presencia de

bandas luminosas y obtener registro fotogrMico.• 5e debe examinar el control negativo, el cual no debera presentar bandas. 5i hay

presencia de bandas de arnpllflcacion se debe repetir el proceso de arnpllftcaclon.• Comparar el marcador molecular con ia posicion de la banda obtenlda por el control

positivo. 51 no hay presencia de banda de arnpllftcacion de 280 bp se debe repetirel proceso de ampliftcaclon.

• Una vez verificados los controles se observa en los carriles de las muestras lapresencia 0 ausencla de bandas de arnpllflcaclon de 280 bp.

• La presencia de banda determina el PCR posltivo, sin ser necesariamente lamuestra positiva a Psa.

• Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando elregistro fotogrMico.

• 5e puede utilizar como alternatlva PCR en tiempo real con los mismos partidores.

e) Pruebas LOPAT

Levana• Traspasar los cultlvos puros a medio de cultivo 5NA e incubar a 28±2°C por 24

horas.• Observar crecimiento bacteria no. 5e considera levano positivo cuando el

creclmiento bacteria no es de color blanco perla, brillante, mucoide y abombado.

Oxidasa• Colocar en un papel flltro unas gotas de reactivo oxldasa (N-N dimetil

parafenilendiamino al 1% en agua destilada, guardada en Frasco opaco a 5°C).

Pagina 27 de 50




• Frotar un asa de platino cargada de cultivo bacteria no.• Reacclon positiva: aparicion de un color purpura en 10 segundos. Si se produce

entre 10 y 30 segundos la reacclon es positiva debil.• Reacclon negativa: color inaiterado despues de 30 segundos.

Pudricion en papa• Tomar un tuberculo de papa y desinfectar con hipoclorito de sodio al 1%.• Colocar papel absorbente en una bandeja con tapa y humedecer. Luego colocar en

la bandeja tapas de placas Petri.• Cortar el tuberculo en los extremos y luego en la mitad.• Colocar la mitad del tuberculo en la placa Petri y sacar un trozo de tejido mediante

sacabocado y agregar 1ml de suspension bacteriana.• Cerrar la bandeja y mantener a temperatura ambiente por 24-48 horas.• Reacclon positiva: se observa pudrlcion blanda alrededor del orificio dejado por el

sacabocados.

Arginina dihidrolasa• Inocular por picadura a partir de los cultivos puros.• Agregar aseptlcarnente 2ml de vaselina esterll e incubar a 27°C por 4 dfas.• Se considera reacclon positiva la alcallnizacion del medio que pasa de un color

rosado a rojo fuerte.

Hipersensibilidad en tabaco• Preparar una suspension bacteriana concentrada (10 B-109 ufc/rnl).• Introduclr la suspension, sin burbujas de aire, en una jeringa de 1 mi.• Inyectar en los espacios intercelulares del enves de las hojas.• Utilizar de preferencia Nicotiana tabacum L. cv. Samsum.• AI introduclr el liquido la superficie de la hoja toma un aspecto hurnedo que

persiste durante media a 1 hora.• Dejar a temperatura ambiente par 48-72 horas.• Reaccion positiva: la zona infiltrada se seca y aparecen necrosis ligeramente

marrones, que no deben confundirse can ias c1orosis originadas par los saprofitos.

f) Presencia gen constitutivos y efectores

Gen constitutivo cts

• Realizar la extracclon de ADN de colonias tai cual se indica para PCR.

• La arnpliflcaclon del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores cts-Fp(AGT TGA TCA TCG AGG GCG CWG CC) Y cts-Rp (TGA TCG GTT TGA TCT CGC ACGG).

• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo ai siguiente esquema (~I):

Agua Mq

dNTPs lOmM

14,7

0,5

Pagina 28 de 50

Instructivo Tecnlco para el muestreo y diaqnosttco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco

del control oficial de fa plaga en kiwi

Buffer lOx 2,5

MgClz 50mM 1,0

Primer cts-Fp 10pmol 2,5

Primer cts-Rp 10pmol 2,5

Taq platinum 0,3

Muestra 1,0


• La mezcla se prepara considerando el volumen por tubo y la cantidad de muestrasy controles a ampliflcar.

• Adernas de las muestras a analizar, se debe Incorporar un control negativo blanco(control agua) y un control positivo de Psa.

• Una vez preparado el mix proceder a reallzar la arnpllflcaclon de acuerdo a lossiguientes ciclos:

94°C

94°C

56,5°C

3 min

2 min

1 min 35 ciclos

noc 1 min

noc 5 min

• A partir de la ampllflcacion anterior reallzar un nuevo PCR utllizando los partidorescts-Fs (CCC GTC GAG CTG CCA ATW CTG A ) Y cts-Rs (ATC TCG CAC GGS GTR TTGAAC ATC).

• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):

Agua Mq 14,7

dNTPs 10mM 0,5

Buffer lOx 2,5

MgClz 50mM 1,0

Primer cts-Fs 10pmol 2,5

Primer cts-Rs 10pmol 2,5

Taq platinum 0,3

Muestra 1,0

Pagina 29 de 50

Instructivo T,f!cnico para el muestreo y diaqnosttco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco



• La mezcla se prepara considerando el volumen por tuba y la cantidad de muestrasy controies a amplificar.

• Adernas de las muestras a analizar, se debe incorporar un control negativo blanco(control agua).

• Realizar la amplificaci6n de acuerdo a los siguientes ciclos:

94°C 3 min

94°C 2 min

}56,5°C 1 min 35 ciclos

noc 1 min

noc 5 min

• Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.• Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el

registro fotogrilfico.

Gen constitutivo gyrB

• Realizar la extracci6n de ADN de colonias tal cual se indica para PCR.

• La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores gyrBFps (MGG CGG YAA GTT CGA TGA CAA YTC) Y gyrB-Rps (TRA TBK CAG TCA RACCTT CRC GSG C).


Agua Mq 14,7

dNTPs 10mM 0,5

Buffer lOx 2,5

MgCI250mM 1,0

Primer cts-Fp 10pmol 2,5

Primer cts-Rp 10pmol 2,5

Taq platinum 0,3

Muestra 1,0


Peoine 30 de 50

Instructivo T'ecrrlco para el muestreo y diagnostico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco

del control oflcial de la plaga en kiwi


• Adernas de las muestras a analizar, se debe incorporar un control negativo blanco(control agua) y un control positivo de Psa.

• Realizar la amplitlcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:

94°C 3 min

94°C 2 min }63°C 1 min 35 ciclosnoc 1 min

noc 5 min

• Reaiizar eiectroforesis y enviar a secuenciar.

• Ingresar los correiativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando elregistro fotogrMico.

Gen efector hrpKl

• Realizar la extraccion de ADN de colonias tal cuai se indica para PCR.• La arnpllftcaclon dei ADN se reaiiza mediante un PCR utilizando los partidores

hrpK1-F (GAC ART GCC GAC AAG GAC K) Y hrpK1-R (ATC KGC GGT TTG CAG AGACT).


Agua Mq 10,25

dNTPs 10mM 0,5

Buffer lOx 2,5

MgCI,50mM 1,0

Primer hrpK1-F 10pmol 5,0

Primer hrpK1-R 10pmoi 5,0

Taq platinum 0,25

Muestra 0,5

• La mezcla se prepara considerando ei volumen par tuba y la cantidad de muestrasy controles a amplificar.

• Adernas de las muestras a analizar, se debe Incorporar un control negativo blanco(control agua) y un control positivo de Psa.

• Realizar la arnpllftcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:

Pagina 31 de 50



95°e 5 min

95°e 2 min }64°e 30 seg 35 ciclosnoe 1 min

72°e 5 min


• Reallzar electroforesls y enviar a secuenciar.• Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de peR, adjuntando el

registro fotoqrafico.

g) cillculo y Expresi6n de Resultados

• Se conslderara un aislamiento negativo a Pss 0 Psa si no hay desarrollo decolonias sospechosas en ninguna de las placas de medio de cultivo.

• Se conslderara un aislamiento sospechoso a Pss 0 Psa cuando exista desarrollo decolonias de caracteristicas similares a Pseudomonas syringae.

• La fluorescencia puede ser positiva 0 negativa.• Las colonias aisladas edemas de ser Gram negativas y tener forma bacllar, deben

presentar el siguiente perfil LOPAT:

Prueba Pss Psa

L Levano (+) (+)

0 Oxldasa (-) (-)

P Pudrici6n Papa (-) (-)

A Arginina Dihidrolasa (-) (-)

T Hlpersensibilldad Tabaco (+) (+)

• Un resultado positivo al perfil LOPAT indica que la muestra esta posltiva aPseudomonas syringae.

• Para el caso de aislamientos que presenten colonias con fluorescencia positiva enmedio B de King y resulten ser Gram negativas, oxidasa negativa, de forma bacilar,pudrlcion en papa positivas, levano negativas e hipersensibilidad en tabacopositlvas, se deberan enviar cultivos puros al Laboratorlo de Referencia del SAGpara complementar diagn6sticos.

• Se considerara un diagn6stico negativo a Psa si no hay presencia de banda deamplificaci6n de 280 bp para los primers PsaFl/R2.

• Se conslderara un diagn6stico probablemente positivo a Psa cuando existepresencia de banda de amplificaci6n de 280 bp para los primers PsaFl/R2.

Pagina 32 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnosttco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-OOSverstcruuz

g) Diagnostico Final

• Se considerare un dlaqnosflco positivo a Pss si hay desarrollo de coloniassospechosas en las placas de medio de cultivo, hay correspondencia con laspruebas LOPAT y no hay presencia de banda de arnpliflcaclon de 280 bp para losprimers PsaFl/R2.

• Se conslderara un dlaqnoatlco positivo a Psa cuando los aislamientos presentenun perfil LOPAT correspondiente a Psa, existe presencia de banda de arnpliflcacionde 280 bp para los primers PsaFl/R2 y los resultados de secuenciaclon de genesconstltutivos y efectores se corresponden con un haplotipo de Psa.

9.2.4 PCR directo

a) Extraccion de ADN a partir de tejido vegetal

Pueden utilizarse diferentes kits comerciales de extraccion de ADN de baeterias queexisten en el mercado, as! como otros procedimientos descritos en la literaturacientifica, que aseguren una extraccion de calidad y confiable.

No obstante 10 anterior y de acuerdo a los buenos resultados obtenidos, a contlnuaclonse detalla el procedimiento sugerido, para realizar la extracclon de ADN (protocolo deextracclon de ADN publicado por L10p et al.,1999)

• Dilacerar 0 machacar las muestras y agregar dos veces el peso de la muestra entampon AFT.

• Mantener en hielo y aqitacion por 20 a 45 minutos.• Tomar 1 ml del macerado y centrifugar a 13.000rpm/5min.• Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 ul de tampon de

extracclon de ADN. Agitar mediante vortex y mantener en aqttaclon durante lhra atemperatura ambiente.

• Centrifugar a 5.000rpm/5min. Tomar 450 jJl del sobrenadante y colocar en unnuevo tubo, Agregar igual volumen de isopropanol. Invertir varias veces y dejar 1hora a temperatura ambiente.

• Centrifugar a 13.000rpm/5min. Descartar el sobrenadante y dejar secar atemperatura ambiente.

• Resuspender el pellet en 200 jJl de agua.

b) PCR• La arnplificaclon del ADN se realiza utilizando el par de primers PsaFl (TTT TGC TTT

GCA CAC CCG ATT TT) Y PsaR2 (CAC GCA CCC TTC AAT CAG GAT G).


Aaua Ma 7,7

dNTPs 10mM 0,5

Buffer lOx 25

Pagina 33 de 50



MqCl250mM 1,50

Primer PsaF1 10 ornol 125

Primer PsaR2 10 omoi 125

Tao olatinum 030

Muestra 100

Codiqo: D-PD-PE-005Version:02

• La mezcla se prepara considerando el voiumen por tube y la cantidad de muestrasy controles a ampiificar.

• Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de arnpllficacion se debeincorporar un control negativo blanco (control agua), un control negativo de Pss yun control positivo de Psa.

• Realizar la ampliftcaclon de acuerdo a los siguientes cielos:

95°C 2 min

95°C 30seg }65°C 30seg 30 ciciosnoc 30seg

72°C 5 min

• Proceder a realizar la electroforesis, con el fin de visualizar si hubo arnplificecion demuestras y controles.

• Preparar el gel de electroforesis disolviendo, en tampon TAE, agarosa al 2% yagregando gel red a una concentraclon aproximada de 0,005%.

• Tomar 5 a 10 [11 de cada tube amplificado y mezelar con tampon de carga.• Cargar en cada bolsillo del gelS a 10 [11 de la mezela obtenida en el punta anterior.• Tomar aproximadamente 2 [11 de marcador de peso molecular 50 bp y mezelar con

tampon de carga. Cargar esta mezela en el gel.• Proceder a correr el gel a 80 0 mas Volts. Observar bajo luz UV la presencia de

bandas luminosas y obtener registro fotogrMico.• En primer lugar se debe examinar el control negativo, el cual no debera presentar

bandas. Si hay presencia de bandas de amplificaclon se debe repetir ei proceso dearnpllflcaclon.

• Posteriormente se debe comparar el marcador molecuiar con la posicion de labanda obtenida por el control positivo. Si no hay presencia de banda dearnpllficaclon de 280 bp se debe repetir el proceso de arnpliflcaclon.

• Una vez veriflcados los controles se observa en los carriles de las muestras lapresencia 0 ausencia de bandas de arnpllflcacion de 280 bp.

• La presencia de banda determlna el PCR positive, sin ser necesariamente lamuestra positiva a Psa.

• Ingresar los correlatlvos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando elregistro fotogrMico.

• Se puede utllizar como alternativa PCR en tiempo real con los mlsmos partidores.

Peqin« 34 de 50

Instructivo Tlknico para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-005Version :02

c) Presencia genes constitutivos y efectores


• Realizar la extracci6n de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica para PCR(9.2.4 a)

• La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando ios partidores cts-Fp(AGT TGA TCA TCG AGG GCG CWG CC) Y cts-Rp (TGA TCG GTI TGA TCT CGC ACGG).


Aqua Mq 10 7

dNTPs 10mM as

Buffer lax 2,5

MoCI,50mM 1,0

Primer cts-Fo 10omoi 25

Primer cts-Ro 10omoi 2,5

Taq olatinum 03

Muestra 5,0

• Adernas de las muestras a anallzar, en cada reacci6n de amplificaci6n se debeincorporar un control negativo blanco (control agua) y un control positive de Psa.

• Reaiizar la amplificaci6n de acuerdo a los siguientes ciclos:

94°C 3 min

94°C 2 min }56,5°C 1 min 35 ciclosnoc 1 min

noc 5 min

• A partir de los amplificados reaiizar un nuevo PCR can ios partidores cts-Fs (CCCGTC GAG CTG CCA ATW CTG A) Y cts-Rs (ATC TCG CAC GGS GTR TIG AAC ATC).

• Proceder a preparar ei mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (ul):

Agua Mq 14,7

dNTPs 10mM as

Buffer lax 25

MoCi,50mM 10

Primer cts-Fs 25

Primer cts-Rs 2,5

Tao 0,3

Muestra 1,0

Pagina 35 de 50




• La mezela se prepara considerando el volumen por tubo y la cantldad de muestrasy controles a amplificar.

• Adernas de las muestras a anallzar, en cada reacclon de ampllflcaclcn se debeIncorporar un control negativo blanco (control agua).

• Una vez preparado el mix proceder a realizar la arnpllflcacion de acuerdo a lossiguientes cielos:

94°C

94°C

56,5°C

72°Cnoc

3 min

2min }1 min 35 cielos

1 min

5 min

• Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.• Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el

registro fotogrMico.

Gen constitutivo gyrb

• Realizar la extracclon de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica para PCR(9.2.4 a).

• La arnpllflcacion del ADN se reallza mediante un PCR utilizando los partidores gyrBFps (MGG CGG YAA GTT CGA TGA CAA YTC) Y gyrB-Rps (TRA TBK CAG TCA RACCTT CRC GSG C).

• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):

Aoua Mo 107

dNTPs 10mM 05

Buffer lOx 25

MoC1250mM 10

Primer cts-Fo 25

Primer Cts-RD 25

Tao 0.3

Muestra 50

• La mezela se prepara considerando el volumen por tubo y la cantidad de muestrasy controles a amplificar.

• Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de ampliflcacion se debeincorporar un control negativo blanco (control agua) y un control positive de Psa.

• Una vez preparado el mix proceder a realizar la arnpliflcacion de acuerdo a lossiguientes cielos:

Peqine 36 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


94°C 3 min

94°C 2 min }63°C 1 min 35 ciclos

72°C 1 minnoc 5 min

C6digo: D-PD-PE-OOSVerstcntuz

• Una vez terminado el programa proceder a colocar los tubas a 5±2oC.

• Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.

• Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando elregistro fotogrMico.

Gen efector hrpKl

• Realizar la extracci6n de ADN tal cual se indica para PCR (9.2.4 a).• La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores

hrpKl-F (GAC ART GCC GAC AAG GAC K) Y hrpKl-R (ATC KGC GGT TTG CAG AGACT).

• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):

Aqua Mq 5,75

dNTPs 10mM o 5

Buffer lOx 2,5

MoC!,50Mm 10

Primer hroKl-F 5,0

Primer hroKl-R 5,0

Taq 025

Muestra 50

• La mezda se prepara considerando el volumen par tuba y la cantidad de muestrasy controles a amplificar.

• Adernas de las muestras a analizar, en cada reacci6n de amplificaci6n se debeincorporar un control negativo blanco (control agua), un control negativo de Pss yun control positivo de Psa.

• Una vez preparado el mix proceder a realizar la amplificaci6n de acuerdo a lossiguientes clclos:

95°C 5 min

95°C 2 min }64°e 30 seg 35 ciclosnoe 1 minnoe 5 min

• Una vez terminado el programa proceder a colocar los tubas a 5±2oe.

Pagina 37 de 50

Instructivo Tlf!cnico para el muestreo y dlaqndstico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-OOSVersion:02

• Realizar electroforesis y enviar a secuenciar• Ingresar 105 correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el


d) Calculo y Expresion de Resultados

• Se conslderara un diagnostico negative a Psa si no hay presencia de banda dearnpllftcaclon de 280 bp para ios primers PsaFl/R2.

• Se conslderara un diaqnosttco probablemente positivo a Psa cuando existepresencia de banda de arnpllflcaclon de 280 bp para 105 primers PsaFl/R2.

e) Diagnostico Final

• Se conslderara un diagnostico positivo a Psa cuando exista presencia de banda dearnpliflcaclon de 280 bp para 105 primers PsaFl/R2 y 105 resultados de secuenclaclonde genes constitutivos y efectores se corresponden con un haplotipo de Psa.

9.2.5 PCR en tiempo real


Pueden utilizarse diferentes kits de extracclon de ADN de bacterias 0 procedimientosdescritos en la literatura cientifica, que aseguren una extraccion de calidad y confiable.A contlnuaclon se indica el procedimiento sugerido, para realizar la extracclon de ADN:

• Agregar a la muestra 5 ml de tampon CTAB y moler mediante homogenizador.

• Dejar decantar unos minutos y tomar 1 ml en un vial libra de DNasas.

• Proseguir de acuerdo al kits de extracclon InviMag Plant DNA mini Kit.

b) Ampllflcacion• La arnpllflcacion del ADN se realiza utilizando el par de primers PsaFl (TTT TGC TTT

GCA CAC CCG ATT TT) Y PsaR2 (CAC GCA CCC TTC AAT CAG GAT G) Y 105 controlesinternes COX-F (CGT CGC ATT CCA GAT TAT CCA) Y COX-R (CAA CTA CGG ATA TAT

AAG AGC CAA AAC TG).• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (~I):

Aqua Mq 25

EvaGreen Reaction Mix 50

Primer PsaFl 511M 05

Primer PsaR2 511M 05

BSA I Ornq/rnl 05

Muestra 10

Pagina 38 de 50



Ccdlqc: D-PD-PE-005Version :02

• Realizar el mismo mix, pero remplazando los primer PsaF1/R2 por los partidoresinternes COX.

• Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de arnplificecion se debeincorporar un control negativo blanco (controi agua), otro negativo de tejidovegetai, un control negative de Pss y un control positivo de Psa.

• Realizar la arnpliflcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:

98°C

98°C

65°C

60°C

83-98°C

2 min

5seg }7 seg 40 clclos

7seg

Incremento 0,50C cada 2seg

• En primer lugar se debe examinar el control negativo de agua, el cual no deberaamplificar. En caso contra rio se debe repetir el proceso de arnplificaclon.

• Luego verificar para el control negativo de planta que la arnpllftcacion sea negativapara Psa y positiva para los controles internos.

• Posteriormente verificar para el control negativo Pss que la ampllflcaclon seanegativa para Psa y negativa para los controies internos.

• Una vez verificados los controles se observa si hubo 0 no arnpllficacion en lasmuestras. Para el caso de los controles internes la arnplificaclon siempre debe serposltlva, en caso contrario se debe repetir la muestra tanto para Psa con para elcontrol interno.

• La presencia de ampliflcacion determina el PCR positivo, sin ser necesariamente lamuestra positiva a Psa.

c) Presencia genes constitutivos y efectores


• Realizar la extracclon de ADN tai cual se indica en punto 9.2.5 a.• La arnpllflcaclon del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores cts-Fp

(AGT TGA TCA TCG AGG GCG CWG CC) Y cts-Rp (TGA TCG GTT TGA TCT CGC ACGG).


Aqua Mq 107

dNTPs lOmM 05

Buffer lOx 25

MqCI,50mM 10

Primer CtS-FD 10Dmol 25

Primer CtS-RD J.Dnrnol 2,5

Taq platinum 0,3

Muestra 5,0

Pagina 39 de 50



c6digo: O-PO-PE-OOSVersi6n:02

• Realizar la amplificaci6n de acuerdo a los siguientes cielos:

94°C 3 min

94°C 2 min }56,5°C 1 min 35 cielosnoc 1 min

zz-c 5 min

• A partir de los amplificados realizar un nuevo PCR con los partidores cts-Fs (CCCGTC GAG CTG CCA ATW CTG A ) Y cts-Rs (ATC TCG CAC GGS GTR TTG AAC ATC).

• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (IJI):

Aoua Mo 147

dNTPs 10mM as

Buffer lax 25

MqCI250mM 10

Primer cts-Fs 2,5Primer cts-Rs 25Tao olatinum 03Muestra 1,0

• La mezcla se prepara considerando el volumen por tube y la cantidad de muestrasy controles a amplificar.

• Una vez preparado el mix proceder a realizar la amplificaci6n de acuerdo a lossiguientes cielos:

94°C94°C

56,5°Cnocnoc

3 min

2min }1 min 35 cielos

1 min

5 min

• Realizar electroforesis y enviar a secuenciar.

• lngresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando eiregistro fotografico.

Gen constitutivo gyrb

• Realizar la extracci6n de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica en el punta9.2.5 a.

• La amplificaci6n del ADN se realiza mediante un PCR utilizando los partidores gyrBFps (MGG CGG YAA GTT CGA TGA CAA YTC) Y gyrB-Rps (TRA TBK CAG TCA RACCTT CRC GSG C).

• Proceder a preparar el mix PCR de acuerdo al siguiente esquema (IJI):

Pagina 40 de 50

Instructivo Tecrrlco para el muestreo y diaqnosfico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Aqua Mn 107

dNTPs 10mM 05

Buffer lOx 25

MoC!,50mM 10

Primer cts-Fo 25Primer cts-Ro 25Tao olatinum o 3Muestra 50

Codlqo: D-PD-PE-OOSVersion :02

• Adernas de las muestras a analtzar, en cada reacclon de arnplificaclon se debeincorporar un contral negativo blanco (controi agua) y un control positivo de Psa.

• Una vez preparado el mix praceder a realizar la arnpliflcaclon de acuerdo a lossiguientes ciclos:

94°C94°C63°Cnocnoc

3 min

2 min

1 min

1 min

5 min

} 35 ciclos

• Una vez terminado ei programa proceder a colocar los tubos a 5±2oC.• Realizar electraforesis y enviar a secuenciar.• Ingresar los correlativos de las muestras en el registra de PCR, adjuntando el


Gen efector hrpKl

• Realizar ia extraccion de ADN desde tejido vegetal tal cual se indica en el punto9.2.5 a.

• La arnpllflcaclon del ADN se realiza mediante un PCR utllizando los partldoreshrpK1-F (GAC ART GCC GAC AAG GAC K) Y hrpK1-R (ATC KGC GGT TTG CAG AGACT).

• Praceder a preparar el mix PCR de acuerdo ai siguiente esquema (~I):

Aqua Mn 575

dNTPs 10mM 0,5

Buffer lOx 2 5

MoCI,50Mm 1 0

Primer hmK1-F 5,0

Primer hrnK1-R 5.0

Tao olatinum 0,25

Muestra 5.0

Pagina 41 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diaqnosfico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Codlqo: D-PD-PE-OOSVersion :02


• Adernas de las muestras a analizar, en cada reacclon de arnpliflcacion se debeIncorporar un control negativo blanco (control agua) y un control positivo de Psa.

• Una vez preparado el mix proceder a realizar ia arnpliflcaclon de acuerdo a lossiguientes clelos:

95°C 5 min

95°C 2 min }64°C 30seg 35 cielosnoc 1 minnoc 5 min

• Una vez terminado el programa proceder a colocar los tubos a 5±20 C.• Realizar electroforesis y enviar a secuenciar• Ingresar los correlativos de las muestras en el registro de PCR, adjuntando el

registro fotograFico.

d) catculo y Expresion de Resultados• 5e conslderara un dlaqnosfico negative a Psa si no hay arnpllflcaclon con los

primers PsaF1/R2 y hay arnpllficacion con los partidores internes COX.

• 5e conslderara un dlaqncstlco probablemente positive a Psa cuando hayampllflcaclon con los primers PsaF1/R2 y hay arnptiflcacion con los partidoresinternos COX.

d) Diagnostico Final• 5e conslderara un diagnostico positive a Psa cuando exista ampllflcaclcn con los

primers PsaF1/R2 y arnpllflcacion con los partidores internes COX, y los resultadosde secuenclaclon de genes constitutivos y efectores se correspondan con unhaplotipo de Psa.

9.2.6 PCR en tiempo real alternativos

EI metoda de tiempo real alternativo verificado hasta la ernision de este instructivo esdnature, el cual corresponde a un kit comercial para Psa-V, sin embargo, de sernecesario, pueden verificarse mas metod os alternativos.


A coritlnuaclon se indica el procedimiento sugerido, para realizar la extracclon de ADN:• Tomar la muestra y moler, de preferencia con nltroqeno Iiquido.• Transferir 50-100 mg a un vial y agregar 400 ul, de Buffer GPX1 y 4 ul, de 5MB y

homogenizar.• 5eguir el procedimiento de acuerdo a 10 especificado en el Kit (adjunto).

Peqine 42 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y dlaqnosfico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco



b) Amplificacion• La ampliflcaclon del ADN se realiza utilizando ei kit dnature, de acuerdo ai siguiente

esquema (J-lI):

Aqua Mq 7,0PsaV orimer mix 20X 10qPCR master 2X 10,0Muestra 2,0

• Adernas de las muestras a analizar, se debe incorporar un control negativo blanco(control agua), otro negativo de tejido vegetal, un control negativo de Pss y uncontrol positivo de Psa.

• Realizar la arnpllftcacion de acuerdo a los siguientes ciclos:

95°C 3 min }95°C 15 seg 43 clclos60°C 30 seg

• En primer lugar se debe examinar el control negativo de agua, el cual no deberaamplificar. En caso contra rio se debe repetir el proceso de arnpllflcaclon.

• Luego verificar para el control negativo de planta que la arnpllflcacion sea negativapara Psa y positiva para los controles internos.

• Posteriormente verificar para el control negativo Pss que la arnpliflcacion seanegativa para Psa y negativa para los controles internos.

• Una vez verificados los controles se observa si hubo 0 no arnplificaclon en lasmuestras. Para el caso de los controles internos la arnpllflcacion siempre debe serpositiva, en caso contra rio se debe repetir la muestra tanto para Psa con para elcontrol interno.

• La presencia de arnplificacton determina el PCR positive, sin ser necesariamente lamuestra positiva a Psa.

c) Calculo y sxpresten de Resultados

• Se conslderara un diaqnosttco negativo a Psa si no hay arnpliflcacion con losprimers PsaV y hay ampllflcaclon con los partidores internos COX.

• Se conslderara un diagnostico probablemente positivo a Psa cuando hayarnpllflcacion con los primers PsaV y hay arnpltflcaclon con los partidores internos.

d) Diagnostico Final

• Se conslderara un dlaqnosflco positivo a Psa cuando exista arnpllflcacion positivacon los primers PsaV y arnpliflcacion positiva con los partidores internos del kit, yadernas, se obtengan resultados de secuenclaclon de genes constitutivos y efectoresque se correspondan con un haplotlpo de Psa, para las 5 primeras muestraspositivas.

Pagina 43 de 50

Instructivo Tecnico para el muestreo y diaqnosflco dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


Codiqc: D-PD-PE-OOSVersion:02

• Se entendera que despues de las primeras 5 muestras positivas el metoda estaracompletamente estandarizadD por el laboratorio autorizado.

• Para la secuenclaclon de genes constitutivos y efectores remitirse ai punto 9.2.5 cde este instructivo.

9.2.7 Porrnulaclon medios de cultivo y tampones

a) Medios de Cultivo

King B (ajustar a pH 7.2)• K2HP0 4

• MgS04*7H 20

• Glicerol• Proteosa peptona N°3• Agar• Agua

SNA (ajustar a pH 7.0 -7,2)• Extracto levadura• Bacto peptona• NaCI• Sacarosa• Agar• Agua

CSGA (ajustar a pH 7.0)• Casarnlnoacldo• K2HP0 4

• MgS04*7H20

• Sacarosa• Geiatina• Agar

LevanoMedio SNA conteniendo 5% de sacarosa

Arginina dihidrolasa

• Peptona• Extracto de carne

• Fosfato de piridoxal

• Purpura de bromocresol

1,5 91,5 910 mL20 920 91 Lt

2g5 95 950 920 91 Lt

10 91 91 910 930 920 9

5g

5 90,005 95 mi (sol. acuosa a 1 por 500)

Pagina 44 de 50

Instructivo Tecrricn para el muestreo y dlaqnosfico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


Ccidigo: D-PD-PE-OOSverston.oz

• Rojo de cresol 2,5 ml (sol. acuosa a 1 por 500)

• Glucosa 0,5 9

• Agua destilada 1 Lt

• Disolver y ajustar el pH a 6.0

• Afiadir L( +) arglnina HCI 10 9

• Distribuir de 6ml por tuba y autoclavar.

b) TAMPONES

AFT• NaCI• NaH2P04*2H20• Na2HP04* 12H 20

• Agua

8 90,4 92,7 91Lt

Tampon extraccion de ADN PCR Convencional• Tris HCL, pH 7,5 24,2g• NaCI 14,6 9• EDTA 9,3 9• 5DS 5 9• Polyvinil pyrrolidone PVP-10 20 9• Agua destilada ajustar volumen a 1 Lt.

Tampon CTAB• CTAS 2,5% (w/v)• Tris-HCI 100mM• EDTA 50mM• NaCI 1,4M• PVP-40 1% (w/v)

25 9100 ml de Tris-HCL 1M, pH 8,0100 ml de EDTA 0,5M, pH 8,082 910 9

Pagina 45 de 50



Codigo: D-PD-PE-OOSVersion:02

9.3 FORMULARIOS

9.3.1 Formulario de ldentlflcaclon de personal que conforma equipos demuestreo y de analista(s) del laboratorio vinculado(s) al diagnostico

Personal oara las labores de rnuestreo:

Nombre completo NO de cedula de Cargo (Jefe Firma

identidad eguipo/apoyol

Identificaci6n del analista(s):

Nombre completo N° de cedula de identidad Firma

Firma del postulante 0 su representante legal

Fecha recepci6n SAG: "

Pagina 46 de 50




9.3.2 Declaraci6n jurada para la designaci6n del laboratorio autorizado queprestara servicios al vivero de kiwis

Por el presente instrumento, yo ................................................. Cedula de identidad N° ,de nacionalldad , con domicllio en................... , ,comuna de , personal encargado del vlvero de plantas de kiwisde la empresa , declare bajo juramento:

1- Que todas las muestras vegetales obtenidas de las plantas mad res de kiwisinscrltas por el vivero antes indicado para la certificaci6n fitosanitaria libre de Psa, queestan ubicadas en la comuna de deberan ser enviadas alsiguiente laboratorio autorizado para que realice el diagn6stico de la bacteria Psa

Nombre 0 Raz6n social: ..

Nurnero y afio de su resoluclon de autorizaci6n vigente: .

Direcci6n: .

Correo electr6nico: .

Telefonc: .

2- Que ante una modificaci6n en la designaci6n del laboratorio autorizado,lnforrnare al SAG en un plazo no superior a 48 horas, el nombre del nuevo laboratorioacreditado al cual el Servicio debera enviar las muestras.

Personal encargado Vivero

Fecha recepcion SAG: .

Nombre 0 representante legal

Laboratorio autorizado

Pagina 47 de 50




9.3.3 Formulario modelo de Declaraclcn de plantas madres

DECLARACION DE MUESTREO ANUAL DE PLANTAS MADRESPARA DIAGNOSTICO DE PSA (HOJA 1)

TEMPORADA:

usa EXCLUSIVO SAGFOUOU'

EI AIl1<cc<lomO$ <1<1 1!WOUllUO' OO'I!I<! ~'I""!.:I. P a"l"~"'"

t""'\""'"~ ~'",WI'", Sit

IREGIOU

,'''"'"'~''''''''II' """po"""" ~~(lR",:n

tj,mc~.".P"'''''t""n''J"/ .~rc

rl:m"H ·:on\-J;J.M I,;ai,aFn.E.'.'"

.....""'..,""M. ·~n

:.s~n::~U"lC

jj:rr.:J'~ ~rn'O~(I<erur

C"""lotu:b:t un.'IC,llm, we",f.;,~¢lli:"W;xlor",e~"

I OfICI!tA, I

HU50

1l,",,,,~T.!to'"

tl,'Tl~" "-e,,,,,,'o.>!"" H",~""

[C'''-;I:'O<;C",,,,,,,f""""fo,

SOLO Sf D!'1!EU OEClARAR l-/IS PWITAS ~lADRESQUE:• tlO Sf EI/(UErrTilEUUBICAOAS Ell HUERTas POSITIVOS• Sf EU:UWTRfll flTOS""IITARlAMElI1E SMIAS 15\11 SlllfOMAS DEBACTERIOSIS>

ESTADECLAAACI'JII, SOLOSfRA \lALIDAOA SIes ACOMPAIJAOA POR:.:.'.rr(:'<.::~::Ct, DE r,'C,J::",R::O 1',,0'" ET~HIO "'"-::D'OC;:i("':"IJI~ :;."..1. ;.:CEDEfl;. !-1JERE, O,,':VIV,C<) y OI"~::J~ICC'1 O'::;:ACII.L CE (:.I.QI. L'/;:' na(.,I.e' P~t.T"':lII,CWID~ Ell LAD::C'~;'F""CIC:II

C;;QCIJI~ ~,,~:. DI~p::s;:rJII O'~:,:':I:'L oe can, un:, C'E~~~Pl..AljTA!:; r.~OF£o; DECl.M'....r>;.!:;:AM DiAG'jO~T,:ODEPSA

lIi)rM:;Rf.PR()PlrrARJOI~' VIVERO fiRMA PROPIETARIOlSIVIVERO

Pagina 48 de 50

Instructivo Tecrrico para el muestreo y diagn6stico dePseudomonas syringae pv, actinidiae (Psa) en el marco


Codlqo: D-PD-PE-OOSversron.nz

Il~ll\~~~DEClARACIOtl DE MUESTREO ANUAL DE PLAtlTAS MADRES

PARA DIAGNOSTlCO DE PSA (lwJ., 2}TEMPORADA:

I:,;;,~",. '"("'"'''''''' .." .... ,," I I:;,;;:::" ' ""'"'9'"''' 0,,,,, I,c·, ,

~'" ~'CC"',",J ~~c .t.,.. "I<'lV"~~O tot'<,l:LCWII "l1~""JO'(Of "'O~

EH","C'O" ",0"'CU''I'O '" ,"O .... ,c,·,~Ou.O'.,c"Ol.lH~.,..lL rEt'\.<

unClE '.... '!n.o flm"CA,IOlHLJfTA..' Hilm '" '"aoc '" Pc:<I": DE

"O'~C"LI ",oe~aleo~ '0 ". "O"~"l: "" I "on c;":nf~l l'fiJE.m~~T'" '/h'!"".< jn"u. cOOEe'"

"""E' ". "" "'lJ!~r[l1 O~lfM~

E"'CMJ ,,""""'" ,,,~u,,. '",",ew- 'C"-'D oc·",~c."'O

I II I,

I I II

I II I

I

Pagina 49 de 50

Instructivo Tecrrico para el muestreo y diagnostico dePseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa) en el marco


C6digo: D-PD-PE-005version-Oz

9.3.4 Formulario modele de Programa de toma muestras para dlaqnosttco de PsaLo"O ·T~Tcero Al;fWibdu To",,,,de MU<O:itnt Pdf.:! Mu=trt:o ydllH.ln(l~tlctl cl ... 1"=0;'"

Fecha:

PROGRAI-1A TOr·1A DE MUESTRAS PARA DIAGNOSTICO DEPSEUDOMONAS S\'RINGAE PV, ACTINIDIAE CPS-A)

ANTECEDENTES TERCERO AUTOR.J.ZAOO (E.mi~or)

Nornbr.. ·Terceru Aulorl;".du

Ncmbn: R=pon""'ble Tecnko

Din:ct:i6n Dntin e ! Comun..

F..Tdefono (~) (fijol rna ...ll)

Numbre del Hu=-trelOdor {JerI:: eQuipo)

r."lconc (::.) mvvil dt: corrt.s ct.c

IOENTIF1CAClON Of. PRf.DIOS A HU.E.STREAR

FECHA Of; COMUNA NOMDRf. DEL PR£DIO NOMBRE DEL SU:P£RFlCl£ VARll'OAO YlPO ESTIMACIONHUESTRf.O PRODUCTOR MUESTR£O PLANTAS

{His} (HUUtTO/PLANTASHAORES)

Pagina 50 de 50

instructivo tecnico para el muestreo y …faolex.fao.org/docs/pdf/chi138583anx.pdf · 5.3.1...

Documents