institutopolitecnicon acional nt centro interdisciplinario de ciencias

Coral Muricea appressa

1

I N S T I T U T O P O L I T E C N I C O N A C I O N A L

NT CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE COMPUESTOS

BIOACTIVOS DEL CORAL Muricea appressa Verril 1864

T E S I S

Que para obtener el

Título de

Maestro en Ciencias

P r e s e n t a

EFRAIN PEÑALOZA AYALA

La Paz, Baja California Sur, México Marzo de 2004


2

Lugar de realización:

Este trabajo de tesis se llevó a cabo en el Laboratorio de

Farmacognosia de la UABCS. Forma parte del Programa de Investigación

Farmacognóstica de los Recursos Naturales de B.C.S. y fué dirigido por la

Dra. Rosalba Encarnación Dimayuga.

Apoyo técnico de la UABCS y CONACyT convenio F 500-N9306.


3

A G R A D E C I M E N T O S

A la Dra. Clara Nogueira de la hermana República de Cuba por sus

valiosos consejos y guías hacia el aislamiento y purificación de los

compuestos.

A la Dra. Rosalba Encarnación por su valiosa dirección y

orientación hacia el aislamiento y purificación de las sustancias,

también por haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo de tesis

en el laboratorio de Farmacognosia que acertadamente dirige.

A las autoridades competentes de la Universidad Autónoma de Baja

California Sur por haberme facilitado los recursos materiales y equipo

necesarios para lograr el objetivo de este trabajo de tesis durante 1992-

1994.

A Pedro Garza y Federico Sinsel del Departamento de Biología Marina

de la U.A.B.C.S., México y al Dr. Frederick Bayer del Museo Nacional de

Historia Natural del Instituto Smithsoniano en Washington, D.C. U.S.A.,

por haber contribuído a la identificación del coral Muricea appressa.

A la Dra. Kasuko Aoki del Departamento de Sistemas Biológicos de la

UAM-XOCHIMILCO en la Ciudad de México, D. F. por ayudarme realizar las

pruebas de contractilidad sobre el músculo liso de yeyuno de conejo.

Al Dr. Carsten Christophersen del Departamento de Química, División

de Química Marina de la Univesidad de Copenhague, Dinamarca, por ayudarme

a realizar las pruebas de RMN de +H y de 13C de los compuestos aislados.


4

LEOBARDO PEÑALOZA BALTAZAR (Q.E.P.D.)

A MIS QUERIDOS PADRES:

MARIA MERCEDES AYALA MAYA

A MIS HERMANOS:

CIRO EDUARDO,

GUADALUPE,

OSCAR,

RUBEN,

RAQUEL VICTORIA,

SITA JOSEFINA

REYNALDO, DAN, J. JESUS, IMELDA, ESTHELA, MARIO, BRIGIDA.POR HABERME TENIDO LA PACIENCIA PARA LA REALIZACIÓN DE ESTA TESIS SIN DEDICARLES UN POCO MAS DE TIEMPO PARA ESTAR CON ELLOS.


5

ÍNDICE GENERAL

Página

RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS III

RESUMEN V

ABSTRACT VI

GLOSARIO VII

1.- INTRODUCCIÓN 1

2.- MORFOLOGÍA Y DISTRIBUCIÓN DE GORGONÁCEOS 3

3.- ANTECEDENTES 5

4.- JUSTIFICACIÓN 10

5.- OBJETIVOS 11

6.- METODOLOGÍA 12 6.1 Recolecta 12 6.2 Identificación 12 6.3 Obtención de extractos crudos 15 6.4 Determinación de la actividad antimicrobiana. Método de difusión en agar. 16 6.5 Determinación de la actividad contráctil 18 6.6 Aislamiento y purificación de los compuestos 19 6.7 Cromatografía en capa fina 20

6.8a Cromatografía en columna del extracto de éter

de petróleo (E) 21

6.8b Cromatografía en columna del extracto clorofórmico 24 6.8c Purificación de los compuestos 25 6.9 Caracterización química 26


6

7.- RESULTADOS 27

7.1 Extracto de éter de petróleo (E) 30 7.2 Extracto clorofórmico (C) 33

7.3 Actividad antimicrobiana y contráctil sobre el músculo liso deyeyuno de conejo de fracciones semipuras de Muricea appressa 36

7.4 Caracterización química de los compuestos aislados 37 8.- DISCUSIÓN 44 9.- CONCLUSIONES 50 10. RECOMENDACIONES 51 11. ANEXO 52 12. LITERATURA CITADA 53

RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS

Página

Fig. 1: Área de recolección de Muricea appressa ...........14

Fig. 2: Fraccionamiento del extracto crudo de éter de

petróleo de Muricea appressa por cromatografía encolumna.....23

Fig. 3: Fraccionamiento del extracto crudo clorofórmico de

Muricea appressa por cromatografía encolumna................25


7

Fig. 4: Fracciones obtenidas del extracto de éter de

petróleo (E) de Muricea appressa.............................35

Fig. 5: Fracciones obtenidas del extracto clorofórmico (C)

de Muricea appressa .........................................36

Fig. 6: Espectro de Resonancia Magnética Nuclear (RMN)+H

(del protón) correspondiente a la mezcla de terpenos (EII-6)..39

Fig. 7: Espectro de RMN +H correspondiente al ácido

esteárico(CI-3)...............................................40

Fig. 8: Espectro de RMN de 13C correspondiente al ácido

esteárico(CI-3)..............................................41

Fig. 9: Espectro de RMN +H correspondiente al derivado del

ácido esteárico(CI-1)............................................42

Fig. 10: Espectro de RMN 13C correspondiente al derivado del

ácido esteárico (CI-1)...........................................43

Tabla I: Resultado de actividades del extracto de éter de

petróleo, clorofórmico y etanólico del coral Muricea

appressa.........................................................28

Tabla II: Resultado de la Actividad Antimicrobiana del Extracto

clorofórmico del coral Muricea appressa….........................29

Fotografía del coral Muricea appressa............................13


8

R E S U M E

N

Ejemplares de gorgonias Muricea appressa fueron recolectadas en el complejo insular Espiritu

Santo-La Partida, al sur del Golfo de California. Fueron realizadas pruebas de actividad

antimicrobiana de los extractos de éter de petróleo, clorofórmico y etanólico obtenidos, contra

microorganismos Gram positivos:(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, y Streptococcus faecalis), un

Gram negativo (Escherichia coli) y un hongo levaduriforme (Candida albicans). Las fracciones

obtenidas del fraccionamiento de los extractos de éter de petróleo y chlorofórmico fueron purificadas

por cromatografía en capa fina y por cromatografía en columna, aislándose de la fracción clorofórmica

dos substancias puras (Ácido esteárico y un derivado de ácido esteárico). De la fracción de éter de

petróleo se aisló una mezcla de terpenos. La estructura química de cada una de las substancias fué

determinada por Resonancia Magnética Nuclear, tanto de +H como de 13

C. La actividad

antimicrobiana y la actividad contráctil de los extractos crudos y de algunas de las fracciones obtenidas

a lo largo de éste estudio es reportada, analizada y discutida.

A B S T R A C T

Samples of coral Muricea appressa were collected from the Gulf of California island complex

Espiritu Santo-La Partida, Baja California Sur, México. Three kinds of crude extracts (petroleum


9

ether, chloroform, and ethanol) were tested for antibiotic properties against Gram positives (Bacillus

subtilis, Stapylococcus aureus and Streptococcus faecalis), a Gram negative microorganism (Escherichia

coli), and one yeast (Candida albicans). Isolated fractions obtained from the crude extracts of

petroleum ether and choloform were purified using thin layer and column chromatography. Two pure

substances were isolated from the chloroform extract; Stearic acid and a stearic acid derivative. A

terpene mixture was also isolated from the petroleum ether extract. The chemical structures of the

isolated substances were determined by spectrometric techniques; proton and carbon NMR. The

antimicrobial activity and pharmacological properties (antibiotic and muscle contractility on the

smooth muscle of rabbit jejune) of the crude extract and from some partially-pure fractions obtained

in this project are reported, analyzed, and discussed.

G L O S A R I O

ÁCIDO GRASO: Ácido carboxílico compuesto de carbono, hidrógeno y oxígeno. El grupo funcional

terminal es COOH. La cadena de átomos puede ir de C4 a C

22.

AMEBICIDA: Sustancia capaz de inhibir el desarrollo y reproducción de las amibas debido a las

alteraciones celulares permanentes que produce.

ANTIMICROBIANO: Molécula natural (obtenida de hongos y de algunos organismos marinos) o

sintética que evita la reproducción y desarrollo de microorganismos.

ANTIFÚNGICO: Agente químico que evita el desarrollo y reproducción de hongos.

BIOENSAYOS: Procedimientos técnicos experimentales llevados a cabo con el fin de probar el efecto

causado por una sustancia en un sistema biológico.

CELENTERADOS: Son metazoos diploblásticos con simetría radiada. Su cuerpo es en forma de saco

con una sola abertura rodeada de tentáculos, que hace la función de boca y ano. Presenta células

urticantes llamadas cnidioblastos en los tentáculos.

CEMBRANO: Diterpeno con anillo de 14 carbonos.


10

CITOTÓXICAS: Sustancias que producen alteraciones celulares definitivas o

temporales y que impiden a la células funcionar y reproducirse.

COMPUESTO BIOACTIVO: Es una sustancia de origen natural o sintético que

ocasiona cambios a nivel molecular en la célula y cuya actividad puede

medirse por comparación con sustancias conocidas.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA: Procedimiento analítico de separación de moléculas que consiste

de una fase estacionaria, adherida a una placa de vidrio o de papel aluminio y de una fase móvil,

constituida por mezcla de diferentes solventes orgánicos con diferentes grados de polaridad.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA: La fase estacionaria es colocada en una columna cilíndrica

vertical y la mezla a analizar se introduce en la parte superior de dicha columna, es adsorbida en la

fase estacionaria y luego se deja pasar la fase móvil; las sustancias separadas según sus diversas

afinidades, son recolectadas en fracciones sucesivas en el fondo de la columna.

DITERPENO: Sustancia animal o vegetal compuesta por cuatro unidades isoprénicas como las

Giberelinas (C20

).

ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL: Aclaración o explicación de la estructura química de un compuesto.

ESTERIFICADO: Sustancia química que tiene o está formando un enlace tipo éster en un compuesto.

ESTEROLES: Compuestos químicos cristalinos de C26-C30

. Contienen funciones R-OH y una cadena

alifática en C-17. Son ampliamente distribuídos y ocurren libres o como ésteres y glucósidos.

EXTRACTO CLOROFÓRMICO: Es el concentrado obtenido del organismo en estudio después de la

maceración con cloroformo y posterior evaporación del solvente.

EXTRACTO ÉTER DE PETRÓLEO: Concentrado obtenido del organismo en estudio después de la

maceración con éter de petróleo y evaporación del solvente.

FEROMONAS: Sustancias químicas que utilizan algunos organismos como los insectos para

comunicarse sexualmente.

FISIÓGRAFO: Instrumento utilizado para medir o describir mediante el registro de estímulos

eléctricos alguna actividad o función de un organismo vivo.

FLUORESCENCIA: Es el efecto causado en las moléculas que poseen dobles enlaces conjugados, de

absorber la luz ultravioleta invisible del espectro de luz y emitir la energía luminosa de 254 nm y de

366 nm.

FRACCIÓN ETÉREA: Fracción obtenida por cromatografía en columna a partir del extracto de éter de

petróleo.


11

GLUCÓSIDO: Compuesto químico abundante en plantas que contiene C, H y O, pueden convertirse

por hidrólisis en azúcares y otras sustancias orgánicas conocidas como agliconas.

HORMONA: Sustancia química que sirve como mensajero celular, se produce en un lugar distante

(glándula) y actúa en un sitio blanco de la célula causándole ciertos efectos fisiológicos.

ISOPRENOIDE: Que tiene estructura parecida a la del isopreno (2- metil-1,3 butadieno).

LACTONA: Éster interno de un ácido carboxílico formado por reacción intramolecular de ácidos

carboxílicos halogenados o hidroxilados con eliminación de agua.

METABOLITO: Molécula que interviene en las reacciones químicas de la célula, puede ser para

producir polímeros orgánicos (síntesis) o para obtener moléculas pequeñas (degradación).

METAZOARIO: Cualquier animal invertebrado que incluye todos los organismos de más de una célula,

constituyendo tejidos y hasta órganos.

MÚSCULO LISO: Organo activo del movimiento, dotado de actividad contráctil, exclusivo de la vida

vegetativa de organismos especializados. Forman en particular la pared de los órganos huecos que se

contraen sin la participación de la voluntad.

OCTOCORALES: Grupo taxonómico con categoría de subclase. La cavidad gastrovascular de los

organismos está rodeada por ocho septos radiales que se unen al disco oral y a la faringe. Los pólipos

poseen ocho tentáculos pinnados o plumosos.

PREGNANO: (Pregnadiol) Esteroide, producto metabólico de la progesterona.

PROSTAGLANDINA: Grupo de compuestos fisiológicamente activos, derivados del ácido

araquidónico, ácido graso C20

. Su nombre proviene de la glándula prostática, de donde fue encontrada

originalmente. Se designan como PG, seguidas con letras del alfabeto.

PROSTANOIDE: Sustancia con estructura química semejante a la de prostaglandina.

RMN: Método espectrométrico de Resonancia Magnética Nuclear. Existen de protón (+H) y de

13C,

empleados para identificación de la estructura química molecular.

SAPONINA: Agente lítico potente, que abate la tensión superficial. Es un glucósido, constituido por

una genina y aglucón capaz de formar abundante espuma.

SENSIDISCOS: Discos de papel filtro de 6.5 mm usados para medir la sensibilidad o resistencia de un

microorganismo frente al extracto o alguna fracción que se desee probar.

SIMBIÓTICO: Asociación entre dos organismos, no afectándose ninguno de

los dos pero sí obteniendo cierto beneficio.


12

TERPENO: Sustancia formada por condensación de dos o más unidades

isoprénicas; se subdividen en monoterpenos(C10), sesquiterpenos(C

15),

diterpenos (C20) y otros.

13C: Isótopo no radioactivo estable del carbono usado en la investigación

analítica especial.

YEYUNO: Parte del intestino delgado mesentérico, que constituye los dos

quintos superiores que siguen al duodeno y preceden al íleon.

ZOOXANTELA: Microalga que se encuentra en simbiosis en la mayoría de los

corales tanto hermatípicos como los ahermatípicos.


13

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA DE COMPUESTOS

BIOACTIVOS DEL CORAL: Muricea appressa Verrill 1864

I.- INTRODUCCIÓN

La información sobre el uso de los productos naturales

con fines medicinales data por lo menos de 4000 años, aunque

se considera que su aplicación es tan antigua como el hombre

mismo (Christophersen et al., 1991).

Desde el punto de vista farmacognóstico, el estudio de

los organismos marinos es más costoso y difícil, comparado

con el de los organismos terrestres (Christophersen et al.,

1991). Sin embargo, dada la inmensa variedad de taxa marinos,

aproximadamente 500,000 especies en 30 phyla (Scheuer, 1986;

Grant y Mackie, 1977), y las características biológicas que

presentan algunos grupos como esponjas, cnidarios,

holotúridos, entre otros, de liberar y producir metabolitos

secundarios activos en su estado natural (Ciereszko y Karns,

1973) han podido ser considerados como un recurso potencial

importante en la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos.

Este potencial es más importante por el hecho de que los

organismos marinos han evolucionado en un medio físico y

químico, distinto al que prevalece en el medio terrestre

(presión más elevada, presencia de sales, etc.) y es muy

probable que un elevado porcentaje de ellos puedan presentar

substancias químicas desconocidas, con nuevas estructuras,


14

actividades biológicas y farmacológicas y por lo tanto mayor

actividad (Baker, 1984).

Las biotoxinas, por ejemplo, representan solamente una

parte de las numerosas y variadas moléculas aisladas durante

las últimas décadas a partir de organismos marinos. Estas

moléculas, aunque están relacionadas con familias de

compuestos ya conocidos, son originales y algunas carecen de

equivalentes en organismos terrestres (Coll et al., 1978).

Ciertos organismos marinos se consideran venenosos o

ponzoñosos debido a que la toxicidad es indicadora de una

actividad fisiológica potente. Es probable que algunas de las

toxinas de organismos marinos puedan originar nuevos

compuestos que tengan actividad fisiológica importante

(Ruggieri, 1976; Barnes, 1977).

Un mayor entendimiento de las relaciones entre los

organismos marinos y su ambiente, nos podría proporcionar

también orientación para la búsqueda de sustancias de interés

biomédico presentes en ellos (Grant y Mackie, 1977). Estas

sustancias pueden ser usadas para diferentes propósitos tales

como defensa, escape, orientación, reproducción y búsqueda

de alimento (Ciereszko y Karns, 1973).

La diversidad de formas y competencia fisiológica de

invertebrados marinos, contribuyen a su utilidad en la

investigación biomédica. Los más intensamente estudiados por

la presencia de sustancias biológicamente activas, han sido

aquellos que son más accesibles como las esponjas, cnidarios,


15

poliquetos, moluscos y equinodermos, pues pueden ser

recolectados con relativa fácilidad y en cantidades

suficientes para la extracción química y la aplicación de

pruebas biológicas (Braekman y Daloze, 1983).

Los estudios de la química de productos naturales de los

corales gorgonaceos fueron iniciados a finales de los años

sesenta con las especies caribeñas más comunes. Estos

estudios ilustraron que éste grupo de invertebrados marinos

contiene altos niveles de metabolitos secundarios, como

acetogeninas, sesquiterpenos, terpenos y en algunos casos

esteroles altamente funcionales (Fenical, 1982). Uno de los

descubrimientos más interesantes en este grupo de corales

blandos, fue el aislamiento de glucósidos esteroidales y

glucósidos triterpenoides a partir de varias especies de

Pseudopterogorgia (Fenical, 1987).

El gran número de metabolitos secundarios aislados de

organismos marinos han conducido al descubrimiento de nuevas

rutas biosintéticas que ocurren solamente en algunos taxa y

a la revisión de algunas ya conocidas. También dio lugar a la

utilización de los datos químicos como una base útil para

estudios taxonómicos (Amico, 1995).

2.- MORFOLOGÍA Y DISTRIBUCIÓN DE GORGONÁCEAS

El Orden Gorgonácea comprende alrededor de 1,200

especies distribuidas por todos los océanos. Harden (1979),

mencionó un total de 173 especies para el Pacífico oriental,


16

registrando 125 especies de 21 géneros desde Perú hasta

Alaska. Brusca (1980) en su publicación acerca de la fauna de

invertebrados marinos del Golfo de California, menciona seis

especies de gorgonaceos.

Las gorgonias o corales blandos pertenecen al Phylum

Cnidaria, Orden Gorgonácea, Suborden Holaxonia, Clase

Anthozoa, Subclase Octocorallia. Muricea appressa Verrill,

1864 pertenece a este Phylum, es de color café obscuro, crece

en forma de abanico, con pequeñas verrugas comprimidas. Su

superficie es rugosa cubierta con pequeñas espículas

cortas. El coral se divide de la base en dos o tres

principales ramas, que crecen hacia fuera y eventualmente

curvadas para quedar paralelas a la rama de origen, cada una

de las cuales se subdivide a un diámetro de 0.64 cm de manera

dicotoma, de tal forma que las muestras de 8.35 cm de altura

tienen más de 20 ramas, casi todas son delgadas y tienen el

mismo diámetro; el cenénquima es delgado, muy poco expuesto

excepto en las ramas principales y en la base. En vida, el

color del tallo es rojo débil y pólipos café amarillentos.

Las muestras más grandes son de 45.7 cm de altura. Son

prominentes miembros de la fauna sésil de aguas someras de

una variedad de localidades; habita en el norte y sur de

California donde representa uno de los pocos miembros de este

Orden en esas aguas frías del norte. Ha sido reportado al sur

del continente americano hasta Panamá y Zorritos, Perú

(Verrill, 1868; Brusca, 1980); tienen pocos depredadores y se


17

mantienen en competencia por espacio sobre sustrato sólido

(Levinton, 1982).

Se piensa que el crecimiento de gorgonias y la escasa o

nula depredación por organismos competidores se debe en

parte a la producción y secreción de sustancias o compuestos

diterpénicos, y a sustancias relacionadas con el cembrano

(Ciereszko, 1977b).

Las formas de desarrollo o ramificaciones son

importantes en la clasificación de los corales y pueden ser

de varios tipos como: arbórea, con brazos en forma de

candelabro (Género Muricea); arbustiva, a los cuales los

pescadores mexicanos les llaman “arbolitos de mar” (Género

Lophogorgia); o con manifestaciones en un plano,

anastomosadas formando amplios abanicos (Género Pacifigorgia)

(Matamoros, 1984).

3.- ANTECEDENTES

Han sido identificadas más de 6,000 nuevas estructuras

químicas entre los años 1973 y 1994 a partir de organismos

marinos, de los cuales el 61% (3,681) corresponden a

moléculas isoprenoides; el 17.2% (1,030) de los compuestos

han sido aislados de celenterados, ocupando el tercer lugar

en relación a los organismos marinos estudiados (Amico, 1995;

Ireland et al, 1993).

Ciereszko (1977a), publicó que las gorgonias de la

especie Eunicea mammosa en Bermuda y Bimini, han logrado un


18

desarrollo abundante debido a la producción de sustancias

terpénicas que producen en el fondo marino y que impiden su

depredación. Su extracción química condujo a la

cristalización de la “eunicina”, el primer terpeno

descubierto en octocorales.

Existen otros antecedentes que apoyan que corales

gorgonianos presentan compuestos bioactivos con diversas

aplicaciones, tales como antimicrobianos, hormonas y

prostaglandinas, entre otros. Estas últimas son de gran

interés biomédico ya que ejercen efectos tranquilizantes en

el sistema nervioso central, estimulan el músculo liso y

disminuyen la presión sanguínea. Las prostaglandinas,

derivadas de los ácidos grasos de cadena C20 han sido los

compuestos más activos que han sido investigados en las

ciencias médicas desde hace 30 años (Scheuer, 1989). Tienen

diversas actividades biológicas y están presentes a baja

concentración en los tejidos de los mamíferos (Goodman y

Gilman, 1982) También se conocen derivados de prostaglandinas

a partir de extractos de la gorgonia del Caribe Plexaura

homomalla (Ciereszko y Karns, 1973). Esta especie contiene

compuestos esterificados de prostaglandinas, idénticos a los

derivados presentes en mamíferos, y además contiene esteroles

C30 de los cuales el principal es el gorgosterol. Es de

destacar que las prostaglandinas constituyeron hasta el 1.3%

de peso seco del organismo, hecho que llamó la atención de la

comunidad de investigación biomédica, sobre el potencial

inexplorado de este organismo como fuente de substancias


19

bioactivas. Además, las prostaglandinas son de interés por su

papel en la producción de hormonas esteroidales como la

codisona, que regula la movilidad en crustáceos (Scheuer,

1989). Es conocido que las microalgas juegan un papel de

hospedero simbiótico intracelular con un gran número de

gorgonias (Levinton, 1982; Rovirosa et al., 1983), lo que

hace pensar que los esteroles aislados de éste tipo de

celenterados, pueden haber sido producidos por estas

microalgas o por la asociación de ambos (Rovirosa et al.,

1983).

Los corales gorgonianos exhiben pocas evidencias de

depredación (Ciereszko, 1977b) y ha sido demostrado que sus

extractos crudos son tóxicos para peces, gasterópodos y

larvas de anuros. Se desconoce si las toxinas aisladas son

los únicos agentes responsables de esa toxicidad. Estos

compuestos se clasifican estructuralmente como lactonas del

cembrano (Colver y Jacobs, 1981).

Bandurraga et al., (1982), publicaron el aislamiento de

tres cembranólidos dicetónicos en una gorgonia del Pacífico

(Lophogorgia alba) que carece de zooxantelas, destacando que

éstas microalgas no son esenciales para la producción de

metabolitos secundarios en algunos corales gorgonianos.

Por otro lado, revisiones de los organismos marinos de

las aguas del Golfo de California, indicaron la presencia de

antimicrobianos y antifúngicos en gorgonias del género

Muricea (Keer, 1988; Encarnación y Keer, 1992).


20

Las gorgonias del género Eunicea son muy comunes en las

aguas someras de la región del Caribe y ha sido demostrado

que producen una cantidad de sesquiterpenos y una variedad de

diterpenos, los cuales en su mayoría, son lactonas derivadas

del esqueleto del cembrano (Rodríguez et al., 1994).

Block (1974), aisló, de la fracción de extracto

hexánico a partir de Muricea appressa var. appressa,

esteroles con diferente grado de saturación y sustituyentes

en el anillo B e insaturación en la cadena lateral.

Así mismo, Block (1974) aisló de otras dos especies de

la familia Gorgoniidae (Plexaura sp de las Bahamas y Eugorgia

ampla del Golfo de California, México) esteroles que

presentaron el anillo del ciclopropano en la cadena lateral o

con cadenas laterales anormalmente cortas o largas.

Ortega et al., (2002), en su estudio sobre gorgonias, a

partir del extracto acetónico de Muricea sp de la Bahía de

Mazatlán, México, aislaron dos metabolitos nuevos: muricenona

A(1) y muricenona B(2), que son pregnanos degradados,

caracterizados por el rompimiento y pérdida de un átomo de

carbono del anillo A del núcleo esteroidal y con propiedades

citostáticas y citotóxicas en células de carcinoma humano.

Izac et al., (1982a y b), publicaron el aislamiento y

estructura de un terpenoide con actividad ictiotóxica, el

pacifigorgiol, a partir del abanico marino Pacifigorgia cf.


21

adamsii, recolectado en la Bahía de Los Frailes B.C.S.,

México.

Faulkner (1994), en una revisión sobre productos

naturales marinos publicó que las gorgonias Calicogorgia sp.

del Japón y Litophyton sp. de Okinawa, Japón, presentan tres

terpenoides con actividades tóxicas que repelen al

gasterópodo Drupella fragum. Asimismo reportó que han

aislado 25 diterpenoides de la gorgonia Solenopodium stechei

de los arrecifes de la Gran Barrera de Australia.

Además, Faulkner (1995), reporta lactonas

sesquiterpénicas aisladas de un octocoral del Mediterráneo

Maasella edwarsi. También registra un nuevo cembranofurano de

Sinularia dissecta de las costas Mandapam, India, que posee

actividad sobre la acetil colinesterasa, y señala que de la

gorgonia de Nueva Caledonia Villogorgia rubra, fueron

aislados dos alcaloides indólicos, (villagorginas A y B)

junto con cafeína y otras aminas sencillas.

Ha sido publicado el alto contenido en compuestos

volátiles (principalmente de sesquiterpenos) en corales

blandos y en algunas especies, representando más de 10% del

peso seco del animal (Salva et al., 1994).

Existen otras evidencias sobre las diversas propiedades

biológicas de algunos compuestos obtenidos de corales

gorgonianos como antitumorales (Rodríguez et al., 1994);


22

antimicrobianos y citotóxicos (Su et al., 1993; 1995; Shin y

Seo, 1995; Duh y Rei-Sheu, 1996; Slattery et al., 1997).

Tambien ha sido reportado que el coral blando Xenia elongata

presentó compuestos clasificados como xenicanos con

propiedades ictiotóxicas (Higuchi et al., 1995).

4.-JUSTIFICACIÓN

Considerando la gran variedad de organismos vivos que se

encuentran en el océano todavía sin estudiar, la probabilidad

de ser portadores de nuevos compuestos activos es alta.

Debido a que en México, la investigación en el campo de la

química de productos naturales dirigida hacia la biología

marina es muy escasa, es importante realizar este tipo de

estudios.

En virtud de que las enfermedades infecciosas ocupan

los primeros lugares como causa de morbilidad en México

(Osuna y Lozoya, 1989), y debido al uso inadecuado de los

antibióticos, lo cuál produce resistencia en los

microorganismos, se ha sentido la necesidad urgente de

desarrollar y descubrir drogas antibacterianas.

Considerando que en las últimas décadas han sido

aisladas y caracterizadas substancias con propiedades

biológicas y farmacológicas a partir de celenterados marinos,


23

y considerando los estudios reportados sobre la actividad

antimicrobiana y sobre el músculo liso de conejo en el

extracto etanólico de M. appressa, (Encarnación y Keer,

1992), se plantea la búsqueda de estas substancias bioactivas

en el coral Muricea appressa, Verril 1864 para conocer mejor

el potencial de esta especie como portadora de compuestos con

actividad biológica. Por lo que este trabajo de tesis está

relacionado con el aislamiento de substancias con actividad

biológica presentes en la gorgonia Muricea appressa, Verril

1864.

5.- OBJETIVO GENERAL

Aislar, purificar y caracterizar químicamente,

compuestos bioactivos presentes en la gorgonia Muricea

appressa Verrill 1864.

5a. OBJETIVOS PARTICULARES

1. Determinar la actividad antimicrobiana de las

fracciones y compuestos aislados de M. appressa Verril 1864

sobre cinco cepas de microorganismos, y su actividad

contráctil en el músculo liso de yeyuno de conejo.


24

2. Determinar y elucidar la estructura química de los

compuestos aislados de M. appressa Verril 1864 por Resonancia

Magnética Nuclear de +H y

13C.

6.- M E T O D O L O G Í A

6.1-Recolecta

La recolecta del coral Muricea appressa fué realizada

por buceo autónomo a una profundidad de 15 a 20 metros en el

Complejo Insular Espíritu Santo-La Partida, área localizada

entre los 24° 24’ latitud norte y los 110° 17’ longitud

oeste, en el Golfo de California (Fig. 1). Las muestras

fueron limpiadas de todo material extraño y colocadas en

bolsas de polietileno por separado, luego se conservaron en

recipientes con hielo para su transporte y posteriormente

conservadas en congelación hasta su uso.

6.2- Identificación

La identificación del material recolectado fue efectuada

por comparación con material de referencia, en el

Departamento de Biología Marina de la U.A.B.C.S., México, y

en el Museo Nacional de Historia Natural del Instituto

Smithsoniano de Washington D.C., E.U.A., y usando caracteres

de campo como la forma de crecimiento, estructura y forma de

la colonia, clase, distribución y estructura de pólipos y

distribución, forma y tamaño de las escleritas. Las gorgonias

de interés fueron identificadas como Muricea appressa Verril,

1864 (Bayer, 1961; Williams, 1993; Hardee y Wickstern, 1996).


25

Fotografía del coral Muricea appressa Verrill 1864

2H C= CH 2

C H 3-

F ig. 6: Espectro de RM N 1H correspondiente a la m ezcla de terpenos (E II-6)

C H 2

54


26

Documento Microsoft Word

Documento Microsoft Word

Golfo de California


27

6.3 - Obtención de extractos crudos

Los ejemplares de Muricea appressa Verrill 1864

recolectados en agosto de 1990, fueron cortados en pequeñas

piezas, pesadas (726 g) y el material fue extraído por

maceración con éter de petróleo, cloroformo y metanol

durante siete días con cada uno de los solventes. Los

extractos crudos obtenidos fueron concentrados en el

rotavapor al vacío hasta sequedad, a una temperatura no mayor

de 40° C , obteniéndose para el extracto de éter de petróleo

5 g, para el extracto clorofórmico 3 g y para el etanólico

0.5 g.

6.4- Determinación de la actividad antimicrobiana. Método de

difusión en agar.

La determinación de la actividad antimicrobiana por el

método de difusión en agar fué llevado a cabo de acuerdo a

Encarnación et al., 1992.

6.4a Preparación de los sensidiscos.

Los sensidiscos se hicieron de papel filtro Whatman # 1,

de 6.5 mm de diámetro. En el solvente correspondiente

(acetato de etilo para el extracto etéreo, cloroformo para el

clorofórmico), fueron disueltos 20 mg/mL de cada uno de los

extractos crudos obtenidos anteriormente. Los sensidiscos


28

fueron impregnados con 140 µL de cada solución y evaporado el

solvente a temperatura ambiente.

6.4b Controles

Los sensidiscos empleados fueron impregnados sólo con el

solvente puro como controles negativos; sensidiscos

comerciales con ácido nalidíxico (30 µg), cloranfenicol (30

µg), y ampicilina (40 µg) fueron empleados como controles

positivos para las bacterias; y sensidiscos con ketoconazol

para el hongo levaduriforme Candida albicans.

6.4c Cepas

Los microorganismos de prueba fueron:

Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus,

Streptococcus faecalis,

Candida albicans,

Escherichia coli.

Las cepas en forma pura fueron obtenidas del Instituto

Oceanográfico de Scripps, Universidad de California, La

Jolla, E.U.A., a excepción de la cepa de S. Aureus, que fue

obtenida del Laboratorio de Diagnóstico y Análisis

Especiales de La Paz, B.C.S., México.

6.4d Preparación de la suspensión de microorganismos.

Por tinción de Gram fue comprobado que las cepas eran

puras. Cada cepa fue sembrada por separado en caldo nutritivo


29

a pH 7 y 37°C durante 18 a 24 horas para obtener una

suspensión que fue ajustada a una concentración de 1X105

UFC/mL de acuerdo a la escala de Mc Farland (En Murray et

al., 1999). El medio de Agar dextrosa Sabouraud líquido (ver

anexo) fue empleado para el desarrollo del hongo

levaduriforme C. albicans.

6.4e Actividad antimicrobiana

La determinación de la actividad antimicrobiana, fue

realizada por duplicado en cajas Petri conteniendo medio de

cultivo agar Müeller Hinton, las cuales fueron inoculadas con

un hisopo con la suspensión del microorganismo de prueba para

tener una capa superficial homogénea de las bacterias, y en

las cajas de Petri que contenía agar dextrosa Sabouraud fue

inoculado el hongo levaduriforme. Sobre éstas fueron

distribuidos los sensidiscos impregnados con 140 µL de los

soluciones de los extractos de éter de petróleo y

clorofórmico previamente preparados a una concentración de 10

mg/mL, e incubadas a 37° C durante 18 a 24 horas. Al terminar

la incubación fue medida la zona de inhibición (en mm)

producida por los extractos (en caso de haber)

considerándose positivos los que presentaron un diámetro

mayor a 6.5 mm y negativos los que no presentaron halo.

Todos los ensayos fueron realizados por duplicado. También

fue efectuada la determinación de la actividad antimicrobiana

por el método de difusión en agar de 14 de las fracciones (6


30

de éter de petróleo y 8 del clorofórmico) obtenidas en el

proceso de fraccionamiento de los extractos crudos por

cromatografía en columna.

6.5 Determinación de la contractilidad muscular en el

músculo liso de yeyuno de conejo.

Preparación de los segmentos de yeyuno.

Los extractos de éter de petróleo y clorofórmico de

Muricea appressa Verrill 1864 fueron sometidos a la prueba de

contractilidad sobre el músculo de yeyuno de acuerdo a

Encarnación et al., (1994). Fueron utilizados conejos machos

de la cepa Nueva Zelanda de 2.5 a 3 kg. Se mantuvieron en

ayuno durante una noche y se sacrificaron. Varios segmentos

del intestino delgado de 5 ó 6 cm, fueron colocados en una

solución de Tyrode a pH 7.4, con 95 % de oxígeno y 5 % de

dióxido de carbono a 37°C. Los segmentos fueron limpiados de

todo tejido que lo rodea, cortados en piezas de 1.5 cm de

longitud y colocados en una cámara de vidrio en posición

vertical con 18 ml de solución Tyrode, permitiendo el

equilibrio durante 30 minutos o hasta una hora. La

contractilidad espontánea del músculo liso fue registrada en

un fisiógrafo tetracanal (CPM, NARCO BIOSYSTEMS Inc., Model

85) equipado con una fuerza transductora F-50 y previamente

calibrado con un estándar de acetilcolina como patrón y un

sistema de referencia conocido (extracto etanólico de la

gorgonia Lophoborgia rigida) como control positivo. El yeyuno


31

fue colocado en una tensión inicial de 0.5 g empleándose

concentraciones de 75 µg/ml de extracto (López et al., 1990).

El intervalo de porcentaje de estimulación/min usado

para considerar una escala de medición de actividad fue: de

24 a 40 % = (1+); de 40 a 80 % = (2+); de 80 a 120 %= (3+) y

de 120 a 160 %= (4+), que son los valores de referencia para

el reporte de positivas en los ensayos (Encarnación et al.,

1994).

6.6 Aislamiento y purificación de los compuestos

El aislamiento y purificación de los compuestos activos

fue llevada a cabo por medio de técnicas cromatográficas,

principalmente cromatografía en capa fina y en columna, y

empleando el bioensayo dirigido hacia la determinación de la

actividad antimicrobiana sobre las cinco cepas de los

microorganismos antes mencionados: S. aureus, S. faecalis, B.

subtilis, E. coli y C. albicans, que condujera finalmente al

aislamiento de los compuestos activos y a la detección de

fracciones con actividad antimicrobiana. Para proceder a

purificar el compuesto activo, el sistema de solventes fue

seleccionado por cromatografía en capa fina, eligiéndose

aquel sistema que permitiese la mejor separación de los

componentes presentes en el extracto o fracción, para

posteriormente extrapolarlo a la cromatografía en columna y

proceder a su fraccionamiento.


32

6.7-Cromatografía en capa fina

Fueron utilizadas placas cromatográficas comerciales

marca Whatman de 2.5 cm de ancho por 5 cm de longitud,

conteniendo silica gel e indicadores de fluorescencia

integrados de dos tipos: el que contiene salisilato de zinc,

que revela las sustancias que absorben longitudes de onda de

254 nm y aparece como un fondo verde, y sales sódicas de

ácido sulfónico, que revelan las sustancias que absorben la

luz ultravioleta de onda larga (366 nm) con un contraste

amarillo (Touchtone, 1992).

Las cámaras cilíndricas empleadas fueron saturadas con

la ayuda de papel filtro humedecido con el eluyente, el cual

fue colocado sobre las paredes internas de la cámara para

favorecer la evaporación del solvente en forma uniforme al

interior de la cámara. La placa fue marcada en el extremo que

se sumerge en el sistema o fase móvil con la muestra aplicada

sobre la misma, a un centímetro de distancia del extremo de

la placa. A intervalos de l5 mm fueron colocadas las

muestras a eluir, dejando evaporar el solvente en los puntos

de aplicación antes de colocar la placa en la cámara. Este

extremo fue sumergido en la fase móvil del sistema quedando

en el fondo de la cámara, justo arriba del nivel del sistema,

el punto de aplicación de la muestra. Después de que el

frente de la fase móvil alcanzó la distancia deseada antes

del tope de la placa (aproximadamente a un centímetro de


33

distancia), ésta fue sacada de la cámara. Se dejó evaporar el

exceso de eluyente para continuar con el proceso de

detección de los compuestos por observación directa de la

placa, bajo la lámpara de luz ultravioleta, para detectar si

había presencia de sustancias con moléculas insaturadas

dobles y triples enlaces carbono-carbono (Sthal, 1969).

Posteriormente fue visualizado el corrimiento de los

componentes por oxidación, empleando la aspersión con

reactivos oxidantes, tales como el H2SO

4 (ácido sulfúrico) al

10% o con la mezcla ácido sulfúrico/Vanillina al 0.5% y

calentamiento (Krebs et al. 1966). La presencia de compuestos

orgánicos que reaccionan con los reactivos oxidantes,

producen manchas visibles coloreadas en ocasiones y

separadas, indicando el número de sustancias presentes en la

muestra.

6.8a Cromatografía en columna del extracto de éter de

petróleo (E)

Una vez determinado el sistema de elución, por

cromatografía en capa fina para el extracto de éter de

petróleo, el sistema fue extrapolado a la cromatografía en

columna para proceder a su fraccionamiento, para lo cuál, 2 g

del extracto fueron montados en una columna cromatográfica de

46 cm de longitud x 3.5 cm de diámetro interno, con silica

gel (60-230 mallas) como soporte, en proporción de 1:60

(muestra: silica), empleando inicialmente como eluyentes


34

tetracloruro de carbono (CCl4) al 100%, y posteriormente la

mezcla CCl4:EtOAc, en un gradiente de polaridad de 5 % al 50

% de acetato de etilo (EtOAc), obteniéndose 10 fracciones

semipuras. Una segunda evaluación de estas fracciones fue

realizada por cromatografía en capa fina para la selección de

un nuevo sistema que permitiera fraccionar una de estas

fracciones semipuras (150 mg de EII), la cual fue sometida a

una posterior purificación por cromatografía en columna,

empacada con silica gel (230-400 de malla), empleando como

eluyente inicial Benceno (Benc) 100 % y finalmente una mezcla

de Benc:EtOAc en proporción de 2:1 (fig. 2).


35

EXTRACTO CRUDO DE ÉTER DE PETRÓLEO (E)Muestra: Extracto éter de petróleo2.0 gSistemas: CCl4 100 %CCl4:ETOAc 5-50 %60-230 mallas

PROPORCIÓN 1:60

10 FRACCIONES SEMIPURAS

FRACCIÓN EII SEMIPURA (150 mg)

Cromatografía en columnaSiO2 gel (230-400 mallas)Sistema: Benceno 100%Benc/EtOAc 2:1

7 FRACCIONES MÁS PURAS

Fig. 2: Fraccionamiento del extracto crudo de Éter de Petróleo de Muricea appressa Verril 1864.

FASE ESTACIONARIA:SO2 GEL


36

6.8b Cromatografía en columna del extracto clorofórmico

(C)

Se procedió a fraccionar el extracto clorofórmico por

técnicas cromatográficas, para la purificación de sus

componentes, y para la elección del sistema, se siguió el

mismo criterio aplicado en el fraccionamiento del extracto de

éter de petróleo descrito en 6.7. Para esto, 2.5 g de éste

fueron montados en una columna cromatográfica de iguales

características que la del extracto etéreo, empacada con SiO2

gel (60 - 230 de malla) en una proporción de 1:40 respecto a

la muestra. La aplicación de la muestra se hizo preparando

una papilla conteniendo la muestra en silica gel en

proporción 1:2. El sistema usado inicialmente fue benceno al

100 %; después fue cambiado por benceno:acetato de etilo 10

%, y finalmente por Benc/EtOAc al 20%. (Fig.3).


37

Adsorbente: Silica gel Muestra: 2.5 g

Sistemas eluyentes:60-230 malla Benceno 100 %....400 mlProporción: 1 g de muestra Benc:EtOAc 10%, 20 %por 40 g de SiO2 gel Recolecciión de fracciones de 5 ml/tubo

EXTRACTO CRUDO CLOROFÓRMICO (C)

14 FRACCIONES SEMIPURAS

Fig. 3: Fraccionamiento del extracto crudo Clorofórmico de Muricea appressa Verrill 1864

Cromatografía en columna

6.8c.Purificación de los compuestos

Después de haber efectuado el fraccionamiento del

extracto crudo de éter de petróleo, la fracción EII (Fig.2)

produjo un precipitado blanco, cuya estructura fue

determinada por RMN de +H y 13C. Por otro lado, la fracción CI

del extracto clorofórmico produjo el compuesto CI-1 cuya

estructura fue analizada por RMN de +H y de 13C y la fracción

CIII dió el precipitado C1-3, cuya estructura también fue

analizada por RMN de +H y 13C (Fig. 5).


38

6.9- Caracterización química

La caracterización química de los compuestos aislados

fue llevada a cabo por técnicas espectroscópicas,

principalmente por RMN: 13C y +H en colaboración con la

División de Química Orgánica Marina de la Universidad de

Copenhague en Dinamarca.

Los espectros de los compuestos puros aislados se

obtuvieron en un espectrómetro de RMN AM 500 con un campo

magnético de 100 MHz, marca Bruker y utilizando como sol-

vente el cloroformo deuterado (CDCl3 ).

La identificación de los compuestos fue efectuada por

comparación y cotejo de tablas con señales características

para cada grupo químico particular (Silverstein et al.,

1974).

La estructura química fue determinada midiendo el

corrimiento químico (de protón y de carbono) resultante de la

diferencia en la posición de absorción electromagnética de un

protón particular, con respecto a la posición de la absorción

de un protón de referencia, generalmente del tetrametil

silano (TMS). La escala delta es dada en unidades de partes

por millón (ppm). Los picos de absorción obtenidos en el

espectro de RMN +H, representan protones en los diferentes

ambientes químicos, y cada área de absorción es proporcional

al número de protones que representa (Silverstein et al.,

1974).


39

7.- RESULTADOS

Debido a la actividad contráctil positiva detectada en

el extracto crudo de éter de petróleo (Tabla I), este fué

fraccionado para su purificación. Por cromatografía en capa

fina se obtuvo un cromatograma con buena separación de los

constituyentes de la mezcla y con el solvente adecuado (CCl4

100% y CCl4/EtOAc 5-50%), el cuál se aplicó a la

cromatografía en columna obteniéndose diez fracciones. El

mismo extracto crudo inicialmente no presentó actividad

antimicrobiana por el método de difusión en agar, pero la

fracción EVI parcialmente pura, resultó positiva contra S.

aureus. El extracto crudo clorofórmico también se probó para

ver si inhibía o no la contractilidad del músculo liso de

yeyuno de conejo, así como su actividad antimicrobiana.

Algunas de las fracciones (6) parcialmente puras obtenidas y

que se les realizaron actividad antimicrobiana, resultaron

positivas (tabla II).


40

TABLA I: RESULTADO DE ACTIVIDADES DE LOS EXTRACTOS CRUDOS: ÉTER DE PETRÓLEO, CLOROFÓRMICO Y ETANÓLICO DEL CORAL Muricea

Appressa Verril 1864 __________________________________________________________ CONTRACTILIDAD ACTIVIDAD EXTRACTOS MUSCULAR * ANTIMICROBIANA** __________________________________________________________ ÉTER DE PETRÓLEO POSITIVA 4+ NEGATIVA __________________________________________________________ CLOROFÓR- MICO INACTIVA NEGATIVA __________________________________________________________ ETANÓLICO POSITIVA 3+ NEGATIVA __________________________________________________________ *PRUEBA DE CONTRACTILIDAD MUSCULAR SE EFECTUÓ SOBRE EL MÚSCULO LISO DE YEYUNO DE CONEJO. **ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA CONTRA LOS GÉRMENES: S.aureus; S.faecalis; B.subtilis; E. coli; C.albicans.


41

TABLA II: RESULTADO DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS FRACCIONES DEL EXTRACTO CLOROFÓRMICO DEL CORAL Muricea appressa Verril 1864. _________________________________________________________ A C T I V I D A D A N T I M I C R O B I A N A __________________________________________________________ FRACCIÓN M I C R O O R G A N I S M O (1) (2) (3) (4) (5) __________________________________________________________ CII

(-) (-) (-) (-) (-) CIII (-) (-) (-) (-) (-)

CIV 10.5* 11 8 (-) (-)

CVI 9 9.5 8 (-) (-)

CVII

11 11 8 (-) (-) CVIII

8.5 7 7 (-) (-) CIX 8.5 9 7.5 (-) (-)

CC 9 12 9 (-) (-)

__________________________________________________________ MICROORGANISMOS:(1) S.aureus;(2)S.faecalis;(3)B.subtilis; (4)E. coli; (5)C.albicans. (-) = NEGATIVA * HALO DE INHIBICIÓN, en mm 7.1 Extracto de éter de petróleo (E).

El sistema de solventes (CCl4 100% y CCl4/EtOAc 5-50%)

encontrado por cromatografía en capa fina para la separación

de los componentes del extracto, fue aplicado en el


42

fraccionamiento del mismo por cromatografía en columna

obteniéndose fracciones diferentes en su contenido, así como

en el comportamiento químico y actividad.

De la fracción EI (25.7 mg) fueron obtenidos cristales

insolubles en cloroformo (2-3 mg) que se guardaron como

referencia.

La fracción EII (158.7 mg) no presentó actividad en el

músculo liso de yeyuno de conejo. Sin embargo, por su aspecto

y cromatograma observados fue sometida a un fraccionamiento

en una columna cromatográfica pequeña, obteniéndose siete

subfracciones en cantidades menores a 10 mg; y una

subfracción denominada EII-6

(8 mg) que se caracterizó por

presentar un precipitado blanco, soluble en n-heptano, la

cual fué purificada por cristalización en EtOAc. La

estructura química de estos cristales (EII-6) fue determinada

por métodos espectrométricos de RMN +H y

13C y resultó ser una

mezcla de terpenos, dejándose un remanente de casi 2 mg como

referencia.

Desafortunadamente las cantidades de cuatro de éstas

subfracciones, (EII-1

, EII-2

, EII-4

y EII-5 ) fueron insuficientes

para detectar actividad antimicrobiana y sobre el músculo

liso de yeyuno de conejo, dejándose como referencia.


43

La subfracción EII-3 (5 mg) fue empleada para determinar

actividad en músculo liso de yeyuno de conejo, resultando

inactiva.

La subfracción EII-7

obtenida, es un polvo obscuro que se

guarda como referencia (8 mg). Por su aspecto parece ser una

fracción muy impura. No se le determinó actividad.

Las fracciones EIII (117 mg); E

IV (130.6 mg) y E

V (109 mg)

son inactivas microbiológicamente.

La fracción EVI (119.7 mg) presentó actividades para

músculo liso de yeyuno de conejo, y antimicrobiana para B.

subtilis, con 10.8 mm de halo de inhibición.

La fracción EVII

(693 mg) no presentó actividad

antimicrobiana.

A las fracciones EVIII

(28.7 mg) y EIX (<10 mg) no se les

determinaron actividades debido a que la EVIII estaba muy

impura y no se obtuvo suficiente cantidad de EIX.

En resumen, de las diez fracciones obtenidas del

extracto de éter de petróleo, una fue positiva, cinco

negativas y a cuatro no se les probó actividad

antimicrobiana. Respecto a la prueba de actividad

contráctil de estas mismas fracciones, tres fueron inactivas,

una positiva y a seis no se les probó actividad.

De la fracción EII-6 fue aislada una mezcla de compuestos

terpénicos por cromatografía en columna, que mostró una sola


44

banda por cromatografía en capa fina denominada EII-6

, cuya

estructura química fue determinada por RMN +H y

13C (Fig. 4).

7.2 Extracto clorofórmico ( C )

EXTRACTO DE ÉTER DE PETRÓLEO (E)

25.7 157.2 158.7 117.2 130.6 109 119.7 <10

NO R E A L I Z A D A S INACTIVA INACTIVA INACTIVA *A

NO R E A L I Z A D A S INACTIVA N O REALIZADA ACTIVA

FRACCIONES <10 mg

*A=Staphylococcus aureus 10.5 mm de halo

Fig. 4: Fracciones obtenidas del extracto de Éter de Petróleo de Muricea appressa Verril l 1864

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10SISTEMA:CCl4/EtOAcGradiente

EI EI' EII EIII EIV EV EVI EIX

Obtenciónde cristalesinsolubles enCHCl3

Por cristalización,precipitado blanco.Estructura química porRMN +H Y 13C

EII-1 EII-2 EII-5 EII-6 EII-7

FRACCIÓNCANTIDAD, mgACTIVIDADES ANTIMICROB.CONTRÁCTIL


45

El extracto crudo clorofórmico, originó 14 fracciones al

emplear inicialmente el sistema Benceno 100% en cromatografía

en columna y dos sistemas binarios consistentes de las

mezclas Benc:EtOAc 10 % y Benc:EtOAc 20 %, lográndose así dos

fracciones casi puras durante el proceso de fraccionamiento

(Fig.5).

La primera fracción, denominada CI-1 (8 mg) por

cromatografía en capa fina de silica gel presentó una mancha,

y por cristalización en un sistema Benc:EtOAc 5:1 produjo un

compuesto puro, identificado por RMN de +H y13C como un

derivado de ácido esteárico.

La fracción CII es inactiva microbiológicamente.

La segunda fracción, conteniendo un compuesto puro,

llamada fracción CI-3, fue cristalizada en metanol,

originando un precipitado blanco denominado CI-3. Se determinó

su estructura química por métodos espectroscópicos de RMN +H

y 13C, identificándose como ácido esteárico. Los resultados de

las actividades antimicrobianas de las fracciones semipuras

obtenidas en este extracto son mostrados en la tabla II,

exceptuando la C1-3, ya que la cantidad de muestra obtenida

fue empleada para la determinación de su estructura química.

De la fracción CIV fueron obtenidos 16.4 mg y fue

comprobada su actividad contra bacterias Gram positivas,


46

dando los siguientes halos de inhibición, en mm: B. subtilis

8; S. faecalis 11 y S. aureus 10.5.

A la fracción CV no se le detectó actividad debido a la

poca cantidad obtenida.

La fracción CVI (22 mg) fue activa para B.subtilis 8 mm;

S. faecalis 9.5 mm y contra S. aureus 9 mm.

Fueron obtenidos 130.5 mg de la fracción CVII y resultó

activa para B. subtilis 8 mm; S. faecalis 11 mm; y S. aureus

11 mm.

Las fracciones CVIII

, CIX y C

C; con 97.2, 80.3 y 228 mg

respectivamente, también mostraron actividad contra los tres

mismos gérmenes Gram positivos contra los que fue activa la

fracción CVII

. De las fracciones CX, C

A y C

B fueron obtenidos

243.5, 106.5, 73.5 mg respectivamente, pero no fue probada

la actividad, por una parte, por no estar muy puras y por

otro lado, porque era prioritario la obtención de los

espectros de RMN de los compuestos puros obtenidos.

De la fracción CXI fueron obtenidos 460.7 mg pero se

encontró inactiva microbiológicamente.


47

t

*X=Bacillus subtilis de 7 a 9 mm

Y = Streptococcus faecalis de 9.5 a 12 mm

Z =Staphylococcus aureus de 9 a 14 mm

EXTRACTO CLOROFÓRMICO (C)

FRACCIÓN

CANTIDAD, mgACT. ANTIM.

NO REALIZADA 106.5INACTIVA

16.4 <10 73.5 228 80.3 460.7FRACCIONES ACTIVAS DE IV A IXPARA *X,* Y, *Z

Fig. 5: Fracciones obtenidas del extracto clorofórmico de Muricea appressa Verrill 1864

Por cristalización:precipitado blanco:CI-3Estructura química porRMN +H y 13C

CI CII CA CIII CIV CV CB CC CIX CXI

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14SISTEMA:Benc/EtOAc proporción:3:2

En sist. Benc:EtOAc 5:1una banda: CI-1. Sedetermina la estructuraquímica por RMN de +H yde 13C.


48

7.3 Actividad antimicrobiana y contráctil sobre el músculo

liso de yeyuno de conejo de fracciones semipuras de M.

Appressa Verril 1864

De las 14 fracciones obtenidas del extracto clorofórmico

por cromatografía en columna, ocho fueron probadas para

actividad antimicrobiana contra los cinco microorganismos.

Resultaron seis positivas, las cuales produjeron zona de

inhibición mayor de 6.5 mm de diámetro, mientras que para la

actividad en músculo liso de yeyuno de conejo de éste mismo

extracto, solo fué probada una fracción (CIII

), la cuál

resultó inactiva. Del extracto de éter de petróleo, fueron

probadas seis fracciones del total de diez, resultando una

positiva para actividad antimicrobiana (EVI), y de las cuatro

probadas (EI’, E

III, E

IV y E

VI) para contractilidad muscular

sólo una resultó positiva (EVI).


49

7.4 Caracterización química de los compuestos aislados

El análisis de los espectros de resonancia magnética

nuclear +H y 13C obtenidos, y los resultados de las fracciones

purificadas por cromatografía en columna (Figs. 6-10),

sugieren que:

En el extracto de éter de petróleo, la subfracción EII-6

corresponde a una mezcla de terpenos. En el espectro de RMN

de protón (Fig. 6) se observa una señal de mayor frecuencia

en 1.28 ppm que corresponde a uniones metileno, y la señal de

menor frecuencia corresponde a moléculas con enlace metilo

(0.9 ppm), moléculas con doble enlace (1.6 ppm) y moléculas

con radical carbonilo (2.0 ppm). Tomando en cuenta las

diferentes señales y tratando de encontrar los enlaces

correspondientes a las moléculas, se puede observar que son

moléculas con diferentes señales así como de estructuras

químicas y que corresponde a una mezcla de terpenos debido a

las señales.

En el extracto clorofórmico, la fracción purificada CI-3

corresponde a la molécula del ácido esteárico C18H36O2 . En el

espectro de RMN +H y

13C (Figs. 7 y 8) se pueden observar que

de las 19 señales, las más sobresalientes por su frecuencia y

grupos que contiene, están situadas a 1.19 (protones

metilenos); 1.5 (metilenos del grupo carbonilo), 0.88 (protón

metilo), mientras que en el espectro de 13C se observa una


50

señal en 14.02 ppm para el grupo metilo; las de los

metilenos (22.6-29.59) y las de los protones de grupos ácido

a campo bajo principalmente, y se encuentra una correlación

directa con el peso molecular, obtenido de la suma de los

pesos de los átomos registrados en el espectro

correspondiente a los 284 daltones, que es el de la fórmula

del ácido esteárico.

En los espectros de las figuras 9 y 10 se observan

señales del grupo metilo en ambos espectros (0.88 y 14.03

respectivamente) y también hay 12 señales (22.6 a 34.34 ppm),

que corresponden a grupos metilenos en 13C y a protones de

metilenos (1.25 ppm) en RMN +H, también se observan señales

en el espectro de 13C en 64.29 y en 173.29 que corresponden a

protones en un ambiente de enlace tipo ester y al radical

carbonilo respectivamente. Debido a la cantidad de señales y

a los grupos funcionales que se presentan en los espectros,

se observa que corresponde a un compuesto puro (CI-1

) derivado

del ácido esteárico. Las señales coinciden con las del ácido

esteárico tanto en el espectro de protón como de 13C.


51

HC = CH

-CH3

Fig. 6: Espectro de 1H de RMN correspondiente a la mezcla de terpenos (EII-6)

-CH2

MEZCLA DE TERPENOS

CDCl3


52

CH2-

δ=1.2

CH3-

δ=0.8

Fig.7: Espectro de RMN 1H correspondiente al ácido esteárico (CI-3)

ÁCIDO ESTEÁRICO CH3 (CH2)16 COOH

CH3CH2 C=O

δ=1.6

δ=2.3

CH2-C=O‘

CDCl3


53


54


55

8.- DISCUSIÓN


56

Las publicaciones o investigaciones consultadas (Benito-

Pruna et al., 1982; Del Rio et al., 1989; Hardee y

Wickestern, 1996 y en la revisión de la base de datos

Marinelit (1999)) sobre el orden Gorgonacea, no reportan

bioactividad en extractos de Muricea appressa Verril 1864, lo

que dificulta su estudio comparativo respecto a estas

pruebas. Por esto, en términos generales puede considerarse

al presente estudio como un apoyo para el conocimiento de

metabolitos bioactivos presentes en estos organismos.

Los extractos crudos de Muricea appressa, Verrill 1864 a

los que se expusieron las bacterias, contenían

concentraciones extremadamente altas de metabolitos y otras

moléculas semipuras, que no se expresan naturalmente a esos

niveles, sin embargo, no resultaron activos para el ensayo de

actividad antimicrobiana por el método de difusión en agar.

Posiblemente esto ocurrió porque existen compuestos

modificados estructuralmente o porque se diluye el efecto

del compuesto activo, con la presencia de los otros

componentes.

Para la actividad en músculo liso de yeyuno de conejo

se observó que la concentración de moléculas bioactivas fue

la adecuada para producir reacción, especialmente los

extractos crudos de éter de petróleo y clorofórmico. Es

posible que existan otras fracciones de las no probadas

hasta el momento y que puedan presentar esta actividad.


57

Considerando que las pruebas realizadas se hicieron

para detectar la actividad, las determinaciones posteriores

fueron las que guiaron a la detección de fracciones y

compuestos activos. El efecto de estas últimas pudo verse

afectado por factores como: concentración, humedad, luz,

oxidación, sobrecalentamiento, impurezas del solvente y

constituyentes del medio (Rios et al., 1988; Smith et al.,

2000).

Debido a que no hay un método estandarizado para

expresar los resultados de escrutinio en sensibililidad

bacteriana hacia antimicrobianos, algunos autores usan el

diámetro de los halos de inhibición y/o el peso mínimo de

extracto que inhibe el crecimiento de un microorganismo (Ríos

et al., 1988). En nuestro caso, empleamos el diámetro del

halo de inhibición, incluyéndose el diámetro del sensidisco

empleado para cada fracción probada, considerándose un

resultado positivo si se obtenía un diámetro mayor que 6.5

mm. Se usó éste debido a que ha dado resultados

satisfactorios con controles de antimicrobianos y para estas

cepas en estudio en el laboratorio (Encarnación et al.,

1994).

En relación al bajo porcentaje de fracciones con

actividad antimicrobiana positiva del extracto de éter de

petróleo obtenidas, Jensen et al., (1996) mencionaron que

puede deberse a que las bacterias asociadas comunmente con la


58

superficie de gorgonias no son inhibidas por compuestos

secundarios producidos por este invertebrado, por lo que

parece que no es la función ecológica principal de los

compuestos secundarios de las gorgonias.

También es posible que no ocurra inhibición bacteriana

por los extractos debido a que las bacterias que colonizan la

superficie del coral son capaces de producir bio-películas y

son mucho menos susceptibles a antibioticos que las bacterias

que crecen libremente en medio de cultivo (Desnottes, 1996,

Costerton et al., 1999). En nuestro caso, el bajo porcentaje

de actividad antimicrobiana obtenido en este extracto, puede

deberse a que no se emplearon cepas bacterianas marinas y

esto pudo haber modificado el resultado o bién a que la

molécula no difunde en el agar.

Es de tomar en consideración que las fracciones

estudiadas para actividades, indiquen que las gorgonias

mantengan defensas químicas inducibles, o metabolitos

secundarios inhibidores de bacterias no probadas en éste

estudio, defensas químicas que no fueron obtenidas del tejido

del animal y defensas químicas que funcionan por mecanismos

diferentes que el de toxicidad como la que se detecta en el

ensayo de difusión en agar o en músculo liso de yeyuno de

conejo.

Desde el punto de vista del procedimiento para obtener

los dos compuestos puros y una mezcla de terpenos, se puede


59

considerar como un método sencillo, rápido y seguro. Sin

embargo, con mucha perseverancia y paciencia, se pueden

obtener resultados iguales o todavía más alentadores que los

hasta el momento se han logrado, como por ejemplo, obtener un

compuesto nuevo.

Una interpretación conservadora de los resultados del

ensayo de actividad antimicrobiana por difusión en agar, que

está basado en lo concerniente a los bajos niveles de

actividad, puede deberse a artefactos producidos in situ

durante el procedimiento de extracción y el procedimiento de

la prueba. Por ejemplo, moléculas de las posibles zooxantelas

(debido al color de Muricea), derivadas del endosimbionte de

corales gorgonianos, como algunos ácidos grasos presentes en

los extractos, pueden degradar la clorofila y estos

productos pueden presentar actividad antibacteriana débil

(Jensen et al., 1996). También es posible que la interacción

física del extracto y bacteria cause pequeñas zonas de

inhibición.

En las fracciones obtenidas de las columnas

cromatográficas del extracto de éter de petróleo, se observó

actividad antimicrobiana para bacterias Gram positivas. Esto

indica que algunos tipos de moléculas presentes en el

extracto etéreo de Muricea appressa penetran al procariote o

de alguna forma se combinan con las moléculas de la pared, o


60

con algunas proteínas celulares e impiden su proliferación en

el medio de cultivo (Lennette, 1985).

El extracto clorofórmico tiene fracciones que desde el

punto de vista cromatográfico, son muy interesantes de

continuar investigando para separar los componentes y definir

su estructura química, ya que posee sustancias a las que es

susceptible el Bacillus subtilis por ejemplo, y es posible

que puedan poseer otras actividades biológicas, diferentes a

las efectuadas en este trabajo de tesis.

Con el hallazgo de dos moléculas puras: ácido esteárico

y derivado de ácido esteárico en el extracto clorofórmico y

la mezcla de terpenos en el extracto de éter de petróleo,

aunque pertenecen a familias de compuestos ya conocidos y

encontradas en corales blandos (Coll et al., 1978; Bandurraga

et al., 1982 ; Fenical, 1987) llama la atención que tanto el

ácido esteárico como su derivado, se encuentren en el mismo

extracto clorofórmico. Esto ocurre posiblemente a que ambas

moléculas se encuentran en diferentes etapas de síntesis,

pero en la misma vía metabólica para la elaboración de

moléculas más complejas que podrían ser la ruta metabólica de

la elaboración de prostaglandinas, las cuales se sintetizan a

partir de ácidos grasos (Scheuer, 1995), las cuales son

necesarias para la subsistencia y conservación evolutiva

propia del coral en estudio.


61

Es difícil saber cuantos compuestos tiene la mezcla de

terpenos aislada por cromatografía en columna y que

estructuras poseen. Químicamente son compuestos diferentes

(figs. 6 y 7), pero debido a la poca cantidad de material

obtenida de ésta fracción, no fué posible proceder a su

purificación.

Lo que podría explicar el hallazgo de los compuestos

terpénicos, el ácido esteárico y su derivado, es que en una

de las reacciones de la vía metabólica, a partir de estos

compuestos, los corales gorgonianos sintetizan

prostaglandinas, aunque en concentraciones pequeñas que son

difíciles de detectar en el género Muricea, pero no en otras

especies como Plexaura. (Scheuer, 1989; Di-Marzo, et al.,

1996).

No se detectó actividad antimicrobiana de amplio

espectro (para varias cepas de microorganismos) como se ha

observado en otros invertebrados marinos y macroalgas (Amico,

1995), pero la incidencia de actividad contra cepas Gram

positivas fué más alta comparada con cepas Gram negativas.

Esto sugiere que M. appressa presenta sustancias con

actividad contra tipos específicos de bacterias. Una

explicación alterna es que las bacterias Gram positivas

carecen de una membrana externa cuya función puede influir en

su protección a los antibióticos (Goodman y Gilman, 1982).


62

Debido a que se detectó una mayor cantidad de fracciones

en el extracto clorofórmico positivas para actividad

antimicrobiana, que en el extracto de éter de petróleo, puede

suponerse que el primero presenta moléculas con mayor

cantidad de fracciones con propiedades antimicrobianas que el

extracto de éter de petróleo para las cepas probadas en este

estudio.

9.- CONCLUSIONES

Los extractos de éter de petróleo* y clorofórmico**,

crudos, de Muricea appressa Verrill 1864 son inactivos

microbiológicamente a la concentración probada por el método

de difusión en agar. Hubo actividad tanto antimicrobiana (CIV,

CVI, CVII, CVIII, CIX y CC) como contráctil (EVI) en el músculo

liso de yeyuno de conejo de algunas de las fracciones

semipuras obtenidas lo que indica la presencia de substancias

bioactivas.

*La mezcla de terpenos EII-6, se encuentra en el extracto

de éter de petróleo.

**El ácido esteárico (C1-1

) y su derivado (C1-3), ambos en

forma pura, se pudieron aislar del extracto clorofórmico

mediante las técnicas de cromatografía en capa fina y en

columna.


63

10.- RECOMENDACIONES

Se sugiere la utilización del sistema de solventes por

gradiente en el procedimiento de cromatografía en columna, ya

que se obtuvo una mayor cantidad de fracciones con

actividades biológicas efectivas y además se aislaron de una

manera más fácil los compuestos puros.

En vista de no haber encontrado información reciente y

actualizada del coral Muricea appressa Verrill 1864, sería

conveniente continuar con la investigación, iniciando con

obtener mayor cantidad de extractos, de preferencia del

clorofórmico, que es donde puede haber más compuestos

biológicamente activos del coral objeto de estudio.

Determinar por métodos espectroscópicos si hay otras

moléculas que puedan ser las responsables de la actividad

antimicrobiana detectada en las fracciones que resultaron

positivas.

Obtener mayor cantidad de la fracción portadora de la

mezcla de terpenos (etérea); sería conveniente su posterior

purificación y la elucidación de la estructura de los

terpenos que la constituyen, ya que alguna de estas moléculas

podría tener una estructura química nueva; y determinar si

presentan o no actividad antimicrobiana, así como su efecto

sobre la contractilidad del músculo de yeyuno de conejo.


64

11.- A N E X O

Medios de cultivo empleados Agar sal manitol Fórmula para 1000 ml de agua destilada Extracto de carne 1.000 g Peptona de carne 5.000 g Peptona de caseína 5.000 g Cloruro de sodio 75.000 g D- Manitol 10.000 g Agar 15.000 g Rojo fenol 0.025 g pH final 7.4 Medio de Agar sabouraud dextrosa Glucosa 40 g Peptona 10 g Agar 15 g Agua destilada 1 l. pH final 5.6 Medio de Müeller Hinton Para 1000 ml de agua destilada: Extracto de carne 2 .0 g Peptona de caseína H 17.5 g Almidón 1.5 g Agar 17.0 g pH final 7.4


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