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SISTEMA NACIONAL DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA FITOSANITARIA

2012SINAVEFSISTEMA NACIONAL DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA FITOSANITARIA

INFORME TÉCNICO

Red Mexicana de Aerobiología para laVigilancia Epidemiológica Fitosanitaria

6.4 INFORME FINAL DEL PROYECTO DE ROYA ANARANJADA ENTREGADA AL DR. TRUJILLO EN AGOSTO DE 2012

INFORME FINAL DEL PROYECTO DE ROYA ANARANJADA ENTREGADA AL DR. TRUJILLO EN AGOSTO DE 2012 AVANCES DEL TRABAJO REALIZADO DURANTE 2012 DEL PROYECTO: Monitoreo aerobiológico y detección molecular de urediniosporas de Puccinia kuehnii causante de roya anaranjada de la caña de azúcar de cultivos infectados o en riesgo: desarrollo de la Red Mexicana de Aerobiología de San Luis Potosí. AVANCES DEL PROYECTO SEGÚN OBJETIVOS PLANTEADOS 2012: OBJETIVO GENERAL

� Monitorear el aire, identificar y detectar mediante biología molecular urediniosporas de Pucinia kuehnii, causante de roya anaranjada en las principales zonas cañeras de San Luis Potosí, y determinar las zonas infectadas o en riesgo para alertar en tiempo y espacio a los productores cañeros de la zonas evaluadas.

Objetivos particulares

� Identificar y cuantificar las urediniosporas de Puccinia kuehnii de muestras

colectadas del aire y de plantas de parcelas centinelas o cultivos de caña de azúcar (Saccharum officinarum) de las zonas cañeras de San Luis Potosí.

� Evaluar el potencial de detección del ADN específico de urediniosporas de Puccinia kuehnii mediante la prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y PCR en tiempo real (QPCR) para estimar su concentración en el aire a través de un ciclo agrícola, y determinar su presencia en el ambiente antes de que infecten a las plantas o que éstas presenten signos de la enfermedad.

� Establecer los métodos de identificación y detección molecular de esta roya y

establecer una vigilancia en los diferentes municipios en los que se ha registrado la enfermedad o se encuentran en riesgo, con el fin de establecer la Alerta Epidemiológica Fitosanitaria de manera permanente en el estado de San Luis Potosí.

Hipótesis Si las uredosporas de Pucinia kuehnii se encuentran en el aire de cultivos de caña de azúcar de San Luis Potosí, será posible detectar su presencia y concentración mediante biología molecular, incluso antes de que las plantas muestren los primeros signos de la enfermedad.

MÉTODOS:

Los equipos aerobiológicos seleccionados fueron:

A) Trampa de esporas tipo Hirst (TETH) (Burkard Manufacturing CO, UK). B) Trampas pasivas de esporas (TPE). C) Muestreador ciclón de superficie.

1) SELECCIÓN DE LAS REGIONES GEOGRÁFICAS PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA FITOSANITARIA DE LA ROYA ANARANJADA EN LA HUASTEVCA POTOSINA.

El presente estudio se llevó a cabo en coordinación y con el apoyo del SINAVEF-‐SENASICA-‐SAGARPA y del Comité Estatal de Sanidad Vegetal de la Planicie Huasteca (Anexo 1 y 2). La zona de estudio y los sitios de muestreo de urediniosporas de Puccinia kuehnii causantes de roya anaranjada de la caña de azúcar en la Huasteca Potosina se muestra en las figuras 1 a 3.

Fig. 1. Muestreo aerobiológico de la roya anaranjada, la flecha indica la zona de la Huasteca Potosina en donde se llevó a cabo el estudio. En la tabla 2 y figura 2 se muestran las áreas propuestas para elaborar el mapa de riesgo de dispersión de las urediniosporas causantes de la roya anaranjada, el cual fue diseñado partiendo de la primera detección positiva del hongo Puccinia kuehnii detectado en la localidad de El Higo y con base en las condiciones climáticas como temperatura, humedad, precipitación, dirección y velocidad de vientos. La instalación de las Trampas Pasivas de Esporas (TPE) se realizó en 12 áreas

Tabla 2. Áreas propuestas para la localización de las Trampas de Esporas pasivas

Fig. 2.

Los

círculos verdes indican los sitios en los diferentes Municipios en los que se instalaron las trampas pasivas de esporas pasivas y la flecha roja muestra la zona de El Higo en donde fue colocada la la trampa de esporas tipo Hirst. En la tabla 3 se indican los municipios y localidades en donde fueron instaladas las Trampas Pasivas de Esporas y la Trampa de Esporas tipo Hirst, así como las coordenadas geográficas, el hospedero y la variedad de caña de azúcar sembrada.

Punto Distancia a punto positivo

Ruta o SIVE Estacion meteorologica

Días favorables para la germinación (anual)

Días favorables para la esporulación (anual)

Cercania a localidades y carreteras

Zonas con muestreo

Área 1 < 5 km Ruta 4 y SIVE 7 6 SMN (2 -‐5 km) 1 INIFAP (2 km)

80 -‐100 días 117 -‐136 días Entre 0.2 y 3 km Si

Área 2 5 -‐10 km Ruta 4 (8 km) y SIVE 7 (14 km)

5 SMN (7 -‐10 km) 1 INIFAP (10 km)

80 -‐100 días 117 -‐136 días Entre 0.2 y 2 km Si

Área 3 20 -‐30 km Ruta 5 (18 km) y SIVE 8 -‐9 (21 km)

4 SMN (0.5 -‐4 km) 80 -‐100 días 117 -‐136 días Entre 0.1 y 1.6 km no

Área 4 30 -‐40 km Ruta 5 (0.1 km) y SIVE 9 (1 km)

4 SMN (2 -‐5 km) 1 INIFAP (11 km)

80 -‐100 días 117 -‐136 días < 1 km si

Área 5 30 -‐40 km Ruta 5 (7 -‐21 km) 7 SMN (1 -‐8 km) 1 INIFAP (2 -‐20 km)

80 -‐100 días 117 -‐136 días Entre 1 y 5 km si


80 -‐100 días 117 -‐136 días Entre 0.9 y 2 km si


80 -‐136 dias 117 -‐136 días Entre 0.2 y 2 km si

Área 8 60 -‐70 km Ruta alejada 20 km

5 SMN (4 -‐8 km) 3 INIFAP (0.2 -‐7 km)

80 -‐136 dias 120 -‐183 días Entre 1 y 5 km si


9 SMN (2 -‐16 km) 3 INIFAP (4 -‐10 km)

100 -‐136 días 120 -‐183 días Entre 0.5 y 2 km si


10 SMN (2 -‐16 km) 2 INIFAP (2 -‐5 km)

117 -‐136 dias 120 -‐183 días Entre 0.5 y 4 km si


4 SMN (1 -‐8 km) 1 INIFAP (10 km)

100 -‐136 días 120 -‐151 dias Entre 0.1 y 1 km si

Área 12 > 100 km Sin rutas 9 SMN (2 -‐30 km) 3 INIFAP (2 -‐10 km)

131 -‐214 dias 28 -‐92 dias si

Tabla 3. Sitios de muestreo donde fueron colocadas las trampas pasivas de esporas y la trampa de esporas tipo Hirst (El Higo)

ID CLAVE TRAMPA MUNICIPIO LOCALIDAD LATITUD LONGITUD HOSPEDERO VARIEDAD

1 TPK 01 San Vicente El Higo 21.782545 -‐98.463382 Caña de Azúcar CP 72-‐2086

2 TPK 02 San Vicente Nieves 21.707381 -‐98.609666 Caña de Azúcar CP 72-‐2087

3 TPK 03 Tamuin Ing. Carrera 21.969185 -‐98.720184 Caña de Azúcar MEX 79-‐431

8 TPK 08 Cd. Valles Cien Fuegos 21.855906 -‐98.868478 Caña de Azúcar CP 72-‐2086

9 TPK 09 Cd. Valles Antiguo Tambolon 21.833609 -‐98.960650

Caña de Azúcar CP 72-‐2086

10 TPK 10 Cd. Valles Tantobal 21.789010 -‐98.950444 Caña de Azúcar CP 72-‐2086

11 TPK 11 Tancanhuitz Las Armas 21.700747 -‐98.964623 Caña de Azúcar CO 997

12 TPK 12 Cd. Valles Laguna Del Mante 22.195830 -‐99.004920

Caña de Azúcar MEX 79-‐431

13 TPK 13 Cd. Valles Ignacio Zaragoza 22.290720 -‐99.145460

Caña de Azúcar

MEX 68-‐1345

14 TPK 14 Cd. Valles Campo Negro 22.130485 -‐99.209777 Caña de Azúcar CP 72-‐2086

15 TPK 15 El Naranjo Buena Vista 22.351009 -‐99.262634 Caña de Azúcar RD 75-‐11

16 TPK 16 El Naranjo Minas Viejas 22.398986 -‐99.33284 Caña de Azúcar CP 72-‐2086

17 TPK 17 Cd. Valles La Loma 22.061185 -‐99.117871 Caña de Azúcar MEX 79-‐431

18 TPK 18 Tambaca Los Peñas 21.971340 -‐99.299350 Caña de Azúcar CP 72-‐2086

19 TPK 19 Tambaca Agua Buena 21.965200 -‐99.381900 Caña de Azúcar MEX 79-‐431

Trabajo de laboratorio desarrollado

Se procesaron muestras provenientes de 6 municipios en 15 localidades de la Huasteca Potosina. Las muestras correspondieron a cada TPE y a las de la TEH (colocado en la zona de El Higo) se procesaron para su revisión al microscopio y para su análisis molecular. Identificación directa al microscopio Se realizó la revisión semanal de cada muestra al microscopio óptico en busca de urediniosporas de Puccinia kuehnii, y cuando se observaron posibles urediniosporas sospechosas se procedió a su análisis molecular utilizando oligonucleótidos específicos para su detección.

RESULTADOS DE LAS MUESTRAS COLECTADAS EN LAS ESTACIONES DE MONITOREO DE

Puccinia kuehnii DE LA HUASTECA, San Luis Potosi:

Los muestreos del aire iniciaron el 5 de diciembre de 2011. En las tablas 4 a xxx se indican las fechas de muestreo y el diagnóstico positivo o negativo con respecto a la presencia de urediniosporas de Puccinia kuehnii observadas al microscopio óptico de cada muestra.

Tabla 4. Muestras obtenidas de la Trampa de esporas tipo Hirst del 31 de diciembre de 2011 al 26 de febrero del 2012 y resultados del diagnóstico. Laminita Diagnóstico Laminita Diagnóstico 31/12/11 Negativo 29/01/12 Negativo 01/01/12 Negativo 30/01/12 Negativo 02/01/12 Negativo 31/01/12 Negativo 03/01/12 Negativo 01/02/12 Negativo 04/01/12 Negativo 02/02/12 Negativo 05/01/12 Negativo 03/02/12 Negativo 06/01/12 Negativo 04/02/12 Negativo 07/01/12 Negativo 04/02/12 Negativo 07/01/12 Negativo 05/02/12 Negativo 08/01/12 Negativo 06/02/12 Negativo 09/01/12 Negativo 07/02/12 Negativo 10/01/12 Negativo 08/02/12 Negativo 11/01/12 Negativo 09/02/12 Negativo 12/01/12 Negativo 10/02/12 Negativo 13/01/12 Negativo 11/02/12 Negativo 14/01/12 Negativo 11/02/12 Negativo 14/01/12 Negativo 12/02/12 Negativo 15/01/12 Negativo 13/02/12 Negativo 16/01/12 Negativo 14/02/12 Negativo 17/01/12 Negativo 15/02/12 Negativo 18/01/12 Negativo 16/02/12 Negativo 19/01/12 Negativo 17/02/12 Negativo 20/01/12 Negativo 18/02/12 Negativo 21/01/12 Negativo 18/02/12 Negativo 21/01/12 Negativo 19/02/12 Negativo

MUESTRAS DE LAS TRAMPAS PASIVAS DE EPSORAS

22/01/12 Negativo 20/02/12 Negativo 23/01/12 Negativo 21/02/12 Negativo 24/01/12 Negativo 22/02/12 Negativo 25/01/12 Negativo 23/02/12 Negativo 26/01/12 Negativo 24/02/12 Negativo 27/01/12 Negativo 25/02/12 Negativo 28/01/12 Negativo 25/02/12 Negativo 28/01/12 Negativo 26/02/12 Negativo

Tabla 5. Muestras obtenidas de las trampas pasivas de esporas del 14 de marzo al 28 de marzo del 2012 (15 días continuos de muestreo) y resultados del diagnóstico. Laminita Diagnóstico TPK01 Negativo TPK02 Negativo TPK03 Negativo TPK04 Negativo TPK05 Negativo TPK06 Negativo TPK07 Negativo TPK08 Negativo TPK09 Negativo TPK10 Negativo TPK11 Negativo TPK12 Negativo TPK13 Negativo TPK15 Negativo TPK16 Negativo TPK17 Negativo TPK18 Negativo TPK19 Negativo TPK20 Negativo TPK21 Negativo TPK22 Negativo

Tabla 6. Muestras obtenidas de las Trampas pasivas de esporas del 28 de marzo al 11 de abril del 2012 (15 días continuos de muestreo) y resultados del diagnóstico. Laminita Diagnóstico TPK01 Negativo TPK02 Negativo TPK03 Negativo TPK04 Negativo TPK05 Negativo TPK06 Negativo TPK07 Negativo TPK08 Negativo TPK09 Negativo TPK10 Negativo TPK11 Negativo TPK12 Negativo TPK13 Negativo TPK14 Negativo TPK15 Negativo TPK16 Negativo TPK17 Negativo TPK18 Negativo TPK19 Negativo TPK20 Negativo TPK21 Negativo TPK22 Negativo

Tabla 7. Muestras obtenidas de las Trampas pasivas de esporas del 11 de abril al 25 de abril y resultados del diagnóstico. Laminita Diagnóstico TPK01 Negativo TPK02 Negativo TPK03 Negativo TPK04 Negativo TPK05 Negativo TPK06 Negativo TPK07 Negativo TPK08 Negativo TPK09 Negativo TPK10 Negativo TPK11 Negativo TPK12 Negativo TPK13 Negativo TPK14 Negativo TPK15 Negativo TPK16 Negativo TPK17 Negativo TPK18 Negativo TPK19 Negativo TPK20 Negativo TPK21 Negativo TPK22 Negativo

Tabla 8. Muestras obtenidas de las Trampas pasivas de esporas del 9 al 23 de mayo de 2012 (15 días continuos de muestreo) y resultados del diagnóstico. Laminita Diagnóstico TPK01 Una urediniospora sospechosa TPK02 Negativo TPK03 Negativo TPK04 Negativo TPK05 Negativo TPK06 Negativo TPK07 Negativo TPK08 Negativo TPK09 Negativo TPK10 Negativo TPK11 Negativo TPK12 Una urediniospora sospechosa TPK13 Negativo TPK14 Negativo TPK15 Negativo TPK16 Negativo TPK17 Una urediniospora sospechosa TPK18 Negativo TPK19 Negativo TPK20 Negativo TPK21 Negativo TPK22 Negativo

Tabla 9. Muestras obtenidas con las trampas pasivas de esporas del 23 de mayo al 10 de julio de 2012 y los resultados del diagnóstico (REVISADAS EN SAN UIS POTOSI).

TRAMPA DE ESPORAS TIPO HIRST

Tabla 10. Muestras obtenidas de la trampa de esporas tipo Hirst del 5 al 31de diciembre de 2011 y resultados del diagnóstico. Fecha Diagnóstico 05/12/11 Negativo 06/12/11 Negativo 07/12/11 Negativo 08/12/11 Negativo 09/12/11 Negativo 10/12/11 Negativo 11/12/11 Negativo 12/12/11 Negativo 13/12/11 Negativo 14/12/11 Negativo 15/12/11 Negativo 16/12/11 Negativo 17/12/11 Negativo 18/12/11 Negativo 19/12/11 Negativo 19/12/11 Negativo 20/12/11 Negativo 21/12/11 Negativo 22/12/11 Negativo 23/12/11 Negativo 24/12/11 Negativo 24/12/11 Negativo 25/12/11 Negativo 26/12/11 Negativo 27/12/11 Negativo 28/12/11 Negativo 29/12/11 Negativo 30/12/11 Negativo 31/12/11 Negativo

Tabla 11. Muestras obtenidas de la Trampa de esporas tipo Hirst del 27 de febrero de 2011 al 24 de marzo del 2012 y resultados del diagnóstico. Laminita Diagnóstico 27/02/12 Negativo 28/02/12 Negativo 29/02/12 Negativo 01/03/12 Negativo 02/03/12 Negativo 03/03/12 Negativo 03/03/12 Negativo 04/03/12 Negativo 05/03/12 Negativo 06/03/12 Negativo 07/03/12 Negativo 08/03/12 Negativo 09/03/12 Negativo 10/03/12 Negativo 10/03/12 Negativo 11/03/12 Negativo 12/03/12 Negativo 13/03/12 Negativo 14/03/12 Negativo 15/03/12 Negativo 16/03/12 Negativo 17/03/12 Negativo 17/03/12 Negativo 18/03/12 Negativo 19/03/12 Negativo 20/03/12 Negativo 21/03/12 Negativo 22/03/12 Negativo 23/03/12 Negativo 24/03/12 Negativo

Tabla 12. Muestras obtenidas de la Trampa de esporas tipo Hirst del 24 de marzo al 21 de abril y resultados del diagnóstico. Laminita Diagnóstico 24/03/12 Negativo 25/03/12 Negativo 26/03/12 Negativo 27/03/12 Negativo 28/03/12 Negativo 29/03/12 Negativo 30/03/12 Negativo 31/03/12 Negativo 31/03/12 Negativo 01/04/12 Negativo 02/04/12 Negativo 03/04/12 Negativo 04/04/12 Negativo 05/04/12 Negativo 06/04/12 Negativo 07/04/12 Negativo 07/04/12 Negativo 08/04/12 Negativo 09/04/12 Negativo 10/04/12 Negativo 11/04/12 Negativo 12/04/12 Negativo 13/04/12 Negativo 14/04/12 Negativo 14/04/12 Negativo 15/04/12 Negativo 16/04/12 Negativo 17/04/12 Negativo 18/04/12 Negativo 19/04/12 Negativo 20/04/12 Negativo 21/04/12 Negativo

MUESTRAS 01/AGOSTO/2012 AL 26/AGOSTO/ 2012 MUESTRAS REVISADAS POR DR BENJAMIN Y QUE NUNCA ME LLEGÓ EL DIAGNOSTICO Y QUE PROBABLEMETNE YA TENIAN SOSPECHOZAS DE ROYA ANARANJADA

NEGATIVAS (?) estas muestras fueron revisadas en SLP, pero no HAY ninguna confirmación ni recepción de dichas muestras para re-analizarlas y comprobar el diagnóstico)

Tabla 13. Muestras obtenidas de la Trampa de esporas tipo Hirst del 09 de junio al 31 de julio y resultados del diagnóstico. Fecha de muestreo

Diagnóstico Fecha de muestreo

Diagnóstico Fecha de muestreo

Diagnóstico

09/06/12 Negativo 06/07/12 Negativo 20/07/12 Negativo 10/06/12 Negativo 07/07/125 Negativo 21/07/12 Negativo 11/06/12 Negativo 08/07/12 Negativo 22/07/12 Negativo 12/06/12 Negativo 09/07/12 Negativo 23/07/12 Negativo 13/06/12 Negativo 10/07/12 Negativo 24/07/12 Negativo 14/06/12 Negativo 11/07/12 Negativo 25/07/12 Negativo 15/06/12 Negativo 12/07/12 Negativo 26/07/12 Negativo 16/06/12 Negativo 13/07/12 Negativo 27/07/12 Negativo 30/06/12 Negativo 14/07/12 Negativo 28/07/12 Negativo 01/07/12 Negativo 15/07/12 Negativo 29/07/12 Negativo 02/07/12 Negativo 16/07/12 Negativo 30/07/12 Negativo 03/07/12 Negativo 17/07/12 Negativo 31/07/12 Negativo 04/07/12 Negativo 18/07/12 Negativo 05/07/12 Negativo 19/07/12 Negativo

Tabla 14. Muestras obtenidas con la Trampa de esporas tipo Hirst del 28 julio al 15 de agosto y los resultados del diagnóstico

CLAVE (PK11), FECHA Diagnóstico 28/07/2012 POSITIVO 29/07/2012 POSITIVO 30/07/2012 POSITIVO 31/07/2012 POSITIVO 01/08/2012 POSITIVO 02/08/2012 POSITIVO 03/08/2012 POSITIVO 04/08/2012 POSITIVO 05/08/2012 POSITIVO 06/08/2012 POSITIVO 07/08/2012 POSITIVO 08/08/2012 POSITIVO 09/08/2012 POSITIVO 10/08/2012 POSITIVO 11/08/2012 POSITIVO 12/08/2012 POSITIVO 13/08/2012 POSITIVO 14/08/2012 POSITIVO 15/08/2012 POSITIVO

2) Detección de urediniosporas por PCR en punto final

La evaluación de sensibilidad en la detección del ADN de las urediniosporas de Puccinia kuehnii colectadas del aire y validación de los métodos utilizados se realizó utilizando las urediniosporas colectadas con el muestreador ciclón de superficie de hojas infectas de caña de azúcar.

La urediniosporas colectadas de hojas de caña de azúcar infectadas fueron utilizadas para hacer curvas de detección.

Tabla 15. Muestras obtenidas con las trampas pasivas de esporas del 10 de julio al 28 julio de 2012 y los resultados del diagnóstico No. de muestra Fecha de muestreo Diagnóstico TPK1 10/07/2012-‐21/08/2012 Negativo TPK2 10/07/2012-‐21/08/2012 Negativo TPK3 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK8 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK9 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK10 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK11 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK12 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK13 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK14 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK15 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK16 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK17 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK18 18/07/2012-‐01/08/2012 Negativo TPK19 21/08/2012-‐12/09/2012 Negativo

En la figura 3 se muestra la curva de concentración de 0 a 3275 urediniosporas. Se observa que fue posible detectar el ADN a partir de 10 urediniosporas hasta 3275.

Fig. 3. Curva de concentración de urediniosporas de Puccinia kuehnii: 1) Marcador molecular 100 pb, 2)Testigo positivo, 3)Testigo negativo, 4) 0 urediniosporas, 5) 1 urediniospora 6) 10 urediniosporas, 7) 100 urediniosporas, 8) 1000 urediniosporas, 9) 3275 urediniosporas.

Muestras de aire colectadas de campo Las muestras colectadas del campo fueron revisadas al microscopio y aquellas que mostraron urediniosporas sospechosas de pertenecer a P. kuehnii, fueron procesadas con la prueba de PCR, utilizando oligonucleótidos específicos para su detección. En la figura 4 a y b, se muestran las detecciones positivas de las muestras colectadas con la TEH del 28/07/2012 al 11/08/2012.

Fig. 4a. Muestras del aire de campos de caña de azúcar con la Trampa de esporas tipo Hirst tomadas de la zona del El Higo, SLP, del 28/07/2012 al 09/08/2012. 1)Marcador molecular 100 pb, 2)Testigo positivo, 3) Testigo negativo, 4) Cinta 28-‐07-‐2012, 5) Cinta 29-‐07-‐2012, 6)Cinta 30-‐07-‐2012, 7) Cinta 31-‐07-‐2012, 8)Cinta 01-‐08-‐2012, 9) Cinta 02-‐08-‐2012, 10) Cinta 03-‐08-‐2012, 11) Cinta 04-‐08-‐2012, 12) Cinta 04-‐08-‐2012, 13) Cinta 05-‐08-‐2012, 14) Cinta 06-‐08-‐2012, 15) Cinta 07-‐08-‐2012, 16) Cinta 08-‐08-‐2012, 17) Cinta 09-‐08-‐2012.

Fig. 4b. Muestras del aire de campos de caña de azúcar con la Trampa de Esporas tipo Hirst tomadas de la zona del El Higo, SLP, del 21/08/2012 al 11/08/2012: 1)Marcador molecular 100 pb, 2)Testigo positivo, 3) Testigo negativo, 4) Cinta 10-‐08-‐2012, 5) Cinta 11-‐08-‐2012. 3) Detección de ADN de urediniosporas colectada del aire de cultivos de caña azúcar por QPCR (PCR en tiempo real)

La detección de las urediniosporas por QPCR se realizará en la segunda etapa del estudio ya que el termociclador para QPCR acaba de ser adquirido (octubre), así como el equipo Nanodrop para cuantificar la cantidad de ADN de las muestras procesadas para poder hacer las curvas correspondientes para la detección en QPCR

Como resultado de los avances realizados en el presente proyecto también se realizaron dos Manuales: El Manual de monitoreo aerobiológico de urediniosporas de la roya anaranjada en cultivos de caña de azúcar y el Manual de Diagnóstico molecular de urediniosporas colectadas del aire de cultivos de caña de azúcar. Ambos manuales fueron entregados a la Dirección General de Sanidad Vegetal del Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA)-‐SAGARPA. Se anexan al presente informe ambos manuales.

527 pb

CONSIDERACIONES PARA REALIZAR EN LA SEGUNDA ETAPA DEL ESTUDIO Los resultados obtenidos en esta primer año del proyecto aportaron sugerencias para mejorar el trabajo de campo que se continuará realizando en los cultivos de caña de azúcar, para lo cual se sugiere lo siguiente: 1) Se recomienda cambiar el aditivo de vaselina con hexano, por silicona, tanto para los

porta objetos utilizados en la TPE como en la TEH por silicona, esto se debe a que en zonas con temperatura por arriba de los de 30 ºC la vaselina se derrite, mientras que la silicona soporta temperaturas hasta de 150º.

2) Las trampas pasivas de esporas deben ser cambiadas cada 7 dias, máximo cada 15 dias en época de secas, mientras que en época de lluvias cada 7 días. Aunque en el método inicial esta fue la propuesta, en diversas ocasiones por situaciones ajenas al proyecto, los técnicos de campo tuvieron que cambiar las trampas cada 15 dias y a veces cada mes (problemas de acceso o lejanía a los campos, lluvias intensas, etc.). 3) Utilizar TPE a la vertical, es decir colocar de 2 a 3 TPE en un solo pedestal con el fin de muestrear a 3 alturas distintas (90cm, 1.5m, 180m o más) según el desarrollo de la caña de azúcar, ya que si las uredinosporas son producidas dentro del mismo cultivo como fuente primaria éstas pueden no ser colectadas si la TPE está colocada a dos metros de altura.

TRABAJO A DESARROLLAR EN LA SEGUNDA ETAPA (SEGUNDO AÑO) DE ESTUDIO 1) Continuar con los monitoreos aerobiológicos en los de cultivos de caña de azúcar en vigilancia epidemiológica durante el ciclo agrícola. 2) Incrementar el número de TPE , así como realizar muestreos a la vertical (diferentes alturas del cultivo). 3) Realizar la detección molecular de las urediniosporas colectadas mediante PCR y QPCR. 4) Establecer de manera permanente y continua la red para la vigilancia epidemiológica de la roya anaranjada en la Huasteca Potosina. 5) Desarrollar y actualizar constantemente los mapas de riesgo de la roya anaranjada en la región cañera de San Luis Potosi.

La detección molecular ADN de las urediniosporas colectadas del aire de muestras del campo con las TPE y la TEH, se llevará a cabo por PCR y por QPCR el cual se describe de la siguiente manera:

� Detección con la prueba de PCR en tiempo real (QPCR): Las cintas de las TEH y de las TPE impactadas con las esporas de hongos colectadas del

aire son removidas y cortadas en secciones de 24 mm, representando periodos de 12 horas de exposición. Cada sección se corta por la mitad de manera transversal, es decir, en dirección a la línea central de rotación del tambor. La mitad de cada sección es colocada dentro de tubos Eppendorf de 1.5 ml para la extracción de ADN y su posterior análisis en QPCR.

� Rompimiento de esporas y extracción del ADN

El método utilizado para la extracción del ADN de las esporas impactadas en la cinta de celofán de la trampa de esporas tipo Hirst, es tomado de Lee y Taylor (1990) y Williams et al. (2001) y Calderón (2002a y b). La cinta es cortada en piezas de 10 x 5 mm y colocada dentro de tubos Eppendorf de 1.5 ml a los que se le agregaron 250 µl de Nonident P40 (Sigma) al 0.1% y 0.2 g de perlas de vidrio lavadas con ácido clorhídrico y de 400 a 455 µm de diámetro (Jencons-‐PLS, Leighton Buzzard, UK), para remover las partículas impactadas sobre la cinta de celofán Melinex y romper la pared de las esporas. Todos los tubos son agitados en el equipo FastPrep (Thermo Savant Instruments, Holbrook, Nueva York, EUA). Se llevan a cabo pruebas en el FastPrep buscando la velocidad y el tiempo óptimo de agitación, con el fin de determinar las condiciones más eficientes que permitan obtener la mayor concentración de ADN.

A partir de 50 µl de la suspensión resultante se purifica el ADN siguiendo el método de Lee y Taylor (1990) y modificado por Williams et al. (2001) por la adición de 20 µg de glicógeno (Roche Diagnostics Ltd. Lewis, RU) como un acarreador para el ADN durante la precipitación con isopropanol, y posteriormente se centrifuga. El botón de ADN es resuspendido en 50 µl de agua estéril Milli-‐Q (Millipore) y 5 µl de dicha suspensión es utilizada en las pruebas de PCR y QPCR. La suspensión es almacenada a 4 °C hasta su uso para PCR y QPCR.

La concentración de ADN purificada será medida con el Nanodrop parfa la realización de la curva de concentraciones a utilizar en la QPCR. Detección del ADN de roya anaranjada utilizando oligonucleótidos específicos en las pruebas de PCR y QPCR. Condiciones de PCR utilizadas: La detección de ADN se llevará a cabo con olognucleótidos específicos de Puccinia kuehnii utilizando la sonda PK1-‐F y Pk1-‐R que generan un producto de 527 pb (Glynn et al. 2010). Las reacciones de PCR en punto final se harán en un termociclador marca Mastercycler Eppendorf. La prueba de PCR se llevarán a cabo en un volumen total de 50 µl conteniendo 2.5 mM MgCl2, 0.25 mM dNTPs, 0.5 µM de cada sonda Ppa1 y Ppa2 y 2.5 unidades de Taq DNA Polimerasa (Applied Biosystems) y su respectivo buffer. Las condiciones del ciclo fueron 94 °C por 5 min, seguidos por 35 ciclos de temperatura de desnaturalización de 94 °C por 30s, temperatura de apareamiento de 56°C por 30s, temperatura de polimerización de 72°C por 30 s y una extensión final de 72 °C por 7 min. Los productos de PCR serán visualizados en geles de agarosa al 2% y el ADN teñido con bromuro de etidio. Condiciones de PCR en tiempo real utilizadas:

Se realizará la detección de ADN del hongo utilizando oligonucleótidos específicos Pk2F y Pk2-‐R y un sistema de detección de tiempo real Chromo4 (Bio-‐Rad) en volúmenes de 20 µL conteniendo 1x Premix Ex TaqTM (perfect Real Time) (TaKaRa Bio,Inc.).

Las reacciones de PCR en tiempo real se realizarán en un termociclador marca

Biorad (Hercules, CA). Las condiciones de reacción serán optimizadas por gradientes de temperatura de apareamiento (54 – 64°C), concentración de primers (0.05 -‐0.5 µM), y concentración de sonda (0.1 – 0.2 µM). Las reacciones en QPCR serán realizadas por triplicado usando 100 ng de DNA genómico (Glynn et al. 2010).

Evaluación de sensibilidad en la detección del ADN de las urediniosporas de Puccinia kuehnii colectadas del aire y validación de los métodos utilizados.

Se realizarán curvas de detección de P. kuehnii en PCR y QPCR para determinar la concentración mínima a detectar en las muestras ambientales. Así como se compararán las detecciones utilizando otros hongos colectados también del ambiente, por ejemplo Puccinia melanocephala.

Análisis de la información generada y correlación con las variables climatológicas registradas durante el tiempo de monitoreo ambiental.

Apoyados con las estaciones meteorológicas del Servicio Meteorológico Nacional y del INIFAP, se incluirán los datos climáticos y se asociarán a los resultados de cada trampa instalada.

Discusión de resultados y conclusiones.

INFRAESTRUCTURA

Este trabajo se llevará a cabo en l la Sección de Ciencias Ambientales del Centro de Ciencias de la Atmósfera, en los laboratorios de Biología Molecular de aeropartículas y el Laboratorio de Micologíapertenecientes a la línea de investigación de Bioindicadores de Contaminación Ambiental. El primer laboratorio cuenta con Estación campana para PCR, 2 termocicladores en punto final, fotodocumentador, computadora, refrigerador, cámaras de electroforesis, material de laboratorio, reactivos para biología molecular, campana para detección de ADN en un cuarto independiente. El laboratorio de Micología cuenta con campana para manejo de hongos y para extracción del ADN, equipos Fast prep (rompimiento de esporas), centrifuga, balanza, refrigerador, maquina de hacer hielo, material de laboratorio, medios de cultivo y otros consumibles. Invernadero. Se cuenta con un pequeño invernadero para el manejo de plantas infectadas con hongos, para su aspiración. Asimismo, contamos con equipos para esterilizar, ultracongelador, congelador, microscópios, incubadoras, etc.

Análisis de la información generada y correlación con las variables climatológicas registradas durante el tiempo de monitoreo ambiental.

Discusión de resultados y conclusiones.

Recomendaciones para realizar la vigilancia, así como para llevar a cabo la prevención o control de la Roya anaranjada y para dar la Alerta Sanitaria correspondiente en tiempo y forma en cada región.

Estrategias para la vigilancia, alerta y monitoreo de la roya anaranjada de la caña de azúcar.

Para llevar a cabo la vigilancia aerobiológica de la roya anaranjada, se hará el seguimiento fitosanitario de la propagación y dispersión de las plagas mediante el monitoreo del aire, en regiones en donde se ha confirmado la presencia de roya en la vegetación o en zonas con posible riesgo de infección. Esto se llevará a cabo a través de la implementación de una red aerobiológica, que se establecerá con base en el análisis de mapas de riesgo y el modelo Hysplit que modela el proceso aerobiológico para determinar la dispersión de las plagas, con la finalidad de dar la alerta fitosanitaria correspondiente (SINAVEF, 2011).

ANEXO

Anexo 1. Junta local de Sanidad Vegetal de la Planicie Huasteca

Fig. x Áreas de cultivo de caña de azúcar en la Huasteca Potosina

Fig. x. Áreas de cultivo de caña de azúcar en la Huasteca Potosina.

x Personal de: Dirección General de Sanidad Vegetal (DGSV-‐SENASICA), Comité Estatal de Sanidad Vegetal de San Luis Potosí (CESAVE-‐SLP), Sistema de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria (SINAVEF) y de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en zonas de cultivos de caña de azúcar.

Fig. x. Trampa de esporas pasiva (TEP)

Fig. x Personal de: Dirección General de Sanidad Vegetal (DGSV-‐SENASICA), Comité Estatal de Sanidad Vegetal de San Luis Potosí (CESAVE-‐SLP), Sistema de Vigilancia Epidemiológica Fitosanitaria (SINAVEF) y de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM).

Fig. x Toma de código QR en trampa de esporas pasiva

Fig. x Código QR en trampa de esporas pasiva

Fig. x Colocación de trampa de Esporas tipo Hirst en la localidad de El Higo.

Fig. x Colocación de trampa de Esporas tipo Hirst en la localidad de El Higo.

Fig. x Trampa de Esporas Pasivas en la localidad de El Higo.

Fig. x Trampa de Esporas tipo Hirst y Trampa de esporas Pasivas colocadas en la localidad de El Higo.

informe tÉcnico sinavef sistema nacional de...

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