7/26/2019 Informe Geentica Sangre

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INFORME DE GENTICA Y BIOLOGA MOLECULAR

Alejandra vera; Allen catalina !nc"e#; Dei$% &ern!nde#

Univer$idad de 'a('l)na; *ac+lta de ciencia$ ,!$ica$; de'arta(ent) de(icr),i)l)-.a

Fl+j)-ra(a del 'r)cedi(ient) de e/tracci0n de ADN

a$

OBTENCIN DE UNA SOLUCIN

Se prepar un capilar con ayuda del mechero de bunsen sellando uno de los extremos del

capilar (pipeta Pasteur) doblando la punta tratando de hacer un gancho.

Se tom 3 ml de sangre en un tubo Falcn y se le aadi 9 ml de la solucin CS (cell

lysis solution) del !it de promega" se me#cl in$irtiendo el tubo unas cuantas $eces" se

coloc a bao serolgico a una temperatura de %&'C min y luego se de a

temperatura ambiente durante *&min. Se pas a centri+ugar en una ultracentri+ugadora

cu,ntica en su m,ximo rpm por *&min se pudo obser$ar la +ormacin del pellet

eliminado el sobrenadante (sangre).

Se tom el pellet y se re suspendi en -.&& l de solucin solucin

salina /012 (SS0) y se agit $igorosamente en el $ortex.

4odi5cacin

Seguidamente se le adicion -&& l de 6aC 74 y && l de S1S al *&8 la cual +ue sometido

una temperatura de %&'C durante % min hasta ue alcan#o un cambio en la $iscosidad" se somet

Se le adicion *-& l de isoproopanol de manera sua$e sobre las paredes del tubo +orm,ndose u

sobre capa" en este punto se mani5esta la +ormacin de una inter+ase" se introduo en el tubo la

pipeta Pasteur y se gir para recoger el precipitado ue se encontraba en la inter+ase

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:na $e# recogido la mayor cantidad posible del precipitado blanco se traslad el capilar

utili#ando un micro tubo de,ndolo drenar" luego de esto se traslad el capilar a un tubo de

microcentri+uga ue conten;a && l de etanol al

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Anlisis de resultados

PRECIPITACIN

2rascurrido el tiempo de centri+ugacin se obser$ sobrenadante pero el pellet de 61 no se obser$intuyendo ue se encontraba en el cimiento del tubo se procedi a eliminar el sobrenadante.

4odi5cacin

l 5nal del proceso de extraccin se obtu$o 7&& de la +ase acuosa (61) y se me#claron con

*&&& de etanol absoluto" y 7& l de acetato de sodio 34" se me#cl" se ubic en hielo

durante min y luego se centri+ugo durante ** min a m,xima rpm.

Para la$ar el 16" al tubo donde uedo el pellet de 16 se adicion && de

etanol al

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La tcnica de extraccin de cidos nucleicos en eucariotas, est relacionada con su

ubicacin en el ncleo celular y las propiedades fsicas y qumicas de todas las

biomolculas celulares.

La sangre contiene una serie de compuestos como protenas, lpidos, glbulos blancos,glbulos rojos, plaquetas y plasma que pueden contaminar el A!. "l contaminante

principal del A! en muestra de sangre es #emo, el componente no proteico de la

#emoglobina.

La me$cla #omognea entre sangre y la solucin de lisis celular %&L'( como su nombre lo

indica produce la lisis de los glbulos rojos, solubili$ando las membranas nucleares y

facilitando la liberacin de los cidos nucleicos, causando posteriormente la lisis en los

ncleos de los glbulos blancos para poder extraer el A! ubicado en ellos.

Al re suspender el pellet en la solucin salina)"*A%''"( siendo una sustancia in#ibidora

de la accin de las !Asas se busc proteger a los cidos nucleicos de la accin deestas en$imas sin poder obser+ar este #ec#o a simple +ista. Luego al adicionar la

solucin de lisis que contiene el detergente inico dodecil sulfato de sodio %''(, se

obser+ una +iscosidad siendo esta el producto de la dispersin de las lipoprotenas de

las membranas y desnaturali$acin de complejos protenicos, las sales de la solucin de

lisis, neutrali$an las cargas negati+as iniciando la precipitacin de los cidos nucleicos.

"l resultado de la centrifugacin de la muestra obtenida, logr separar una fase slida

%pellet( restos de clulas, protenas, lpidos, de una fase acuosa %sobrenadante(, que

contiene cidos nucleicos, #idrfilos y solubles en agua debido a sus grupos fosfato.

&on la adicin de isopropanol y con la formacin de una sobre capa se manifest lainterfase siendo des#idratacin y total precipitacin de los cidos nucleicos insolubles en

alco#ol, ubicndose los cidos nucleicos en la interfase agua)alco#ol.

na +e$ lisadas las clulas un paso muy importante fue la concentracin del A! %por

precipitacin con alco#oles(, la+ado %para eliminar restos de reacti+os y sol+entes que

puedan in#ibir la taq polimerasa( lo cual se logr usando etanol al - / siendo un

desnaturali$ador acti+o de protenas y causando su precipitacin se confirma su accin

en el momento en el que se adicion fenol absoluto el cual despus de desproteini$ar,

precipit los cidos nucleicos.

'eguidamente con la adicin de la solucin fenol)isopropanol se constat que el fenoles quien diluye las protenas %el cloroformo diluye a su +e$ el fenol( por ser #idrfobas.

&omo los cidos nucleicos por su contenido en fosfato, son #idrfilos se diluyen en la

fase acuosa separndose en la otra fase las protenas. Al trasferir la fase acuosa a otro

tubo y me$clar con etanol absoluto se produjo un precipitado blanquecino %cido nucleico(

siendo extrado con la micropipeta, pre+iamente drenado y secado se coloc en una

solucin buffer *" buscando obtener la dispersin total del A! lo cual se logr

satisfactoriamente.

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"l restante de +olumen de la interfase encontrado de apariencia +iscosa el cual fue

trasladado a un micro tubo %tubo0( se le reali$o el mismo procedimiento que al micro tubo

que contiene el A! y la solucin buffer *e, seguidamente mencionado.

1ara la purificacin del A! se tom los tubos y al agregarles un +olumen de fenol

saturado y posterior a esto se centrifug obser+ando la separacin de las fases, una

orgnica %A2!(, una acuosa que es donde se encuentran los cidos nucleicos y la

interfase que seran las protenas %esta ltima se encuentra entre la fase orgnica y la

acuosa que en el caso del tubo 0 respecti+amente no se obser+ separacin lo que

puede #aber sido que solo se encuentran protenas y no A! ya que este +olumen #acia

parte de la interfase.

espus de la separacin delas fases obser+adas al final de la centrifugacin se adicion

una me$cla de fenol cloroformo)isoamilico actuando de manera que el fenol como se

mencion anteriormente desproteini$a, el cloroformo desnaturali$a las protenas y el

isoamilico reduce la espuma, ayudando a la separacin y manteniendo las capas

separadas por la centrifugacin. "s nue+o se adicion una me$cla en este casocloroformo isoamilico buscando que con este tratamiento se remue+an todos los residuos

de fenol.

&omo el p3 puede influir y ser influido por un nmero de factores celulares, mantener un

p3 estable es esencial para la extraccin del A!. &omo paso final se recuperan los

cidos nucleicos de la interfase, por centrifugacin y posterior des#idratacin se liberan

del agua y del alco#ol y se disol+i el pellet que posiblemente se encontraba en el micro

tubo y se suspendi en una solucin buffer *" siendo importante porque puede mantener

un p3.