informe de laboratorio n° 2 biología
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1. OBJETIVOS
Extraer el ADN de una muestra vegetal (tomate) y una fruta (plátano).
2. FUNDAMENTO TEORICO
El ácido desoxiribonucleico o ADN (DNA) es la molécula que guarda el código genético de
todas las células. Sin importar que el organismo sea multicelular o unicelular, eucariota o
procariota, todos tienen el DNA como vehículo de su código genético.
Muchas de las técnicas de biología molecular incluyen algún tipo de manipulación del
material genético. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el conocimien-to
del código genético, que ya es posible clonar organismos enteros. Los procedimientos iniciales
eran largos y tediosos y podían pasar varios días antes de saber con certeza que se había logrado
obtener DNA en calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Además algunos de los
reactivos usados para estos procesos son tóxicos y mutagénicos. Hoy día podemos obtener
suficiente DNA de buena calidad en unas horas.
Los ácidos nucleicos están siempre asociados con proteínas, de allí que una vez hecha la ruptura
de las células se proceda a la desproteinización. Esta puede realizarse agitando suavemente la
mezcla ácido nucleico-proteina con una solución de fenol y/o una mezcla de cloroformo-alcohol
isoamílico a fin de precipitar las proteinas, la que se remueven por centrifugación. Las proteinas
pueden también disociarse de los ácidos nucleicos con detergentes, cloruro de guanidina o altas
concentraciones salinas, pueden también degradarse mediante proetasas, tal como la pronasa. Se
obtiene así una mezcla de RNA y DNA que puede aislarse precipitando con etanol. El RNA se
recupera de estos precipitados tratándolo con DNAsa pancreática para eliminar el DNA, y el DNA
puede liberarse del RNA tratando el precipitado con RNasa. El DNA y RNA pueden también
separase por ultracentrifugaciones. En todo este proceso y las maniulaciones subsecuentes, los
ácidos nucleidos deben protegerse de la acción degradativa de las nucleasas. Estas pueden
inhibirse por agentes quelantes como el EDTA que secuestra los iones metálicos divalentes que
son esenciales para la actividad de las nucleasas. Los ácidos nucleicos son generalmente de más
fácil manipulación que las proteínas por carecer, en la mayoría de los casos, de estructura
terciaria, haciéndolas más tolerantes a condiciones extremas.
3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a. Se trituró la muestra con un poco de agua destilada en el mortero.
b. Se tamizó el triturado celular en un recipiente limpio. Se tomó 5 ml del triturado celular
tamizado en un recipiente limpio y se agregó 5 ml del tampón frío. Se agitó vigorosamente
durante 2 minutos.
c. Se tomó 5 ml de la suspensión molecular en un tubo de ensayo (el sobrenadante) y se añadió
5 ml de alcohol isoamílico a 0ºC.
d. Se dejo reposar
e. Se realizó los pasos a, b, c y d, para el plátano.
4. OBSERVACIONES Y DATOS TABULADOS
FALTA
5. RESULTADOS Y CALCULOS
Muestra 1: Tomate
Muestra 1, después de agregar alcohol
Después de 5 minutos de reposo:
Muestra 2: Plátano
Muestra 2, después de agregarle alcohol
Muestra 2, después de 5 minutos de reposo
6. DISCUSIÓN
La extracción de ADN empieza cuando se rompen las células mediante un detergente,
vertiendo a este contenido molecular una disolución tampón. El tampón ahora contiene ADN y
todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en
menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se fraccionan en cadenas
más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. El alcohol se utiliza para precipitar
el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita
en la interfase entre el alcohol y el agua.
7. CONCLUSIONES
La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que
romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula.
A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por
último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que
hacer que precipite en alcohol.
8. BIBLIOGRAFÍA
FALTA
10.CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la función del cloruro de sodio, detergente, alcohol isoamilico?
a. Cloruro de Sodio: El NaCl tiene como función de proteger y guardar el ADN.
b. Detergente (shampoo): El detergente es utilizado para realizar una mezcla homogénea de
los tejidos utilizados.
c. Alcohol Isoamílico: El ADN se precipita en el alcohol fuera de la solución, donde puede ser
visto. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes
celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa.
2. ¿Cuál es la función del detergente sobre la membrana celular?
La función del detergente sirve para romper la membrana plasmática y nuclear e incluso la
pared celular.
3. ¿Por qué el ADN precipita en alcohol?
El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en
alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua.
4. ¿Por qué se debe trabajar a bajas temperaturas?
A menor temperatura menor solubilidad. El ADN es muy poco soluble en alcohol, y menos aun
en alcohol frio, por lo que precipita más rápido.
5. ¿Por qué el azul de metileno tiñe las fibras del ADN?
El azul de metileno tiñe el ADN, porque este posee un grupo fosfato en su estructura.
6. ¿Qué otros colorantes que pueden ser utilizados para teñir las fibras de ADN?
Se puede utilizar el verde de metilo para teñir las fibras del ADN.
7. Explique, cómo se puede determinar la concentración del ADN.
Para determinar la concentración del ADN obtenido, se puede utilizar el siguiente
procedimiento:
a. Diluir 20 ml de muestra de DNA en 980 ml de agua desionizada y esteril (dilución 1/50)
b. Medir absorbancia a 260 nm usando cubetas de 1 ml, que puedan usarse a luz ultravioleta.
c. La concentración de DNA a A260 = 1.0 en una cubeta de 1 cm equivale a 50 mg de DNA por
ml de agua. Para calcular la concentración de la muestra:
[DNA] = 50 mg / ml x A260 x factor de dilución (50)
[DNA total] = [DNA] x volumen eluído en ml