importancia de la triada catalítica del efector xopao1 en
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Importancia de la triada catalítica del efector XopAO1 en la bacteria
fitopatógena Xanthomonas axonopodis pv. manihotis
Persona Orientada: González Girón, Juan Luis
Director: Bernal, Adriana Jimena.
Codirector: Medina, César Augusto
LAMFU, Universidad de Los Andes, Bogotá, Colombia
Resumen
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis es una bacteria fitopatógena importante como agente
causal del añublo bacteriano de la yuca. En el proceso infeccioso hace uso del sistema de
secresión tipo III por el cual transloca más de 19 efectores que tienen como finalidad alterar
el metabolismo de la célula vegetal. XopAO1 es uno de los efectores de Xam más interesantes
ya que ha mostrado ser el único capaz de inhibir las dos líneas de inmunidad vegetal. En esta
investigación se logró determinar que el efector comparte un arreglo de tres aminoácidos
conservados con proteínas de tipo ADP Ribosil transferasas que poseen casi toda la función.
De estos tres aminoácidos, uno de ellos se encontró como el responsable de la supresión de
PTI, teniendo homología funcional con el mismo aminoácido conservado del efector
AvrRpm1 de Pseudomonas syringae.
Palabras clave: Supresión de inmunidad vegetal, efector, homología funcional, tríada
catalítica.
Introducción:
El añublo bacteriano de la yuca (Cassava bacterial blight) es una enfermedad destructiva
causada por la bacteria fitopatógena Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam). Esta
bacteria afecta los cultivos de yuca en América del Sur, África y Asia (Verdier, Ojeda, &
Mosquera, 2001) y puede reducir la productividad en más del 90% (Mamba-Mbayi et al.,
2014) dependiendo de las condiciones ambientales presentes en la zona. A su vez, la yuca,
Manihot esculenta Crantz, es una planta originaria de América del Sur, muy importante por
sus tubérculos ricos en almidón, su eficiencia en el aprovechamiento de agua y nutrientes en
suelos pobres y su fuerte resistencia a la sequía (FAO, 2013). Este tubérculo tiene una alta
relevancia ya que compone la fuente principal de carbohidratos para gran parte de la
población en países tropicales en vías de desarrollo.
A diferencia de los vertebrados, las plantas carecen de una inmunidad adquirida y por este
motivo dependen de la inmunidad innata que posee cada célula para combatir a los patógenos
que las infectan (Jones & Dangl, 2006 & Reyes, Restrepo, & Bernal, 2011). A pesar de esto,
son capaces de evitar una infección mediante dos líneas de inmunidad. La primera línea de
respuesta inmune, conocida como PTI por las siglas en inglés de Inmunidad Elicitada por
Patrones Moleculares Microbianos, se inicia cuando receptores en la pared de la célula
vegetal reconocen componentes conservados en la mayoría de microorganismos (MAMPS).
Este reconocimiento desemboca a su vez en una respuesta local que incluye un
endurecimiento de la pared celular vegetal por la deposición de calosa, un polisacárido, y la
inducción del metabolismo de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estas respuestas tienen
como finalidad endurecer la pared vegetal para evitar la penetración del patógeno.
Para sobrepasar las barreras de crecimiento que imponen la inmunidad vegetal, Xam tiene la
capacidad de inyectar proteínas, conocidas como efectores, dentro de la célula vegetal
mediante un sistema de secreción tipo III. El sistema se compone de un canal proteico
análogo a una jeringa por el cual los efectores son translocados hasta el citosol de la célula
de la planta.
Luego de ser secretados por la bacteria, los efectores pueden cumplir con una amplia variedad
de funciones en la célula del hospedero. Algunos efectores tienen como función
desestabilizar rutas metabólicas relacionadas con inmunidad u otras funciones enzimáticas,
como es el caso de los efectores pertenecientes a la familia de efectores XopJ (White et al.,
2009). Por otra parte, los efectores tipo TAL, por las siglas en inglés de Activadores
Transcripcionales, poseen un módulo central de repeticiones variables que puede unirse
específicamente a algunas regiones del genoma de la planta. A su vez, este tipo de efectores
posee un dominio de activación transcripcional en la región C-terminal capaz de reclutar la
maquinaria transcripcional eucariota e inducir la expresión de los genes a los que se une
corriente arriba (Dominguez et al., 2012). El repertorio de efectores translocados es entonces
de vital importancia para la patogenicidad del microorganismo. Así, un mutante que carezca
del sistema de secreción reduce casi completamente la capacidad de crecer, de sobrepasar la
inmunidad vegetal, y de generar lesión en la planta debido a su incapacidad de translocar
efectores (Alfano & Collmer, 2004).
Los efectores inducen un cambio en el metabolismo de la planta que detiene la respuesta
inmune basal y activan genes que mejoran las condiciones de crecimiento de la bacteria
dentro de la planta. Ahora bien, algunas plantas tienen la capacidad de reconocer estos
efectores bacterianos y encender una segunda línea de inmunidad conocida como ETI. En
este despliegue inmune la planta induce rutas metabólicas que llevan a la muerte celular
programada de su propio tejido en una respuesta hipersensitiva (HR). Esta respuesta inhibe
la dispersión del patógeno a tejidos circundantes.
En los últimos años se ha descubierto que Xam inyecta en la planta un repertorio de 19
efectores con funciones enzimáticas diversas, algunas de las cuales aún son desconocidas
(Kay & Bonas, 2009 & White et al., 2009). La función enzimática de un efector depende de
los dominios activos que posea, lo que depende sustancialmente de la secuencia primaria de
aminoácidos que presente. Así, la mutación dirigida de estos aminoácidos lleva a que la
proteína pierda enteramente su funcionalidad (Cherkis et al., 2012).
XopAO1 es un efector tipo III inyectado por Xam a la célula de yuca en el proceso de
infección. Éste es un factor de virulencia importante para la bacteria ya que se encuentra
relacionado con la supresión tanto de PTI como de ETI (Reyes, Restrepo & Bernal, 2011).
Sin embargo, aún no se tiene claro la función que cumple dentro de la célula vegetal. De
forma interesante, XopAO1 comparte una similitud en secuencia primaria del 62% con el
efector AvrRPM1 de la bacteria fitopatógena Pseudomonas syrinage lo que lleva a predecir
que también puede poseer una actividad ADP-Ribosil Transferasa (ADP-RT). En este último
efector toda la función catalítica depende únicamente de tres aminoácidos denominados
tríada catalítica, que al ser mutados inhiben significativamente la capacidad de la bacteria de
generar una lesión en la planta (Cherkis et al., 2012).
De manera similar, XopAO1 es importante para la virulencia de la bacteria y se relaciona
con la agresividad de la infección. Debido a la importancia que tiene este único efector para
la bacteria en el proceso infeccioso, su caracterización es de vital importancia. Así, este
estudio tiene como finalidad tanto determinar si el efector XopAO1 posee la tríada catalítica
conservada de las ADP-Ribosil Transferasas (ADP-RT) como determinar si estos tres
aminoácidos son importantes para la virulencia de la bacteria y para la supresión de la
inmunidad vegetal basal.
Materiales y métodos:
* Búsqueda de la tríada catalítica de XopAO1:
La funcionalidad de las proteínas se relaciona con su estructura terciaria y esta a su vez
depende en mayor medida de la estructura primaria. Para determinar si el efector XopAO1
posee la tríada catalítica de la familia de efectores ADP-RT se comparó su secuencia
aminoacídica primaria con la secuencia de aminoácidos del efector AvrRPM1 de 3 cepas de
la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae usando el software MUSCLE del Instituto
europeo de Bioinformática (Edgar, 2004), parámetros por defecto. La tabla suplementaria 1
expone los números de accesión del NCBI para cada una de las secuencias empleadas en el
alineamiento.
* Mutagénesis del efector:
Para determinar cuál era la relevancia de cada uno de los aminoácidos de la tríada catalítica
en la virulencia y supresión de inmunidad se diseñaron parejas de primers en cuya región
central se localizó un codón para que se produjera un cambio puntual hacia el aminoácido
Alanina. Los primers se listan en la tabla 1. El primer forward que flanquea el gen fue
diseñado con la secuencia CACC para emplear la clonación con tecnología Gateway en los
distintos vectores de clonación para cada uno de los experimentos. La PCR fusión se realizó
manteniendo una temperatura de anillaje de 53 °C bajo la que se obtuvieron los mejores
resultados. En la primera amplificación se usaron 35 ciclos y en la segunda 10 ciclos de
amplificación. La tabla 1 muestra las parejas de primers empleados para cada una de las
sustituciones realizadas. Cada una de las mutaciones fue comprobada mediante
secuenciación para garantizar que sólo las mutaciones deseadas estuvieran presentes en el
gen.
* Construcción de los plásmidos de entrada
Tabla 1. Resumen de los primers diseñados para generar las mutaciones deseadas en xopAO1. Los primers
1, 2 y 3 fueron los primers diseñados en este proyecto. La pareja de primers 1 anilla hacia la región 5´del
gen y sustituye un codón para histidina por un codón de alanina en la posición 41. La segunda pareja de
primers anilla complementariamente sobre la región central del gen sustituyendo el codón que codifica para
fenilialanina por uno de alanina en la posición 101. Por último, la pareja de primers 3 genera una sustitución
del codón de una asparagina en la posición 157 hacia una alanina. La pareja de primers 4 fue diseñada
previamente para amplificar el gen xopAO1 de muestras silvestres de Xam.
Primer Secuencia 5´-3´ Mutación
1 Fw GACAGCAGTGTTTTATATGCGGGGACAAAGCATCCGCAT
H41→A
1 Rv ATGCGGATGCTTTGTCCCCGCATATAAAACACTGCTGTC H41→A
2 Fw AAGAAAGAAGCCAAGAATGCAGCCATGTTCGCTGACATG
F101→A
2 Rv CATGTCAGCGAACATGGCTGCATTCTTGGCTTCTTTCTT F101→A
3 Fw AACAGCTCCCCCGGGGAAGCGGCGCAGGTGTTCAAGAAA N157→A
3 Rv TTTCTTGAACACCTGCGCCGCTTCCCCGGGGGAGCTGTT N157→A
4 Fw CACCATGCCAAGGTCCATCAGAAG Amplificación de
xopAO1
4 Rv TCGACCCCTCATTCGGCTCATA Amplificación de xopAO1
Imagen 1. Esquematización del sitio de unión de todos los primers empleados en la mutagénesis del gen
xopAO1. Cada pareja de primers se representa como flechas indicando la direccionalidad. Los números
dentro del cuadro expresan la posición relativa de anillaje de cada pareja de primers dentro del gen y los
números entre comillas se relacionan con la nomenclatura de la tabla 1.
Primers
“1”
Primers
“2”
Primers
“3”
H→A F→A N→A
“4” “4”
Los productos de PCR de xopAO1 conteniendo cada una de las tres sustituciones generadas
fueron clonados en el vector de entrada pENTR/TOPO/SD haciendo uso del kit “pENTRTM
Directional TOPO® Cloning Kit” de Invitrogen. Este kit fue escogido ya que permite hacer
uso de la tecnología Gateway para transladar un inserto desde un vector de entrada a un vector
de destino empleando una recombinasa. Posteriormente, los plásmidos de entrada fueron
transformados en Escherichia coli DH5α quimiocompetentes, recuperados en cajas de agar
LB con kanamicina 50 µg/mL y cultivados ON a 37 °C en LB más kanamicina.
* Clonación de XopAO1 en los plásmidos de destino:
Se empleó el kit “Gateway® LR ClonaseTM II Enzyme Mix” de Invitrogen para clonar
xopAO1 con cada una de las tres mutaciones en los plásmidos de destino pBav226 y Pln615.
La reacción se incubó a temperatura ambiente O.N. Los productos fueron entonces
transformados en Escherichia coli DH5α quimiocompetentes y recuperados en LB más
gentamicina 20µg/mL para pLN615::xopAO1 y en LB más Tetraciclina 10µg/mL para
pBav226::xopAO1.
* Transformación de Pseudomonas flourescens y Xam
El constructo pBav226::xopAO1 conteniendo cada una de las mutaciones generadas fue
tranformado en células electrocompetentes de Xanthomonas axonopodis pv. manihotis a la
que previamente se le había delecionado el gen xopAO1 (ΔxopAO1). Los clones fueron
recuperados en LPGA tetraciclina 50 µg/mL Esta cepa tiene una resistencia cromosomal a
rifampicina por lo que este marcador también fue empleado a una concentración de 100 µg/mL
a la hora de seleccionar los transformantes.
Por su parte, el constructo pLN615::xopAO1 conteniendo cada una de las mutaciones fue
transformado en células electrocompetentes de Pseudomonas fluorescens a la que
previamente se le introdujo el cluster hrp/hrc para que contenga el sistema de secreción tipo
III. Los transformantes fueron seleccionados en medio KB usando gentamicina 20 µg/mL.
Cada uno de los clones seleccionados fue crecido O.N., y se le realizó un screening para
comprobar la presencia del plásmido mediante secuenciación.
* Crecimiento del material vegetal
Las plantas de Arabidopsis thaliana col-0 empleadas en el ensayo de supresión de calosa
fueron mantenidas en invernadero a una temperatura de 20-22°C bajo un régimen de luz de
9 horas diarias, durante ocho semanas antes de las inoculaciones.
Por su parte, las plantas de yuca (variedad Colombia) fueron obtenidas a partir de estacas y
crecidas en invernadero entre 25 y 30°C con un régimen de luz de 12 horas diarias durante
10 semanas. Previamente a las inoculaciones, las plantas fueron mantenidas 24 horas a una
humedad relativa cercana al 100% para garantizar una inoculación más homogénea.
* Ensayos de virulencia en yuca
Las hojas de yuca fueron inoculadas con una suspensión de Xam ΔxopAO1transformada con
las tres mutaciones de XopAO1 a un OD de 0.1. Se tomaron muestras de las áreas de lesión
al día 4 posterior a la inoculación, se realizó un maceración del tejido y posterior sembrado
por microgota en LPGA+rifampicina+tetaciclina. El conteo se realizó usando un
estereoscopio de luz a una magnificación de 40x.
* Ensayos de supresión de PTI.
vPara observar si las mutaciones son de relevancia en la supresión de inmunidad se realizó
una inoculación de Pseudomonas fluorescens pML1965 cargando el gen con cada una de las
mutaciones en el vector pLN615. Las infiltraciones se realizaron a un OD de 0.2 en
Arabidopsis thaliana y se contaron deposiciones de calosa a las 24 horas post-inoculación de
acuerdo al protocolo de Reyes et al., 2011. Las hojas fueron seleccionadas aleatoriamente y
en diferentes plantas. De igual manera, cada hoja fue inoculada en su totalidad. La medición
de las deposiciones se realizó con un microscopio de fluorescencia a una magnificación de
40x el campo visual. Las imágenes fueron analizadas con el software ImageJ en una prueba
de conteo de pixeles contrastantes.
Resultados
XopAO1 posee la tríada catalítica de la familia de las ADP-RT.
El alineamiento de las secuencias de XopAO1 con la secuencia de AvrRPM1 arrojó una
similitud del 63,5%. Además, como se observa en la imagen 2, el efector comparte los
aminoácidos de la tríada catalítica con otras proteínas con función ADP-RT lo que significa
que la actividad enzimática puede también depender enteramente de estos tres aminoácidos.
Las mutaciones reducen significativamente el crecimiento de la bacteria en
Manihot esculenta.
Imagen 2. Alineamiento de secuencia aminoacídica de XopAO1 con la secuencia de AvrRPM1 de
tres cepas de Pseudomonas syringae. Los aminoácidos en naranja se localizan en los tres subdominos
catalíticos y fueron los aminoácidos mutados en el experimento.
Las inoculaciones de las tres mutaciones evidenciaron que la mutaciones H y N en la proteína
reducen significativamente el crecimiento de la bacteria dentro de la planta (Tukey p-
value<0.01, α=0.05). Ninguna colonia pudo ser recuperada de la inoculación con el mutante
F, ni de los tratamientos de la cepa silvestre, o de la cepa mutante pero complementada con
el efector.
Sólo uno de los aminoácidos activos presenta un rol en la supresión de las
deposiciones de calosa.
A diferencia de las mutaciones de la fenilalanina 101 y de la asparagina 157, la mutación
del aminoácido histidina 41 presentó un nivel elevado de deposiciones de calosa
mostrando un incremento significativo respecto a los demás tratamientos (α=0,05, p-
value<1E-5). Esto significa que mutar este aminoácido disminuye la capacidad de la
bacteria de suprimir parcialmente la inmunidad vegetal basal, o PTI. Así, el aminoácido
H41 de la proteína puede estar relacionado directamente con una ruta metabólica asociada
a la deposición de calosa en la pared celular.
Gráfica 1. Conteo de unidades formadoras de colonia (UFC) recuperadas del tejido foliar al 4 día posterior a las
inoculaciones. El conteo de las UFC se encuentra graficado en escala logarítmica. La cepa silvestre se empleó
como control de crecimiento pero no pudo ser recuperada de las muestras. De igual manera, no se logró recuperar
células viables bacterianas del mutante F ni de la cepa deficiente para el gen cromosomalmente pero
complementada con pADN. Las barras evidencian la desviación estándar del conteo de UFC.
Discusión
Con la finalidad de determinar cuál es la relevancia de cada uno de los aminoácidos de la
tríada catalítica del efector XopAO1 se generaron las sustituciones previamente expuestas y
se evaluó su función tanto en la supresión de deposiciones de calosa como en la capacidad
de crecimiento in planta. En este sentido, esta investigación soporta la idea de que usar PCR
fusión para generar mutantes puntuales de un gen es una herramienta útil en investigación
sobre la biología de los efectores. De igual manera, emplear Pseudomonas fluorescens
pML1965 como un modelo de translocación de efectores sencillos se mostró como una
manera adecuada de reducir el ruido producido por la posible función redundante de algunos
efectores cuando se realizan ensayos de deleción puntual de efectores para evaluar su
importancia.
Para el caso de los ensayos de supresión de PTI, se puede observar que los aminoácidos
Fenilalanina-101 y Asparagina-157 no son importantes mientras que el aminoácido
Gráfica 2. Conteo de deposiciones de calosa en las inoculaciones realizadas. Como control se
tuvieron los tratamientos de Pseudomonas fluorescens sin ningún vector y clones conteniendo el
efector silvestre sin ningún tipo de mutación. El tratamiento H fue el único que evidenció una
diferencia estadísticamente significativa respecto al control sin el efector (p-value= 1,68E-14,
α=0,05).
Histidina-41 sí puede ser. Si bien el único tratamiento que mostró una diferencia significativa
en la cantidad de deposiciones de calosa fue el tratamiento con el mutante H41A, no se
obtuvieron los datos esperados para la inoculación con la cepa control que contenía el efector
silvestre. En este experimento no hubo una diferencia significativa en la cantidad de
deposiciones de calosa entre el tratamiento inoculado sin el efector (mayor cantidad de
deposiciones esperadas) y el tratamiento inoculado con el efector silvestre, que debería
reducir casi por completo las deposiciones en Arabidopsis thaliana (Reyes et al., 2011). Esta
disonancia de los resultados con la literatura hace imperativo realizar réplicas para determinar
si la tendencia observada es constante o si estuvo influenciada por alguna forma de error.
Por otra parte, la necesidad de emplear un modelo homólogo y no el patosistema natural para
realizar las mediciones de deposiciones de calosa e inhibición de PTI pueden no reflejar la
veracidad de las interacciones en un ambiente natural.
En cuanto a los ensayos de inoculación en yuca, se puede concluir que el efector es un factor
de virulencia importante para el crecimiento de la bacteria en la planta, como puede verse en
la gráfica 1. Sin embargo, la imposibilidad de recuperar UFC de los tratamientos controles
hace imposible definir concretamente cuál es el efecto de cada una de las mutaciones en la
actividad general del efector.
Aunque se hace imperativo realizar réplicas futuras de los experimentos, los datos obtenidos
hasta el momento permiten concluir que el aminoácido H41 de XopAO1 puede presentar
homología funcional con el efector AvrRPM1 de Pseudomonas syringae y proteínas con
funciones enzimáticas similares.
Referencias
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Agents in Bacterial Disease and Plant Defense. Annual Review of Phytopathology p. 385-
414, vol. 42.
Cherkis K., Temple B., Chung E., Sondek J., Dangl J. L. (2012). AvrRpm1 Missense
Mutations Weakly Activate RPS2-Mediated Immune Response in Arabidopsis thaliana.
PLoS ONE 7(8): e42633. doi: 10.1371/journal.pone.0042633
Domingues M., de Campos B., de Oliveira M., de Mello U., Benedetti C. (2012).
TAL Effectors Target the C-Terminal Domain of RNA Polymerase II (CTD) by Inhibiting
the Prolyl-Isomerase Activity of a CTD-Associated Cyclophilin. PLoS ONE 7(7): e41553.
doi:10.1371/journal.pone.0041553
Edgar, R. (2004), MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and
high throughput, Nucleic Acids Research 32(5), 1792-97.
FAO. (2013). Save and Grow: Cassava. A guide to sustainable production
intensification. Obtenido de http://www.fao.org/ag/save-and-grow/cassava/en/1/index.html
Jones, J. D., & Dangl, J. L. (2006). The plant immune system. Nature , 323-329.
Kay, S., & Bonas, U. (2009). How Xanthomonas type III effectors manipulate the
host plant. Current opinion in Microbiology , 37-43.
Mamba-Mbayi, G. , Tshilenge-Djim, P. , Nkongolo, K. and Kalonji-Mbuyi, A. (2014)
Characterization of Congolese Strains of Xanthomonas axonopodis pv. manihotis Associated
with Cassava Bacterial Blight. American Journal of Plant Sciences, 5, 1191-1201
Reyes, P., Restrepo, S., & Bernal, A. J. (2011). Cassava’s immunity suppression
mediated by Type III effectors of Xanthomonas axonopodis pv. manihotis. Honolulu: The
American Phytopathological Society.
Verdier, V., Ojeda, S., & Mosquera, G. (2001). Methods for detecting the cassava
bacteriual blight pathogen: A practical approach for managing the disease. Euphytica , 103-
107.
White, F. F., Potmis, N., Jones, J. B., & Koebnick, R. (2009). The type III efectors of
Xanthomonas. Molecular Plant Pathology, 749-766.
Documentos suplementarios
Tabla suplementaria 1. Números de accesión del NCBI de las secuencias de AvrRPM1
empleadas en el alineamiento contra XopAO1.
Cepa bacteriana Referencia
Pseudomonas syringae pv.
syringae B728a gi|63254706|gb|AAY35802.1|
Pseudomonas syringae pv. maculicola str. M6]
gi|14010711|ref|NP_114197.1|
Pseudomonas syringae pv. actinidiae ICMP 18884
gi|620047353|gb|KAK41039.1|