identificación molecular de bacterias productoras de polihidrixialcanoatos en subproductos de...

8/17/2019 Identificación Molecular de Bacterias Productoras de Polihidrixialcanoatos en Subproductos de Lácteos y Caña de A…

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Cardona, A.C.; Mora, A.L.; Marín, M:

Rev.Fac.Nal.Agr.Medellín 66(2): 7129-7140. 20137132

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento y detección de bacterias productoras dePHAs. En este estudio se detectaron, mediante dobletinción con rojo Nilo en medio MMS suplementadocon 2% de glucosa, 49 cepas bacterianas productorasde PHAs, que fueron agrupadas en 22 morfotipos porsus caracteríticas en medio AN (Tabla 2); siendo elsustrato de cachaza de caña, el que presentó el mayornúmero de aislamientos y morfotipos bacterianos (8aislamientos/5 morfotipos), seguido por la melaza delIngenio Incauca (8/4) y Sopetrán (7/4) y el lactosuerode la Estación Agraria Paysandú (8/3). Los sustratos

Tabla 1. Cebadores utilizados para amplicar el gen phaC en las bacterias productoras de PHAs.

Cebadores Secuencia Tamaño T° unión Referencia

B1F

B1R

5´ AACTCCTGGGCTTGAAGACA 3´5´

TCGCAATATGATCACGGCTA 3´ 600 pb 60 °C Shamala et al. (2003)I-179LI-179R

5´ ACAGATCAACAAGTTCTACATCTTCGAC 3´5´GGTGTTGTCGTTGTTCCAGTAGAGGATGTC3´ 540 pb 54 °C Solaiman et al. (2000)

G-DG1-RG-2R

5’ GTGCCGCCSYRSATCAACAAGT 3´5´ GTTCCAGWACAGSAKRTCGAA 3´5´ GTAGTTCCASAYCAGGTCGTT 3´

551 pb(491 pb) 50-55 °C Revelo et al. (2007)

phaCf1phaCR4

5´ ATCAACAARTWCTACRTCYTSGACCT 3´5´ AGGTAGTTGTYGACSMMRTAGKTCCA 3´ 496 pb 50 °C Sheu et al. (2000)

que presentaron menor número de morfotipos

productores de PHAs fueron el lactosuero caprino(3 aislamientos y 2 morfotipos) y el bagazo de caña,pues a pesar de presentar ocho aislamientos, éstossólo representaban dos morfotipos bacterianos (Tabla2). Treinta y ocho de estas cepas, distribuidas en 18morfotipos, fueron reconrmadas como productorasde PHAs con la prueba de tinción con azul Nilo.Las colonias de dichos aislamientos emitieronuorescencia rojo-naranja cuando fueron expuestas auna longitud de onda de 450 nm, siendo evidentes lasdiferencias en sus patrones de acumulación de PHAs(Figura 1).

Figura 1. Microscopía de uorescencia a 450 nm para células bacterianas teñidas con azul Nilo, cultivadas en

MMS y aisladas a partir de subproductos agroindustriales. Cepa 28-bagazo -1.000 X (A); Cepa 19-lactosuero1.000 X (B) y Cepa 15-lactosuero - 1000 X (C).

Estos resultados indican que ambos tipos de sustratosevaluados, presentan una alta diversidad de orabacteriana con capacidad de síntesis de PHAs, lo quepuede deberse a sus altos contenidos de carbono ybajos niveles de nitrógeno (residuos de caña de azúcar)

o de fósforo (lactosueros). Trabajos previos realizadospor De Lima et al. (1999) habían identicado lossuelos de cultivo y los derivados de la caña de azúcarcomo nichos ecológicos óptimos para el aislamientode bacterias productoras de PHAs, dado sus altos

A B C


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Identicación molecular de bacterias productoras de polihidroxialcanoatos ...

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desbalances de C: N. Esta situación fue conrmada enColombia por Moreno et al. (2007), quienes realizaronun proceso de aislamiento de bacterias productorasde PHAs, en la rizosfera de caña de azúcar cultivadaen diferentes departamentos, y encontraron que al

menos 291 de 440 aislamientos evaluados, podíanacumular estos biopolímeros a partir de algunade las tres fuentes de azúcar evaluadas (glucosa,fructosa y sacarosa). En forma similar, Naheed et al.

(2012) aislaron de diversos residuos agroindustriales,bacterias del género Enterobacter con capacidad deacumular PHB en un 57% de su peso celular seco,utilizando como medio de fermentación melaza decaña de azúcar suplementada con 0,2% de sulfato de

amonio. En el presente trabajo, se logró la obtención deun amplio número de morfotipos bacterianos a partirde subproductos de caña de azúcar, obteniéndose tantobacterias Gram negativas, como Gram positivas; aunque

Tabla 2. Resultados de evaluaciones de producción de PHAs e identicación molecular de bacterias aisladas eneste estudio.

MorfotiposPrueba

positiva conrojo Nilo*

Pruebapositiva con

Azul Nilo

Secuencias16S

SecuenciasphaC Identicación molecular**

Tipo de genphaC***

Melaza de Caña (Sopetrán)Morfotipo 1 2 2 2 2 Pantoea sp. II

Morfotipo 2 1 1 1 1 Bacillus megaterium IVMorfotipo 3 2 2 1 - Complejo Bacillus subtilis -

Morfotipo 4 2 2 - - NI - Melaza de Caña (Incauca)Morfotipo 5 4 4 4 - Leuconostoc sp. -

Morfotipo 6 1 1 1 - Gluconobacter sp. -

Morfotipo 7 2 2 2 - Acinetobacter sp. -

Morfotipo 8 1 - - - NI -

Lactosuero bovino (Estación Agraria Paysandú)

Morfotipo 9 6 6 3 2 Lactococcus lactis IV

Morfotipo 10 1 1 1 - Klebsiella sp. -

Morfotipo 11 1 - - - NI - Lactosuero bovino (Santa Rosa de Osos)Morfotipo 12 2 - - - NI -

Morfotipo 13 5 5 5 2 Klebsiella sp. yEnterobacter sp. II

Lactosuero caprino (Sopetrán)Morfotipo 14 2 - - - NI -

Morfotipo 15 1 1 1 - Pseudomonas sp. - Bagazo de Caña (Ingenio Incauca)Morfotipo 16 6 5 5 3 Bacillus megaterium IV

Morfotipo 17 2 2 2 1 Bacillus megaterium IV Cachaza de Caña (Ingenio Incauca)Morfotipo 18 2 - - - NI -

Morfotipo 19 2 2 Enterobacter sp. -Morfotipo 20 2 - - - NI -

Morfotipo 21 1 1 1 - Enterobacter sp. -

Morfotipo 22 1 1 1 - Complejo Bacillus cereus -

* Número de cepas evaluadas de cada morfotipo.** Identicación molecular con base en análisis logenético de secuencias 16S del ADNr.*** Bacterias representativas de cada tipo de arreglo genético de biosíntesis de PHAs. Tipo I: Cupriavidus necator ; Tipo II: Pseudomonas sp.; Tipo III: Chromatium vinosum; Tipo IV: Bacillus megaterium.


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fue evidente que los sustratos de bagazo y cachaza decaña de azúcar favorecieron el aislamiento de estasúltimas, destacándose el alto número de morfotiposidenticados como Bacillus megaterium (Tabla 2).

Con respecto a los lactosueros resultantes de laagroindustria de producción de quesos, se hanrealizado diferentes evaluaciones biotecnológicas queincluyen el uso de lactosa, su principal carbohidrato,como fuente de bioetanol, vinagre y de diferentesaditivos alimenticios (Koller et al., 2012). Young etal. (1994) reportaron por primera vez, la posibilidadde usar lactosueros como fuente de carbono para lasíntesis de PHAs, utilizando la bacteria Pseudomonascepacia (antes Burkholderia cepacia). Dicha bacteriademostró la capacidad de acumular a partir delactosa, hasta 56% de PHB en peso seco celular, lo querepresentaba una eciencia de conversión de 5 g L-1

de lactosuero. Posteriormente, Ahn et al. (2000, 2001)propusieron la utilización de cepas genéticamentemodicadas de Escherichia coli con el operón debiosíntesis de PHAs de Alcaligenes latus, para la síntesisde bioplásticos a partir de lactosueros, alcanzandohasta 4 g/L/h de PHAs en procesos fermentativos porlotes y con altas concentraciones de lactosa (hasta280 g L-1). Estos reportes coinciden con los resultadosencontrados en este estudio, en los que fue posiblela identicación de bacterias especialmente Gramnegativas a partir de los sustratos de lactosuerosbovinos y caprinos, destacándose en este sustrato lapresencia de un morfotipo representante del género

Pseudomonas, cuyos miembros son ampliamenteutilizados a nivel biotecnológico para la síntesis yacumulación de PHAs (Reddy et al., 2003; Keshavarzy Roy, 2010).

Identifcación molecular de bacterias. Lasamplicaciones por PCR con los cebadores PA yPC5B permitieron obtener amplicones de 1.440pb (Figura 2) en las 27 bacterias seleccionadaspara su identicación, que incluían al menos un

representante de cada morfotipo (Tabla 2). Elanálisis por BLASTN indicó que diez de las cepaspertenecen al género Bacillus, tres a los génerosLactococcus, Klebsiella y Enterobacter , dos a Pantoea;mientras que se identicó un representante enlos géneros Enterococcus, Neisseria, Pseudomonas,Leuconostoc, Gluconobacter y Acinetobacter . Además,de una bacteria sólo determinada a nivel de la familia(Enterobacteriaceae). Estos resultados de BLASTNcorresponden a un alineamiento local que conduce aidenticaciones genéricas y putativas, pues dependende la validez taxonómica de las accesiones depositadasen las bases de datos moleculares. Por lo tanto, para

tener mayor conabilidad en la identicación, se realizóun análisis logenético con secuencias de referenciaque presentan respaldo en la literatura cientíca(Patel, 2001; Janda y Abbott, 2007). Los dendrogramasresultantes presentaron topologías similares con ambosalgoritmos (NJ y ML), lo que ofrece un soporte adicionala las inferencias taxonómicas realizadas. Por lo anterior,sólo se presenta el dendrograma de ML (Figura 3).

El análisis logenético incluyó además de 27secuencias obtenidas en este estudio, 55 secuenciasrepresentativas de diferentes especies y como grupoexterno (outgroup) se utilizó una secuencia deDeinococcus sp. (Accesión KC49323). El dendrogramaresultante presentó dos clados principales quesepararon las bacterias Gram negativas (I) de lasGram positivas (II). El primer clado se subdividió a

Figura 2. Amplicones obtenidos mediante PCR con cebadores especícos para la región: 16S del ADNr(1440 pb) (A); phaC de bacterias con arreglo tipo II del operón de biosíntesis de PHAs (491 pb) (B) y phaC debacterias con arreglo tipo IV del operón de biosíntesis de PHAs (590 pb) (C). Líneas A-1, B-1 y C-7: marcadorde peso molecular 100 pb plus (Fermentas). Líneas A-12, B-9 y C-1: controles negativos. Las echas indican losfragmentos del tamaño esperado.


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Figura 3. Árbol logenético generado mediante el algoritmo ML, con base en secuencias 16S del ADNr debacterias aisladas en Colombia a partir de subproductos de la caña de azúcar y lactosueros bovino y caprino.Los valores de bootstrap se indican sobre las ramas.


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su vez en tres subclados soportados por valores debootstrap de 100%, que diferenciaron las Gamma (IA),Beta (IB) y Alfa (IC) proteobacterias, siendo el subcladoIA el que incluyó mayor número (11) de bacteriasGram negativas obtenidas de todos los subproductos,

con excepción de bagazo de caña. Este subclado,dividió a su vez las bacterias productoras de PHAsentre las familias Enterobacteriaceae, Moraxellaceae yPseudomonadaceae, siendo identicadas a nivel genéricolas cepas 11-lactosuero y 13-lactosuero (Klebsiella sp.),34-cachaza, 12-lactosuero y 14-lactosuero (Enterobacter sp.), 6-melaza (Pantoea sp.), 26-melaza ( Acinetobacter sp.) y 19-suero (Pseudomonas sp.); mientras que fueposible inferir la identicación a nivel de especie en estesubclado IA, de los aislamientos 33-cachaza (Enterobacteroryzae) y 30-cachaza (Enterobacter cloacae). Lo anterior,fue, además, soportado por la matriz de identidadgenética, en donde dichos aislamientos compartieron

valores de 98 y 100%, con cepas de referencia de ambasespecies (matriz no mostrada).

El subclado IB alojó a la cepa 16-lactosuero en conjuntocon dos secuencias de referencia de Neisseria mucosa; sinembargo, al compartir niveles de identidad de 87%, nofue posible identicar dicha bacteria a nivel de especie.Por su parte el subclado IC, agrupó la cepa 24-melazacon acetobacterias del género Gluconobacter , aunquesólo compartió con estas 81% de identidad.

Por otra parte, el clado II representando las bacteriasGram positivas, presentó cuatro subclados con soportes

de bootstrap superiores al 98%. El subclado IIA incluyóal aislamiento 20-melaza con diferentes especies delgénero Leuconostoc, mientras que el IIB presentó trescepas obtenidas de lactosuero (8, 9 y 10) en conjuntocon diferentes secuencias de Lactococcus lactis, subsp.lactis y subsp. cremoris. El subclado IIC representael género Enterococcus e incluyó el aislamiento15-lactosuero. Finalmente, el subclado IID agrupó todaslas especies del género Bacillus, que se subdividieron entres grupos soportados por valores bootstrap de 100%y que representan los complejos de especies B. subtilis,B. cereus y B. megaterium; siendo las cepas 37-melazay 35-cachaza, representantes de los dos primeroscomplejos; mientras que siete cepas se identicaroncomo B. megaterium, lo cual se soportó, adicionalmente,por altos niveles en la matriz de identidad (>99%)con cepas de referencia de dicha especie (matriz nomostrada).

De las bacterias identicadas en este trabajo, ya sehabían mencionado en la literatura como productoras

de PHAs miembros de los géneros Enterobacter (Naheed et al., 2012), Klebsiella (Zhang et al., 1994);Pantoeae (Gasser et al., 2009), Acinetobacter (Reddyet al., 2003), Pseudomonas (Reddy et al., 2003),Neisseria (Kalia et al., 2007), Lactococcus (Tanaka et

al., 1995) y Bacillus (Reddy et al., 2003); mientras que,hasta donde se conoce, dichos reportes no se hanrealizado para especies de los géneros Leuconostoc,Gluconobacter y Enterococcus, por lo que el estudiode dicha característica en las cepas aquí aisladase identicadas, resultará prioritario en el futuropróximo. Para esto será necesario realizar procesosfermentativos con diferentes fuentes de carbono ycondiciones operacionales, además de detectar, clonary secuenciar los genes responsables de la biosíntesisde PHAs en dichas bacterias, de tal manera que seevalúe el tipo de su operón.

A nivel mundial, las bacterias Gram negativasproductoras de PHAs más recurrentemente aisladasy utilizadas corresponden a las especies C. necator,

A. latus, P. oleovorans, P. putida, E. coli recombinantey Azotobacter vinelandii; siendo C. necator la másempleada por su capacidad de acumular grandescantidades de PHB, en un porcentaje cercano al 80%del peso seco celular, a partir de medios simples confuentes de carbono económicas (Reddy et al., 2003;Keshavarz y Roy, 2010). Para el caso de las bacterias Grampositivas, B. megaterium es la bacteria más registradacomo productora de PHAs (Reddy et al., 2003; Shamalaet al., 2003). Esta bacteria ha sido aislada de una gran

variedad de sustratos y desechos agroindustriales,así como utilizada en procesos fermentativos condiferentes fuentes de carbono, siendo posible a partirde la manipulación de las condiciones de crecimiento,reducir su esporulación y por tanto, inducir laacumulación de altas cantidades de bioplásticos (Lópezet al., 2012). En Colombia se han adelantado diferentesestudios tendientes a detectar la presencia de bacteriasproductoras de PHAs a partir de diferentes sustratos yresiduos de procesos agroindustriales (Moreno et al.,2007; Revelo et al., 2007; Franco et al., 2009; Sánchezet al., 2012). Recientemente, éstos últimos autoresaislaron a partir de suelos contaminados con residuosdel benecio de que (Furcraea bedinghausii) en elmunicipio de Guarne (Antioquia), cuatro cepas conpotencial para producir PHAs, siendo identicadascomo B. megaterium (dos cepas), B. mycoides y Gordonia sp. El gen PhaC fue detectado en los dos aislamientosde B. megaterium y mediante cromatografía de gasescon detector selectivo de masas, fue posible develar alpolihidroxibutirato (PHB) como el principal biopolímero


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acumulado en dichas bacterias. Ya que en el presenteestudio, también se identicaron varias cepas de B.megaterium, su utilización en pruebas posteriores queevalúen diferentes sustratos y desechos agroindustrialescomo fuentes de síntesis de PHAs, resultará altamente

promisorio para su posible escalado industrial enColombia, más aún cuando existen reportes recientesde la posibilidad de aumentar la eciencia en laproducción de PHAS por parte de cepas de estaespecie (hasta 65% de PHB), mediante el control de laconcentración de amonio (0,2-0,4 g L-1) en sistemas defermentación por lotes (Sabra y Aboud-Zeid, 2008).

Por otra parte, en el presente estudio, los lactosuerosde origen bovino y caprino se caracterizaron pormostrar la mayor diversidad de morfotipos bacterianosproductores de PHAs, seguramente como resultado desu riqueza nutricional, siendo identicadas en estos

sustratos las bacterias Lactococcus lactis, Klebsiella sp.,Enterobacter sp. y Pseudomonas sp. La utilización dedichas bacterias representa un potencial importantepara Colombia, que ha logrado establecerse como

el cuarto productor de lácteos en América Latina,con cerca de 6500 millones de litros/año (Proexport,2011b). Diferentes trabajos han conrmado la utilidadde bacterias para transformar lactosueros en PHAs,incluyendo E. coli, Hydrogenophaga psedofava,

Azotobacter spp., Lactobacillus spp., C. necator, Haloferaxmediterranei y P. hydrogenovora (Koller et al., 2012). Enadición, existen informes sobre el mejoramiento en laeciencia de síntesis de PHAs a partir de este sustratoy que pueden ser evaluados con las cepas obtenidasen el presente estudio. En este sentido, Ahn et al. (2000) registraron concentraciones nales de 92,6 gL-1 de PHB y altas productividades en su síntesis (2,57g/L/h), a partir de lactosuero sometido a fermentaciónFed Batch con la bacteria recombinante E. coli CGSC4401, transformada con los genes de la biosíntesisde PHAs de A. latus. Durante el proceso los autores,estratégicamente, disminuyeron la concentración de

oxígeno disuelto en el medio (DOC) por etapas, del40% al 30% y luego al 15%. Cada vez que el DOC seredujo durante la fase activa síntesis de PHB, la tasa desíntesis de PHB aumentó de forma pronunciada.

Aislamiento Similitud en GenBank NúmeroAccesión

Gen Identidad Valor e

6-Melaza Pseudomonas entomophila CT573326 poly(3-hydroxyalkanoate)

polymerase 1

92% 0,0

7-Melaza Pseudomonas uorescens AY232443 PhaC (phaC) genes 92% 0,0

14-Lactosuero Pseudomonas entomophila CT573326 poly(3-hydroxyalkanoate)polymerase 1

92% 9e-177

16-Lactosuero Paracoccus sp. HM026759 poly(3-hydroxyalkanoate)synthase

81% 1e-104

9-Lactosuero Bacillus megaterium JQ755810 polyhydroxyalkanoate synthase(phaC)

99% 0,0


100% 0,0


100% 0,0


97% 0,0

28-Bagazo Bacillus megaterium JQ755810 polyhydroxyalkanoate synthase(phaC)

100% 0,0

29-Bagazo Bacillus sp. FJ436021 PhaC gene 98% 0,031-Bagazo Bacillus sp. FJ436021 PhaC gene 98% 0,032-Bagazo Bacillus megaterium JQ755810 polyhydroxyalkanoate synthase

(phaC)97% 0,0

36-Melaza Bacillus megaterium JQ755810 polyhydroxyalkanoate synthase(phaC)

100% 0,0

Tabla 3. Similitud de secuencias del gen phaC de las bacterias aisladas a partir de subproductos de caña deazúcar y lactosueros en Colombia, con respecto a la base de datos del GenBank. En adición al porcentaje deidentidad, se presentan los valores e de la comparación.


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Detección del gen phaC. La identicación molecularde las bacterias bajo estudio, sirvió de base pararealizar la selección de los cebadores más apropiadospara la detección del gen phaC, siendo posible suconrmación en un subgrupo de siete de las cepas

(Tabla 2) mediante la PCR anidada que utiliza loscebadores GD/G1R/G2R, y que generó amplicones de491 pb (Figura 2). Adicionalmente, la utilización de loscebadores B1F/R dirigidos a amplicar una porcióndel gen phaC del tipo IV, permitió la obtención deamplicones de 590 pb en nueve cepas identicadasmolecularmente como B. megaterium. La naturalezade dichos amplicones fue conrmada mediantesecuenciación directa en dos cepas, representandolos morfotipos 1 y 13 y conteniendo el arreglogenético de biosíntesis de PHAs tipo II, y en cuatrocepas de los morfotipos 2, 9, 16 y 17, que presentaronel operón tipo IV; obteniéndose, con excepción

de la cepa 16-lactosuero, valores de identidad enGenBank superiores al 92% con respecto al gen phaCde bacterias del género Pseudomonas y Bacillus sp.,respectivamente (Tabla 3). La cepa 16-lactosuero,identicada como asociada logenéticamente algénero Neisseria, fue la excepción al presentar tansólo un 82% de identidad con el gen phaC de labacteria Paracoccus sp. (Accesión HM26759), lo cualno permite su ubicación en uno de los cuatro tipos deoperones de biosíntesis de PHAs.

Este estudio abre la posibilidad de realizar un ampliorango de investigaciones y aplicaciones futuras, para

la evaluación de sustratos y condiciones fermentativas,utilizando las bacterias aisladas e identicadas a partirde residuos de la caña de azúcar y lactosueros enColombia. De gran interés resultará evaluar, no sólosu capacidad para metabolizar los mismos residuos apartir de los cuales fueron aisladas, sino también, otrossubproductos y desechos agroindustriales producidosen Colombia y otros países tropicales, como aquellosgenerados en el procesamiento de palma de aceite,pulpa de frutas y de concentrados de animales.

CONCLUSIONES

Se logró el aislamiento de 38 cepas bacterianas quepresentan potencial como productoras de PHAs,siendo identicadas 27 cepas, a nivel de género oespecie, mediante secuenciación de regiones 16S delADNr. Los lactosueros de bovinos y caprinos fueronlos que presentaron mayor diversidad de bacterias,con miembros de los géneros Enterobacter, Klebsiella,Pseudomonas, Enterococcus, Lactococcus y Bacillus;

mientras que, en los residuos de caña de azúcar sedestacó el aislamiento repetido de B. megaterium.

Fue posible la detección del gen phaC, mediantePCR especíca en aislamientos seleccionados que

presentaron tinción positiva de PHAs con rojo y azulNilo. Las secuencias obtenidas conrmaron los altosniveles de identidad de dicho gen, con respecto a laregión correspondiente en los operones de biosíntesisde PHAs de los tipos II y IV depositados en las basesde datos moleculares.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue nanciada por el proyectoDIME 20101007214. Se agradece a Catalina PinedaMolina del Laboratorio de Cultivo Tisular del CES, porsu asistencia con las observaciones de microscopia

de uorescencia y al Ingenio Incauca por proveer lossubproductos de la caña de azúcar.

BIBLIOGRAFÍA

Ahn, W.S, S.J. Park and S.Y. Lee. 2000. Production ofPoly(3-Hydroxybutyrate) by fed-batch culture ofrecombinantEscherichia coli with a highly concentratedwhey solution. Applied and EnvironmentalMicrobiology 66(8): 3624-3627.

Ahn, W.S., S.J. Park and S.Y. Lee. 2001. Production ofpoly(3-hydroxybutyrate) from whey by cell recycle

fed-batch culture of recombinant Escherichia coli.Biotechnological Letters 23(3): 235-240.

Basanta, R., M.A. García, J.E. Cervantes, H. Mata y G.Bustos. 2007. Sostenibilidad del reciclaje de residuosde la agroindustria azucarera: una revisión. Ciencia yTecnología Alimentaria 5(4):293-305.

Capuccino, J. and N. Sherman. 2007. Microbiology: ALaboratory Manual. Benjamin Cummings, New York.544 p.

Ciesielski, S., A. Cydzik-Kwiatkowska, T. Pokoj andE. Klimiuk. 2006. Molecular detection and diversityof medium-chain-length polyhydroxyalkanoates-producing bacteria enriched from activated sludge.Journal of Applied Microbiology 101(1): 190-199.

De Lima, T.C.S., B.M. Grisi and M. Bonato. 1999.Bacteria isolated from sugarcane agro ecosystem:their potential production of polyhydroxyalkanoates


11/12



and resistance to antibiotics. Revista de Microbiología30(1): 241-224.

Franco, M., D. Gómez, N. Castro y M. Rendón. 2009.Polihidroxialcanoatos en actinomicetos nativos de

suelos colombianos. Revista Peruana de Biología16(1): 115-118.

Gasser, I., H. Muller and G. Berg. 2009. Ecology andcharacterization of polyhydroxyalkanoate producingmicroorganisms on and in plants. FEMS MicrobiologyEcology 70(1): 142-150.

Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biologicalsequence alignment editor and analysis program forWindows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series41: 95-98.

Janda, J.M. and L.S. Abbott. 2007. 16S rRNA genesequencing for bacterial Identication in thediagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls.Journal of Clinical Microbiology 45(9): 2761-2764.

Kalia, V., S. Lal and S. Cheema. 2007. Insight in to thephylogeny of polyhydroxyalkanoate biosynthesis:Horizontal gene transfer. Gene 389(1): 19-26.

Keshavarz, T. and P. Roy. 2010. Polyhydroxyalkanoates:bioplastics with a green agenda. Current Opinion inMicrobiology 13(3): 321-326.

Koller, M., A. Salerno, A. Muhr, A. Reiterer, E. Chiellini,S. Casella, P. Horvat and G. Braunegg. 2012. Chapter2: Whey lactose as a raw material for microbialproduction of biodegradable polyester. pp. 19-60. In:Saleh, H. (ed.). Polyesters. InTech, China. 420 p.

Kuske, C.R., S.M. Bams and J.D. Busch. 1997. Diverseuncultivated bacterial groups from soils of the aridSouthwestern United States that are present inmany geographic regions. Applied EnvironmentalMicrobiology 63(9): 3614-3621.

Lau, N. and K. Sudesh. 2012. Revelation of the abilityof Burkholderia sp. USM (JCM 15050) PHA synthaseto polymerize 4-hydroxybutyrate monomer. AMBExpress 2(41): 2-9.

Londoño, M., J. Sepúlveda, A. Hernández y J. Parra.2008. Bebida fermentada de suero de queso frescoinoculada con Lactobacillus casei. Revista FacultadNacional Agronomía Medellín 61(1): 4409-4421.

López, J.A., J.M. Naranjo, J.C. Higuita, M.A. Cubitto,C.A. Cardona and M.A. Villar. 2012. Biosynthesis ofPHB from a new isolated Bacillus megaterium strain:outlook on future developments with endosporeforming bacteria. Biotechnology and Bioprocess

Engineering 17(2): 250-258.

McCool, G. and M. Cannon. 2001. PhaC andPhaR are required for polyhydroxyalkanoic acidsynthase activity in Bacillus megaterium. Journal ofBacteriology 183(14): 4235-4243.

Moreno, N., I. Gutiérrez, D. Malagón, V. Grosso,D. Revelo, D. Suárez, J. González, F. Aristizábal, A.Espinosa and D. Montoya. 2007. Bioprospectingand characterization of poly-β-hydroxyalkanoate(PHAs) producing bacteria isolated from Colombiansugarcane producing areas. African Journal of

Biotechnology 6(13): 1536-1543.

Naheed N., N. Jamil, S. Hasnain and G. Abbas.2012. Biosynthesis of polyhydroxybutyrate inEnterobacter sp. SEL2 and EnterobacteriaceaeBacterium sp. PFW1 using sugar cane molasses asmedia. African Journal of Biotechnology 11(16):3321-3332.

Ostle, A.G. and J.G. Holt. 1982. Nile Blue A as auorescent stain for poly-beta-hydroxybutyricacid. Applied and Environmental Microbiology44(1): 238-241.

Parra, R.A., 2009. Lactosuero: importancia en laindustria de alimentos. Revista Facultad Nacionalde Agronomía Medellín 62(1): 4967-4982.

Patel, J.B. 2001. 16S rRNA gene sequencing forbacterial pathogen identication in the clinicallaboratory. Molecular Diagnosis 6(4): 313-321.

PROEXPORT. 2011a. Sector Agroindustrial Colombiano,http://www.proexport.com.co; consulta: febrero 2013.

PROEXPORT. 2011b. Sector lácteo en Colombia.En: http://www.botschaft-kolumbien.de/descargas_proexport/berl in_2011/espanol/ invers ion/ agroindustria/perl_lacteo.pdf. 18 p.; consulta: abril2013.

Reddy, C.S.K., R. Ghai, R. Rashmi and V.C. Kalia. 2003.Polyhydroxyalkanoates: an overview. BioresourceTechnology 87(2): 137-146.


12/12



Rehm, B.H. and A. Steinbuchel. 1999. Biochemicaland genetic analysis of PHA synthases and otherproteins required for PHA synthesis. InternationalJournal of Biological Macromolecules 25(1): 3-19.

Revelo, D., M.V. Grosso, N. Moreno and D. Montoya.2007. A most effective method for selecting abroad range of short and medium chain-lengthpolyhidroxyalkanoate producing microorganisms.Electronic Journal of Biotechnology 10(3): 348-357.

Sabra, W. and D.M. Aboud-Zeid. 2008.Improving feeding strategies for maximizingpolyhydroxybutyrate yield by Bacillus megaterium.Research Journal of Microbiology 3(5): 308-318.

Sánchez, S., M. Marín, A. Mora y M. Yepes.2012. Identicación de bacterias productoras

de polihidroxialcanoatos (PHAs) en sueloscontaminados con desechos de que. RevistaColombiana de Biotecnología 14(2): 89-100.

Schlegel, H.G., R. Lafferty and I. KraussI. 1970. Theisolation of mutants not accumulating poly-beta-hydroxybutyric acid. Archives of Microbiology 71(3):283-294.

Shamala, T.R., A. Chandrashekar, S.V.N. Vijayendra and L. Kshama. 2003. Identication ofpolyhydroxyalkanoate (PHA)-producing Bacillusspp. using the polymerase chain reaction (PCR).

Journal of Applied Microbiology 94(3): 369-374.

Sheu, D.S., Y.T. Wang and C.Y. Lee. 2000. Rapiddetection of plyhydroxyalkanoate-accumulatingbacteria isolated from the environment by colonyPCR. Microbiology 146(8): 2019-2025.

Solaiman, D.K., R.D. Ashby and T.A. Foglia. 2000. Rapidand specic identication of medium-chain-length

polyhydroxyalkanoate synthase gene by polymerasechain reaction. Applied Microbiology and Biotechnology53(6): 690-694.

Spiekermann, P., B.H. Rehm, R. Kalscheuer, D. Baumeister

and A. Steinbuchel. 1999. A sensitive, viable-colonystaining method using Nile Red for direct screeningof bacteria that accumulate poly-lyhydroxyalkanoicacids and other lipid storage compounds. Archives ofMicrobiology 171(2): 73-80.

Stubbe, J. and J. Tian. 2003. Polyhydroxyalkanoate (PHA)homeostasis: the role of the PHA synthase. NaturalProducts Reports 20(5): 445-457.

Tamura K., D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Neiand S. Kumar. 2011. MEGA5: Molecular evolutionarygenetics analysis using máximum likelihood,

evolutionary distance, and máximum parsimonymethods. Molecular Biology and Evolution 28(10):2731-2739.

Tanaka, K., K. Katamune and A. Ishizaki. 1995.Fermentative production of poly(β-hydroxybutyric acid)from xylose via L-lactate by a two-stage culture methodemploying Lactococcus lactis IO-1 and Alcaligeneseutrophus. Canadian Journal of Microbiology 41(13):257-261.

Young, F.K., R. James, K. Sheldon and W. May. 1994.Microbial Production of poly-β-hydroxybutyric acid

from d-xylose and lactose by Pseudomonas cepacia.Applied and Environmental Microbiology 60(11): 4195-4198.

Zhang, H., V. Obias, K. Gonyer and D. Dennis. 1994.Production of polyhydroxyalkanoates in sucrose-utilizing recombinant Escherichia coli and Klebsiella strains. Applied and Environmental Microbiology 60(4):1198-1205.

identificación molecular de bacterias productoras de polihidrixialcanoatos en subproductos de...

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