identificación de marcadores genéticos en genomas de

INSTITUTO POLITÉCNICONACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DEINVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO

INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA

Identificación de marcadores genéticos en

genomas de Salmonella spp. aislados de

hospitales

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRÍA EN

RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA

AGUSTÍN OLAYA MARTÍNEZ

GUASAVE, SINALOA; MEXICO JULIO DE 2020

Cesión de derechos

CARTA CESIÓN DE DERECHOS

En la Ciudad de Guasave, Sinaloa el día 02 del mes de Junio del año 2020, el

que suscribe Agustín Olaya Martínez alumno del Programa de Maestría en Recursos

Naturales y Medio Ambiente, con número de registro A180459, adscrito al CIIDIR

Unidad Sinaloa, manifiesta que es el autor intelectual del presente trabajo de Tesis

bajo la dirección del Dr. José Luis Acosta Rodríguez y el Dr. Jorge Montiel Montoya,

cede los derechos del trabajo titulado “Identificación de marcadores genéticos en

genomas de Salmonella spp. aislados de hospitales”, al Instituto Politécnico Nacional

para su difusión, con fines académicos y de investigación.

Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual,

gráficas o datos del trabajo sin el permiso expreso de la autora y/o directores del

trabajo. Este puede ser obtenido escribiendo a las siguientes direcciones

[email protected]; [email protected]; [email protected];. Si el

permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la

fuente del mismo.

i

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

AGUSTÍN OLAYA MARTÍNEZ

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALSECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

ACTA DE REVISIÓN DE TESIS

En la Ciudad de siendo las horas del día del mes de

del se reunieron los miembros de la Comisión Revisora de la Tesis, designada

por el Colegio de Profesores de Posgrado de: para

examinar la tesis titulada:

del (la) alumno (a):

ApellidoPaterno:

ApellidoMaterno:

Nombre (s):

Número de registro:

Aspirante del Programa Académico de Posgrado:

Una vez que se realizó un análisis de similitud de texto, utilizando el software antiplagio,se encontró que el trabajo de tesis tiene ______ % de similitud. Se adjunta reporte de softwareutilizado.

Después que esta Comisión revisó exhaustivamente el contenido, estructura, intención yubicación de los textos de la tesis identificados como coincidentes con otros documentos,concluyó que en el presente trabajo SI NO SE CONSTITUYE UN POSIBLE PLAGIO.

JUSTIFICACIÓN DE LA CONCLUSIÓN: (Por ejemplo, el % de similitud se localizaen metodologías adecuadamente referidas a fuente original)

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

**Es responsabilidad del alumno como autor de la tesis la verificación antiplagio, y del Director o Directoresde tesis el análisis del % de similitud para establecer el riesgo o la existencia de un posible plagio.

Finalmente, y posterior a la lectura, revisión individual, así como el análisis e intercambiode opiniones, los miembros de la Comisión manifestaron APROBAR SUSPENDERNO APROBAR la tesis por

UNANIMIDAD o MAYORÍA en virtud de los motivos siguientes:____________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ii

SIP-14

COMISIÓN REVISORA DE TESIS

Director de TesisNombre completo y firma

Nombre completo y firma Nombre completo y firma

2° Director de Tesis (en su caso)Nombre completo y firma

Nombre completo y firma Nombre completo y firma PRESIDENTE DEL

COLEGIO DE PROFESORES

iii

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

SECRETARIA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

ACTA DE REGISTRO DE TEMA DE TESISY DESIGNACIÓN DE DIRECTOR DE TESIS

México, D.F. a de del 2009

El Colegio de Profesores de Estudios dePosgrado e Investigación de

en su sesión

No. celebradael día

delmes de

conoció la solicitud

presentada por el(la) alumno(a):

Apellido paterno Apellido materno Nombre (s)

Con registro:

Aspirante de:

1.- Se designa al aspirante el tema de tesis titulado:

De manera general el tema abarcará los siguientes aspectos:

2.- Se designa como Director de Tesis al Profesor:

3.- El trabajo de investigación base para el desarrollo de la tesina será elaborado por elalumno en:

que cuenta con los recursos e infraestructuranecesarios.

4.- El interesado deberá asistir a los seminarios desarrollados en el área deadscripción del trabajo desde la fecha en que se suscribe la presente hasta la aceptación de la tesis

por la Comisión Revisora correspondiente:

Director(a) de Tesis

v

SIP-13

Aspirante Presidente del Colegio

vi

Hoja de reconocimiento a proyectos y becas

El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de _Biotecnologia_ del Centro

Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad

Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado

económicamente a través de los proyectos:

_____________________________________________________. El alumno/a Agustín

Olaya Martínez fue apoyado con una beca CONACYT con clave 894933.

vii

Dedicatoria

Este trabajo va dedicado primeramente a Dios, el que me dio fuerzas

cuando más abajo me sentía.

También va dedicado a mis padres Agustín e Ibón,

Y a mis hermanos Andrés y Antonio,

que sin su apoyo no hubiera llegado hasta este punto,

ya que fueron mis pilares principales.

Y por último y no menos importante, a mi novia Lluvia Isamarede,

gracias por tener siempre esas palabras de aliento y de apoyo

cuando más necesitaba de alguien, te lo agradezco de corazón.

viii

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca de

maestría Y a la Beca de Estimulo Institucional de Formación de Investigadores

(BEIFI) otorgadas durante el periodo enero 2018- diciembre 2019.

Al Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral

Regional unidad Sinaloa por el apoyo recibido con las grandiosas personas que

conforman el centro.

A mis directores de tesis el Dr. José Luis Acosta Rodríguez, que me aconsejó

y me dirigió dentro del mundo de Linux, y Dr. Jorge Montiel Montoya, que me guió a

través del mundo de las bacterias de la manera más paciente y precisa, por sus

consejos y enseñanzas. Por brindarme la oportunidad, confianza y paciencia para la

realización de esta tesis. Sus enseñanzas las llevaré siempre conmigo. Gracias por

su apoyo incondicional.

A mi comité tutorial que conformó el Dr. Manuel García Ulloa Gómez, la Dra.

María Nancy Herrera Moreno y en un principio la M.C. Mariela Guadalupe Espinoza

Mancillas, gracias por todas sus observaciones siempre atinadas y siempre bien

intencionadas, con el propósito de mejorar mi tesis y presentación. Sus consejos

fueron siempre útiles y me ayudaron a crecer bastante dentro del mundo de la

investigación.

A los maestros que me dieron alguna vez clases, sus enseñanzas me abrieron

otro panorama para mi entonces visión limitada de las cosas, todo en conjunto fue de

gran ayuda para orientarme en la investigación de este trabajo y fue de mucha

utilidad. Les agradezco el momento que dedicaron a enseñarme algo.

A mis compañeros de laboratorio, América, Dulce, Héctor, Alejandra, Víctor,

Yamel, Priscila, Berenice, Juan Francisco, Kenya, Zoe, Jesús Eduardo, Adrían y

Rodolfo que hicieron la estancia y el trabajo estresante más ameno por sus

comentarios siempre divertidos e interesantes. Las risas no faltaron nunca, y les

ix

agradezco el haber convivido con cada uno de ustedes. Son grandes personas y

amigos.

A mis excompañeros de laboratorio Mario2, Idalia, Irma y Fernanda, que

siempre los vi como mis hermanos mayores, ya que ustedes me guiaron en mis

primeros pasos y me hicieron sentir en confianza con ustedes y conmigo mismo para

lograr mis objetivos, sin ustedes todo sería muy distinto. Gracias por todo.

A mis amigos de generación Claudia Imelda, Iván, Asbel Itahí, Daniela,

Alejandro, Adara, Rigo y Romina, con ustedes todo fue mejor y más llevadero,

gracias por los buenos momentos y las risas, son cosas que llevaré conmigo

siempre.

A mis padres Agustín e Ibón, los cuales me apoyaron desde un principio

cuando la maestría era una incertidumbre para mí, me alentaron y jamás me dejaron

de la mano para terminar este trabajo. Les agradezco de corazón su apoyo

incondicional y las sabias palabras que me dieron desde un principio. Los amo.

A mi novia Lluvia Isamarede, cuando más desesperanzado me sentía y más

harto de todo, siempre estuviste conmigo. Tus palabras y tus acciones las llevo

conmigo siempre, gracias por ser ese soporte para no decaer. ¡Te amo!

x

Índice

Cesión de derechos-----------------------------------------------------------------------------i

Hoja de reconocimiento a proyectos y becas-------------------------------------------vii

Dedicatoria--------------------------------------------------------------------------------------viii

Agradecimientos--------------------------------------------------------------------------------ix

Índice----------------------------------------------------------------------------------------------xi

Glosario------------------------------------------------------------------------------------------xiii

Índice de Figuras-------------------------------------------------------------------------------xv

Índice de Tablas------------------------------------------------------------------------------xvii

Resumen---------------------------------------------------------------------------------------xviii

Abstract------------------------------------------------------------------------------------------xix

I. Introducción------------------------------------------------------------------------------1

II. Antecedentes---------------------------------------------------------------------------3

2.1 Salmonella-------------------------------------------------------------------------------3

2.1.1 Jerarquía taxonómica-------------------------------------------------------------3

2.1.2 Enfermedades por Salmonella-------------------------------------------------5

2.1.3 Situación mundial de la salmonelosis-----------------------------------------6

2.1.4 Situación en México de la salmonelosis-------------------------------------7

2.2 Antibióticos------------------------------------------------------------------------------7

2.2.1 Resistencia a antibióticos en Salmonella------------------------------------8

2.2.2 Mecanismos de resistencia----------------------------------------------------10

2.2.3 Estructura molecular de la multirresistencia-------------------------------12

2.3 Marcadores genéticos en Salmonella spp.----------------------------------15

2.4 Uso de la bioinformática dentro de los genomas bacterianos-------16

III. Justificación--------------------------------------------------------------------------17

IV. Hipótesis--------------------------------------------------------------------------------18

V. Objetivos--------------------------------------------------------------------------------18

xi

5.1. Objetivo general---------------------------------------------------------------------18

5.2. Objetivos específicos--------------------------------------------------------------18

VI. Materiales y métodos-----------------------------------------------------------19

6.1. Preprocesamiento de secuenciación----------------------------------------19

6.2 Ensamblado de novo de genomas de Salmonella------------------------19

6.3 Anotación y comparación de genomas de Salmonella---------------21

6.4 Determinación de pangenoma, coregenoma y genoma accesorio o

endémico---------------------------------------------------------------------------------------------21

6.5 Búsqueda de genes de resistencia en pangenoma, coregenoma, y

genoma accesorio---------------------------------------------------------------------------------21

VII. Resultados---------------------------------------------------------------------------23

7.1. Preprocesamiento de secuenciación-----------------------------------------23

7.2. Ensamblar de novo los genomas de salmonellas aislados de

hospitales--------------------------------------------------------------------------------------------29

7.4 Determinación de pangenoma, coregenoma y genoma accesorio o

endémico---------------------------------------------------------------------------------------------36

7.5 Búsqueda de genes de resistencia en pangenoma, coregenoma, y

genoma accesorio---------------------------------------------------------------------------------40

VIII. Discusion-----------------------------------------------------------------------------61

IX. Conclusiones------------------------------------------------------------------------64

X. Bibliografía-----------------------------------------------------------------------------65

xii

Glosario

ADN: Información genética de un genoma codificada en el ácido

desoxirribonucleico (ADN) que se conserva en el núcleo celular. El ADN tiene dos

cadenas estructuradas en una doble hélice, formada por un glúcido (desoxirribosa),

fosfato y cuatro bases químicas − los nucleótidos: adenina (A), guanina (G), citosina

(C) y timina (T). Una A en una cadena se empareja siempre con una T en la otra

mediante dos enlaces de hidrógeno, en tanto que una C siempre se empareja con

una G mediante tres enlaces de hidrógeno. Las dos cadenas son, pues,

complementarias entre sí.

ADN complementario (cADN): Secuencias de ADN generadas por la

transcripción inversa de las secuencias de mARN. Este tipo de ADN incluye exones y

regiones no traducidas en los extremos 5’ y 3’ de los genes, pero no incluye el ADN

del intrón.

ARN: El ácido ribonucleico es un ácido nucleico de una cadena formado por

tres de las cuatro bases presentes en el ADN (A, C y G). T, es sustituida por uracilo

(U).

Bioinformática: Campo de la ciencia en el cual confluyen varias disciplinas:

biología, computación y tecnología de la información.

Coregenoma: Representa los genes presentes en todas las cepas de una

especie.

Marcador genético: Polimorfismo del ADN que se puede detectar fácilmente

mediante análisis fenotípico o molecular. El marcador puede hallarse dentro de un

gen o en un ADN sin función conocida. Dado que los segmentos de ADN que se

encuentran próximos entre sí en un cromosoma tienden a heredarse juntos, los

marcadores se suelen utilizar como maneras indirectas de seguir la pista del patrón

de herencia de un gen que aún no se ha identificado, pero cuya localización

aproximada sí es conocida.

xiii

Morbilidad: Número de personas que enferman en una población y período

determinados.

Mortalidad: Número de defunciones en una población y período

determinados.

Nosocomio: Hospital; establecimiento destinado para la atención y asistencia

a enfermos por medio de personal facultativo, enfermería, personal auxiliar y de

servicios técnicos durante 24 horas, 365 días del año y disponiendo de tecnología,

aparatología, instrumental y farmacología adecuadas.

Pangenoma: Colección de todos los genes en una especie (aplicado

típicamente a bacterias y arqueas, que pueden presentar una gran variación de

contenido genético entre cepas estrechamente relacionadas). El pangenoma es el

conjunto completo de genes de todas las cepas de una especie. Incluye genes

presentes en todas las cepas (Coregenoma) y genes presentes solo en algunas

cepas de una especie (genoma variable o accesorio). El pangenoma (o

supragenoma) adquiere importancia en un contexto evolutivo, especialmente con

referencia a la metagenómica, pero es usado también en un contexto genómico más

amplio.

Plásmidos: Pequeños fragmentos circulares de ADN, están presentes

prácticamente en todas las células bacterianas. Contienen de 2 a 30 genes. Algunos

tienen la capacidad para incorporarse o salir del cromosoma bacteriano.

Phred (Q): Phred base calling, programa informático diseñado para la

identificación de una secuencia de base o nucleobase a partir de señales de

fluorescencia generados por un secuenciador de ADN automatizado. El uso más

importante de los niveles de calidad de Phred es la determinación automática de

secuencias consenso precisas basadas en la calidad de su secuenciación.

xiv

Índice de Figuras

Figura 1. Forma de transmisión entre distintos ambientes de bacterias resistentes en

humanos y animales (Rivera de Linton, 2016).....................................................10

Figura 2. Representación esquemática de los mecanismos de resistencia a

antibióticos más comunes en una bacteria. 1: Entrada del antibiótico a través de

porinas. 2: Enlace al objetivo. A: Pérdida de porinas. B: Enzimas inactivadoras de

antibióticos por modificación (B1) o por hidrólisis (B2). C: eflujo mejorado. D:

modificación pre-transcripcional del objetivo / blanco. E: Modificación

postraduccional del objetivo. (i) Cromosoma bacteriano que porta el gen que

codifica el objetivo. (ii) Los plásmidos de resistencia que llevan genes que

codifican para modificar enzimas (González-Zorn y Escudero, 2012).................12

Figura 3. Representación esquemática de los mapas genéticos de 4 plásmidos V de

Salmonella. Los plásmidos pSLT/pSTV, pSEV, pSCV y pSDV (específicos de

serotipos S. typhimurium, S. enteritidis, S. choleraesuis y S. dublin,

respectivamente) se presentan alineados respecto a pSLT. Deleción

determinada: ----; deleción no determinada: ; región heteróloga (Mendoza et al.,

2009)......................................................................................................................14

Figura 4. Porcentaje de genomas de Salmonella enterica con serovar......................23

Figura 5. Subespecies de Salmonella enterica...........................................................24

Figura 6. Tamaño de genomas completos de S. entérica...........................................24

Figura 7. Tipos de serovar de S. entérica....................................................................25

Figura 8. Porcentaje de genomas de Salmonella bongori con serovar......................25

Figura 9. Tamaño de genomas completos de S. bongori............................................26

Figura 10. Análisis de componentes principales que muestra la cercanía entre las

cepas aisladas, con un rango que va de 0 a 1, donde los colores más cálidos son

los que representan más homogeneidad, y los colores más fríos muestran menos

homogeneidad entre ellos.....................................................................................30

Figura 11. Dendograma donde se muestra la formación de clústeres de los 15

genomas aislados por ENCB. Los porcentajes que se muestran en color verde

xv

representan el valor esperado dentro de las ramas del dendograma, mientras

que el color rojo muestra el valor que resultaron de los valores ANI...................31

Figura 12. Dendograma que muestra todos los genomas completos de Salmonella

spp. descargados de NCBI junto con los 15 genomas aislados por ENCB.........34

Figura 13. Acercamiento dentro del dendograma donde se muestra la ubicación de

las cepas INP55, INP36, INP33, INP53, INP45, INP35, INP48, INP50, INP46 y

INP47.....................................................................................................................35


las cepas INP51, INP52 y INP34..........................................................................35


las cepas INP34 y INP52......................................................................................36

Figura 16. Esquema que muestra el total de genes encontrados dentro del

pangenoma............................................................................................................37


coregenoma...........................................................................................................37

Figura 18. Esquema que muestra el total de genes ubicados dentro del genoma

accesorio o endémico...........................................................................................38

Figura 19. Gráfica que muestra el porcentaje de identidad de los genes encontrados

por el software BLAST..........................................................................................39

Figura 20. Gráfica de pangenoma. En el eje X muestra el número de genomas

ingresados al pangenoma. El eje Y muestra el número ingresado de genes a

medida de ir ingresando cada genoma.................................................................40

Figura 21. Lecturas de secuencias pareadas..............................................................41

xvi

Índice de Tablas

Tabla 1. Número de lecturas con el que cuenta cada genoma, el porcentaje de

nucleótidos secuenciados mayores a 20 en la escala de valores Phred (% Q20),

el tamaño del genoma expresado en Megabases (MB) y la cantidad de N en el

genoma, expresados en Megabases....................................................................27

Tabla 2. Puntuación Q de Phred y sus respectivos valores de precisión (Padilla,

2018)......................................................................................................................28

Tabla 3. Genes dentro de los genomas de Salmonella recolectados por la ENCB....31

Tabla 4. Genes encontrados dentro del coregenoma, la primera columna muestra el

nombre del gen y la segunda columna muestra la función de cada uno de ellos.

...............................................................................................................................41

Tabla 5. Genes de resistencia a antibióticos encontrados dentro del genoma

accesorio de las cepas aisladas. Cada tabla tiene una división el cual es el

nombre de la cepa aislada. La primera columna muestra el nombre de los genes

y la segunda columna muestra la función de cada gen........................................41

xvii

Resumen

Las epidemias de infección intestinal por Salmonella spp. son uno de los

problemas más comunes, es considerada la enfermedad más difundida a nivel

mundial. Existe una gran preocupación por la infección de este enteropatógeno y se

han convertido en un factor de riesgo debido a la creciente resistencia de esta

bacteria a los fármacos. Ante esta problemática, se han buscado herramientas para

el diagnóstico y seguimiento de estas enfermedades multidrogorresistentes. Durante

los últimos años, la genética y bioinformática, mediante la secuenciación y el análisis

de marcadores genéticos, han adquirido una significación especial para ello. Por lo

tanto, los genes de esta bacteria en las muestras de hospitales de la Ciudad de

México recolectados y secuenciados por el Instituto Nacional de Ciencias Biológicas

(ENCB) en México, fueron analizados para identificar similitudes entre los serotipos

de Salmonella. Se descargaron 7,979 genomas de Salmonella enterica y 12 de

Salmonella bongori desde el servidor del Centro Nacional para la Información

Biotecnológica (NCBI). Para el preprocesamiento de los genomas ensamblados, se

utilizó el software FastQC. Una vez obtenidos los genomas con ensamble de novo,

se procedió a comparar los genomas anteriormente ensamblados con los genomas

completos descargados de la base de datos de NCBI. Se determino el pangenoma,

coregenoma y el genoma accesorio de todos los genomas de Salmonella y para

localizar los genes de resistencia dentro de los resultados anteriores, se utilizó el

software ARIBA. Se encontraron 36,057 genes que estuvieron presentes en todos los

genomas descargados de la base de datos de NCBI, dentro de los cuales, se

ubicaron 1,838 genes dentro del coregenoma y los 34,219 genes restantes fueron

ubicados dentro del genoma accesorio. Dentro del último objetivo específico, se

concluye que, de los 15 genomas aislados por la ENCB, 419 genes presentaron

resistencia a antibióticos, los cuales, se comparten entre todos los aislados y 52 de

estos genes encontrados están ubicados dentro del genoma accesorio, lo que indica

que son genes únicos.

xviii

Abstract

Epidemics of intestinal infection by Salmonella spp. They are one of the most

common problems, it is considered the most widespread disease worldwide. There is

great concern about the infection of this enteropathogen and they have become a risk

factor due to the increasing resistance of this bacterium to medicine. Given this

problem, tools have been sought for the diagnosis and monitoring of these multidrug-

resistant diseases. In recent years, genetics, and bioinformatics, through the

sequencing and analysis of genetic markers, have acquired special significance for

this. Therefore, the genes of this bacterium in the samples of Mexico City hospitals

collected and sequenced by the National Institute of Biological Sciences (ENCB) in

Mexico, were analyzed to identify similarities between the Salmonella serotypes.

7,979 genomes of Salmonella enterica and 12 of Salmonella bongori were

downloaded from the server of the National Center for Biotechnological Information

(NCBI). For the preprocessing of the assembled genomes, the FastQC software was

used. Once the genomes were obtained with a de novo assembly, the previously

assembled genomes were compared with the complete genomes downloaded from

the NCBI database. The pangenome, coregenome and accessory genome of all the

Salmonella genomes were determined and to locate the resistance genes within the

previous results, the ARIBA software was used. 36,057 genes were found that were

present in all genomes downloaded from the NCBI database, within which 1,838

genes were located within the coregenome and the remaining 34,219 genes were

located within the accessory genome. Within the last specific objective, it is concluded

that, of the 15 genomes isolated by the ENCB, 419 genes presented resistance to

antibiotics, which are shared among all the isolates and 52 of these genes found are

located within the accessory genome, which indicates that they are unique genes.

xix

I. Introducción

El género Salmonella está constituido por bacterias gram negativas; es

causante de muchas de las infecciones transmitidas por los alimentos y se agrupan

en S. enterica y S. bongori (Fookes et al., 2011). Esta última es un bacilo que causa

una enfermedad gastrointestinal (diarrea) en algunos animales y, raramente, se han

reportado casos en seres humanos (Chan et al., 2003). Por su parte, S. enterica

provoca dos formas de enfermedades en humanos: fiebre tifoidea (potencialmente

letal), causada por unos pocos serovares específicos como Salmonella enterica

subespecie enterica serovar typhi (S. typhi); y salmonelosis no tifoidea, producida por

salmonellas distintas a S. typhi (los casos letales son excepcionales, pero pueden

ocurrir sobre todo en ancianos y pacientes inmunodeprimidos (Eguale et al., 2017).


problemas más comunes, es considerada la enfermedad más difundida a nivel

mundial (OMS, 2018) y se han convertido en un factor de riesgo, ya que

normalmente, se transmite a través de los alimentos cuando no se han manipulado

en condiciones higiénicas. Esta bacteria produce una rápida propagación de sus más

de 2500 serotipos en el hombre (Chan et al., 2003). Sin embargo, la gran

preocupación por la infección de este enteropatógeno se debe al elevado número de

fracasos en los tratamientos con antimicrobianos convencionales. En México, en el

año 2017 se diagnosticaron 25,683 más casos de salmonelosis que en 2016

(121,846 casos; Rivera Calderón et al., 2012; SINAVE, 2017), posiblemente,

ocasionados por la alta resistencia bacteriana a estos fármacos (Rivera Calderón et

al., 2012). Las bacterias resistentes pueden circular entre distintas y distantes

poblaciones de seres humanos y animales (Lazovski et al., 2018), ya que los genes

que codifican los mecanismos de resistencia pueden transmitirse entre diferentes

especies bacterianas de manera rápida e impredecible, lo que reduce las

posibilidades terapéuticas en un número creciente de infecciones (Enriquez et al.,

2017).

Cabe mencionar que el desarrollo de la resistencia a los antimicrobianos

(RAM) sucede de manera natural con el tiempo, es parte del proceso de adaptación

1

biológica de las bacterias; sin embargo, el uso excesivo y/o inadecuado de los

antimicrobianos en salud humana, la falta de higiene, el saneamiento deficiente y el

control inadecuado de las infecciones en los hospitales y clínicas han acelerado

notablemente este proceso (OMS, 2015).

Debido a lo anterior, se han buscado herramientas para el diagnóstico,

seguimiento y tratamiento de las enfermedades como la salmonelosis y, durante los

últimos años, la genética y bioinformática, mediante la secuenciación y el análisis de

marcadores genéticos, han adquirido una significación especial para ello (FAO,

2015). Estos últimos son específicos para cada individuo, grupos, especies o grupos

sistemáticos mayores, convirtiéndolos así en herramientas de análisis tanto de

individuos como de poblaciones (Renteria, 2000).

2

II. Antecedentes

A finales del siglo XIX, se realizó la primera descripción de bacterias del

género Salmonella por Daniel Elmer Salmon y Theobald Smith, quienes aislaron

Salmonella choleraesuis de muestras tomadas de un cerdo con peste porcina

clásica, entendiendo que era el agente de esta enfermedad. Más tarde, estas

bacterias se denominaron Salmonella por Joseph Léon Marcel Ligniéres, en honor a

Salmon (Feliz, 2011).

2.1 Salmonella spp.

Es una bacteria móvil en forma de bastón, se caracteriza por ser bacilos gram-

negativos, anaerobios facultativos, catalasa positivos, oxidasa negativos, no

formadores de esporas y por poseer flagelos perítricos que les confieren movilidad,

con excepción del serotipo S. gallinarum y las variantes inmóviles de otros serotipos

(Feliz, 2011). Es la causante de muchas de las infecciones transmitidas por los

alimentos. El potencial de patogenicidad se representa en S. entérica y por sus más

de 2,600 serotipos descritos hasta el momento (Izquierdo-Blasco et al., 2013). Su

hábitat principal es el tracto intestinal del hombre y de los animales. Destaca por su

gran capacidad de adaptación, sobrevive durante largos periodos en el ambiente

asociada a substratos orgánicos, se multiplican entre los 7 y los 45 ºC y sobreviven a

la refrigeración y congelación, lo que les permite infectar a un amplio rango de

hospedadores (Feliz, 2011). Se inactivan a pH inferior a 5 y a temperaturas

superiores de 60 ºC (Ellermeier y Slauch, 2006).

2.1.1 Jerarquía taxonómica

Actualmente, la clasificación más aceptada es la que propone que el género

Salmonella comprende dos especies: Salmonella bongori y Salmonella enterica. No

3

obstante, esta clasificación oficialmente no está reconocida por el Comité

Internacional de Taxonomía Bacteriana (ICBT; Feliz, 2011).

Reino: Bacteria (Cavalier-Smith, 2002)

Subreino: Negibacteria (Cavalier-Smith, 2002)

Filo: Proteobacterias (Garrity et al., 2005)

Clase: Gammaproteobacteria (Garrity et al., 2005)

Orden: Enterobacteriales (Garrity y Holt, 2001)

Familia: Enterobacteriaceae (Rahn, 1937)

Género: Salmonella (Lignieres, 1900)

Especies: Salmonella

bongori (Le Minor et al., 1985)

Reeves et al., 1989

Salmonella enterica (Le Minor y

Popoff, 1987)

Salmonella subterranea

(Shelobolina et al., 2005).

La clasificación de los serotipos o serovares de Salmonella puede realizarse

desde el punto de vista epidemiológico, de acuerdo al grado de adaptación en una

especie hospedadora (Kingsley y Bäumler, 2000). Por ejemplo, existen serovares

adaptadas rigurosamente a un hospedador especifico, como es el caso de S. typhi,

que únicamente está asociada a infecciones en el hombre, o S. gallinarum en aves.

De igual manera, serovariedades adaptadas a un hospedador específico pero que

pueden aislarse en otros hospedadores, como S. cholerasuis que se ha asociado a

4

procesos sistémicos graves en cerdos y en el hombre; y finalmente, serovariedades

no adaptadas a hospedadores específicos como S. typhimurium que se aísla de una

gran variedad de animales y del ambiente (Uzzau et al., 2000). Estos últimos (S.

cholerasuis y S. typhimurium) son los que frecuentemente originan brotes de

salmonelosis en el hombre, asociados al consumo de productos contaminados,

principalmente huevos y carne (Feliz, 2011).

2.1.2 Enfermedades por Salmonella

Una forma particular de infección por Salmonella en el humano es la fiebre

tifoidea, la cual, es causada por la ingestión e invasión intestinal por un serotipo

específico de Salmonella enterica, el serovar typhi (S. typhi), que produce infección

sistémica, y de acuerdo con Zaidi et al. (2006), en el mundo hay al menos 16

millones de casos de fiebre tifoidea actualmente, resultando en 600,000 muertes; así

mismo, mencionan que existen tres vacunas disponibles contra la fiebre tifoidea: a)

La vacuna parenteral K (presentan fuertes efectos secundarios adversos,) b) La

vacuna oral Ty21a, producida con S. typhi atenuada mediante mutagénesis química

(se requieren de 3-4 dosis para la generación de protección y de refuerzo cada 5

años) y c) La vacuna parenteral a base del antígeno capsular Vi (debido a su

naturaleza química, el polisacárido Vi no induce memoria inmunológica, por lo cual,

se requieren refuerzos cada 3 años y es poco inmunogénico en niños menores de 2

años y en adultos mayores. Cabe mencionar que no hay actualmente una vacuna

contra las otras serovariedades de salmonella capaces de producir infecciones

sistémicas (Rivera Calderón et al., 2012).

Otra enfermedad provocada por Salmonella es la salmonelosis, la cual, es un

tipo de intoxicación alimentaria. Por lo general, se alojan en los intestinos de los

animales y humanos, y se expulsan a través de las heces fecales. Generalmente,

esta enfermedad se contrae por consumir carne cruda o poco cocida, aves, huevos o

productos de huevo. Su incubación dura entre horas hasta por dos días, por lo que

los síntomas de la salmonelosis se empiezan a mostrar en promedio entre 8 a 72

5

horas. Los posibles signos y síntomas incluyen: Náuseas, vómitos, dolor abdominal,

diarrea, fiebre, escalofríos, dolor de cabeza, dolores musculares (mialgia) y sangre

en las heces.

Estos síntomas generalmente duran de cuatro a siete días, aunque puede

tomar varios meses para que sus intestinos vuelvan a la normalidad. La confirmación

de intoxicación de la salmonella se hace mediante un cultivo de muestra de heces

del individuo en un laboratorio.

2.1.3 Situación mundial de la salmonelosis

Las enfermedades diarreicas en general, son la mayor causa de morbi -

mortalidad en los países en vías de desarrollo. En los países desarrollados, aunque

la mortalidad es escasa la morbilidad es alta. La importancia de las gastroenteritis

por Salmonella (no typhi) en los países en vías de desarrollo, es relativamente menor

con respecto a otros gérmenes causantes de diarreas. En los países desarrollados,

Salmonella es la principal causa de gastroenteritis, siendo su principal fuente de

infección, los alimentos contaminados. Existen datos muy dispares acerca del

número de casos de salmonelosis declarados en un determinado año entre unos

países y otros. Generalmente, el número de casos declarados no corresponde con el

número real, dependiendo, en su mayor parte, de la información sanitaria de cada

país. Paradójicamente, países con mejores condiciones higiénico-sanitarias declaran

mayor número de casos de salmonelosis que países con medidas más deficitarias.

Ello se debe, fundamentalmente, a la información epidemiológica y control sanitario

existente. Otras veces es debido a que en determinados países los casos de diarreas

por Salmonella no tienen importancia, aunque sean un número elevado, con respecto

a diarreas más graves causadas por otros gérmenes más patógenos como cólera

(Ellermeier y Slauch, 2006).

2.1.4 Situación en México de la salmonelosis

6

Salmonella es un patógeno ampliamente distribuido en México, de acuerdo

con la DGE (Dirección General de Epidemiologia (2017), las infecciones por

Salmonella no tifoidea alcanzan alrededor de 70,000 casos cada año. La diversidad

fenotípica indica que hay al menos 216 serotipos en el país, entre los cuales, S.

enteritidis, S. typhimurium, S. anatum, S. agona y S. meleagridis son las más

comunes.

Las autoridades sanitarias mexicanas han realizado enormes esfuerzos para

fortalecer el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE), que es

responsable de recopilar información sobre eventos epidemiológicos, incluida la

salmonelosis, que se informa una vez por semana y cumple con la Norma Oficial

Mexicana NOM-017 SSA2-1994.

En este sentido, el SINAVE mostró un aumento significativo en la fiebre

tifoidea de 1984 a 2017, de 7,629 a 45,280 casos; la paratifoides / otras salmonelosis

fueron de 31,943 a 104,471 casos. Estas estadísticas muestran que Sinaloa y

Tamaulipas son los estados con mayor incidencia de fiebre tifoidea, con 12.9% y

10.25% respectivamente.

El contagio y la resistencia de los serotipos circulantes en México dependen

de la presión selectiva de los cambios ambientales, incluida la temperatura y la lluvia.

Del mismo modo, el aumento exacerbado de serotipos de Salmonella con

multiresistencia a los antibióticos, lo que proporciona a las bacterias un mayor factor

de virulencia (Contreras-Soto et al., 2018).

2.2 Antibióticos

Los antibióticos son compuestos naturales o sintéticos que sirven para

combatir las infecciones producidas por bacterias. El uso excesivo de estos

medicamentos favorece la selección de bacterias resistentes a diferentes grupos de

antibióticos multirresistentes (Rivera Calderón et al., 2012). De acuerdo con Silva

(1996) los antibióticos intervienen en moléculas de procesos biológicos esenciales de

las bacterias; entre ellos, la ADN girasa en la replicación del ADN, la ARN polimerasa

7

en la síntesis del ARN, los ribosomas en la síntesis de proteínas y las

transpeptidasas (PBP) en la síntesis del peptidoglucano que conforma la pared

celular. Además, actúan en diferentes niveles, por ejemplo, las quinolonas inhiben la

replicación del ADN, la rifampicina suprime la síntesis de ARN y los aminoglucósidos,

macrólidos, tetraciclinas y cloranfenicol anulan la síntesis de las proteínas. El grupo

de los antibióticos b-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, monobactam y

carbapenémicos) inhibe la síntesis de la pared celular.

2.2.1 Resistencia a antibióticos en Salmonella

La resistencia bacteriana es la capacidad que tiene la bacteria de sobrevivir en

presencia de un antibiótico, lo que representa una ventaja para expandir su nicho

ecológico y posibilitar su proliferación, ya sea en el ambiente o en nosocomios; por lo

que reduce las opciones terapéuticas además de provocar elevados índices de

morbilidad, mortalidad y costos hospitalarios (Garza-Ramos et al., 2009). La

resistencia antibiótica puede ser natural (intrínseca) o adquirida. Una de las

principales razones para desencadenar la resistencia a los medicamentos es su uso

intensivo e indiscriminado (Angulo et al., 2004). El éxito de las bacterias con

resistencia a antibióticos se debe a su capacidad de mutar e intercambiar material

genético entre diferentes especies bacterianas (Contreras-Soto et al., 2018).

Si bien los alimentos de origen animal han sido descritos como la principal

causa de brotes por Salmonella, la presencia de esta bacteria en individuos sanos y

enfermos puede convertir al humano como portador, diseminador y, por ende,

responsable de la transmisión de esta enfermedad (Zaidi et al., 2006; Contreras-Soto

et al., 2018).

En 1972 y principios de 1973, un brote de fiebre tifoidea (causada por

Salmonella typhi) ocurrió en la Ciudad de México y se extendió rápidamente a los

alrededores, afectando a más de 10,000 personas (Bessudo et al., 1973; Gonzalez-

Cortes et al., 1973; Olarte & Galindo, 1973). Se informaron otros dos brotes

importantes relacionados con el consumo ordinario de alimentos contaminados; el

primero ocurrió en hospitales, involucrando 155 infecciones por Salmonella enteritidis

8

(Chávez-de la Peña et al., 2001); el segundo ocurrió en prisión, hubo 150 prisioneros

que desarrollaron síntomas de diarrea y otras enfermedades intestinales causadas

por Salmonella oranienburg (Vázquez-Garcidueñas et al., 2014).

Diversas investigaciones se han centrado en los diferentes niveles de

resistencia que pueden exhibir varios serotipos de Salmonella, desde resistencia a

un solo fármaco hasta resistencia a múltiples fármacos y antibióticos como

ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfonamida y tetraciclina (Bessudo et al.,

1973; Gonzalez-Cortes et al., 1973; Olarte y Galindo, 1973; Alaniz- de la O et al.,

1997; Miranda et al., 2009; Nayarit-Ballesteros et al., 2016; Aguilar-Montes de Oca

et al., 2018), todos estos medicamentos son para el tratamiento de la salmonelosis

(Contreras-Soto et al., 2018).

Este problema subraya la necesidad de implementar un plan de monitoreo

más continuo y extenso para tener un seguimiento de las fuentes de contaminación y

usar técnicas más sensibles y rápidas para distinguir los patógenos, y, a medida que

estos procesos e interacciones biológicas se profundicen, el diseño e implementación

de estrategias efectivas para prevenir, diagnosticar y controlar la Salmonella se

mejorará con el fin de evitar brotes epidémicos y minimizar su impacto en la salud

pública (Contreras-Soto et al., 2018).

El Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) ha

clasificado a el Campylobacter, Salmonella typhi, Salmonella no productora de

tifoidea, y Shigella como las bacterias resistentes a fármacos que han producido las

amenazas más graves en años recientes (Rivera Calderón et al., 2012).

La OMS sugiere como acciones necesarias para contener el proceso de la

resistencia a antibióticos, optimizar la utilización de antimicrobianos y a disminuir su

transmisión (mejorando el control de las enfermedades infecciosas). No obstante,

esto involucra no sólo acciones sobre salud humana, sino también, sobre salud

animal, producción de alimentos y sobre el medio ambiente, debido a que los

microorganismos son capaces de desplazarse y desarrollarse en distintos ambientes

(Fig.1).

9

Figura 1. Forma de transmisión entre distintos ambientes de bacteriasresistentes en humanos y animales (Rivera de Linton, 2016).

Las infecciones bacterianas gram negativas son muy comunes en pacientes

hospitalizados, especialmente, en la unidad de cuidados intensivos. La resistencia

múltiple representa un desafío terapéutico, con pocas oportunidades para tratar estas

infecciones. Los mecanismos utilizados por las bacterias para defenderse contra los

antibióticos están en constante evolución (Tafur et al., 2008).

2.2.2 Mecanismos de resistencia

La aparición de resistencia a los medicamentos entre los patógenos

bacterianos más importantes se considera una amenaza importante para la salud

pública, ya que no solo han surgido organismos resistentes a múltiples fármacos en

el entorno del hospital, sino que ahora, también se encuentran con frecuencia en

10

entornos comunitarios, lo que indica la presencia de depósitos de bacterias

resistentes fuera del hospital (Munita y Arias, 2016).

La plasticidad genética de los patógenos bacterianos puede desencadenar

reacciones específicas que conducen a la adaptación de la mutación, la adquisición

de material genético o cambios en la expresión génica, desarrollando así resistencia

a casi todos los antibióticos disponibles actualmente en el mercado (Tafur et al.,

2008).

Los mecanismos de resistencia mas prevalentes en las bacterias gran

negativas pueden resumirse en cuatro categorías (Fig.2): 1) Modificación enzimática

del antibiótico: las enzimas expresadas por las bacterias pueden causar cambios en

la estructura de los antibióticos, lo que lleva a la pérdida de la función. La

betalactamasa es la más común. Son proteínas capaces de hidrolizar el anillo de β-

lactama que posee esta familia de antibióticos. De manera similar, las enzimas

modificadoras de aminoglucósidos pueden modificar estos antibióticos mediante

reacciones de acetilación, adenilación y fosforilación (Livermore, 1991); 2) Bombas

de expulsión: Se encuentran en la membrana externa de las células y expulsan

grandes cantidades de moléculas, incluidos metabolitos, detergentes, solventes

orgánicos y antibióticos. Para este fin, utilizan la hidrólisis de ATP o el mecanismo de

inversión de iones como sustrato de energía. La función principal de este mecanismo

es mantener baja la concentración de sustancias tóxicas en las células (Tafur et al.,

2008). La bomba de salida puede ser específica del fármaco (generalmente

codificada por un plásmido y, por lo tanto, transmisibles) o no específica

(generalmente expresada en un cromosoma bacteriano). Si aumenta la expresión de

las bombas no específicas, se puede usar un solo mecanismo para generar

resistencia cruzada a múltiples medicamentos (Depardieu et al., 2007); 3) Cambios

en la permeabilidad de la membrana externa: las bacterias tienen la capacidad de

generar cambios de la bicapa lipídica, no obstante la permeabilidad de la membrana

se ve alterada principalmente por cambios en las porinas (Tafur et al., 2008); y 4)

Alteraciones del sitio de acción: las bacterias pueden alterar el sitio donde el

antibiótico se une a la bacteria para interrumpir una función vital de ésta. Un sitio de

11

acción de los antibióticos es la síntesis de proteínas. Aunque recientemente se ha

asociado con genes transmitidos por plásmidos, generalmente es causado por

cambios cromosómicos (Wang et al., 2004). Se han encontrado genes tipo qnrA,

qnrB y qnrS en plásmidos, cuyos productos bloquean la acción de la ciprofloxacina

sobre la girasa y la topoisomerasa IV del ADN (Tran y Jacoby, 2002).

Figura 2. Representación esquemática de los mecanismos de resistencia aantibióticos más comunes en una bacteria. 1: Entrada del antibiótico a través deporinas. 2: Enlace al objetivo. A: Pérdida de porinas. B: enzimas inactivadoras deantibióticos por modificación (B1) o por hidrólisis (B2). C: eflujo mejorado. D:modificación pre-transcripcional del objetivo / blanco. E: Modificación postraduccionaldel objetivo. (i) Cromosoma bacteriano que porta el gen que codifica el objetivo. (ii)Los plásmidos de resistencia que llevan genes que codifican para modificar enzimas(González-Zorn y Escudero, 2012).

2.2.3 Estructura molecular de la multirresistencia

Desde la perspectiva de adquirir patogenicidad (V) y / o resistencia a los

agentes antimicrobianos (R), la evolución de las bacterias patógenas se debe

12

fundamentalmente a la introducción de fragmentos de ADN (generalmente

introducción secuencial) que origina nuevos elementos genéticos (Mendoza et al.,

2009). Los fragmentos involucrados en este proceso de ingeniería evolutiva se

dividen en tres tipos: operables (que incluyen genes que codifican y regulan las

funciones V y R), translocación (como secuencias de inserción, integrasas,

transposasas, resolvasas, etc.) y dispersivos (islas genómicas, bacteriófagos,

plásmidos, transposones e integrones-casetes génicas; Baquero, 2004).

Hace unos años, se especuló que el 4% (aproximadamente 200 genes) del

genoma de la cepa de Salmonella (Salmonella enteritidis serovar Typhimurium LT2)

está relacionado con la patogenicidad de los ratones (Bowe et al., 1998).

Actualmente, en Salmonella, la mayoría de los determinantes de V se encuentran en

los cromosomas que forman islas, islotes, operones o genes sueltos, pero también

se sabe que existen en plásmidos específicos de ciertos serotipos de S. enteritidis no

tifoideos (McClelland et al., 2001).

Los plásmidos de virulencia de Salmonella varían en tamaño (50-90 kb), pero

todos comparten una región de 7.8 kb, o spv, que es necesaria para la reproducción

bacteriana en el sistema reticuloendotelial (Rotger y Casadesús, 1999). Otros loci en

el plásmido, como el operón de fibra pef, el gen de transferencia de unión traT y los

misteriosos loci rck y rsk, pueden desempeñar un papel en otras etapas del proceso

de infección.(Rotger y Casadesús, 1999). El locus spv está formado por 5 genes

designados spvRABCD. El gen spvR codifica un regulador positivo esencial para la

expresión de los otros genes spv. El producto de spvB es una ADP ribosil transferasa

que actúa sobre la actina, bloqueando la conversión de G-actina en F-actina y

provocando una desestabilización del citoesqueleto de células eucarióticas.

Dependiendo del serotipo, los plásmidos V pueden contener otros genes

asociados a virulencia (Fig. 3) como son: a) El operón pefBACDI (plasmid-encoded

fimbriae), partícipe en la síntesis de una bacteria involucrada en la adhesión del pilus

de las células epiteliales intestinales del ratón (Bowe et al., 1998). b) Los genes rsk y

13

rck pueden estar relacionados con la resistencia de Salmonella a la lisis sérica. El

primero se encuentra en los plásmidos V de S. typhimurium, S. enteritidis y S.

choleraesuis, y el segundo sólo en los de S. typhimurium y S. enteritidis; c) El locus

spf presente en tres plásmidos V (pSTV, pSEV y pSCV) está implicado en la

supresión de la activación de la respuesta inmune del huésped; d) Los otros genes V

son mig-5, tlpA y srgA, que codifican anhidrasa carbónica inducible por macrófagos y

posiblemente un enlace disulfuro oxidorreductasa, respectivamente, que es esencial

para el desarrollo biológico de las fimbrias codificadas por plásmidos; e) Otros loci

codifican funciones de replicación y transferencia mediante conjugación; f) También

se detectaron muchos loci con funciones desconocidas en el plásmido V.

14

Figura 3. Representación esquemática de los mapas genéticos de 4 plásmidosV de Salmonella. Los plásmidos pSLT/pSTV, pSEV, pSCV y pSDV (específicos deserotipos S. typhimurium, S. enteritidis, S. choleraesuis y S. dublin, respectivamente)se presentan alineados respecto a pSLT. Deleción determinada: ----; deleción nodeterminada: ; región heteróloga (Mendoza et al., 2009).

De acuerdo con Peña (1996), los trabajos encaminados a estudiar las posibles

zonas plasmídicas implicadas en la resistencia permitieron la caracterización de dos

genes, traT y rok, y una región reguladora denominada rsk. El gen traT forma parte

del operón de transferencia de plásmidos conjugativos del complejo lncF.

Actualmente, hay 28 tipos de plásmidos conocidos en Enterobacteriaceae que

se distinguen por tipificación de replicones basada en PCR (PBRT; PCR-based

replicon typing). Los plásmidos informados con frecuencia [IncF, IncI, IncA / C, IncL

(anteriormente denominados IncL / M), IncN e IncH] son los que tienen la mayor

variedad de genes de resistencia (Rozwandowicz et al., 2018).

La metilación del sitio aminoacilo del ARNr 16S, confiere un alto nivel de

resistencia a los aminoglucósidos clínicamente importantes como la amicacina,

tobramicina y gentamicina. Ocho genes 16S rRNA metiltransferasa, armA, rmtA,

rmtB, rmtC, rmtD, rmtE, rmtF y npmA, se han identificado en varias especies de

enterobacterias en todo el mundo (Hidalgo et al., 2012).

2.3 Marcadores genéticos en Salmonella spp.

Estudios recientes han demostrado que la combinación del análisis del

genoma del núcleo con el análisis del conjunto de genes accesorios, como los

estudios de asociación amplia del pangenoma (pan-GWAS), ha mejorado la

comprensión de los patrones evolutivos y filogeográficos de varios patógenos

bacterianos transmitidos por los alimentos (Ashlock, 2005).

Holt et al. (2011) identificaron en Salmonella enterica serovar typhi (S. typhi)

más de 300 polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) dentro de las regiones

15

conservadas del plásmido IncHI1 y genotipificaron tanto el plásmido como los SNP

cromosómicos en más de 450 S. typhi. Por su parte, Hendriksen et al. (2015)

investigaron la epidemiología de un brote masivo de Salmonella enterica serovar

typhi en Zambia durante 2010 a 2012. La mayoría (83.0%) de los aislamientos fueron

resistentes a múltiples fármacos (MDR). Tipificaron la secuencia del genoma

completo (WGST) de 33 aislamientos y realizaron un análisis bioinformático,

identificaron el tipo de secuencia multilocus (MLST), haplotipo, replicón de plásmido,

genes de resistencia a antimicrobianos y relación genética mediante análisis de

polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y deleciones genómicas.

El género Salmonella, se ha presentado en México desde la época de la

colonización. Vågene et al. (2018), mediante una nueva herramienta de análisis

metagenómico llamada MALT, identificaron Salmonella entérica subsp. enterica

serovar paratyphi C de entre los dientes de indígenas enterrados en un cementerio al

sufrir una epidemia en el siglo XVI en México. Se trata de la primera evidencia de la

aparición de Salmonella en México.

En la ciudad de México, la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB)

recolectó muestras de Salmonella de hospitales de la Ciudad de México y las

secuenció con tecnología de Illumina. Estas cepas recolectadas aún no han sido

identificadas, y se sabe que son resistentes a antibióticos.

2.4 Uso de la bioinformática dentro de los genomas bacterianos

Particularmente, en el campo de la resistencia bacteriana, la bioinformática es

empleada para la asignación funcional de genes por medio de comparaciones con

secuencias (ADN o proteínas) previamente existentes en el GenBank. Por otro parte,

diferentes grupos de investigación han desarrollado programas bioinformáticos para

resolver diferentes interrogantes (Ford y Avison, 2004).

Garza-Ramos et al. (2009) mencionan que a partir del análisis de la secuencia

de genomas bacterianos se pueden identificar genes y proteínas esenciales para la

16

sobrevivencia de la bacteria y, a partir de esta información, "diseñar" nuevos

antibióticos que inhiban el crecimiento bacteriano.

17

III. Justificación


problemas de salud pública más comunes a nivel mundial; se han convertido en un

factor de riesgo debido a la creciente resistencia de esta bacteria a los fármacos, la

cual, ha sido acelerada por varios factores como el uso excesivo y/o inadecuado de

los antimicrobianos en salud humana, la falta de higiene, el saneamiento deficiente y

el control inadecuado de las infecciones en los hospitales y clínicas. Los mecanismos

utilizados por las bacterias para defenderse contra los antibióticos están en constante

evolución. No solo han surgido organismos resistentes a múltiples fármacos en el

entorno del hospital, sino que ahora también, se encuentran con frecuencia en

entornos comunitarios, lo que indica la presencia de depósitos de bacterias

resistentes fuera del hospital. Los alimentos de origen animal han sido descritos como

la principal causa de brotes por Salmonella, sin embargo, la presencia de esta

bacteria en individuos sanos y enfermos puede convertir al humano como portador,

diseminador y, por ende, responsable de la transmisión de esta enfermedad. Ante

esta problemática, se han buscado herramientas para el diagnóstico y seguimiento de

estas enfermedades multidrogorresistentes, pues representa un desafío terapéutico,

con pocas oportunidades para tratar estas infecciones. Durante los últimos años, la

genética y bioinformática, mediante la secuenciación y el análisis de marcadores

genéticos, han adquirido una significación especial para ello. A partir del análisis de la

secuencia de genomas bacterianos se pueden identificar genes y proteínas

esenciales para la sobrevivencia de la bacteria y, a partir de esta información,

"diseñar" nuevos antibióticos que inhiban el crecimiento bacteriano.

Por lo tanto, los genes de esta bacteria en las muestras de hospitales de la

Ciudad de México recolectados y secuenciados por el Instituto Nacional de Ciencias

Biológicas (ENCB) en México, fueron analizados para identificar similitudes entre los

serotipos de Salmonella.

18

IV. Hipótesis

Dado el constante flujo de genes dentro del género Salmonella, se espera que

los genes de resistencia se localicen en el genoma accesorio (plásmido).

V. Objetivos

5.1. Objetivo general

Identificar los marcadores genéticos en genomas de Salmonella ssp.

multidrogorresistentes.

5.2. Objetivos específicos

1. Ensamblar de novo los genomas de salmonellas aislados de hospitales.

2. Comparar los genomas ensamblados de Salmonella con todos los genomas

completos en la base de datos del NCBI.

3. Determinar el pangenoma y el genoma core de todos los genomas de

Salmonella.

4. Identificar las regiones genómicas asociadas a la resistencia de antibióticos.

19

VI. Materiales y métodos

6.1. Preprocesamiento de secuenciación

Se descargaron 7,979 genomas de Salmonella enterica y 12 de Salmonella

bongori desde el servidor del Centro Nacional para la Información Biotecnológica

(National Center for Biotechnology Information, NCBI por sus siglas en inglés).

Posteriormente, se separaron los genomas completos de los incompletos, ya que,

para mejores resultados, es preferible trabajar con genomas completos.

Para el preprocesamiento de los genomas ensamblados de Salmonella, se

utilizó el software FastQC (Andrews, 2010) para hacer una valoración de las

secuencias crudas obtenidas por la tecnología de secuenciación (Andrews, 2010).

Posteriormente, se utilizó el software KARECT (KAUST Assembly Read Error

Correction Tool; Allam et al., 2015) para corregir los errores de lectura que presente

el ensamble de la tecnología de secuenciación.

6.2 Ensamblado de novo de genomas de Salmonella

Los ensambles de novo se realizaron con el software Shovill (Carriço et al.,

2018); este programa está especializado para el ensamble de genomas de bacterias

aisladas con base en lecturas pareadas de Illumina (Shen et al., 2005), esto se

realizó con los 15 genomas aislados y secuenciados por la ENCB. Una vez

terminados los ensambles con el software anterior, se utilizó Assembly Improvement,

que tiene como función tomar los ensambles en formato FASTA, los lee en formato

FASTQ y mejora los ensambles llenando los huecos que quedan en el genoma.

Una vez obtenidos los genomas con ensamble de novo, se procedió a

comparar los genomas anteriormente ensamblados con los genomas completos

descargados de la base de datos de NCBI, primero se utilizó el programa OAU (Lee

et al., 2016), el cual, es una herramienta para calcular valores de OrthoANI usando el

algoritmo USEARCH. Esto para encontrar cuál de todos los genomas completos de

20

Salmonella comparte más información genética con los 15 aislados y poder tomarlo

como referencia (Lee et al., 2016).

Una vez obtenido el genoma de referencia, se utilizó el software Gfinisher

(Guizelini et al., 2016), que es una serie de herramientas para el refinamiento y la

finalización de ensambles de genomas procarióticos, esto para identificar errores de

ensambles previos y organiza los contigs o andamios respecto a los genomas de

referencia. (Guizelini et al., 2016).

Para el ensamble de los plásmidos de novo, se utilizaron tres softwares

especializados. Esto, para encontrar la similitud que existe entre los resultados de

cada software y así descartar resultados azarosos.

El primero de ellos es PlasmidSPAdes (Antipov et al., 2016), el cual, es una

herramienta para el ensamble de plásmidos a partir de los datos de secuenciación

del genoma completo, utilizando el software SPAdes para transformar una gráfica de

Bruijn en una gráfica de ensamble y establece una subgráfica del ensamble a la cual,

se refiere como el gráfico de plásmidos. Además, utiliza ExSPAnder para la

resolución de repetición en el gráfico del plásmido utilizando lecturas pareadas y

genera contigs plasmídicos.

El segundo software utilizado fue PlasmidFinder (Carattoli et al., 2014;

Carattoli & Hasman, 2020), el cual, permite la identificación de plásmidos en el total o

en la parcialidad de los aislados secuenciados de una bacteria. Está basado en una

base de datos depurada para replicones de plásmidos dirigidos para la identificación

de plásmidos en secuencias de genomas completos originarios de especies de la

familia Enterobacteriaceae.

El último software fue cBar (Zhou y Xu, 2010), que fue desarrollado para

clasificar un metagenoma dado en secuencias cromosomales y plasmídicas, basado

en diferencias observables en sus frecuencias pentaméricas. Este método está

basado en un modelo de Optimización Secuencial Mínima (SMO, por sus siglas en

inglés) y separa secuencias cromosómicas de secuencias plasmídicas.

21

6.3 Anotación y comparación de genomas de Salmonella

Para la anotación de genes dentro de los genomas de Salmonella, se utilizó el

programa Prokka (Seemann, 2014), que es una herramienta que anota rápidamente

genomas bacterianos y genera archivos de salida estandarizados para su fácil

comprensión (Seemann, 2014).

Se utilizó el pipeline OAU, que es una herramienta para línea de comandos

desarrollado para calcular los valores OrthoANI (Ortholog Average Nucleotidic

Identity) entre dos archivos de secuencia de genomas, en formato fasta. Debido a la

limitante de esta herramienta que solo compara un genoma contra otro genoma, se

desarrolló un script para comparar cada uno de los genomas ensamblados contra

todos los genomas completos

6.4 Determinación de pangenoma, coregenoma y genoma accesorio

o endémico

Para determinar el pangenoma, coregenoma y el genoma accesorio de todos

los genomas de Salmonella, se utilizó Roary (Chan et al., 2003), el cual, es una

herramienta que rápidamente construye pangenomas a gran escala, identificando

genes dentro del genoma core y el genoma accesorio. Hace la construcción del

pangenoma de miles de muestras procariotas en una computadora básica sin

comprometer la precisión de los resultados.

6.5 Búsqueda de genes de resistencia en pangenoma, coregenoma,

y genoma accesorio

Para encontrar los genes de resistencia dentro de los resultados anteriores, se

utilizó el software ARIBA (Hunt et al., 2017), que utiliza un combinado de

alineamiento y mapeo junto con ensambles locales específicos para identificar genes

22

de resistencia antimicrobial y variantes eficientes y precisas para secuencias de

lecturas pareadas de Illumina. ARIBA reporta más detalles significativos que las

herramientas existentes, estableciendo un entendimiento más profundo sobre la

resistencia asociada con cada aislado. Para este software, se utilizaron 7 bases de

datos para identificar los genes de resistencia, los cuales fueron vfdb_full,

plasmidfinder, argannot, megares, resfinder, srtst2_argannot y virulencefinder.

23

VII. Resultados

7.1. Preprocesamiento de secuenciación

De los 7,919 genomas descargados de Salmonella entérica únicamente

presentó 391 genomas completos, mientras que Salmonella bongori presentó cuatro.

Se encontró que de los 391 genomas completos de Salmonella enterica, 361

(92%) contienen serovar, mientras que 30 (8%) no lo contienen (Fig. 4).

92%

8%

Salmonella enterica

Serovar

Sin serovar

Figura 4. Porcentaje de genomas de Salmonella enterica con serovar.

En el caso de subespecies (Fig. 5), la subespecie que predominó fue enterica,

con 368 genomas que lo contienen, seguido de 13 genomas que no contienen

subespecie.

24

368

2 136 2

Subespecies de S. enterica

subsp. Enterica

subsp. arizonae

sin sub

subsp. diarizonae

subsp. salamae

Figura 5. Subespecies de Salmonella enterica.

Como se muestra en la Figura 6, el promedio del tamaño de genomas

completos de S. enterica, es de 4.83 Mb.

Figura 6. Tamaño de genomas completos de S. enterica.

Entre los tipos de serovar que se identificaron, se encontró que 78 genomas

pertenecen a la subespecie enterica enteritidis, significando que es el tipo de serovar

más común en los genomas completos de Salmonella enterica (Figura 7).

25

78

52

44

262215

8

146

Tipos de Serovar (S. enterica)

subs. Enterica Enteritidis

subs. Enterica Typhimurium

subs. Enterica Typhi

subs. Enterica Heidelberg

subs. Enterica Newport

subs. Enterica Anatum

subs. Enterica Paratyphi

Otros (Infantis, Weletvreden, Agona

Figura 7. Tipos de serovar de S. enterica.

En la Figura 8 se muestran los cuatro genomas completos de Salmonella

bongori, de los que el 50% tienen serovar.

50%50%

Salmonella bongori

Serovar

Sin serovar

Figura 8. Porcentaje de genomas de Salmonella bongori con serovar.

En cuanto al tamaño promedio del genoma de S. bongori es de 4525275.25Mb (Figura 9).

26

Figura 9. Tamaño de genomas completos de S. bongori.

Los genomas con mayor y menor número de megabases fueron INP46

(911.72025 MB) e INP49 (267.21405) respectivamente (Tabla 1); el número de

lecturas promedio fue 3938721.533. En todos los casos se obtuvieron valores Phred

>99%, es decir que el porcentaje de que haya errores por cada 100 pares de bases

es de 1%, y esto se debe al gran número de lecturas.

27

Tabla 1. Número de lecturas con el que cuenta cada genoma, el porcentaje denucleótidos secuenciados mayores a 20 en la escala de valores Phred (% Q20), eltamaño del genoma expresado en Megabases (MB) y la cantidad de N en el genoma,expresados en Megabases

IDENTIFICADOR N° DE LECTURAS

Phred

(%Q20)

TAMAÑO

GENOMA (MB) N

INP33 4650116 99.34 697.5174 1.70 Mb

INP34 4661690 99.345 699.2535 1.69 Mb

INP35 5255708 99.27 788.3562 2.13 Mb

INP36 4650006 99.32 697.5009 1.76 Mb

INP45 5410275 99.23 811.54125 2.30 Mb

INP46 6078135 99.32 911.72025 2.11 Mb

INP47 4314517 99.32 647.17755 1.63 Mb

INP48 1950782 99.42 292.6173 0.62 Mb

INP49 1781427 99.40 267.21405 0.59 Mb

INP50 2028158 99.37 304.2237 0.70 Mb

INP51 1846274 99.43 276.9411 0.58 Mb

INP52 2389228 99.40 358.3842 0.78 Mb

INP53 5023195 99.44 753.47925 1.56 Mb

INP54 5889337 99.38 883.40055 2.04 Mb

INP55 3151975 99.50 472.79625 0.88 Mb

Cabe mencionar que el porcentaje de calidad expresado en la columna Phred

(% Q20) está basado en la puntuación de calidad de Phred (puntuación Q), el cual,

evalúa la precisión de la plataforma de secuenciación, lo que indica la posibilidad de

que el secuenciador identifique erróneamente las bases de nucleótidos (Padilla,

2018). Hay cinco diferentes puntajes Q esperados en este sistema, los cuales,

representan diferentes porcentajes de precisión para identificar pares de bases,

llevados a cabo por el secuenciador (Tabla 2).

28

Tabla 2. Puntuación Q de Phred y sus respectivos valores de precisión(Padilla, 2018).

7.2. Ensamblar de novo los genomas de salmonellas aislados de

hospitales

Se ensamblaron los genomas de los 15 aislados proporcionados por la ENCB

y se compararon entre sí para observar gráficamente la homogeneidad que existe

entre las cepas, tomando como base los valores ANI (Average Nucleotidic Identity, o

Identidad Nucleotídica Promedio) que mostró el software OAU. Se formaron 4

clústers, que fueron agrupados por su cercanía en valor de ANI’s (Fig. 10).

29

Figura 10. Análisis de componentes principales que muestra la cercanía entre

las cepas aisladas, con un rango que va de 0 a 1, donde los colores más cálidos son

los que representan más homogeneidad, y los colores más fríos muestran menos

homogeneidad entre ellos.

Con los valores obtenidos y graficados en la Fig. 10, se realizó un

dendograma (Fig. 11) donde este se hizo y deshizo 10,000 veces para descartar

cualquier factor de azar o de casualidad al momento de la formación de los clústeres.

Lo que se obtuvo al obtener el dendograma fue una confirmación de los resultados

anteriores y agrupa los genomas aislados dentro de la misma raíz.

30

Figura 11. Dendograma donde se muestra la formación de clústeres de los 15

genomas aislados por ENCB. Los porcentajes que se muestran en color verde

representan el valor esperado dentro de las ramas del dendograma, mientras que el

color rojo muestra el valor que resultaron de los valores ANI.

7.3. Anotación y comparación de genomas de Salmonella

En la anotación de genes dentro de los genomas proporcionados por la ENCB,

se encontró que existen 4491 genes en promedio y dentro de los genomas de

referencia, 9 de los 15 descritos contienen por lo menos 1 plásmido (Tabla 3).

31

En la Tabla 3 se describe el resultado de la anotación de genes dentro de los

genomas de Salmonella. La primera columna muestra el nombre de las cepas, la

segunda muestra el número de genes que contiene cada uno de ellos, la tercera

muestra el tamaño del genoma en megabases, la cuarta muestra el nombre del

genoma de referencia de cada uno, la quinta muestra el ANI que dio como resultado

del genoma de referencia con el genoma aislado, la sexta muestra el porcentaje de

alineamiento del genoma aislado con respecto al genoma de referencia, la séptima

columna muestra el número de replicones dentro del genoma de referencia y la

octava muestra el nombre del plásmido contenido dentro del genoma de referencia.

32

Tabla 3. Genes dentro de los genomas de Salmonella recolectados por la ENCB.

Una vez que se determinó la relación que existe entre los 15 aislados, se

realizó un script mediante el cual se compararon los 15 genomas analizados

previamente junto con los 395 genomas completos, dando como resultado 410

genomas en total. Con el script, se compararon un total de 168,100 genomas entre

sí, para generar una matriz de valores ANI; con base en estos valores se determinó

la distancia que existe entre cada uno de los genomas de NCBI y los genomas

aislados. Una vez obtenida la matriz con todos los valores OAU, se trazó un

dendrograma con todos los genomas, indicando las posiciones en donde se ubican

los genomas aislados entre los genomas completos (Figura 12, 13, 14 y 15).

33

Figura 12. Dendograma que muestra todos los genomas completos de

Salmonella spp. descargados de NCBI junto con los 15 genomas aislados por ENCB.

34

Figura 13. Acercamiento dentro del dendograma donde se muestra la

ubicación de las cepas INP55, INP36, INP33, INP53, INP45, INP35, INP48, INP50,

INP46 y INP47.


ubicación de las cepas INP51, INP52 y INP34.

35


ubicación de las cepas INP34 y INP52.

7.4 Determinación de pangenoma, coregenoma y genoma accesorio

o endémico

Como resultado de la determinación del pangenoma, en total se encontraron

36,057 genes presentes en todos los genomas descargados de la base de datos de

NCBI, dentro de los cuales, 1,838 se encuentran ubicados dentro del coregenoma, y

los restantes 34,219 se encuentran dentro del genoma accesorio (Fig. 16, 17 y 18).

36


pangenoma.


coregenoma.

37

Figura 18. Esquema que muestra el total de genes ubicados dentro delgenoma accesorio o endémico.

Se realizó una búsqueda en blast de los genes totales encontrados, dando

como resultado un total aproximado de casi 120,000 genes dieron un 100% de

porcentaje de identidad con los genes ya reportados en la base de datos de BLAST,

y también se pudo observar un repunte de 97% de identidad de los genes

encontrados (Figura 19).

38

Figura 19. Gráfica que muestra el porcentaje de identidad de los genesencontrados por el software BLAST.

Al irse generando el pangenoma, se determinó la cantidad de genes

ingresados al pangenoma a medida que se iba ingresando cada uno de los genomas

que lo conforma, encontrando que se iba formando una asíntota con tendencia a

estandarizarse, lo que demuestra que lo generado es un pangenoma cerrado (Figura

20).

39

Figura 20. Gráfica de pangenoma. En el eje X muestra el número de genomasingresados al pangenoma. El eje Y muestra el número ingresado de genes a medidade ir ingresando cada genoma.

7.5 Búsqueda de genes de resistencia en pangenoma, coregenoma,

y genoma accesorio

Para la búsqueda de genes dentro de los genomas de Salmonella se utilizó el

software ARIBA, que es una herramienta que identifica genes de resistencia a

antibióticos utilizando ensambles locales. La entrada que recibe el software es un

40

archivo .fasta de la secuencia de referencia, dentro de los cuales, puede ser una

combinación de genes y regiones de secuencias no codificantes, y lecturas de

secuencias pareadas (Fig. 21).

Figura 21. Lecturas de secuencias pareadas

Como resultado, de los 15 genomas aislados se contabilizaron 419 genes

resistentes a antibióticos, los cuales, se comparten entre ellos y 52 de estos genes

son únicos. Se encontraron 28 cassetes de operones completos dentro de los

aislados, así como 25 cassetes de operones que estaban incompletos.

Se ubicaron 15 genes que estuvieron presentes dentro de los 15 aislados, por

lo tanto, estos se encuentran ubicados dentro del coregenoma. Los 15 son para la

resistencia a antibióticos (Tabla 4).

41

Tabla 4. Genes encontrados dentro del coregenoma, la primera columnamuestra el nombre del gen y la segunda columna muestra la función de cada uno deellos.

GENES EN INTERSECCIÓNGen FuncióncsgA Major curlin subunitcsgF Curli production assembly/transport component CsgFcsgG Curli production assembly/transport component CsgGflk Flagellar regulator flkfur Ferric uptake regulation proteininvA Invasion protein InvAinvF Invasion protein InvForgB Oxygen-regulated invasion protein OrgBphoQ Virulence sensor histidine kinase PhoQprgH Protein PrgHprgK Lipoprotein PrgKsdiA Regulatory protein SdiAsicA Chaperone protein SicAssaV Secretion system apparatus protein SsaVsthA Soluble pyridine nucleotide transhydrogenase

En cuanto a los genes encontrados en los genomas accesorio, se encontraron

665 genes repartidos entre los 15 aislados (Tabla 5).

Tabla 5. Genes de resistencia a antibióticos encontrados dentro del genomaaccesorio de las cepas aisladas. Cada tabla tiene una división el cual es el nombrede la cepa aislada. La primera columna muestra el nombre de los genes y la segundacolumna muestra la función de cada gen.

Cepa INP33Gen Función

cheR_2 Chemotaxis protein methyltransferaseCsgB Minor curlin subunitcsgC Curli assembly protein CsgC

csgDMinor curlin subunitAC operon transcriptional regulatory

proteincsgE Curli production assembly/transport component CsgEfimD_

3 Outer membrane usher protein FimD

42

flhC_2 Flagellar transcriptional regulator FlhC

flhD_2 Flagellar transcriptional regulator FlhD

flhE_2 Flagellar protein FlhE

fliP Flagellar biosynthetic protein FliPfliT_2 Flagellar protein FliThila Transcriptional regulator HilAinvG Protein InvGlpfA putative major fimbrial subunit LpfAlpfC putative outer membrane usher protein LpfC'lpfC putative outer membrane usher protein LpfC'lpfD putative minor fimbrial subunit LpfDlpfE putative fimbrial subunit LpfE

mgtB Magnesium-transporting ATPase, P-type 1ompD Outer membrane porin protein OmpDpagN Outer membrane protein PagNpipB_

1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipA Cell invasion protein sipAsipB Cell invasion protein SipBsipC Cell invasion protein SipCsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopE Guanine nucleotide exchange factor SopEsopE

2Guanine nucleotide exchange factor Guanine nucleotide

exchange factor SopE2spaO Surface presentation of antigens protein SpaOspaS Surface presentation of antigens protein SpaSsptP Secreted effector protein SptPspvB Mono(ADP-ribosyl)transferase SpvBspvC MAPK phosphothreonine lyasessaN putative secretion system apparatus ATP synthase SsaNsseA_

1 Type III secretion system chaperone SseAsseC Secreted effector protein SseCsseD Secreted effector protein SseDsseL Deubiquitinase SseL

43

stbB Protein StbBsteC_

1 Secreted effector kinase Secreted effector kinase SteC

Cepa INP34Gen FuncióncheR

_2 Chemotaxis protein methyltransferasecsgB Minor curlin subunitcsgC Curli assembly protein CsgC


proteincsgE Curli production assembly/transport component CsgEfimC_

1 Chaperone protein FimCfimD_

3 Outer membrane usher protein FimDflhC_

2 Flagellar transcriptional regulator FlhCflhD_

2 Flagellar transcriptional regulator FlhDflhE_

2 Flagellar protein FlhEfliP Flagellar biosynthetic protein FliP

fliT_2 Flagellar protein FliThila Transcriptional regulator HilAinvG Protein InvGmgtB Magnesium-transporting ATPase, P-type 1pagN Outer membrane protein PagNpipB_

1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipA Cell invasion protein sipAsipB Cell invasion protein SipBsipC Cell invasion protein SipCsipD Cell invasion protein SipDsopD Secreted effector protein SopDsopE Guanine nucleotide exchange factor SopEspaO Surface presentation of antigens protein SpaOspaS Surface presentation of antigens protein SpaSsptP Secreted effector protein SptPssaN putative secretion system apparatus ATP synthase SsaNsseA_

1 Type III secretion system chaperone SseA

44

sseC Secreted effector protein SseCsseD Secreted effector protein SseDsseL Deubiquitinase SseLsspH

2 E3 ubiquitin-protein ligase SspH2stbB Protein StbBsteC Secreted effector kinase SteC

steC_1 Secreted effector kinase Secreted effector kinase SteC










fliT_2 Flagellar protein FliThila Transcriptional regulator HilAinvG Protein InvGlpfA putative major fimbrial subunit LpfAlpfC putative outer membrane usher protein LpfC'lpfC putative outer membrane usher protein LpfC'lpfD putative minor fimbrial subunit LpfDlpfE putative fimbrial subunit LpfE


1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicP

45

sifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopD

2 Secreted effector protein SopD2sopE Guanine nucleotide exchange factor SopEsopE



1 Type III secretion system chaperone SseAsseC Secreted effector protein SseCsseD Secreted effector protein SseDsseL Deubiquitinase SseLsspH












46

hila Transcriptional regulator HilAinvG Protein InvGlpfA putative major fimbrial subunit LpfAlpfC putative outer membrane usher protein LpfC'lpfC putative outer membrane usher protein LpfC'lpfD putative minor fimbrial subunit LpfDlpfE putative fimbrial subunit LpfE


1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipA Cell invasion protein sipAsipB Cell invasion protein SipBsipC Cell invasion protein SipCsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopD




1 Type III secretion system chaperone SseAsseC Secreted effector protein SseCsseD Secreted effector protein SseDsseL Deubiquitinase SseLstbB Protein StbB


Cepa INP45Gen FuncióncheR Chemotaxis protein methyltransferase

47

_2csgB Minor curlin subunitcsgC Curli assembly protein CsgC










1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopD



exchange factor SopE2spaO Surface presentation of antigens protein SpaOspaS Surface presentation of antigens protein SpaSsptP Secreted effector protein SptP

48

spvB Mono(ADP-ribosyl)transferase SpvBspvC MAPK phosphothreonine lyasessaN putative secretion system apparatus ATP synthase SsaNsseA_


2 E3 ubiquitin-protein ligase SspH2stbB Protein StbB


Cepa INP46Gen FuncióncsgB Minor curlin subunitcsgC Curli assembly protein CsgC






2 Flagellar transcriptional regulator FlhDfliP Flagellar biosynthetic protein FliP



1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicP

49

sifA Secreted effector protein SifAsipA Cell invasion protein sipAsipB Cell invasion protein SipBsipC Cell invasion protein SipCsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopD







Cepa INP47Gen FuncióncsgB Minor curlin subunitcsgC Curli assembly protein CsgC






2 Flagellar transcriptional regulator FlhDfliP Flagellar biosynthetic protein FliP

50



1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipA Cell invasion protein sipAsipB Cell invasion protein SipBsipC Cell invasion protein SipCsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopD






steC_ Secreted effector kinase Secreted effector kinase SteC

51

1












1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopE Guanine nucleotide exchange factor SopEsopE


exchange factor SopE2spaO Surface presentation of antigens protein SpaO

52

spaS Surface presentation of antigens protein SpaSsptP Secreted effector protein SptPspvB Mono(ADP-ribosyl)transferase SpvBspvC MAPK phosphothreonine lyasessaN putative secretion system apparatus ATP synthase SsaNsseA_












2 Flagellar protein FlhEfliC_2 Flagellin


53


1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDslrP_

1 hypothetical proteinsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopD

2 Secreted effector protein SopD2sopE


exchange factor SopE2spaO Surface presentation of antigens protein SpaOspaS Surface presentation of antigens protein SpaSssaN putative secretion system apparatus ATP synthase SsaNsseA_

1 Type III secretion system chaperone SseAsseC Secreted effector protein SseCsseD Secreted effector protein SseDsseL Deubiquitinase SseLstbB Protein StbBsteC Secreted effector kinase SteC









2 Flagellar protein FlhE

54










Cepa INP51

55

Gen FuncióncheR










1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDsopD Secreted effector protein SopDsopE Guanine nucleotide exchange factor SopEspaO Surface presentation of antigens protein SpaOspaS Surface presentation of antigens protein SpaSsptP Secreted effector protein SptPssaN putative secretion system apparatus ATP synthase SsaNsseA_



56












1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDsopD Secreted effector protein SopDsopE Guanine nucleotide exchange factor SopEspaO Surface presentation of antigens protein SpaOspaS Surface presentation of antigens protein SpaSsptP Secreted effector protein SptPssaN putative secretion system apparatus ATP synthase SsaNsseA_

1 Type III secretion system chaperone SseAsseC Secreted effector protein SseCsseD Secreted effector protein SseDsseL Deubiquitinase SseLsspH E3 ubiquitin-protein ligase SspH2

57

2stbB Protein StbBsteC Secreted effector kinase SteC













1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sefA Fimbrial proteinsicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopD

58

sopD2 Secreted effector protein SopD2

sopE Guanine nucleotide exchange factor SopEsopE




2 E3 ubiquitin-protein ligase SspH2stbB Protein StbB











fliT_2 Flagellar protein FliThila Transcriptional regulator HilAinvG Protein InvGlpfA putative major fimbrial subunit LpfAlpfC putative outer membrane usher protein LpfC'

59

lpfC putative outer membrane usher protein LpfC'lpfD putative minor fimbrial subunit LpfDlpfE putative fimbrial subunit LpfE


1 Secreted effector protein PipBpipB2 Secreted effector protein PipB2sicP Chaperone protein sicPsifA Secreted effector protein SifAsipD Cell invasion protein SipDslrP_

1 hypothetical proteinsopa E3 ubiquitin-protein ligase SopAsopD Secreted effector protein SopDsopD

2 Secreted effector protein SopD2sopE








proteincsgE Curli production assembly/transport component CsgEfimD_ Outer membrane usher protein FimD

60

3flhC_










1 Type III secretion system chaperone SseAsseC Secreted effector protein SseCsseD Secreted effector protein SseDsseL Deubiquitinase SseLstbB Protein StbB

61


62

VIII. Discusion

Se llevó a cabo el proceso de descifrar las secuencias genómicas a partir de

pequeños fragmentos de ADN, es decir, el ensamblaje de novo de genomas de

Salmonella aislados de hospitales. De acuerdo con Aguilar-Bultet y Falquet (2015) , el

ensamblaje de novo se limita generalmente a proyectos de genomas microbianos

debido a su pequeña talla.

Entre los indicadores disponibles de diferentes proporciones de genoma, la

técnica de cálculo de la identidad de nucleótidos (ANI) es uno de los métodos más

confiables para medir la proporción de genomas entre dos genomas, y tiene un gran

potencial en la taxonomía de bacterias y arqueas. Puede reemplazar la tecnología

tradicional. como la hibridación ADN-ADN (DDH) (Padilla, 2018). El valor del uso de

la tecnología ANI para distinguir diferentes genomas bacterianos se describe como

un valor de aproximadamente 95-96% como la identidad de nucleótidos promedio, es

decir, que un valor menor a este indica que son diferentes especies (Richter y

Rosselló-Móra, 2009). En el presente estudio, todos los valores ANI fueron mayor del

98%, es decir, todos los genomas pertenecen a Salmonella entérica y se formaron 4

clústers, que fueron agrupados por su cercanía en valor de ANI’s.

Desde 1968 a 2018, se han detectado en México un amplio rango de serotipos

de Salmonella aislados del ambiente, alimentos, humano y animales, destacando a

S. enteritidis, S. typhimurium, S. anatum, S. agona, S. meleagridis, S. oranienburg, S.

derby, S. infantis, S. ohio y S. havana como los serotipos más predominantes

(Contreras-Soto et al., 2018), en el presente estudio se encontró a los serotipos S.

enteritidis, S. typhimurium y S. typhi mayormente, esta predominancia de serotipos

también es consistente con los estudio realizado por Gutiérrez-Cogco et al. (2000),

en el que S. typhimurium, S. enteritidis, S. derby, S. agona y S. anatum fueron los

principales serotipos de Salmonella que circulaban en el país en el período de 1972 a

1999, aislados de diversas fuentes (humanos, ambiente, alimentos) y a lo reportado

por Juncosa Morros et al. (2005), quienes encontraron 31 serotipos de 860 aislados

de Salmonella en hospitales; los predominantes fueron S. enteritidis, S. typhimurium,

63

S. virchow. Situaciones similares se describen en otros estudios realizados en

distintas ciudades de España, en los cuales, S. enteritidis ha sido siempre el serotipo

predominante (Dorronsoro et al., 1996; Rodríguez et al., 2002).

Se sabe que el genoma bacteriano evoluciona de varias maneras, incluidas

mutaciones, reordenamientos y transferencia horizontal de información genética

(Padilla, 2018). El creciente número de bibliotecas genómicas de secuenciación

muestra que los genomas bacterianos contienen muchos genes auxiliares además

del genoma central que contiene genes metabólicos esenciales que son adquiridos

mediante transferencia horizontal entre bacterias y que codifican rasgos de

adaptación que posiblemente les beneficie a bacterias que se desarrollan bajo ciertas

condiciones (Schmidt y Hensel, 2004), como la resistencia a antibioticos.

Se ha demostrado experimentalmente que, incluso, si se secuencian varias

cepas de la misma especie, aún se descubrirán nuevos genes, y modelos

matemáticos predicen que, incluso, si se secuencian cientos de genomas por

especie, nuevos genes continuarán apareciendo (Medini et al., 2005), por lo que el

análisis masivo de estas secuencias es necesario para conocer el reportorio de los

genes que existen en una especie particular de bacteria (Padilla, 2018).

En la anotación de genes dentro de los genomas proporcionados por la ENCB,

se encontró que existen 4,491 genes en promedio y dentro de los genomas de

referencia, 9 de los 15 descritos contienen por lo menos 1 plásmido. De acuerdo con

Rotger y Casadesús (1999), los factores de virulencia responsables de la

patogenicidad en bacterias entéricas a menudo están codificados por plásmidos,

como en Escherichia coli, Yersinia spp. y Shigella spp. Sin embargo, actualmente se

sugiere que la contribución de los plásmidos de virulencia a la patogénesis en

Salmonella es menos importante que en las bacterias mencionadas anteriormente.

Así mismo, menciona que la presencia de plásmidos de virulencia en serovars

adaptados al huésped sugiere que la adquisición del plásmido de virulencia puede

haber expandido el rango del huésped de Salmonella.

64

Como resultado de la determinación del pangenoma, es decir, el número total

de genes putativos codificantes de proteínas que existen en los genomas

descargados de la base de datos de NCBI, se encontraron 36,057 genes presentes

en todos los genomas descargados. En estos resultados se observa el alto reportorio

de genes que existen en diferentes cepas de estas bacterias que, muy

probablemente, les han conferido alguna ventaja en su historial de adaptación y,

además, han de estar involucrados en su capacidad de proliferar en diversas

condiciones y hábitat. En el caso del coregenoma 1,838 se encuentran en este y los

restantes 34,219 se encuentran dentro del genoma accesorio.

Para la búsqueda de genes dentro de los genomas de Salmonella, se utilizó el

software ARIBA. Como resultado, de los 15 genomas aislados se contabilizaron 419

genes resistentes a antibióticos, los cuales, se comparten entre ellos y 52 de estos

genes son únicos. Se ubicaron 15 genes presentes dentro de los 15 aislados, por lo

tanto, estos se encuentran ubicados dentro del coregenoma. Los genes son: csgA,

csgF, csgG, flk, fur, invA, invF, orgB, phoQ, prgH, prgK, sdiA, sicA, ssaV y sthA.

CsgA es la subunidad de fibra principal y CsgE, CsgF y CsgG son proteínas

no estructurales involucradas en la biogénesis de curli. Estos ultimos son fibras

amiloides biológicamente importantes que se han asociado con la formación de

biopelículas, la adhesión e invasión de las células huésped y la activación del

sistema inmune. Robinson et al. (2006), mediante microscopía electrónica de Rotary

Shadow de CsgG purificado, sugirieron que esta proteína se ensambla en un

complejo oligomérico con un poro central aparente y determinaron que CsgG

participa en un complejo de membrana externa con otras dos proteínas de

ensamblaje de curli, CsgE y CsgF en E. coli.

En el caso de phoQ, es parte del sistema regulador de dos componentes

PhoP / PhoQ que regula la expresión de genes implicados en la virulencia, la

adaptación a entornos ácidos y con bajo contenido de Mg2+ y la resistencia a los

péptidos antimicrobianos de defensa del huésped y es esencial para la supervivencia

intramacrófaga de S. typhimurium (Miller et al., 1989). El gen invF da lugar a la

proteína invasora InvF (Darwin, 2001).

65

Las técnicas informáticas genómicas para la identificación de estas regiones

han demostrado ser herramientas útiles, capaces (Padilla, 2018) e innovadoras que

vendrán a revolucionar la vigilancia epidemiológica, ofreciendo herramientas útiles

para el monitoreo, prevención y diseño de estrategias para el control de

microorganismos patógenos responsables de brotes epidemiológicos. Lo que, a su

vez, impactará fuertemente en la inocuidad alimentaria a lo largo de la cadena de la

producción de alimentos y la salud pública.

IX. Conclusiones

Se encontraron 36,057 genes que estuvieron presentes en todos los genomas

descargados de la base de datos de NCBI, dentro de los cuales, se ubicaron 1,838

genes dentro del coregenoma y los 34,219 genes restantes fueron ubicados dentro

del genoma accesorio. Dentro del último objetivo específico, se concluye que, de los

15 genomas aislados por la ENCB, 419 genes presentaron resistencia a antibióticos,

los cuales, se comparten entre todos los aislados y 52 de estos genes encontrados

están ubicados dentro del genoma accesorio, lo que indica que son genes únicos.

Contrastando la hipótesis de esta investigación “Dado el constante flujo de

genes dentro del género Salmonella, se espera que los genes de resistencia se

localicen en el genoma accesorio (plásmido)”, la conclusión es que los genes de

resistencia si se encuentran dentro del genoma accesorio, por lo cual la hipótesis se

acepta.

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