PRACTICO N° 1

INTRODUCCIÓN A LAS COLUMNAS CAPILARES

A. OBJETIVOS

1. Familiarizarse con las columnas capilares y la instrumentación requerida por ellas.

2. Calcular el volumen muerto, velocidad l ineal del gas portador(), f lujo volumétrico y razones de división.

3. Estudiar el efecto de en el t iempo de análisis y en la resolución.

B. PROCEDIMIENTO

1. Discusión sobre la síl ica fundida (estructura química, cómo se dibuja), recubrimiento de poli imida y sobre como cortar y examinar los extremos de las columnas ( uso de lentes de aumento o microscopio ).

2. Discusión del sistema cromatográfico: gas portador, sistema de inyección (l impieza y reemplazo de inserto y septum), instalación de columnas, elección de temperaturas y f lujos de trabajo.

3. Instalación de columnas capilares: medición de con propano (metano), ajuste de la presión en la cabeza de la columna (si es necesario).

4. Cálculo de la razón de división:

Cálculo del volumen de la columna Cálculo del f lujo volumétrico Cálculo del f lujo “split” uti l izando un medidor de flujo de burbuja.

5. Inyección de una muestra estándar a 4 f lujos diferentes, (ej.: 40, 80, 120, 160 cm/s). Examinar el efecto de sobre la resolución y el t iempo de análisis.

TABLA DE DATOS

VALOR MEDIDO VALOR NORMAL

Temperatura Columna ºC

Largo (L) m

Fase estacionaria

I.D. mm

Espesor del film m

Gas portador Helio o Hidrógeno

Temperatura Detector ºC

Gas combustible (FID)

Hidrógeno mL/min

Aire mL/min

Make-up Nitrógeno mL/min

Temperatura Inyector ºC

Tm s

cm/s

Fc mL/min

Flujo Split (Fs) mL/min

Razón split

Ecuaciones:

L = largo de la columna

tm = tiempo de retención del metano

= velocidad lineal promedio del gas = L/tm (cm/s)

Fc = flujo volumétrico = (volumen de la columna/tm) = r2 L; r = radio columna; L = largo columna

Razón de división (Split) = Flujo split (Fs)/ Flujo columna (Fc) ID=diámetro interno

C. BIBLIOGRAFÍA:

Manual Supelco

Fotocopias, guía del profesor

Libros usuales de análisis Instrumental(Skog y West, Skog y Leary, Wil lard)

Internet, etc.

PRÁCTICO Nº 2

DETERMINACIÓN DE NITRITOS EN CECINAS SEGÚN MÉTODO

MODIFICADO DE GRAU-MIRNA

FUNDAMENTO : El método se basa en la diazociación del ácido sulfaníl ico con el nitr i to, y posterior copulación con el clorhidrato de nafti lamina para formar un compuesto azo coloreado, cuya absorción se lee en un espectrofotómetro a 520 nm.

MATERIALES Y EQUIPOS:

Espectrofotómetro. Balanza analít ica. Baño de vapor. Juguera.

REACTIVOS:

Reactivos de Griess

Griess I : Pesar 0,5g de ácido sulfaníl ico, agregar 30mL de ácido acético glacial y 120 mL de agua. Disolver en caliente y f i l trar. Conservar en refrigeración.

Griess II : Pesar 0,1g de alfa-nafti lamina y disolver en 120 mL de agua caliente, enfriar y luego agregar acético glacial y f i l trar. Conservar en refrigeración.

Solución de sulfato de zinc 0,42M. Solución de hidróxido de sodio al 2%. Solución patrón de sodio.

Solución madre de nitr i to de sodio : Pesar 0,5 g de nitr i to de sodio de pureza conocida y disolver en 1L de agua (1mL = 0,5mg nitr i to de sodio).

Solución de trabajo : Diluir 1mL de la solución madre en 100mL de agua (1mL = 0,005mg de nitr i to de sodio).

Curva de calibración : Agregar 1-2-5-7-9mL de la solución de trabajo en matraces volumétricos de 50mL. Agregar luego 1mL de la solución de Griess I y 1mL de la

solución de Griess II, agitar y aforar. Leer a los 20 minutos a 520 nm. Graficar Absorbancia v/s mg de nitr i to de sodio.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar 5 g de muestra previamente homogeneizada.

2. Transferir a juguera, agregar 40mL de agua a 80ºC y mezclar perfectamente, cuidando de que no queden grumos.

3. Transferir a un vaso precipitado o a un matraz Erlenmeyer.

4. Colocar a baño María por 2 horas. Agitar enérgicamente, ocasionalmente.

5. Agregar 10mL de solución de sulfato de zinc y 12mL de solución de hidróxido de sodio, agitar por 10 minutos más.

6. Enfriar y transferir por medio de fi l tración por algodón a un matráz aforado de 250mL, aforar con agua desti lada.

7. Tomar alícuotas del f i l trado, de acuerdo al probable contenido de nitr i tos, y agregar 1mL de solución de Griess I y II, agitar y aforar a 50mL. Leer a los 20 minutos a 520nm.

CÁLCULOS

De acuerdo a la interpolación realizada en la gráfica, y a las diluciones realizadas, calcule las partes por mil lón (mg/L) de nitr i to en la muestra.

OBSERVACIONES

Las soluciones altamente coloreadas que den lecturas bajo 20% T, se deben repetir necesariamente tomando una alícuota menor, así como las lecturas de más de 90% se tomará una alícuota mayor.

En lo posible se debe leer a los 20 minutos, ya que aumenta la intensidad del color con el t iempo, especialmente en sets de muestras con más de 10 ppm, se debe agregar las soluciones Griess I y II en intervalos de 10 minutos.

BIBLIOGRAFÍA

“Tóxicos Químicos en Alimentos” , Schmidt-Hebbel. “Determinación de Nitritos en Cecinas” , Oscar Perez.

Libros de Química de los Alimentos. Ver Reglamentación.,etc.

PRÁCTICO Nº3

DETERMINACIÓN DE FURFURAL POR METODO ESPECTRROFOTOMÉTRICO.

Fundamento Teórico: El fulfural presenta la propiedad de combinarse con la anilina en medio acético un compuesto de color rojo anaranjado. La intensidad del color es proporcional a la concentración del furfural pudiendose comparar con soluciones patrón para su determinación cuantitativa. En la reacción, es muy sensible el grupo carbonilo, se puede condensar con las aminas aromáticas para dar origen a los compuestos coloreados conocidos como bases de schiff. Es conveniente emplear anilina pura y recien destilada.

Procedimeinto:

Destilación simple

-Medir exactamente 100mL del licor a un matraz de aforo y tomar la temperatura del licor.-Verter el licor en un balón de destilación y enjuagar tres veces el matraz con una pequeña cantidad de agua destilada.-Neutralizar el licor con aproximadamente 2mL de hidróxido de sodio 5N.-Agregar perlas de ebullición, a fin de obtener una destilación uniforme.-Por otra parte, agregar 10 mL de agua destilada a un matraz de 100mL y sumergir el tubo del refrigerante en el agua.-Cuando toda la instalación balón-matraz ha terminado, dar el agua al refrigerante y encender la manta calefactora.-Regular la temperatura a fin de obtener una ebullición adecuada.-Recibir aproximadamente, el 75% del destilado en el matraz colector(matraz de 100mL). -Detener el proceso de destialción.-Aforar el matraz con agua destilada y homogenizar, para que de esta manera, el destilado quede listo para su análisis.-Conservar el destilado tapado y refrigerado, para evitar la volatilización de los componetes.***El destilado debe servir para 2 prácticos, por lo cual debe ser traspasado a una botella desechable y de cierre hermético***

Reactivos y soluciones

Preparación de soluciones

-Preparación de alcohol exento de aldehídos. 1.-Hervir suavemente y bajo reflujo 1 litro de etanol durante 2 0 3 horas, habiendose agregado previamente unas 10 lentejas de hidróxido de sodio y alguanas bolitas de vidrio.

2.-Al cabo de este tiempo, destilar la solución gota a gota.

3.-Verificar que el alcohol obtenido sea exento de aldehídos agregando 4mL del reactivo de schiff en 10mL de destilado llevado en 50 G.L.

*Este procedimiento, permite polimerizar y precipitar los aldehídos, es un método automático que no disminuye la graduación alcohólica, pero de muy lento y de bajo rendimiento, por lo que, el proceso debe repetirse varias veces.

Preparación de las soluciones patrón de furfural

-Preparar una solución madre de 1g/100mL. Luego, diluir ésta solución 100 veces con alcohol de 50G.L, a partir de la cual se toman alícuotas de 0,25; 0,50; 0,78; 1,00; 1,25 y 1,50mL a partir de la solución de trabajo y se lleva a matraz de 25mL, aforados con alcoholde 50 G.L.

Destilación de anilina

-La anilina comercial es coloreada debido a la presencia de compuestos oxidados como consecuencia de la exposición a la luz y al aire, por lo que es necesario destilarla. -En un balón de destilación introducir 200mL de anilina y agregar 1 a 2g de zinc en polvo.-Desechar las primeras porciones de destilado y cuando este comienza a salir limpio e incoloro, recibir en un matraz limpio y seco, eliminando las últimas porciones dee destilado.

Preparación de la muestra

-Para la determinación de furfural se requiere que el alcohol obtenido después de haber destilado el líquido original sea llevado a la graduación de 50G.L. Para proceder a esta operación efectuar la cruz de las mezclas o los cuadrados de Pearson, determinando las diferencias entre el grado deseado y el que se tiene.

Análisis por espectrofotometría

-Medir la intensidad del color en un Spectronic 20.-Tomar 10mL del destilado llevado a 50º en un tubo de ensayo.-Agregar 10 gotas de anilina incolora y 1mL de ácido acético glacial.-Agitar y dejar en reposo durante 10 minutos.-Efectuar la misma operación con las soluciones de la curva de calibración.-Considerar un blanco.-Al término de este tiempo, medir la intensidad del color a una longitud de onda de 520nm.- Si la muestra es muy concentrada, efectuar una dilución con alcohol de 50º.

INFORME: Calcular las ppm de furfural en licor de 100º.

BIBLIOGRAFÍA : --

Análisis de metanol, alcoholes superiores y furfural en bebidas alcohólicas por cromatografía de gases. Autores: Natalia Garay y Paula Parra.- Manual A.O.C.

Práctico Nº4DETERMINACIÓN DE METANOL Y ALCOHOLES SUPERIORES POR CROMATOGRAFÍA

DE GASES.

A. FUNDAMENTO TEÓRICO

La muestra de licor es analizada por cromatografía de gases. Para ello se introduce una cantidad de muestra destilada en la cámara de inyección del cromatógrafo, usando una microjeringa. La muestra se vaporiza y es arrastrada por el gas portador hacia la columna cromatográfica capilar de diámetro ancho, donde los componentes de la mezcla son separados en función de sus características fisico-químicas. Los componentes separados llegan al detector de ionización por llama generándose aquí una señal eléctrica proporcional a la concentración de cada componente. La señal es amplificada y transmitida a un registrador – integrador. La cuantificación se realiza por el método del estándar interno.

B. REACTIVOS Y SOLUCIONES

Acetato de etilo, p.a. 1-Butanol, p.a. 1-Propanol, p.a. Metanol, p.a. 2-metil-1-propanol, p.a. 1-pentanol, p.a. 3-metil-1-butanol, p.a. Etanol, p.a. 2-metil-2-Butanol, p.a. (estándar interno)

Preparación de Soluciones

- Preparación de solución stock:

Pesar, con precisión al 0,1 mg en balanza analítica; 0,90 g de metanol; 0,20 g de 1-propanol; 0,15 g de acetato de etilo; 0,5 g de 2-metil-1-propanol; 0,10 g de 1-butanol; 0,50 g de 3-metil-1-butanol y 0.15 g de 1-pentanol, en un matraz de aforo, completando el volumen a 100 mL con una solución hidroalcoholica al 40%v/v.

- Preparación de patrón interno:

Pesar; 2,5 g de 2-metil-2-butanol, en una balanza de precisión 0,1 mg y enrasar a 1 L con una solución hidroalcohólica al 40%v/v.

- Preparación de la solución de calibración:

Con una pipeta aforada tomar 5 mL de la solución stock de alcoholes y ésteres, y 5 mL de patrón interno, trasladar a un matraz aforado de 50 mL, completando el volumen con solución hidroalcohólica al 40% v/v. Conservar en refrigeración para evitar evaporación.

C. PROCEDIMIENTO

Análisis cromatográfico

1. Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando férulas de grafito para asegurar conexiones herméticas.

2. Encender el cromatógrafo de gases, abrir la válvula del gas portador (N) y regular cuidadosamente su flujo.

3. Ajustar las condiciones cromatográficas.4. Abrir las válvulas de los otros gases, primero el aire y luego el hidrógeno.5. Con una solución de jabón o detergente, verificar fugas de gases en todas las conexiones.6. Encender el detector y obtener una línea de base estable.

Condiciones Cromatográficas

-Tº inicial del horno = 35ºC.-Tº final del horno = 90ºC.-Tiempo inicial = 5min.-Tiempo final = 5min.-Velocidad de calentamiento = 10 ºC/min.(RATE =rampa)-Tº inyector = 180ºC.-Tº detector = 180ºC.-Flujo del gas portador = entre 5 y 6,2 mL/min.

Condiciones de integración

-Atenuación = 0-Nivel de ruido = 0.-Chart speed = 1cm/min.-Pk wd = 0,16.

Luego de establecidas las condiciones cromatográficas, se procede a la determinación de los parámetros en estudio.

Preparación de la muestra:

1. Tomar 5 mL de la solución stock de patrón interno con una pipeta aforada y trasladar a un matraz, aforar a 50 mL con la muestra de licor destilado (del práctico anterior), homogeneizar la solución resultante.

2. Limpiar la microjeringa con etanol absoluto.3. Ambientar la microjeringa con la muestra, tomar 0,5 uL e inyectar.4. Inyectar la solución de calibración bajo las mismas condiciones.

INFORME : Determinación de los analitos en la muestra de licor destilado en g/L. Comparar método con A.O.A.C. Comparar resultados con Ley de alcoholes. Discutir el por qué del orden de elución incluyendo todos los factores y considerando el tipo de columna utilizada. Buscar formulas estructurales y propiedades físico-químicas de los alcoholes analizados.

ORDEN DE ELUCIÓN: etanol, acetato de etilo, isobutanol, 2-metil-2-butanol, butanol, isoamílico y amílico.

D. BIBLIOGRAFÍA

Análisis de metanol, alcoholoes superiores y furfural en bebidas alcohólicas por cromatografía de gases. Autores: Natalia Garay y Paula Parra.

Manual Supelco Manual A.O.A.C. Guía de Cromatografía Libros de Análisis Instrumental Libros de Química Orgánica (estructuras y propiedades de los alcoholes)

Práctico nº5

DETERMINACIÓN DE ANTIOXIDANTES POR CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA Y

CROMATOGRAFÍA DE GASES

A.- FUNDAMENTO TEÓRICO:

El método sirve para la detección de antioxidantes en grasa y aceites animales y vegetales. El

aceite es disuelto en éter de petróleo o hexano y la solución es extraída con acetonitrilo.

Después de la evaporación del solvente, el extracto se pone sobre la placa de sílice. Las

placas son desarrolladas y las gotas son visibles usando un indicador adecuado. Los

antioxidantes son detectados comparando las manchas obtenidas (valor Rf) entre la muestra y

un estándar.

B.- REACTIVOS:

-Metanol p.a.

-Etanol.

-Éter de petróleo.

-Acetonitrilo p.a.

-(2,6-dicloro-4-benzoquinona clorhimida).

-Sulfato de sodio anhidro p.a.

-Benceno p.a.

-Ácido acético glacial p.a.

-Yodo p.a..

C.- MATERIALES:

-Container de vidrio con tapa de vidrio en el cual se puedan acomodar las placas de

5x10cm.

-Cromatoplacas de sílica gel para cromatografía en placa fina de 5x10cm.

-Rotavapor.

-Embudos de decantación.

-Material usual de laboratorio.

D.- SOLUCIONES

Preparación de soluciones:

-Acetonitrilo saturado con éter de petróleo:

Transferir 900 mL de acetonitrilo en 100 mL de éter de petróleo en un embudo de

decantación de 2 L. Agregar algo de sulfato de sodio anhidro. Agitar el contenido por 5 min.

vigorosamente. Dejar decantar toda la noche. Usar la fase inferior.

-Éter de petróleo saturado con acetonitrilo:

Transferir 900 mL de éter de petróleo en 100 mL de acetonitrilo en un embudo de

decantación de 2 L. Agregar un poco de sulfato de sodio anhidro. Agitar el contenido por 5

min. y dejar decantar toda la noche. Usar la fase superior.

-Solvente revelador:

Preparar 200 mL de solvente revelador, mezclando éter de petróleo, benceno y

ácido acético glacial en la proporción 40/40/20 (v/v). Preparado fresco antes de usar.

-Solución estándar de antioxidantes:

Disolver en un matraz de aforo de 100 mL, 100 mg de cada antioxidante en

metanol, enrasar y mezclar.(BHT; BHA, TBHQ).

E.- PROCEDIMIENTO:

*Extracción de antioxidantes:

1) Disolver 7,5-10 g de muestra en un vaso de 250 mL en 100 mL de éter de petróleo. Si fuese

necesario calentar ligeramente en plancha. Transferir la solución en un embudo de decantación

de 250mL.

2) Enjuagar el vaso con un poco de éter de petróleo y agregar el líquido al embudo de

decantación. Asegúrese que ninguna partícula insoluble esté presente en el éter de petróleo

que se agrega al embudo de decantación.

3) Agregar 50 mL de acetonitrilo saturado con éter de petróleo agitar por 1 min. Extraer la fase

de acetonitrilo (fase inferior) y transferirla a otro embudo de decantación. Repetir una vez más.

4) Lavar los extractos combinados (en el segundo embudo de decantación) de acetonitrilo, 2

veces con 50 mL de éter de petróleo saturado con acetonitrilo.

5) Transferir la fase acetonitrilo (fase inferior del embudo de decantación) a un matraz de fondo

plano con boca esmerilada de 250 mL. Enjuagar el embudo de decantación una vez con 25 mL

de acetonitrilo y agregarlo al matraz. Evaporar el solvente con vacío en el rotavapor a la menor

temperatura posible (no sobrepasar los 40ºC).

6) Disolver el residuo obtenido en 2mL de metanol y transferir la solución a un tubo pequeño de

vidrio y taparlo. Si el residuo no se disuelve completamente, filtrar la solución a través de una

pipeta pasteur con filtro de lana de vidrio (libre de grasa).

Detección:

1) Verter la mezcla de solvente revelador en el Container hasta la altura de 1 cm. Tapar y dejar

en la sombra durante 2 hrs. para estabilizar la atmósfera del container.

2) Agregar 10 uL (con una microjeringa o micropipeta) del extracto de antioxidantes (solución

obtenida anteriormente) a 2 cm del costado vertical lateral de la placa de sílice. Agregar otros

20 uL del extracto de antioxidante a 2 cm de la gota anterior (en una línea horizontal). Se debe

tener precaución que ambas gotas queden en línea horizontal perfecta., lo que constituye la

línea de partida.

3) Enseguida poner alicuotas de 2, 4, 6 uL de la solución estándar a una distancia de 2 cm

entre gota y gota, en la línea de partida.

4)Trazar una línea paralela a 15 cm por encima de la línea de partida. Poner la placa en el

container y dejarla a la sombra hasta que el solvente alcance la línea marcada.

5) Sacar la placa del container y dejarla secar al aire.

Revelado:

1) Para visualizar los antioxidantes se puede proceder de dos formas:

a.-Atomizar con el solvente revelador sobre la placa a una distancia de 20cm y

poner la placa a 105ºC por 10-15minutos.

b.-Con vapores de yodo; colocar las placas en un recipiente de vidrio tapado que

contiene una atmósfera saturada de yodo, dejar por 5-10minutos hasta la aparición de

manchas amarillas.

*En ambos casos demarcar las manchas con un lápiz de grafito, comparar el Rf de la muestra

con el estándar y la intensidad de color de las manchas.

Notas:

*Si se forma una emulsión, cerrar cuidadosamente el embudo de decantación y calentarlo a

baño maria a 50ºC hasta que se obtenga una fase clara. Otra alternativa es agregar una punta

de espátula de cloruro de sodio p.a.

*Si el contenido de antioxidantes esperado es menor a 100 ppm, se recomienda disolver el

contenido en 1 mL de metanol.

*Si se pone la placa de sílice verticalmente y si se observa de arriba hacia abajo, se detecta en

esa dirección BHT, BHA y TBHQ. La intensidad de la mancha indica el mayor o menor

contenido de antioxidantes.

Cromatografía de gases:

-El principio de extracción es el mismo que para cromatografía en placa fina, se extrae de la

misma forma y se analiza posteriormente por cromatografía de gases.

-Las condiciones cromatográficas se darán en el laboratorio.

F.- BIBLIOGRAFÍA:

-Manual de A.O.A.C

-Análisis de Alimentos, Pearson.

-Memoria de Carolina Fuentes.

FORMULAS

Rf = Dm Distancia recorrida por la muestra

Ds Distancia recorrida por el disolvente

Esta distancia se mide desde el punto de origen hasta su

posición final (centro de la mancha)