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Argentino deAcreditación

GUIA PARA LA VALIDACIÓN DEMÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

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Fecha de entrada envigencia: 08-julio-2011

TÍTULO:

GUÍA PARA LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS

RESUMEN: Este documento describe las actividades para la validación de Métodos de EnsayoMicrobiológicos que soliciten su acreditación ante el Organismo Argentino de Acreditación.

Este documento se distribuye como copia no controlada. Debe confirmarse su vigencia antes de haceruso de esta versión, por si ha sido modificada.



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1. OBJETIVO .......................................................................................................... 3 2. ALCANCE ........................................................................................................... 3 3. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA .............................................................. 3 4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES ................................................................. 4 5. RESPONSABILIDADES ..................................................................................... 8 6. DESCRIPCIÓN ................................................................................................... 8 6.1. Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación dela incertidumbre de medición ..................................................................................... 8 6.2. Validación de los métodos ................................................................................ 10 6.3. Estimación de la incertidumbre de medición .................................................... 14 6.4. Expresión de la Incertidumbre de medición en los informes de ensayo ........... 16 7. DOCUMENTACIÓN RELACIONADA ............................................................... 16 8. Anexo I - Parámetros de validación y expresiones para su cálculo .................. 17



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1. OBJETIVOEstablecer una guía para la validación de métodos de ensayo no normalizados,desarrollados o diseñados por el Laboratorio, métodos normalizados empleados fuera delalcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos normalizados y para lasverificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar correctamente los métodosnormalizados antes de utilizarlos para los ensayos. Establecer los principios y los requisitospara la evaluación de la incertidumbre de medida en los ensayos y para la expresión dedicha incertidumbre. Esta guía está dirigida a Laboratorios que realizan ensayosmicrobiológicos utilizados en el análisis de agua y de alimentos destinados al consumohumano y la alimentación animal, a muestras ambientales en el ámbito de la producción ymanipulación de alimentos y, en productos farmacéuticos o cosméticos.

2. ALCANCE

Esta guía la deben aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA, loslaboratorios que solicitan su acreditación, y los evaluadores y expertos técnicos que actúanen los procesos de acreditación.

3. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA3.1. Norma IRAM 301 vigente (ISO/IEC 17025: vigente), Requisitos generales para lacompetencia de los laboratorios de ensayo / calibración.

3.2. Norma ISO 9000 vigente. Sistemas de Gestión de la Calidad - Fundamentos yvocabulario.

3.3. Norma ISO 16140: 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol forthe validation of alternative methods.

3.4. Norma ISO/TR 13843 vigente. Water quality - Guidance on validation of microbiologicalmethods.

3.5. Norma ISO/TS 19036:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations.ISO/TS 19036:2006/Amd 1:2009. Measurement uncertainty for low counts.

3.6. Norma ISO 17994 vigente. Water quality -- Criteria for establishing equivalencebetween microbiological methods.

3.7. Norma ISO 5725-2 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurementmethods and results -- Part 2: Basic method for the determination of repeatability andreproducibility of a standard measurement method.

3.8. Norma ISO 5725-3 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurementmethods and results -- Part 3: Intermediate measures of the precision of a standardmeasurement method

3.9. Norma ISO 8199 vigente. Water quality -- General guidance on the enumeration ofmicro-organisms by culture.

3.10. Norma ISO 11133-2 vigente. Microbiology of food and animal feeding stuffs --Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical guidelines onperformance testing of culture media



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3.11. AOAC INTERNATIONAL Methods Committee Guidelines for validation of qualitativeand quantitative food microbiological official methods of analysis. Journal of AOAC Int. Vol.85, No 5, 2002

3.12. AOAC INTERNATIONAL Presidential Task Force on Best Practices forMicrobiological Methodology. BPMM Task Force Final Report 8-7-06.

3.13. EA Guide EA-04/10: 2002. Accreditation for Laboratories Performing MicrobiologicalTesting.

3.14. Environment Agency. Standing Committee of Analysts. Methods for the Examinationof Waters and Associated Materials. The Microbiology of Drinking Water (2002) - Part 3 -Practices and procedures for laboratories

3.15. Oficina Internacional de Pesos y Medidas (BIPM). Vocabulario Internacional deMetrología - Conceptos fundamentales y generales, y términos asociados (VIM). JCGM200:2008. JCGM 200:2008 Corrigendum. May 2010.

3.16. NMKL/NordVal. Protocol for the validation of alternative microbiological methods.2009

3.17. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA) vigente.

3.18. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to MethodValidation and Related Topics. EURACHEM Guide. Editor: H. Holcombe, LGC, Teddington:1998.

4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES

4.1. ABREVIATURAS- AOAC: Association of Analytical Communities.

- EA: European co-operation for Accreditation.

- ISO: International Standardization Organization

- IRAM: Instituto Argentino de Normalización.

- NMKL: Nordic Committee on Food Analysis

4.2. DEFINICIONES

Analito: componente medido por el método de análisis. En el caso de métodos

microbiológicos esto es el microorganismo sus componentes o productos asociados(enzimas o toxinas) (3.11)

Especificidad: (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): Fracción delnúmero total de cultivos o colonias negativos que son asignados correctamente con elmétodo utilizado (3.4).

Nota: También puede definirse como la capacidad de un método de no detectar elmicroorganismo diana, si este no está presente.

Exactitud de medida: proximidad entre un valor medido y un valor verdadero de unmensurando (3.15).

Nota: Es la combinación de la precisión y la veracidad. La exactitud en los ensayos

microbiológicos, pueden determinarse mediante los resultados obtenidos en losinterlaboratorios (que dan una idea de precisión) y mediante el análisis de un material dereferencia certificado (que da una indicación de la veracidad).



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Exactitud relativa: Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado y losobtenidos utilizando un método de referencia reconocido (3.3).

Nota: En lo posible deben utilizarse muestras idénticas. Sin embargo, cuando se utilizandiferentes pre-enriquecimientos, se hace necesario la duplicación de las muestras.

Factor de cobertura (k): factor numérico utilizado como multiplicador de la incertidumbrede medida para obtener una incertidumbre expandida de medición. (3.5).

Nota: Típicamente su valor se encuentra entre 2 y 3

Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, quecaracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos almensurando (3.5).

Nota: El parámetro puede ser, por ejemplo, una desviación estándar (o un múltiplo de ella),o la mitad de un intervalo de un nivel de confianza determinado.

Incertidumbre combinada, uc (y): incertidumbre estándar de un resultado, y, de unamedición cuando ese resultado es obtenido a partir de valores de otras cantidades, que esigual a la raíz cuadrada positiva de la suma de los términos, siendo estos términos, lasvarianzas o covarianzas de esas cantidades divididas por los resultados de esasmediciones (3.5).

Incertidumbre estándar, u (xi): incertidumbre del resultado xi de una medición expresadacomo una desviación estándar (3.5).

Incertidumbre expandida (U): cantidad que define a un intervalo en torno al resultado deuna medición que puede esperarse que incluya una fracción grande de la distribución delos valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando (3.5).

Inclusividad/ Exclusividad: inclusividad es la capacidad de un método alternativo dedetectar el microorganismo diana a partir de un amplio rango de cepas. Exclusividad es lafalta de interferencia, en un método alternativo, a partir de un rango amplio de cepas no-diana (3.3).

Nota: La exclusividad expresa la capacidad del método de no detectar a losmicroorganismos no - diana, es decir aquellos que pueden presentar reacciones cruzadascon el microorganismo diana. La inclusividad es el rango de cepas que refleja la diversidadgenética y / o serológica del microorganismo diana que el método puede detectar.

La inclusividad y la exclusividad se determinan sobre un amplio rango de cultivos puros decepas diana y no - diana, mientras que la sensibilidad/especificidad se determinan enmatrices contaminadas. La inclusividad/exclusividad da una medida de la selectividad delmétodo.

Este requisito no es aplicable al recuento total de microorganismos viables, recuento dehongos y levaduras o métodos de enumeración que no están dirigidos contramicroorganismos específicos.

Límite de detección: aplicado a ensayos microbiológicos cualitativos, es el númeromínimo de microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que nopueden estimarse con precisión (3.13).

Límite de cuantificación: aplicado a ensayos microbiológicos cuantitativos, es el númeromínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarseen las condiciones experimentales del método evaluado (3.13).



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Nota: También se lo denomina límite de determinación. Representa el nivel más bajovalidado con una precisión satisfactoria.

Mensurando: magnitud que se desea medir (3.15).

Nota: En microbiología el mensurando es definido en términos del método empleado.Puede expresarse, por ejemplo, como ufc por la unidad de cantidad de muestra (ufc/ml óufc/g). Ejemplo: en la determinación cuantitativa de Listeria en leche, el mensurando puedeser el resultado obtenido a partir del recuento de colonias, luego que se han seguido todoslos pasos especificados en el método de ensayo.

Método cualitativo: método de análisis cuya respuesta es la presencia o ausencia delanalito, detectado de forma directa o indirecta en una cierta cantidad de muestra. (3.3).

Método cuantitativo: método de análisis cuya respuesta es la cantidad del analito medidode forma directa (enumeración en masa o volumen), o indirecta (color, absorbancia,impedancia, etc.) en una cierta cantidad de muestra (3.3).

Método de referencia: método internacionalmente reconocido y ampliamente aceptado(3.3).

Nota: (por ejemplo, NMKL, ISO, CEN, métodos de AOAC Internacional, métodos que seindican en la Unión Europea, en las legislaciones nacionales y ciertas normas nacionalesde calidad equivalente).

Método alternativo: método de análisis que demuestra o estima, para una dada categoríade productos, el mismo analito que se mide utilizando el correspondiente método de

referencia (3.3).Precisión de medida: proximidad entre las indicaciones o los valores medidos obtenidosen mediciones repetidas de un mismo objeto, o de objetos similares, bajo condicionesespecificadas. (3.15).

Nota: Es habitual que la precisión de una medida se exprese numéricamente mediantemedidas de dispersión tales como la desviación típica, la varianza o el coeficiente devariación bajo las condiciones especificadas. Las “condiciones especificadas” pueden ser condiciones de repetibilidad, condiciones de precisión intermedia, o condiciones dereproducibilidad

Precisión intermedia: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de precisión

intermedia. (3.15).Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medición, el mismolugar y mediciones repetidas del mismo objeto u objetos similares durante un periodoamplio de tiempo, pero que puede incluir otras condiciones que involucren variaciones.

Las variaciones pueden comprender nuevas calibraciones, patrones, operadores ysistemas de medida. En la práctica, conviene que toda especificación relativa a lascondiciones incluya las condiciones que involucren variaciones y las que no.

Rango de validación: rango de número medio de partículas por porción analítica para elcual las expectativas de las especificaciones de validación (en particular linealidad)hansido aceptablemente demostradas.Nota: por lo general se expresa como el rango de recuento de colonias “confiable” (3.4).

Repetibilidad: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de repetibilidad.(3.15).



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Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medida, los mismosoperadores, el mismo sistema de medida, las mismas condiciones de operación y el mismolugar, así como mediciones repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodocorto de tiempo.

Reproducibilidad: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones dereproducibilidad (3.15).

Nota: Este conjunto de condiciones incluye diferentes lugares, operadores, sistemas demedida y mediciones repetidas de los mismos objetos u objetos similares. Los diferentessistemas de medición pueden utilizar diferentes procedimientos de medida. En la práctica,conviene que toda especificación relativa a las condiciones incluya las condiciones quevarían y las que no.

Robustez: capacidad de un método para mantenerse sin cambios ante pequeñas perodeliberadas variaciones en los parámetros del método, que provee una indicación de suconfiabilidad durante el uso normal (3.18).

Nota; las variaciones a las que hace referencia la definición son por ejemplo, cambios enlas condiciones ambientales, en las condiciones de incubación (tiempo/temperatura),calidad y vida útil de medios de cultivo y reactivos, pH, etc. La información de la prueba derobustez puede utilizarse para especificar las condiciones en que debe ser aplicado elmétodo

Sensibilidad (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): Fracción del númerototal de cultivos o colonias positivos que son correctamente asignados con el método

utilizado (3.4).También puede definirse como la capacidad de un método de detectar el microorganismodiana, cuando este está presente.

Tasa de Falsos Positivos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es laprobabilidad o frecuencia con que la muestra sea asignada como positiva cuando enrealidad es negativa. Falsos Positivos son aquellos que han sido asignados como talesconociendo que en realidad son negativos. La incidencia de falsos positivos es igual a: 1menos la especificidad (3.11).

Tasa de Falsos Negativos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es laprobabilidad o frecuencia con que una muestra conocida como positiva, sea asignada

como negativa por el método. La incidencia de falsos negativos es igual a 1 menos lasensibilidad (3.11).

Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se hancumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (3.2).

Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se hancumplido los requisitos especificados. (3.2).

Veracidad: proximidad entre la media de un número infinito de valores medidos repetidosy un valor de referencia (3.15).

Nota: El verdadero valor de una cantidad es un concepto teórico y, en general, no puedeser conocido exactamente. En la práctica el valor de referencia aceptado puede sustituir al

valor verdadero. La veracidad se expresa habitualmente en términos de sesgo o bias. Esaceptado, en los ensayos microbiológicos cuantitativos, que no se tenga en cuenta alsesgo, en la estimación de la incertidumbre de medición debido a la naturaleza empírica de



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los métodos microbiológicos. Es el procedimiento analítico el que determina directamenteel resultado de la medición, por ejemplo, el número de unidades formadoras de coloniaspor unidad de muestra. Por lo tanto, no es posible en la práctica determinar el valorverdadero que se requiere para determinar el sesgo. Incluso cuando se utilicen materialesde referencia certificados, o los valores derivados de los Ensayos de Aptitud, sólo puedeevaluarse una parte del sesgo. En cualquier caso, aún cuando no se evalúe el componentede la incertidumbre debida al sesgo, el laboratorio puede demostrar que se encuentra bajocontrol, por ejemplo, mediante su participación en ensayos de aptitud o mediante el ensayode materiales de referencia certificados.

5. RESPONSABILIDADES

Se encuentran descriptas en el documento DC-SG-07, Responsabilidades y en elpunto 6 de este documento.

6. DESCRIPCIÓN

Un Laboratorio que realiza ensayos microbiológicos puede utilizar métodos cualitativos y/ocuantitativos, los cuales se basan en la capacidad natural de los microorganismos dedesarrollarse en un determinado medio de cultivo, a fin de detectarlos y/o podercuantificarlos.

El laboratorio debe utilizar métodos de ensayo, que satisfagan las necesidades del clientey que sean apropiados para los ensayos que realiza, es decir ajustados a su propósito.

Para ello puede utilizar:

métodos normalizados: son aquellos métodos publicados como normasinternacionales o nacionales, o por organizaciones técnicas reconocidas (Ej.: ISO, NMKL,UNE, EN, AOAC, APHA, FDA, EPA, Standard Methods for Water and Wastewater, USP,EP, etc.)

métodos alternativos: se trata de métodos que han sido validados por comparacióncon el método de referencia que corresponda, de acuerdo a un estándar aceptado (ej.ISO 16140, ISO/TR 13843, ISO 17994) y son reconocidos formalmente comoequivalentes al método de referencia por un organismo competente de acuerdo a unosdatos experimentales obtenidos por ej. mediante ensayos colaborativos.

métodos no normalizados: pueden considerarse aquellos métodos normalizadosmodificados o utilizados fuera de su alcance. Por ejemplo: otra matriz, otros medios decultivo, diferentes tiempos/temperaturas de incubación, equipos con distintas tolerancias alas especificadas, combinación de partes del método normalizado con partes de unareferencia bibliográfica, etc.

métodos internos: son aquellos elaborados por el propio laboratorio y que no seencuentran en normas o u otras colecciones de métodos.

6.1. Requisitos generales para las actividades de validación y para laestimación de la incertidumbre de medición

a) La validación de los métodos de ensayo y la estimación de la incertidumbre de

medición, debe ser realizada por miembros del personal experimentados, competentes y,por lo tanto, autorizados. El laboratorio debe operar bajo un sistema de aseguramiento dela calidad de sus ensayos. Los equipos e instrumentos deben ser calibrados y/ o validados



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antes de su uso, los medios de cultivo evaluados y controlados, etc. Ver lo dispuesto en eldocumento CE-LE-06 Criterios específicos para la evaluación y acreditación de laboratorioque llevan a cabo ensayos microbiológicos.

b) Para la validación/verificación de los métodos, el número y categoría de matrices aanalizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debe basarse enreferencias bibliográficas o estándares reconocidos, por ejemplo el anexo B de la normaISO 16140 o el anexo B del documento Final Report and Executive Summaries from theAOAC International Presidential Task Force on Best Practices in MicrobiologicalMethodology.

c) Para la estimación de la incertidumbre, debe tenerse en cuenta: el tipo de matriz (ogrupo consistente de matrices), el microorganismo (o grupo consistente de

microorganismos, por ejemplo, coliformes) y el método empleado. El número y categoríade matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debebasarse en referencias bibliográficas o estándares reconocidos, por ejemplo la normaISO/TS 19036.

d) Las actividades de validación y las de estimación de incertidumbre de medición debenreflejar las condiciones reales de la aplicación de los métodos de ensayo, es decir, debentener en cuenta las condiciones encontradas en la práctica diaria. Por ello puedenutilizarse: de preferencia muestras naturalmente contaminadas, contaminadas por mezcla,o en su defecto muestras inoculadas o materiales de referencia. El Anexo C de la normaISO 16140 sirve como referencia para alimentos. Una guía para la preparación demuestras de agua, se encuentra en la referencia 3.14 de este documento. Cuando se

utilice la inoculación, debe tenerse en cuenta que según la naturaleza del método y de lamatriz, se hace necesario considerar la presencia de la flora acompañante a fin de evaluarposibles interferencias. Para ello se pueden utilizar matrices estériles inoculadas, con elmicroorganismo diana y con cepas distintas a la diana en concentraciones superiores.También pueden utilizarse muestras no esterilizadas inoculadas, que hayan demostradopreviamente la ausencia del microorganismo diana. Para la selección de losmicroorganismos a utilizar puede servir como referencia lo indicado en el Anexo G de lanorma ISO 16140 o en la norma ISO 11133-2. El nivel del inóculo debe ser acorde a loanalizado por el laboratorio en la práctica diaria y lo especificado por el método de ensayo,por ejemplo el análisis de muestras de alimentos con alta carga y baja carga en ladeterminación de Salmonella . También debe tenerse en cuenta el estado fisiológico del/losmicroorganismo (s) de acuerdo a las matrices analizadas.

e) Tanto en la validación como en el cálculo de la incertidumbre de medición se debetener en cuenta el rango de trabajo que emplee el Laboratorio en sus análisis de rutina.

f) Para los modelos descriptos en 6.3.2.1 y 6.3.2.2, la incertidumbre debe recalcularsecuando se produzcan cambios significativos en las condiciones: por ejemplo, cambio en losequipos, en los analistas, en los medios de cultivo, etc. Si se necesita estimar laincertidumbre para un cliente o para la interpretación de un resultado en contra de unaespecificación, y el cálculo no se ha actualizado en los últimos 6 meses, es recomendableque se lo revise.

g) Se debe designar a un Responsable que tenga las calificaciones y la competencianecesarias, para evaluar el diseño experimental y los resultados obtenidos, tanto en la

validación de los métodos como en la estimación de la incertidumbre de medición. Éste



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decidirá además las acciones a seguir en caso que no se obtengan los resultadosesperados.

h) La participación en Ensayos de Aptitud (EA), no puede ser utilizada como único métodopara la validación ni para la estimación de la incertidumbre de medición, debido a lassiguientes limitaciones:

en las rondas de EA, las matrices, en muchos casos, son diferentes a las que analiza elLaboratorio en su rutina diaria y no tienen en cuenta la presencia de flora acompañante;

las muestras distribuidas durante la ronda, han sido especialmente homogeneizadas yestabilizadas;

los niveles de microorganismos en las muestras del EA, pueden no ser aquellos que el

laboratorio analiza rutinariamente y pueden no cubrir el rango encontrado en el trabajodiario;

los laboratorios participantes, utilizan una variedad de métodos empíricos para obtenersu resultado, por lo cual para evaluar el resultado de la ronda se utilizan valores deconsenso.

Sin embargo la participación en EA, puede utilizarse como actividades complementarias ala validación y pueden dar una indicación de la precisión obtenida para un método enparticular.

La participación en EA puede utilizarse en la estimación de la incertidumbre de mediciónbajo las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente.

6.2. Validación de los métodos

El término “validación” se utiliza para indicar el proceso que provee evidencia objetiva queel método es capaz de servir a su uso esperado, es decir para detectar o cuantificar unmicroorganismo o grupo de microorganismos específicos, para lo cual deben determinarsesus características de desempeño a fin de comprobar que cumple con los requisitosespecificados para ese uso particular.

El término “verificación” se utiliza, en el contexto de este documento, para indicar elproceso que lleva a cabo el laboratorio con el fin de demostrar su capacidad para ejecutarcorrectamente un método normalizado cuando lo realiza exactamente como está descripto

en la norma.En adelante se mencionará el término validación pero lo expuesto aplica igualmente a laverificación de los métodos de ensayo.

6.2.1. Etapas en el proceso de validación

El proceso de validación de un método debe estar cuidadosamente planificado, por ellodeben contemplarse los siguientes pasos:

a) Conocer el problema analítico a resolver. Los procedimientos y el alcance de lavalidación no son siempre los mismos. Deben ser establecidos de acuerdo a lascaracterísticas del método de ensayo utilizado por el Laboratorio y tener en cuenta lasnecesidades del cliente.

b) Planificar las acciones a seguir. Esto implica especificar los requisitos y condicionesa cumplir, determinar los parámetros de desempeño del método, establecer el diseño



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experimental y el método de análisis de resultados. El diseño experimental y el análisis deresultado tienen que ser estadísticamente válidos. En esta etapa es fundamental definir elalcance de la validación de acuerdo al método a emplear, especificar la matriz o matricesa estudiar; establecer condiciones tales como temperatura y tiempo de incubación, límitesde operación; realizar una clara descripción del/los microorganismos de interés; yestablecer otras limitaciones y especificaciones. Si los parámetros de desempeño noestán ya especificados, el laboratorio debe decidir cuáles deben ser caracterizados con elfin de validar el método, lo cual deberá estar fundamentado de manera confiable ycientífica.

En todos los casos se requiere un Protocolo de validación (ver 6.2.3.1).

c) Llevar a cabo la validación y evaluar los resultados obtenidos, por comparación

con los parámetros de desempeño establecidos. Confirmar la validez del procedimientoutilizado de acuerdo al propósito establecido y, si se han satisfecho los requisitos.

d) Realizar el Informe de validación (ver 6.2.3.2).

6.2.2. Alcance de la Validación/verificación de los métodos

El alcance dependerá del tipo de método utilizado. Se pueden presentar los siguientescasos.

6.2.2.1 Métodos normalizados: el Laboratorio utiliza un método normalizado que se aplicaexactamente como está descripto en la norma. En este caso el laboratorio debe confirmarque puede aplicarlo correctamente previo a su uso en ensayos, mediante la comprobacióndel cumplimiento de los parámetros estadísticos que figuran en el método normalizado(siempre y cuando se indiquen en la norma).

Los parámetros a determinar son:

Ensayos cualitativos Ensayos cuantitativos Límite de detección Verificación de la sensibilidad y laespecificidad

Precisión (Repetibilidad + Precisiónintermedia) Límite de cuantificación (a) Verificación de la veracidad

(a) El límite de cuantificación debe ser determinado en los casos que afecte o esté cercanoal límite especificado en la norma correspondiente.

Debe tenerse en cuenta que cualquier variación en el método normalizado implica larepetición de dicha confirmación.

6.2.2.2 Métodos modificados: el Laboratorio realiza modificaciones al método de ensayonormalizado que pueden tener una repercusión sobre la calidad de los resultados. En elcaso de los métodos microbiológicos se consideran modificaciones relevantes, entre otras:

incluir en el alcance del método otra matriz que la especificada en el métodonormalizado;

la utilización de medios de cultivos diferentes a los descritos en el método dereferencia;

cambios en las condiciones de incubación (tiempo-temperatura);



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el uso de equipos críticos con distinta tolerancia a la especificada en el métodonormalizado, por ejemplo estufas de incubación, baños termostáticos utilizados para laincubación de caldos de pre - enriquecimiento o de enriquecimiento, etc.;

utilización de un rango de recuento diferente al especificado en el método normalizado;

utilización de un método de recuento de colonias o un método de cálculo y expresiónde los resultados diferente al especificado en el método normalizado;

utilización de una porción de ensayo o suspensión inicial diferente;

utilización de una sola placa de Petri para el recuento cuando el método normalizadoindica dos;

combinación de partes del método normalizado con partes de una referenciabibliográfica;

En estos casos se debe tener en cuenta que los parámetros a determinar dependerán delas modificaciones introducidas y la naturaleza del método, prestando particular atención aaquellas características de desempeño que puedan haber sido afectadas por el cambiointroducido.

6.2.2.3 Métodos alternativos: el Laboratorio utiliza métodos alternativos o métodosrápidos de confirmación. En estos casos, cuando se dispone de los datos de validación, elLaboratorio debe realizar una verificación de su aplicabilidad, siguiendo los lineamientosestablecidos en 6.2.2.1. Los datos de validación pueden obtenerse de ensayoscolaborativos o de datos provistos por el fabricante y sometidos a la evaluación de una

tercera parte (por ejemplo, AOAC, AFNOR, NMKL). Cuando no se disponga de estainformación (datos de validación), o estos no son plenamente aplicables, el Laboratoriodebe realizar la validación, antes de utilizar el método en el laboratorio, siguiendo loslineamientos establecidos en la Norma ISO 16140 o los protocolos de AOAC, NordVal.

6.2.2.4 Métodos internos: para estos métodos, la validación es mucho más exigente ydeben ser adecuada y totalmente validados antes de su uso, ya que al no disponerse deinformación previa sobre el desempeño del método, se deberán evaluar, según suscaracterísticas, todos los parámetros de desempeño posibles, para satisfacer lasnecesidades del tipo de aplicación. Se pueden utilizar como guías, según las matrices, porejemplo: la Norma ISO 16140, la Norma ISO/TR 13843, o los protocolos de AOAC,NordVal. El diseño experimental y el análisis de los resultados tienen que ser

estadísticamente válidos.Los parámetros a determinar son:Ensayos cualitativos Ensayos cuantitativos Límite dedetección Sensibilidad Especificidad Inclusividad/ Exclusividad Robustez

Recuento de microorganismostotales (a)

Recuento de microorganismosen medio selectivo/diferencial

Precisión (Repetibilidad +Precisión intermedia) Límite de cuantificación(b) Rango validado Incertidumbre de medición Robustez

Además de los especificadosen (a): Sensibilidad Especificidad Inclusividad Exclusividad

(b) El límite de cuantificación debe ser determinado en los casos que afecte o esté cercanoal límite especificado en la norma correspondiente.



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6.2.3. Protocolo e Informe de validación6.2.3.1 Protocolo de validación. Con el fin de organizar y planificar las actividades de lavalidación se debe elaborar un protocolo de validación que incluya:

Objetivo

Alcance: ámbito de aplicación del ensayo a validar. Aquí tiene suma importancia laespecificación de la matriz, especialmente cuando pueden causar diferencias significativasen la recuperación de los microorganismos y el rango de aplicación en el caso de losensayos cuantitativos.

Personal que llevará a cabo la validación

Metodología y diseño experimental. Este debe incluir: la definición del analito, lanaturaleza de las muestras (naturales o inoculadas) utilizadas para la validación, elacondicionamiento y preparación de las mismas, los microorganismos utilizados, laestandarización del inóculo, las condiciones del ensayo, etc.

Listado de equipos, instrumentos, materiales, medios de cultivo, reactivos y cepas dereferencia.

Condiciones ambientales, cuando corresponda.

Parámetros de desempeño a determinar.

Criterios de aceptación para cada uno de los parámetros.

Análisis estadístico Metodología para el cálculo de la incertidumbre, cuando corresponda.

Registros asociados

El Protocolo de validación debe ser revisado y aprobado por el Responsable.

6.2.3.2 Informe de validación. Debe reflejar el protocolo de validación e incluir, ademásde lo especificado en 6.2.3.1

Resultados obtenidos, incluyendo la incertidumbre de medición, cuando corresponda aun método de ensayo cuantitativo.

Conclusiones y declaración de conformidad sobre la aptitud del método de ensayo,

fundamentada en la evaluación de los parámetros de desempeño respecto a los criteriosestablecidos.

Criterios de revalidación

El Responsable debe justificar y fundamentar apropiadamente si considera al métodoadecuado, aún cuando se hayan producido desviaciones del protocolo o, cuando uno delos puntos del informe no concuerde con el requisito establecido previamente, por ejemplolos criterios de aceptación.

Se deben adjuntar al informe de validación los datos originales o hacer referencia en dondeestos se encuentren.

El Informe de validación debe ser revisado y aprobado por el Responsable.



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6.3. Estimación de la incertidumbre de mediciónPara todos los métodos, ya sean cualitativos o cuantitativos, el Laboratorio debe:

a) identificar las distintas fuentes de incertidumbre, como por ejemplo, la homogeneidadde los reactivos, la interpretación de los analistas, etc. y demostrar que se encuentran bajocontrol.

Esto puede realizarse de muchas maneras, tales como diagramas de flujo, tablas, listas odiagramas de causa-efecto (espina de pescado).

6.3.1. Métodos de ensayo microbiológicos cualitativos: El concepto de cálculo deincertidumbre de medición no puede aplicarse directamente a los resultados de losensayos cualitativos como los obtenidos en los análisis de detección o en los de

determinación de atributos para fines de identificación. No obstante, el Laboratorio debe,además de lo especificado en 6.3 a):

a) determinar el límite de detección, basado en requisitos de especificidad y sensibilidad yrealizado en matrices representativas, teniendo en cuenta, cuando corresponda lapresencia de la flora acompañante, ya que es un importante indicador de la validez delmétodo en el laboratorio.

b) determinar la incidencia de resultados falsos positivos y falsos negativos asociada a losensayos cualitativos que se realizan (Tasa de Falsos Positivos y Tasa de FalsosNegativos). Esta no debe exceder las recomendaciones publicadas, ya sea en la literatura(normas o publicaciones relevantes al sector) o por los fabricantes, en este último casopara los métodos alternativos o de confirmación rápida.

6.3.2. Métodos de ensayo microbiológicos cuantitativos: el Laboratorio debe, ademásde lo especificado en 6.3 a):

a) realizar un cálculo para estimar la incertidumbre asociada a sus ensayos cuantitativos.

Existen diferentes modelos para estimar la incertidumbre para ensayos cuantitativos, ellaboratorio puede utilizar aquel que, basado en un pensamiento crítico y en el mejor juicioprofesional, estime conveniente. La estimación de la incertidumbre de medición deberealizarse para resultados válidos, es decir aquellos que se encuentran dentro de loslímites de recuento especificados en el método.

Dado el carácter de los ensayos microbiológicos, métodos empíricos1, donde es difícil

construir un modelo apropiado que permita cuantificar las contribuciones de cada paso a laincertidumbre del proceso de medida y, la poca disponibilidad de materiales de referenciacertificados que representen al microorganismo en su hábitat natural, el consenso actualsobre la estimación de la incertidumbre en los ensayos microbiológicos cuantitativos es

1 Método empírico: es un método que determina un valor al que sólo se puede llegar en términos delmétodo en cuestión y que, por definición, sirve como el único método para establecer el valoraceptado del parámetro medido (AOAC). Un método de ensayo diferente (a menudo para el mismoanalito) puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se define en los términos delmétodo. Por esta razón, en los métodos microbiológicos cuantitativos, el sesgo o “bias” nocontribuye a la incertidumbre del método, dado que los resultados dependen de las condicionesdefinidas en el método, tales como, la temperatura y tiempo de incubación, los medios de cultivo,

etc. Es por ello que la utilización de materiales de referencia certificados, cuyo valor se obtienetambién de métodos empíricos, constituye una herramienta útil para demostrar la competencia dellaboratorio, pero no deben ser utilizados para cuantificar el sesgo.



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que la precisión es el componente más importante y el único que puede determinarse deuna manera práctica, mediante la utilización de datos experimentales.

Por ello el Laboratorio puede utilizar los siguientes modelos:

6.3.2.1 Precisión intermedia, tal como se describe en la norma ISO 5725-3 incorpora lamayoría, sino todas, las fuentes de incertidumbre significativas.

Este enfoque es aplicable para estimar la incertidumbre en ensayos microbiológicoscuantitativos, cuando el recuento de los duplicados seleccionados para realizar laestimación se encuentra dentro del rango de recuento especificado en el método que setrate.

Sin embargo, cuando se obtienen recuentos bajos o ningún recuento, ya sea en placa o

por filtración por membrana, lo cual para una matriz particular y para un ensayo dadopuede ser la regla, no es apropiado el cálculo de la precisión intermedia, dado que elcoeficiente de variación (CV) aumenta rápida y significativamente cuando disminuye elrecuento.

En estos casos no se considera apropiado inocular las muestras con un adecuado númerode microorganismos para poder llevar a cabo el cálculo de la precisión intermedia, dadoque se asume que la incertidumbre asociada con los recuentos bajos en placa o enmembrana, es similar a la que se obtiene para recuentos mayores y, además, no refleja nirepresenta la verdadera condición de estas muestras.

Para recuentos bajos ver 6.3.2.2.

6.3.2.2 Norma ISO/TS 19036:2006 y su Amd1: 2009. Esta norma propone un modelo,que adopta un enfoque “top-down” o "global", y se basa en la desviación estándar de lareproducibilidad (sR) del resultado final del proceso de medición, que incluye todas lasfuentes de variabilidad que pueden encontrarse en la práctica. La incertidumbre de medidase estima mediante un enfoque simplificado tomando en cuenta la distribución de Poisson.Aplica a ensayos cuantitativos de productos destinados al consumo humano y laalimentación animal y, a muestras ambientales en el ámbito de la producción ymanipulación de alimentos, donde la enumeración de microorganismos se lleva a cabomediante técnicas de recuento de colonias. También es aplicable a ensayos cuantitativosllevados a cabo mediante métodos instrumentales. Aplica a cualquier resultado incluyendorecuentos bajos y/o bajo número de microorganismos. No es aplicable a la enumeración demicroorganismos utilizando la técnica del Número Más Probable.

Utiliza tres posibilidades para el cálculo de la desviación estándar de la reproducibilidad(sR):

sR intralaboratorio, que es un caso particular de "precisión intermedia" según lo definidoen la ISO 5725-3.

sR interlaboratorio derivado de la validación del método;

sR interlaboratorio derivado de pruebas de aptitud. Para este último caso el Laboratoriodebe tener en cuenta las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente.

El laboratorio debe tener en cuenta lo especificado en la Norma ISO/TS 19036, al planificarel diseño experimental para la recolección de datos y operar bajo condiciones de

aseguramiento de calidad, tanto interno como externo, de modo de demostrar que elmétodo se encuentra bajo control y minimizar variabilidades. De este modo se asegura la



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validez de la estimación de la incertidumbre de medición para las actividades rutinarias dellaboratorio y no solamente en un momento dado.

6.3.3. Ensayos que utilizan el Número Más Probable (NMP) para determinar elnúmero de microorganismos en una muestra de ensayo: para estos ensayos y deacuerdo al consenso actual, el Laboratorio puede utilizar los límites de confianza de lastablas, siempre que:

a) identifique las combinaciones inusuales e investigue sus causas;

b) demuestre que la precisión (determinada por ejemplo, mediante el análisis deduplicados) se encuentra dentro de dichos límites.

c) cumpla con lo especificado en 6.3 a).

6.4. Expresión de la Incertidumbre de medición en los informes de ensayo

En el Amd.1 de la Norma ISO/TS 19036, se dan las indicaciones para la expresión delresultado del ensayo y su incertidumbre asociada. El Laboratorio puede adoptar laexpresión que le resulte más conveniente y que considere clara a fin de informar al cliente,cuando éste así lo requiera. Debe indicarse además el nivel de confianza considerado y elfactor de cobertura. Por ejemplo, lo expresado en el ítem 8.2.1 del Amd.1 de la NormaISO/TS 19036. También deberá indicarse o hacer referencia al procedimiento empleadopara el cálculo de la incertidumbre, ya que, de los diversos métodos utilizados, algunos,conducen a una subestimación significativa de la incertidumbre. Este procedimiento debe

estar disponible para el cliente.Para los métodos de recuento que utilizan el Número Más Probable (NMP), laincertidumbre del resultado se expresará como el límite inferior y superior del intervalo deconfianza de las tablas (de acuerdo al método utilizado), indicando el nivel de confianzaconsiderado.

7. DOCUMENTACIÓN RELACIONADA

CE-LE-06, Criterios específicos para la evaluación y acreditación de laboratorios que llevan a cabo ensayos microbiológicos .



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8. Anexo I - Parámetros de validación y expresiones para su cálculo

guia microbiologicos

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