validacion de métodos microbiologicos

8/17/2019 Validacion de Métodos Microbiologicos

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Instituto de Hidrología, Meteorología y Estudios AmbientalesMinisterio de Ambiente, Vivienda y Desarrollo Territorial – República de Colombia

SUBDIRECCIÓN DE ESTUDIOS AMBIENTALES - GRUPO DE ACREDITACIÓN

Código: XXXXXX Fecha: 18/09/2008 Versión: 01 Página 1 de 12

Validación de Métodos Microbiológicos

Elaborado por: Ivonne Bernier Laboratorio LtdaFecha: 18/09/2008

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1. OBJETIVOS

Establecer una guía para la validación de métodos microbiológicos, con especial énfasis en métodoscuantitativos selectivos en los cuales el cálculo cuantitativo se basa en el recuento de partículas, yasea directamente, con la ayuda de un microscopio, o indirectamente, sobre la base del crecimiento(multiplicación) en colonias o turbidez.

Los principios y procedimientos dentro de este objeto se conocen comúnmente como el recuento decolonias, presencia/ausencia (P/A), el número más probable (NMP), y recuento directo(microscópico).

2. ALCANCE DE LA APLICACIÓN

La presente guía es tomada de la ISO 13843. Water Quality - Guidance on Validation of Methods.Geneva. 2000 y adoptada por el Icontec como GTC 84. Guía para la orientación acerca de lavalidación de métodos microbiológicos y de Política de Selección y Validación de Métodos de EnsayoOGA-GEC-016, de la oficina de Acreditación de Guatemala, 29 enero de 2007

Aunque los conceptos son básicos para la validación de un método microbiológico cuantitativo ycualitativo, cada laboratorio de ensayos para su aplicación debe realizar las adaptaciones necesariasa las matrices a validar

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES

La siguiente terminología es aplicable y práctica para ser utilizada en cualquier tipo de validaciónmicrobiológica:

Exactitud de la medición: grado de correspondencia entre el resultado de un ensayo y el valor dereferencia aceptado.

Analito: cantidad particular sometida a medición

Porción analítica: volumen de suspensión de partículas inoculado en una unidad detectora

Coeficiente de variación: CV desviación estándar relativa para una característica no-negativa, es laproporción de la desviación estándar al promedio

Detector de partículas: placa de matriz sólida o tubo de líquido que contiene un medio nutriente parael recuento o detección de partículas microbianas vivas.

Límite de detección: número de partículas x (por porción analítica) donde la probabilidad p0 de unresultado negativo es igual al 5 %.

Límite de determinación: concentración de partículas mínima promedio x por porción analítica,donde la incertidumbre estándar relativa esperada es igual a un valor (RSD)


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Linealidad: dependencia lineal de la señal en la concentración del analito

Distribución binomial negativa: distribución estadística particular "sobre dispersa" de recuentos

Precisión: grado de concordancia entre resultados de ensayo independientes bajo condicionesestipuladas.

Validación primaria o validación completa: establecimiento de las especificaciones para eldesempeño de un nuevo método y/o verificación experimental de que un método cumple criterios decalidad derivados teóricamente

Validación secundaria: demostración, mediante experimentos, de que un método establecidofunciona de acuerdo con sus especificaciones, cuando lo emplea el usuario.

Repetibilidad: grado de concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismoelemento mensurado realizadas bajo las mismas condiciones de medición.

Reproducibilidad: grado de concordia entre los resultados de las mediciones en el mismo elementomensurado realizadas bajo condiciones de medición alteradas.

Robustez: intensidad de un método analítico frente a pequeños cambios en procedimiento

Especificidad: fracción del número total de culturas o colonias negativas asignadas correctamenteen la presunta inspección.

Incertidumbre estándar: incertidumbre del resultado de una medición expresada como desviaciónestándar

4. GENERALIDADES SOBRE VALIDACIÓN

4.1. Definición

La validación significa un proceso que ofrece evidencia de que un método es capaz de servir para supropósito planeado, es decir, para detectar o cuantificar un grupo microbiano especificado conadecuada precisión y exactitud.

Los métodos de recuento total no tienen un grupo objeto definible y sólo pueden validarse en relacióncon otros métodos o contra expectativas teóricas de precisión.

La validación se clasifica como primaria o secundaria de acuerdo con su propósito.

4.2. Tipos de Validación

4.2.1. Validación primaria


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La validación primaria es un proceso exploratorio con la meta de establecer los límites operacionalesy características de desempeño de un método nuevo, modificado o caracterizado en forma

inadecuada. Debería originar especificaciones numéricas y descriptivas para el desempeño e incluiruna descripción detallada y precisa del objeto de interés (colonia positiva, tubo o placa)

Característicamente, la validación primaria procede mediante el uso de esquemas de ensayoespecialmente diseñados.

Los laboratorios que desarrollan un método "en casa" o una variante de una norma existente debenrealizar los pasos de validación primaria.

4.2.2. Validación secundaria

La validación secundaria (también llamada verificación) tiene lugar cuando un laboratorio procede a

implementar un método desarrollado en otra parte.

La validación secundaria se centra en la reunión de evidencia acerca de que el laboratorio está encapacidad de cumplir las especificaciones establecidas en la validación primaria.

Normalmente, la validación secundaria emplea formas seleccionadas y simplificadas de los mismosprocedimientos empleados en la validación primaria, aunque posiblemente extendidas por un tiempomayor. Las muestras naturales constituyen el material de ensayo óptimo y el trabajo sólo requieretratar el procedimiento dentro de los límites operacionales establecidos por la validación primaria.

4.2.3. Métodos equivalentes

Es necesario aplicar dos métodos en forma paralela sobre las mismas muestras al desarrollar unmétodo en casa y también al reunir información para justificar el uso de un método alternativo.

El desempeño del método consta de muchos aspectos. No existe un único ensayo de equivalencia demétodo, ni criterios numéricos para él. Un método puede ser superior en especificidad, pero inferioren recuperación.

4.3. Detectores

Con frecuencia resulta conveniente denominar detector al medio nutriente en su contenedor. Seemplean dos tipos de detectores: sólidos y líquidos, en diferentes variantes de métodosmicrobiológicos. Además, en la mayoría de los casos, se asocian con diferentes principios de

enumeración o detección: líquido con P/A y NMP, y sólido con recuentos de colonia.Todas las formas de validación en microbiología se centran en el desempeño de losdetectores.

El conjunto de tubos (NMP) o la serie de placas (contables) empleadas para análisis se denominaconjunto de detección o conjunto detector. Cada NMP de tubo individual es un detector P/A.

4.3.1. Comparaciones de detectores


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Para la mayoría de métodos de recuento de colonia se puede producir una contraparte líquida con la

misma composición química pero con la matriz sólida (agar, filtro de membrana).

El efecto del ambiente sólido puede evaluarse comparando recuentos de colonia con el cálculo NMPequivalente siempre a que la reacción para reconocimiento de objeto sea la misma en ambos tipos dedetectores y el número de tubos paralelos sea lo suficientemente grande para la precisión adecuada.Además se puede evaluar la sensibilidad de los detectores de P/A mediante comparaciones delíquidos-sólidos similares.

4.4. Características de Desempeño

Las características de desempeño deberían ser cuantificables y susceptibles de ensayo para usarseen validación.

La terminología sobre características de desempeño en esta norma, en su mayor parte, sigue el usoquimiométrico. Puesto que las definiciones originales de los términos no siempre encajan con losmétodos microbiológicos a la perfección, éstas han sido modificadas y adaptadas, de acuerdo con lasnecesidades.

Las características de desempeño tratadas en esta norma se relacionan con el objeto (lista desituaciones y tipos de muestras donde el método es aplicable), la precisión, linealidad, recuperación,límites de trabajo en términos del más bajo y más alto número de colonias recomendable por placa,selectividad, especificidad y estabilidad (rugosidad).

4.5. Especificaciones

Las especificaciones son expresiones numéricas o cualitativas de características de desempeño o delímites de trabajo derivados de ellas. La validación primaria debe ofrecer lo siguiente:

a) Identificación morfológica del (presunto) objetob) Declaraciones con respecto a las condiciones de incubación (temperatura, tiempo, gas,

atmósfera, humedad) y características de los medios (pH, estabilidad)c) Una declaración en cuanto a los límites de trabajo confiables en términos de colonia o

números de placa por detector (placa, número más probable , filtro de membrana)d) Expresiones de incertidumbre dentro de límites confiables especificadose) Objeto y limitaciones

5. PROCEDIMIENTOS Y PASOS DE VALIDACIÓN

La validación casi necesariamente ocurre en pasos. Las investigaciones de desempeño real delmétodo deberían estar precedidas por una búsqueda del intervalo de trabajo confiable en la que eldesempeño del método es pertinente. Cualquier comparación de recuperación entre dos métodosdebería limitarse a casos para los cuales son confiables ambos métodos.

5.1. Validación Primaria


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5.1.1. Identificación de objeto

Los estudios de cultivos puros durante el desarrollo inicial del método proporcionan la descripciónbásica de las colonias objeto o tubos P/A. Obviamente, se debe ensayar más de una cepa de cultivopuro del objeto.

Se debe probar la validez de la descripción básica empleando el método candidato en una selecciónrepresentativa de muestras naturales. Se ensayan las presuntas colonias objeto, placas o cultivosaislando los cultivos y realizando ensayos de confirmación apropiados. Las presuntas colonias no-objeto o tubos negativos se ensayan de la misma manera.

Se deben calcular los valores numéricos de sensibilidad, selectividad, tasas de falsos positivos yfalsos negativos y eficiencia.

Se corrige la descripción del objeto, si es necesario.

5.1.2. Incertidumbre del recuento y sensibilidad al tiempo

Después de que se ha definido adecuadamente la morfología del objeto, el método se empleatentativamente sobre una colección de muestras naturales.

Se estudia la confiabilidad de línea de base de los recuentos mediante recuento repetido de lascolonias de las placas de muestras dentro de un corto tiempo. Si va a trabajar más de una persona enel laboratorio con el método, todos deben participar.

5.1.3. Otras características de robustezSi existen dudas acerca de los efectos de la temperatura de incubación, la humedad o la atmósferade gas, éstas deberían estudiarse mediante ensayos especiales que involucren la incubación de sub-muestras paralelas bajo las condiciones alternativas.

5.1.4. Límite superior de trabajo

Habiendo establecido las condiciones "ambientales" y las características del objeto, el siguiente pasoes explorar las limitaciones cuantitativas del detector en cuestión.

Esto puede realizarse con un único tipo de experimento: una serie finamente graduada de diluciones

o volúmenes, con paralelos. El ejercicio ofrece los datos para evaluar el límite superior sobre la basede proporcionalidad y repetibilidad.

5.1.5. Precisión

El laboratorio responsable de introducir un nuevo método debería también ser el responsable deofrecer los valores iniciales de sus cálculos de precisión. Estos deberían incluir cálculos deincertidumbre de recuento y repetibilidad básica y cálculos de reproducibilidad de diferentesrepeticiones (placas paralelas, series de dilución paralela, matrices).


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Otros laboratorios requieren esta información para su validación secundaria del método y

subsecuentemente para establecer los sistemas de control de calidad analítico.

5.1.6. Veracidad y recuperación relativa

La recuperación absoluta (veracidad) del analito microbiológico es inmensurable, lo cual representaun problema en la validación primaria de un nuevo método.

5.2. Validación Secundaria

Se deben obtener numerosas muestras naturales. Las muestras divididas o series de diluciónduplicadas se estudian con estriado paralelo. Se practica el recuento duplicado con el fin de verificarel desempeño de recuento esperado.

Se debe aislar y verificar numerosos presuntos positivos (por lo menos 100). Las características dedesempeño categóricas se calculan y comparan con los valores especificados, si se encuentrandisponibles.

6. ESQUEMA DE UNA VALIDACIÓN

6.1. Caso 1 - Método Normalizado

El laboratorio que va a utilizar un método normalizado debe verificarlo contra sus especificaciones devalidación, atendiendo los requisitos para el aseguramiento de la calidad, y no necesita validarlo.

Esta verificación permite demostrar que el laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente (eluso corresponde al propósito para el que fue desarrollado, con respecto a la propiedad medida,matriz, rango, equipos utilizados, repetibilidad, etc.).

En la mayoría de los casos se puede considerar que en el desarrollo de los métodos normalizados sehan tenido en cuenta todos los aspectos necesarios relativos a la validación.

Al presentarse el caso de no haber evidencia suficiente para deducir que se ha llevado a cabo unacorrecta validación, el laboratorio usuario deberá definir un procedimiento para calcular y evaluar losparámetros de desempeño que considere necesarios para asegurar la confiabilidad del método.

6.2. Caso 2 - Método No Normalizado:El laboratorio que va a modificar un método normalizado debe revalidarlo para demostrar que lasespecificaciones del método original no se ven afectadas por la modificación introducida. El nivel derevalidación requerido aumenta conforme la magnitud de los cambios realizados.

Se consideran cambios menores, por ejemplo, la modificación del tamaño de la muestra y sustituciónde reactivos.


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Se considera cambio mayor, por ejemplo, el cambio de procedimiento o equipo y cambios en elalcance (aplicación a matrices que no se especifican).

Para demostrar que una versión modificada de un método cumple las mismas especificaciones que elmétodo original, se deben realizar comparaciones utilizando réplicas. El diseño experimental y elanálisis de los resultados deben ser estadísticamente válidos.

El laboratorio usuario de un método normalizado modificado debe verificarlo contra susespecificaciones originales, o de revalidación, y así demostrar que domina el ensayo y lo utilizacorrectamente.

En el caso de métodos no normalizados, los terceros que los desarrollan son responsables de incluiren dicho proceso la etapa de validación, para demostrar que el método cumple con los criterios deaceptación adecuados para el propósito de aplicación; el laboratorio usuario debe verificar el

desempeño del método contra sus especificaciones de validación y así demostrar que domina elensayo y lo realiza correctamente.

6.3. Caso 3 - Método desarrollado por el laboratorio:

El laboratorio que desarrolla y utiliza sus propios métodos debe validarlos, para demostrar quecumplen con los criterios de aceptación adecuados para el propósito de aplicación.

Una vez está en uso el método, el laboratorio debe verificar su desempeño contra los parámetros devalidación, para demostrar que sigue dominando el ensayo y lo realiza correctamente.

6.4. Revisión de los métodos de ensayo incluidos en el alcance

Como parte de la revisión se debe incluir, pero no circunscribirse a, lo indicado a continuación:

Para confirmar que el método se ajusta al uso previsto en el laboratorio es necesario determinar sudesempeño (verificar) conforme una o una combinación de las siguientes técnicas, según loestablecido en la nota NTC/ISO/IEC 17025, adoptada como un criterio de acreditación paralaboratorios de ensayo y calibración:

La calibración utilizando patrones de referencia o materiales de referencia La comparación con resultados obtenidos por otros métodos Las comparaciones interlaboratorios La evaluación sistemática de los factores que influyen en el resultado

La evaluación de la incertidumbre de los resultados basada en el conocimiento científico delos principios teóricos del método y en la experiencia práctica.

Aún cuando se haya realizado la validación del método, el laboratorio tendrá que verificarperiódicamente que se cumplen los parámetros de desempeño documentados por parte de laorganización que lo desarrolló, modificó y/o publicó.

Para esta verificación el laboratorio puede utilizar, por ejemplo, muestras inoculadas o materiales dereferencia incorporados a las matrices más representativas. También tiene que tomar en cuenta los


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resultados obtenidos de las auditorías internas y externas de sus sistemas de gestión, dejandoregistro de las verificaciones.

La documentación de la modificación, actualización, validación y verificación del método debe incluirregistros de la determinación de los parámetros de desempeño, limitaciones de su aplicabilidad,procedimientos para control de calidad, calibración y control de documentos. Estos registros debenestar disponibles a solicitud de los miembros del equipo evaluador durante las visitas en sitio, ya seade evaluación para la acreditación, seguimiento o reevaluación.

Los procedimientos y responsabilidades para el desarrollo, validación, verificación e implementaciónde los métodos deben ser descritos en detalle dentro de la documentación del sistema de calidad dellaboratorio. Los diagramas de flujo son una herramienta para describir el procedimiento; paramétodos complejos también se pueden utilizar programas informáticos de gestión de procesos. Elpersonal responsable debe dejar establecidos los requisitos mínimos de calidad antes de empezar el

proceso de validación e implementación del método, o mejor aún establecerlos antes de comenzartodo el proceso de desarrollo.

6.5. Validación de análisis microbiológicos

De acuerdo con ENAC los métodos de análisis microbiológicos cualitativos y cuantitativos deben servalidados estimando, cuando sea apropiado, los parámetros de desempeño que se indican en elcuadro siguiente, utilizando métodos estadísticos apropiados.

Propósito del Ensayo/Parámetros del Método

Análisis Cualitativo Análisis Cuantitativo

Exactitud relativa + +

Repetibilidad + +Reproducibilidad + +

Sensibilidad No se valida +Desviación positiva + +Desviación negativa + +

Especificidad + +Límite de detección + No se valida

Límite de cuantificación No se valida +Efecto matricial + +

NOTA:(-) Significa que este parámetro normalmente no se evalúa.(+) Significa que este parámetro normalmente se evalúa.

6.5.1. Para las pruebas rápidas

Para los análisis cualitativos que detectan metabolitos, drogas, microorganismos, hormonas y otros,en fluidos corporales, aguas, alimentos, etc., por medio de pruebas rápidas (tales como ensayosinmunocromatográficos tipo cassette, aglutinación, etc.), se debe aplicar los mismos criterios devalidación que los especificados en las pruebas convencionales.


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Para la verificación del desempeño del método en uso, como mínimo se debe determinar lasensibilidad (límite de detección), especificidad (detección inequívoca) y los otros parámetros de

desempeño declarados por el fabricante de la prueba y los requeridos por las normas.

Es importante mencionar que entre las pruebas rápidas, algunas son empleadas exclusivamente paratamizaje o discriminación, por lo que los resultados positivos requieren de un análisis confirmatorioposterior, cuyo principio metodológico sea diferente.

6.5.2. Para los análisis automatizados

En el caso de utilizar pruebas normalizadas o validadas por el fabricante del equipo automatizado, ellaboratorio deberá proceder a una verificación de la metodología.

El laboratorio que emplee equipo automatizado deberá comprobar la calibración del mismo al

momento de su instalación y que ésta cumpla con los requerimientos de la casa comercial.

Así mismo, periódicamente deben emplearse controles comerciales (negativos y positivos) y correrloscomo muestras en la rutina del laboratorio; adicionalmente debe comprobarse que los resultados delos controles analizados se encuentren dentro del rango permisible para el análisis, con el objeto deverificar el buen funcionamiento del equipo. Como parte de la verificación continua del desempeño delos métodos analíticos automatizados, es especialmente recomendable que el laboratorio participe enprogramas de comparación entre laboratorios.

Según los criterios internacionalmente vigentes para el aseguramiento de la calidad de los resultadosde los laboratorios analíticos planteados por ICH (Chan et al), la validación de un método que usaequipo automatizado requiere cualificar el sistema de hardware y software correspondiente y así

establecer su capacidad y confiabilidad de funcionamiento bajo las condiciones adecuadas de uso. Lacualificación del sistema se simplifica si los fabricantes y proveedores de los equipos cumplen con lanorma ISO 9001; el proceso de cualificación debe abarcar las etapas de instalación, operación ydesempeño del sistema.

El laboratorio debe contar con un procedimiento documentado de cualificación que contenga, entreotros componentes, las pruebas a realizar, los correspondientes criterios de aceptación y los formatospara el registro de datos y resultados. La cualificación de instalación permite establecer si el sistemarecibido cumple con las especificaciones de fabricación y fue debidamente instalado.

La cualificación de operación permite establecer si, al quedar instalado el sistema integrado, o susmódulos, están funcionando de acuerdo con las especificaciones operacionales del caso; se lleva a

cabo haciendo pruebas con analitos en muestras específicas para ello. Y, por último, la cualificaciónde desempeño permite demostrar si el sistema cumple con los requisitos definidos acorde a lasnecesidades del usuario; ésta se puede llevar a cabo corriendo las aplicaciones analíticas departicular interés para el usuario.


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7. DIAGRAMA DE UNA VALIDACIÓN


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8. BIBLIOGRAFÍA

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